Krooninen sairaus

tiivistelmä

heterogeeninen ydin- ribonucleoparticule A1 /A2 ( hnRNP A1 /A2) ja silmukoinnin kerroin 2 /vaihtoehtoisen silmukoinnin tekijä (SF2 /ASF), ovat olennaisen tärkeitä esiaste lähetti-RNA (pre-mRNA) liittämiseen. Interferoni säätelytekijänä-3 (IRF-3) näyttelee kriittistä roolia isännän puolustuksessa vastaan ​​virus- ja mikrobi-infektio. Katkaistu IRF-3 proteiinit vaihtoehtoisista silmukoinnin on tunnistettu ja luonnehdittu toiminnallinen antagonisteina täyspitkän IRF-3. Tässä tutkimuksessa selvitimme molekyylimekanismiksi liittämiseen sääntelyä IRF-3 pre-mRNA ja ensimmäinen raportoitu sääntelyn vaikutus hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF IRF-3 liittämiseen ja aktivointi. RNA-interferenssi-välitteisen ehtyminen hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin lisäsi syrjäytymisen eksonien 2 ja 3 IRF-3-geenin ja vähentää ekspressiotasot IRF-3-proteiinin ja IRF- 3 alavirtavaikuttajainhibiittorit molekyylit interferoni-beeta ja CXCL10 /IP-10. Lisäksi suora sitoutuminen hnRNP A1 ja SF2 /ASF spesifinen sitoutuminen motiivien IRF-3 introni 1 varmistettiin RNA elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä. Myöhemmät minigeeninä liittämiseen testi osoitti, että IRF-3 minigeenit kanssa mutatoitunut hnRNPA 1 /A2 tai SF2 /ASF sidosmotiivien lisääntynyt syrjäytymisen eksonien 2 ja 3. Lisäksi knockdovvn hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF NSCLC soluissa vahvistettu fytohemagglutiniinilla aiheuttama kasvain necrosis factor-alpha release ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC), mutta tukahdutti että interleukiini-10 NSCLC /PBMC co-kulttuureissa. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että erityiset Knockdown for hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF lisäys poissulkeminen eksonien 2 ja 3 IRF-3 pre-mRNA ja vaikuttaa immunomodulaarisia toimintoja ihmisen NSCLC-solujen.

Citation: Guo R, Li Y, Ning J, Sun D, ​​Lin L, Liu X (2013) hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF Regulate vaihtoehtoiset jatkaminen interferoni Regulatory Factor-3 ja Vaikuttaako Immunomodulatorisia Toiminnot Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (4): e62729. doi: 10,1371 /journal.pone.0062729

Editor: Luwen Zhang, University of Nebraska – Lincoln, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2012; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 29 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (Grant nro 30572072) ja XL ja Pekingin Kunnan Natural Science Foundation (Grant nro 5092009) ja National Natural Science Foundation of China (Grant nro 30871366) ja YL. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Jinying Ning, koska kolmas kirjoittaja tämän käsikirjoituksen, oli työntekijä yhtiön Crown Bioscience Inc (Beijing). Hän vaikutti jonkin verran analyysityökaluja ja konsultoinut tähän työhön. Ei patentit jaetaan Crown Bioscience Inc (Beijing). Ei tuotteita kehitteillä, eikä kaupan tuotteiden Crown Bioscience Inc (Beijing) käytettiin tässä tutkimustyössä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Alternative esiaste lähetti-RNA (pre-mRNA) silmukointi on tärkeä posttranskriptionaalisella mekanismi, jonka solut voivat tuottaa erilaisia ​​ohjelmistoon proteiinia isoformien harvempiin geenejä [1]. On arvioitu, että suurin osa ihmisen monieksoni- geenit vaihtoehtoisesti liitettyjä [2]. Vaihtoehtoinen silmukointi on merkittäviä rooleja kehittämiseen, fysiologian, ja tautien ja prosessi poistaa intronien valikoivasti ja yhteenliittämisen jäljellä eksonien edellyttää tarkkaa sääntelyä ja on usein häiriintynyt tulehdussairauksiin ja syöpien [3] – [6]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut RNA-sitovat proteiinit voivat osallistua sääntelyn tulehduksellisten prosessin ja kasvaimen kehittymisen säätelemällä liittämiseen tai mRNA vakautta inflammation- ja kasvaimeen liittyvien geenien [4], [6] – [8]. Kaksi ydinaseiden RNA sitovan proteiinin perheitä, perhe heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa (hnRNP) ja perheeseen seriini /arginiini-rikas proteiineja (SR), pelata keskeisiä rooleja sääntelyssä vaihtoehtoisen silmukoinnin ja mRNA vakautta. HnRNP perhe sisältää vähintään kaksikymmentä jäsentä ja pääasiallisesti sitoutuu sekvenssit kutsutaan liittämiseen äänenvaimentimet, joka sijaitsee eksonit (ESSs, eksoni liittämiseen äänenvaimentimia) tai intronit (ISS:, introni liittämiseen äänenvaimentimet), edistää eksonin syrjäytymistä ja toimii liitos repressorit [9]. Runsain ja parhaiten tunnettu proteiinien tässä ryhmässä ovat hnRNP A1 ja hnRNP A2, joka jakaa korkea sekvenssihomologia ja toiminnallinen homologia [10]. Lisääntyvä todisteita ovat osoittaneet, että hnRNP A1 ja hnRNP A2 on yli-ilmentynyt erilaisia ​​kasvaimia ja toimii kasvaimen varhaiseen biomarkkereita [7], [11] – [13]. HnRNP U, kun toinen hnRNP perheenjäsen, on raportoitu parantaa TLR aiheuttamaa tulehdusta edistäviä sytokiinituotannossa vakauttaa mRNA makrofageissa [14]. Perhe SR proteiinien, toinen säädin vaihtoehtoisia liittämiseen, sisältää myös yli kaksikymmentä jäsentä. Nämä proteiinit sitoutuvat liittämiseen parantajia, jotka sijoittumaan eksonit (paikkansapitävyys, eksoni liittämiseen tehostajat) tai intronit (ISES, introni liittämiseen parantajia), ja pääasiallisesti toimivat antagonisteina hnRNP proteiinien [15]. Kuitenkin useat tutkimukset ovat myös paljastaneet, että SR proteiinit säätelevät eksonin ohittaminen tapahtumia ja eri SR proteiineilla päinvastainen toiminta edistää eksonin osallisuuden tai ohita samana geenit [16], [17]. Jatkaminen kerroin 2 /vaihtoehtoisen silmukoinnin tekijä (SF2 /ASF), kuten parhaiten karakterisoitu jäsen SR perhe, on raportoitu olevan säädelty useissa ihmisen syövissä, kuten keuhkosyöpä ja kohdunkaulan syöpä, ja on merkittäviä rooleja laitoksessa ja ylläpito solujen transformaatio [8], [18] – [20]. Viimeaikainen tutkimus paljasti myös, että SF2 /ASF välitteistä IL-17 aiheuttama mRNA vakaus kemokiinin CXCL1 ihmisen kohdunkaulansyövän solut [21].

Jatkuvasti kasvava interferoni säätelytekijänä (IRF) perheeseen kuuluu transkription aktivaattoreita ja repressoreja jotka säädellä geeniekspressiota kriittinen immuunivasteeseen, hematopoieesin, ja solujen eloonjääminen [22] – [24]. IRF-3 on ainutlaatuinen IRF perheenjäsenten, että se on keskeinen suora anturin viruksen kaksijuosteisen RNA: n ja bakteerilipopolysakkaridi-välitteistä signalointia, [25], [26]. IRF-3 toimii olennaisena transkription aktivaattori tyypin I interferonien (IFNa /β), osajoukko interferoni-stimuloitujen geenien sekä joitakin kemokiini geenejä, kuten RANTES ja CXCL10: n /IP-10, ja sillä kriittiset roolit sekä synnynnäisen immuniteetin vastaan ​​virusinfektio ja myöhemmin immuniteetin aktivaatio [27] – [31]. IRF-3-geenin koostuu 8 eksonia ja 7 intronit ja se koodaa 427 aminohapon proteiinia. IRF-3 on fosfoproteiini ja se koostuu N-pään DNA: ta sitovan domeenin (DBD) (aminohapot 1-110), joka on C-terminaalinen IRF-liittyvä domeeni (IAD, aminohapot 198-374), ja transaktivaatiodomeenin (TAD, aminohapot 134-394) [32]. Sen kriittinen rooli isännän puolustukseen, aktiivisuus IRF-3 on tarkasti valvottua. IRF-3 ilmentyy laajalti ja sitä löytyy pääasiassa inaktiivisessa soluliman muodossa. Infektion jälkeen virus tai kaksijuosteinen RNA indusoi fosforylaation C-terminaalin seriini /treoniiniryhmä ja johtaa konformaatiomuutoksen IRF-3 altistumiseen sekä DBD ja IAD verkkotunnuksia, mikä edelleen johtaa homo- tai heterodimerisoitumisella, cytoplasm- to-ydin translokaatio, yhdessä CBP /p300 koaktivaattoreiden, ja transkription aktivoituminen useiden kohdegeenien [33], [34].

Rakenteelliset eheys on välttämätöntä IRF-3 hoitaa säännöllisesti tehtävän lukemattomia solureiteillä kuten on osoitettu toiminnallisia muutoksia vaihtoehtoisista silmukoinnin IRF-3 pre-mRNA. IRF-3a on ensimmäinen tunnettu IRF-3 silmukointi-isoformin ja sen alkuperäinen eksoni 2 löytyy IRF-3 korvataan intronin 2 [35]. IRF-3a-proteiinin puuttuu osa N-terminaalinen DBD ja IRF-3 ja on kykenemätön sitoutumaan klassisen IRF sitovia osia, kuten IFN-stimuloidun vaste-elementit (ISREs). Kuitenkin, IRF-3a, jossa on ehjä IAD domeeni on osoitettu muodostaa heterodimeerin IRF-3 seuraavat virusinfektio ja estävät IRF-3 transkriptionaalisen aktiivisuuden [36]. Viime aikoina olemme tunnistettu viisi uusia silmukoivia muunnoksia IRF-3, kutsutaan IRF-3b, -3c, -3D, -3E, ja -3f, ja kävi ilmi, että nämä silmukointivariantit syntyvät poistetaan eksonien 2, 3, tai 6 tai jokin niiden yhdistelmä [37]. Nämä uudet silmukointi-isoformit lähdettävä menettää koko alueen DBD domain (IRF-3b, -3c, -3D, ja -3f) tai hävitä osia TAD ja IAD verkkotunnuksia (IRF-3b, -3D, ja -3E ). Lisäksi olemme myös osoittaneet, että nämä uudet silmukointivariantit ilmaistiin erilaisissa ihmisen soluja ja kudoksia, ja näytti toimivan negatiivisena modulaattoreina IRF-3 ja vähentää transaktivaation IFNp promoottorin eri tahtiin. Nämä perustettu rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia johtuen vaihtoehtoisen silmukoinnin optio lisätutkimuksia molekyylitason mekanismi liittämiseen sääntelyä IRF-3 pre-mRNA.

Tässä tutkimuksessa, RNA-interferenssi-välitteisen ehtyminen hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin lisäsi syrjäytymisen eksonien 2 ja 3 IRF-3 pre-mRNA. Käyttämällä sekvenssianalyysi ja ohjelmien, kuten ESE Finder tunnistimme hnRNP A1 /A2 sitoutumiskohta (UAGGGA) ja SF2 /ASF sitoutumiskohta (GGAAGGA) in IRF-3 intronin 1. Myöhemmät elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) käyttäen villityypin ( painosta) RNA-koetin tai RNA: mutaatio näissä sitoutumiskohtiin ja mutantti IRF-3 minigeeniin silmukoinnin määritys varmisti hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sidosmotiivia IRF-3 intronin 1. Lisäksi vaikutus muutoksen IRF- 3 silmukointi kuvio ilmaisuna sen loppupään kohdegeenien ja sytokiinituotantoon NSCLC /perifeerisen veren mononukleaarisissa solu (PBMC) co-viljelmät arvioitiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja RNA Häiriöt

Ihmisen NSCLC solulinjat A549 ja Calu-6 saatiin ATCC (Manassas, VA). Soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Pieni häiriöitä RNA: t (siRNA: t) kohdistaminen hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, tai polypyrimidiinijuosteen sitovan proteiinin (PTB tai hnRNP I) mRNA valittiin ja siRNA transfektiot suoritettiin kuvatulla [7] , [38]. Johtuen toiminnallinen redundanssi hnRNP A1 ja hnRNP A2 raportoitu aiemmin, siRNA: t näistä kaksi geeniä transfektoitiin samanaikaisesti. Lyhyesti, eksponentiaalisesti kasvavia A549 ja Calu-6-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (2 x 10

5 solua /kuoppa). Seuraavana päivänä, 80 pmol hnRNP A1 ja hnRNP A2 (kukin 40 pmol), 40 pmol SF2 /ASF, tai 40 pmol PTB duplex-RNA: iden (Beijing DNA-SYN Biotekniikka Co, Peking, Kiina) sekoitettiin 6 ul Oligofectamine transfektioreagenssia (Invitrogen) plus 250 ui Opt-MEM-alustassa (Invitrogen), 20 minuutin ajan ja lisättiin sitten soluihin, vastaavasti. Transfektion jälkeen 48 tuntia, solut edelleen transfektoitiin 20 pmol kaksijuosteista RNA-Poly (I: C) (Sigma, St. Louis, MO), aktivoida signalointi IRF-3-reitin. Jälkeen Poly (I: C) stimulaatio 24 h, koko solun RNA: ta ja proteiinia, eristettiin lisäanalyysiä varten. Erityisiä siRNA transfektioiden paritonta siRNA transfektio käytettiin valetransfektoidun ohjaus.

Yhteensä RNA: n eristäminen ja semikvantitatiivinen RT-PCR

Solun kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Noin 3 ug kokonais-RNA: ta kustakin solulinjasta pilkottiin RNaasi-vapaata DNaasia I (Promega, Madison, WI) poistaa DNA-kontaminaation ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen Superscript III System (Invitrogen). Tutkia mRNA: n ilmentymisen tasot kohdegeenien soluissa, tyyppi-spesifisiä alukesarjoja suunniteltiin ja vastaavat PCR-tuotteet sekvensoitiin transkription tarkkuutta. Alukesarjat, hehkutus lämpötilassa vahvistusta, ja pituus PCR-tuotteiden on lueteltu taulukossa 1. PCR-seos koostui 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 200 pmol kutakin aluke, 2 U Taq DNA-polymeraasia (Promega), ja 1-2 ui näytettä cDNA. Tuloksena olevat fragmentit tehtiin elektroforeesi 1,2-2,5% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Kaikki PCR-reaktiot toistettiin toistettavia tuloksia. β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan ja kokonais-RNA samasta soluja ilman käänteistranskriptio käytettiin negatiivisena kontrollina. Sen varmistamiseksi, että PCR-reaktioissa kuuluvat lineaarisen alueen vahvistus, asianmukainen määrä pyöräily monistamiseen kunkin ohjaus- tai kohdegeenin tutkittiin (tietoja ei esitetty).

Western blot -analyysi

Solut hajotettiin 30 min lyysipuskuria (15 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, ja 1 mM DTT), jota on täydennetty proteaasi-inhibiittorit ja liuos kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 rpm 15 min. Kokonaisproteiinista (25 ug) 1 x natriumdodekyylisulfaattia (SDS) näytepuskuriin, erotettiin 10% SDS-PAGE ja elektro-siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL). Sitten membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja tutkittiin erityisiä primaaristen vasta-aineiden: anti-hnRNP A1 (Proteintech Group, Inc., Chicago, IL), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA), anti-PTB (Proteintech), anti-Actin (I-19) (Santa Cruz), tai anti-IRF-3 (Proteintech) (1:1000 ja 1:3000 laimennus), vastaavasti. Kun oli pesty 0,2% Tween 20 /PBS-puskuria kolme kertaa, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- järjestelmä, ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

elektroforeettinen liikkuvuus Shift (EMSA) B

sekvenssi intronin 1 IRF-3 pre-mRNA, ylävirtaan eksonin 2 5 ’silmukoitumiskohta sisältää UAGGGA sekvenssin, joka on sama kuin konsensus hnRNP A1 /A2 korkean affiniteetin sitoutumisen site tunnistetaan SELEX, UAGGG (A /U) [39]. Käyttämällä ESE Finder ohjelmaa, muut kaksi sitoutumiskohtaa (GGAAGGA) on SF2 /ASF tunnistettiin heti ylävirtaan eksonin 2 5 ’silmukointikohtaan. Tutkia mahdollisuutta, että hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sitoutuvat näihin sitovat motiivit, fuusioproteiinit GST-hnRNP A1 ja GST-SF2 /ASF esittivät IPTG induktion ja puhdistettiin glutationin Sepharose 4B. Synteettiset RNA oligonukleotideja, jotka sisältävät villityypin sitovat motiivit hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF (wt-A1 tai wt-SF2), The G3C mutantti sitova motiivi hnRNP A1 /A2 (mu-A1), tai G2C mutantti sitova motiivi SF2 /ASF (mu-SF2) biotinyloitiin käyttämällä Pierce RNA 3 ’End biotinylointikitti (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) seuraten valmistajan ohjeita. Geeli shift-reaktiot suoritettiin käyttäen LightShift Kemiluminesenssiin EMSA Kit (Pierce) mukaan valmistajan kuvauksen. Lyhyesti, 20 fmol biotinyloidun villityypin tai mutantti-RNA-koettimet inkuboitiin 50 ng puhdistettua GST-fuusioproteiinien 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 20 ul: sitovat reaktiossa, joka sisälsi 2 ug tRNA. EMSA-reaktiot suoritettiin elektroforeesi 6% natiivi-PAGE, siirrettiin positiivisesti varatulle nailonkalvolle (Amersham), ja sen jälkeen silloitettu käyttäen GS Gene Linker UV kammion (BioRad, Hercules, CA). Detection biotinyloitua RNA suoritettiin käyttäen stabiloitua streptavidiini /piparjuuriperoksidaasi-konjugaatin (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Osoittaakseen spesifisyyden proteiini-RNA-kompleksin muodostumisen, puhdistettua GST-proteiinia käytettiin EMSA reaktion ja toimi negatiivisena kontrollina.

IRF-3 -minigeenin Rakentaminen ja transfektio

villityypin minigeeni sisältävä asiaankuuluvat IRF-3 genomin alueella eksonista 1 eksoniin 4, ja reunustavat alueet kloonattiin pcDNA3.0-vektoriin (Invitrogen) käyttämällä

Kpn

I ja

Eco

RI leikkaus sivustoja. Introni 1 wt-IRF-3 minigeeniin sisältää oletetun sitoutumiskohtia hnRNP A1 /A2 (wt-A1) ja SF2 /ASF (wt-SF2). Minigeenit kanssa G3C mutantti sitoutumiskohdan hnRNP A1 /A2 (mu-A1) tai G2C mutantti sitoutumiskohdan SF2 /ASF (mu-SF2) tuli läpi kaksivaiheinen PCR overlap extension [40] käyttämällä wt-IRF -3 -minigeenikonstruktista templaattina. Kaikki ekspressiokasetit ovat valvonnassa CMV-promoottorin ja polyA-signaalin. Kaikki konstruktit varmistettiin sekvensoimalla. Villityypin ja mutatoidut minigeeniä vektorit transfektoitiin A549-soluja. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja suhteelliset ekspressiotasot IRF-3-isoformit analysoitiin RT-PCR: ää.

eristäminen ja viljely perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) ja Co-viljelyn kanssa A549 Cells

tutkimus protokolla ja suostumus asiakirjat hyväksyttiin eettisen ja Academic valiokuntien Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala. Ääreislaskimoon verinäytteet saatiin terveiltä luovuttajilta kanssa lupaa. Eristäminen ja viljely PBMC suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, PBMC: t eristettiin perifeerisestä verestä käyttäen Histopaque®-1077 (Sigma) seuraten valmistajan ohjeita. Viljelyyn PBMC, solut suspendoitiin RPMI 1640, johon oli lisätty 5% kuumentamalla inaktivoitua FBS: ää (Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 5 ug /ml fytohemagglutiniinilla (PHA) (Sigma) ja 10 mM HEPES ja ympättiin 2 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä.

Tämän jälkeen viljelemällä PBMC, A549-solut on 60-80% konfluenssiin transfektoitiin erityisiä siRNA: t, kuten on kuvattu edellä. 48 h transfektion jälkeen solut edelleen transfektoitiin Poly (I: C). Neljä tuntia myöhemmin väliaine vaihdettiin PBMC-co-elatusaineeseen [RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 1 ug /ml PHA: ta, ja 10 mM HEPES]. PBMC (5 x 10

6 solua) ympättiin TranswellTM-Clear insertit (0,4 um huokoskoko, Costar Group, Washington, DC) ja sijoitetaan päälle A549 kulttuureissa. Co-viljely tehtiin 72 h ja viljelyalusta kerättiin sen jälkeen lisäanalyysiä varten.

havaitseminen IFNp, CXCL10 /IP-10, TNF-α: n ja IL-10 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA ) B

pitoisuudet IFNP (Pierce), CXCL10 /IP-10 (SABiosciences, Frederick, MD), tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) (SABiosciences), ja interleukiini-10 (IL-10) (SABiosciences) soluviljelmissä supernatantit määritettiin ELISA mukaan valmistajan ohjeiden. Tiedot mitattiin 450 nm: ssä BioRadin mikrolevylukijalla.

immunohistokemiallinen värjäys

Immunohistokemiaa analyysin ekspression hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, ja IRF-3, 63 parafinoidut ihmisen NSCLC tuumorikudoksista, 39 vieressä ei ollut kasvainta kontrollisilkkipaperia, ja 26 bronchiectasis kudokset saatiin Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala, Peking, Kiina. Tutkimus hyväksyttiin sekä eettisen ja Academic komiteoiden Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala, ja suostumus saatiin kultakin kohteelta.

Kaikki kudokset parafiiniin ja värjättiin käyttäen S-P immunohistokemiallisella menetelmällä. Lyhyesti, objektilaseja deparaffinised ksyleenissä, kostutetaan porrastettu etanoliin, ja sitten käsiteltiin PBS: llä, joka sisälsi 3% vetyä hiilidioksidin endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi. Sen jälkeen kun esi-inkuboimalla 10% vuohen seerumia ja ei-spesifisen sitoutumisen block, kalvot inkuboitiin sitten erityisiä primaarisilla vasta-aineilla: anti-hnRNP A1 (Proteintech), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz), tai anti-IRF-3 (Proteintech) 4 ° C: ssa yön yli. Huuhtelun jälkeen leikkeitä jälkeen sitä inkuboitiin biotinyloidun immunoglobuliineja 15 minuuttia ja sitten streptavidiini-peroksidaasikonjugaatin 15 min. Signaalit kehitettiin DAB-H

2O

2 ratkaisu. Objektilasit vastavärjättiin 5% hematoksyliinillä ja tutkittiin sitten valomikroskoopilla. Kohdat ilman primaarista vasta-ainetta hoitoa käytettiin negatiivisena kontrollina. Värjäytyminen pisteytettiin asteikolla 0 IV seuraavasti: 0, alle 5% soluista oli värjäytynyt; I, 5-25% soluista oli värjäytynyt; II, 25-50% soluista oli värjäytynyt; III, 50-75% soluista oli värjäytynyt; ja IV, yli 75% soluista oli värjäytynyt. Tulospalvelu II-IV luokiteltiin positiivisiksi, kun taas tulokset 0 ja I olivat negatiivisia.

Tilastollinen analyysi

SPSS 15.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL) käytettiin määritettäessä tilastollista merkittävyyttä. Jatkuva muuttujat Eri ryhmät esitetään keskiarvo ± S.D. ja verrattiin käyttämällä

t

testiä. Chi-square testiä käytettiin analysoitaessa merkitystä hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, ja IRF-3 ilmaisun välillä pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia keuhkokudoksesta ryhmiä tutkittu. Arvot

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

knockdovvn hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF Human NSCLC solut Lisäykset poissulkeminen eksonit 2 ja 3 IRF-3 Gene

Jotta voidaan tutkia mahdollisia vaikutuksia hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF silmukoinnin säätely IRF-3-geenin, teimme siRNA-välitteinen ehtyminen hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF NSCLC soluissa A549 ja Calu-6. Jälkeen siRNA transfektion ja sen jälkeen Poly (I: C) stimulaatio IRF-3-signalointireitin, solun kokonais-RNA: ta ja proteiinia, eristettiin ja runsaasti hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF-mRNA: ja proteiinien arvioitiin semikvantitatiivinen RT-PCR- ja Western blot-analyysi, vastaavasti. Kun verrataan valetransfektoidun ohjaus Uutteiden otteita sekä A549 ja Calu-6-solut transfektoitu erityisiä siRNA osoitti vähentynyt selvästi ekspressiotasot kohdegeenien (kuviot. 1B ja 1C). Kuten odotettua, SF2 /ASF siRNA transfektio ei vaikuttanut tasoa hnRNP A1 /A2, ja päinvastoin.

(A) Kaavamainen piirros, joka esittää kolmen silmukointimuunnoksen FL-IRF-3 (täyspitkän IRF -3), tyypin I (vain E2 syrjäytyminen) ja tyypin II (sekä E2 ja E3 syrjäytyminen) isoformit. E, eksoni. IRF-3 eksonit 1-4 on numeroitu. Musta kiinteä viiva edustaa intronit. Nuolet yläpuolella selostukset näyttää sijainnin erityisten alukesarjoista suunniteltu RT-PCR-analyysi IRF-3 silmukoitumisvariantteja. (B) Jatkaminen factors hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF depletoitiin erityisillä siRNA transfektiolla ihmisen NSCLC soluissa A549 ja Calu-6, vastaavasti. A1, hnRNP A1; A2, hnRNP A2. Yhteensopimattomia ohjaus siRNA käytettiin valetransfektoidun ohjaus. Jälkeen siRNA transfektion ja sen jälkeen Poly (I: C) stimulaatio, solut kerättiin ja semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin, jotta niiden vaikutus RNA häiriöitä ilmentymisen kohdegeenien ja IRF-3 silmukoitumisvariantteja. Tuotteet vastaavat FL-IRF-3 ja sen kahdenlaisia ​​silmukoivat (tyyppi I ja II) on osoitettu nuolilla. Kaikki reaktiot, kokonais-RNA uutettiin A549-soluja ilman käänteistranskriptio käytettiin negatiivisena kontrollina. PCR-tuotteiden FL-IRF-3, tyyppi I ja tyyppi II isoformit kvantitoitiin TotalLab Quant skannauksen. Kuvaaja osoittaa suhde isoformin FL /(FL + I + II), ja arvot ovat keskiarvoja ± SD n = 3 kokeissa. (C) Western blot -analyysi suoritettiin vasta-aineiden kanssa proteiinien osoitettu oikealla. Proteiini bändejä IRF-3 myös määrällisesti ja normalisoitiin sisäisen valvonnan Actin. Käyrä osoittaa suhde IRF-3 /Actin ja arvot ovat keskiarvoja ± SD n = 3 kokeita.

#

P

ja

##

P

0,05 verrattuna valetransfektoidun A549 ja Calu-6 solua, vastaavasti.

Niistä IRF-3 silmukointivariantit, IRF-3b, -3c, -3D, ja -3f menettää eksoni 2 tai molempia eksonin 2 ja eksonin 3 [37]. Analysoimaan muutosta vaihtoehtoisen silmukoinnin IRF-3 siRNA-transfektoiduissa soluissa, RT-PCR-monistus IRF-3 suoritettiin käyttämällä spesifistä aluketta, joissa on eteenpäin aluketta, joka sijaitsee eksonissa 1 ja käänteisaluketta eksonissa 4. Kuten kuvioissa. 1A ja 1B, täyspitkä IRF-3 (FL-IRF-3) ja sen kahdenlaisia ​​silmukoivat (Tyyppi I: vain eksonin 2 syrjäytymistä ja tyyppi II: sekä eksonin 2 ja eksonin 3 syrjäytyminen) luotu kolme kaistaa: 500 emäsparia (E1 + 2 + 3 + 4), 327 bp (E1 + 3 + 4), ja 155 bp: n (E1 + 4) pituus, vastaavasti. Kuten A549-soluja, yhdistetyn ehtyminen hnRNP A1 ja hnRNP A2 ja yksi ehtyminen SF2 /ASF johtivat molemmat ilmeinen väheneminen FL-IRF-3 mRNA, 67%: sta 9% tai 11%, ja samanaikainen kasvu mRNA Tyyppi I ja II isoformit (Fig. 1 B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä Calu-6-solut, joissa pudotus on hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF tuloksena laskua 91%: sta 13% tai 15% FL-IRF-3 mRNA: ta (Fig. 1 B). Yhden hnRNP A1 tai hnRNP A2 ehtyminen suoritettiin myös NSCLC soluissa ja osoitti mitään vaikutusta IRF-3 silmukoinnin (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukainen RT-PCR-tuloksiin, hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF ehtyminen johti ilmeinen väheneminen ekspressiotasot IRF-3-proteiinin sekä A549- ja Calu-6 solua (Fig. 1 C).

tutkimiseksi suoremmin spesifisyys hnRNP A1 /2 tai SF2 /ASF ehtyminen ja eksonin ohitus IRF-3 pre-mRNA, käytimme siRNA tyhjentämiseksi PTB, toinen runsas negatiivinen säätelijä vaihtoehtoisen silmukoinnin. PTB ehtyminen ei osoittanut vaikutusta silmukoinnin IRF-3 (kuviot. 2A ja 2B).

Jatkaminen tekijä PTB oli tyhjentynyt erityisillä siRNA transfektiolla ihmisen NSCLC soluissa A549 ja Calu-6. Yhteensopimattomia ohjaus siRNA käytettiin valetransfektoidun ohjaus. Jälkeen siRNA transfektion ja sen jälkeen Poly (I: C) stimulaatio, solun kokonais-RNA: ta ja proteiinia, kerättiin ja testattiin semikvantitatiivinen RT-PCR: llä (A) ja Western blot -analyysi (B) tutkia ekspressiotasot kohdegeenien ja IRF- 3 silmukointivarianttien osoitettu oikealla. RT-PCR-reaktioissa, kokonais-RNA uutettiin A549-soluja ilman käänteistranskriptio käytettiin negatiivisena kontrollina. Kaikille RT-PCR ja Western blot-analyysi, Actin käytettiin sisäisenä kontrollina.

hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sitoutuvat spesifisesti sekvenssit IRF-3 Intron 1

johtuen tunnistamisen hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sidosmotiivien välittömästi ylävirtaan IRF-3 eksoni 2 5 ’silmukoitumiskohta (Fig. 3A), me tutkia tarkemmin mahdollisuutta, että hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sitoutuvat spesifisesti näiden sitovia motiiveja. Fuusioproteiinit GST-hnRNP A1 ja GST-SF2 /ASF esittivät IPTG induktion ja puhdistettiin Glutathione Sepharose 4B (Fig. 3B). GST-fuusioproteiinit inkuboitiin biotinyloidun RNA-koettimia, jotka sisältävät UAGGGA tai GGAAGGA sekvenssit IRF-3-introni 1, ja EMSA-analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, selkeä muutos bändit havaittiin GST-hnRNP A1 ja GST-SF2 /ASF proteiineja. Edelleen G3C mutaatio UAGGGA motiivin ja G2C mutaatio GGAAGGA aihe johti suuriin lasku hnRNP A1 ja SF2 /ASF sitova. Nämä tiedot vahvistivat läsnä hnRNP A1 /A2 ja SF2 /ASF sitoutumiskohdat ylävirtaan eksonin 2 5 ’liitos sivusto IRF-3 pre-mRNA: n.

(A) sekvenssit intronin 1 (439-462) ja introni 1 (558-600) ja IRF-3. N oletettu sitoutumiskohtia hnRNP A1 /A2 (wt-A1) tai SF2 /ASF (wt-SF2) on lihavoitu kursiivilla. G3C mutantti sitoutumiskohdan hnRNP A1 /A2 (mu-A1) sekä G2C mutantti sitoutumiskohdan SF2 /ASF (mu-SF2) on alleviivattu. (B) Fuusio proteiineja GST-hnRNP A1 (GST-A1) ja GST-SF2 /ASF (GST-SF2) esittivät IPTG induktion ja puhdistettiin glutationin Sepharose 4B. (C) Kaksikymmentä nanogrammaa kunkin GST, GST-A1, ja GST-SF2-proteiinia käytettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä biotinyloidulla RNA-koettimia WT-A1 tai wt-SF2 ja niiden mutantti johdannaiset.

IRF-3 minigeenit kanssa mutaation hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF sidosmotiivien Kasvata poissulkeminen eksonit 2 ja 3

tutkimaan edelleen roolit hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF sidosmotiivia silmukoinnin säätely IRF -3-geeni, IRF-3 minigeeneillä, jotka sisältävät villin tyypin tai mutantti-hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF sitovat motiivit rakennettiin ja transfektoitiin A549-solut (kuviot. 4A ja 4B). Suhteellinen ekspressiotasot IRF-3-isoformit mitattiin RT-PCR-analyysillä. Verrattuna villityypin minigeenin transfektion mutaatio hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF sitoutumiskohtia johtanut ilmeinen suhde pieneni isoformin FL /(FL + I + II), 79%: sta 23% tai 28% (molemmat

P

0,05), vastaavasti, kuten on esitetty kuvioissa. 4B ja 4C.

(A) Villityypin (wt) ja mutantti (MU) versiot IRF-3 mini- geenin näkyvät. Pcmv, promoottori pcDNA3.0-vektoriin. pA, polyA-signaali. IRF-3 eksonit 1-4 on numeroitu. Musta kiinteä viiva edustaa intronit. (B) Ohimenevä transfektio paino–IRF-3 tai mu-IRF-3 minigeeneillä suoritettiin A549-soluja ja suhteellinen ekspressiotasot IRF-3-isoformit mitattiin RT-PCR-analyysillä. (C) Kaavio osoittaa suhde isoformin FL /(FL + I + II), ja arvot ovat keskiarvoja ± SD n = 3 kokeissa.

#

P

ja

##

P

0,05 verrattuna wt-IRF-3 mini- geenin transfektio.

siRNA-välitteinen väheneminen of hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF Vähentää Expression of IRF-3 alavirtavaikuttajainhibiittorit Molekyylit IFNp ja IP-10

tutkia vaikutusta IRF-3 vaihtoehtoisen silmukoinnin säätelee knockdovvn hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF ilmentyminen IRF-3-indusoituvan geenit, olemme eristettiin kokonais-RNA: A549 ja Calu-6-solut sen jälkeen, kun erityinen siRNA transfektion ja sen jälkeen Poly (I: C) stimulaatio ja suoritettiin semi-kvantitatiivinen RT-PCR analysoida ekspressiotasoja IFNP ja IP-10-geenit. Lisäksi supernatantti soluviljelmästä kerättiin myös ja IFNp ja IP-10-proteiinit tutkittiin ELISA-määrityksellä käyttäen anti-IFNp tai anti-IP-10-vasta-aineita, vastaavasti. Kuten kuvioissa. 5A ja 5B, A549 ja Calu-6-solut ilman Poly (I: C) stimulaatio oli hyvin vähäinen ekspressiotasot IFNp ja IP-10, verrattuna soluihin, joissa Poly (I: C) stimulaatio. Kuten odotettua, alas-säätely IFNP ja IP-10-geenien sekä mRNA ja proteiini tasoilla rinnastettiin merkittävästi vähentynyt ekspressiotasot IRF-3-proteiinin sekä A549- ja Calu-6-solut transfektoitu hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF siRNA (kuviot. 1C, 5A, 5B).

A549 ja Calu-6-solut tehtiin erityinen siRNA-välitteisen knockdovvn hnRNP A1 /A2 tai SF2 /ASF. Mock, transfektoitu paritonta ohjaus siRNA. Ohjaus, soluja ilman erityisiä tai mock siRNA transfektiota ja Poly (I: C) stimulaatio. (A) Kun siRNA transfektion ja sen jälkeen Poly (I: C) stimulaatio, mRNA ilmaus IFNp ja IP-10-geenit analysoitiin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä. Kokonais-RNA eristettiin A549-soluja ilman käänteistranskriptio käytettiin negatiivisena kontrollina. (B) eritys IFNP (ylhäällä) ja IP-10 (alhaalla) proteiinit tutkittiin ELISA-määrityksellä. Arvo jokaisessa määrityksessä esitetään keskiarvo ± S.D. Kuten on esitetty kuviossa.