Krooninen sairaus

tiivistelmä

laatineet aerosoli perustuva demetylaatio hoito saavuttaa terapeuttista tehoa syöpää edeltäviin tai in situ vaurioita keuhkosyöpään, ilman systeemistä toksisuutta. Optimaalinen hoito aerosolisoituneen atsasytidiini (atsa) suunniteltiin ja käytettiin potilaalle tehdä ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ksenograftimalleissa. Terapeuttinen tehokkuus ja toksisuus aerosolihiukkasten Aza verrattiin intravenoosisesti Aza. Havaitsimme, että 80% pisaroiden aerosoli Aza mitattu ~0.1-5 mikronia, mikä johti laskeuma alemman keuhkoputkien hengitysteihin. Eläinmallissa, että phenocopies alalla carcinogeneisis ihmisillä on kehitetty intratrakeaalisessa inokulaation ihmisen keuhkosyövän soluja hiirissä, mikä johtaa niiden jakaminen koko hengitysteiden tilaa. Aerosolized Aza merkittävästi lisäsi elinaikaa hiirillä endo-keuhkoputken keuhkokasvaimia. Aerosoli hoito ei aiheuta mitään havaittavissa keuhko- toksisuutta tai systeemistä toksisuutta. Ennalta Farmakokineettinen tutkimus hiirillä osoittivat, että keuhkodeposition aerosolisoituneen Aza oli huomattavasti suurempi kuin laskimoon. Keuhkokasvaimia resekoitiin jälkeen aerosoli hoidon ja metylaatiotasot 24 edistäjiä kasvaimeen suppresser liittyvistä geeneistä keuhkosyöpään analysoitiin. Aerosoli Aza vähensi metylaation tason 9 näistä promoottoreista ja reexpressed useita geenejä testattu. Johtopäätöksenä aerosoli- Aza ei-sytotoksisia annoksia näyttää olevan tehokas ja johtaa DNA demetylaatio ja tuumorisuppressorigeeniä uudelleen ilme. Terapeuttinen indeksi aerosoli Aza on 100-kertainen laskimoon Aza. Nämä tulokset antavat prekliinisissä perustelut vaiheen I kliinisen tutkimuksen Aerosolin Aza aloitettava meidän Institution.

Citation: Qiu X, Liang Y, Sellers RS, Perez-Soler R, Zou Y (2014) Aerosoli atsasytidiini Estää Orthotopic keuhkosyövässä hiirissä kautta DNA Demetylaatio ja Gene uudelleenaktivointi Effects. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10,1371 /journal.pone.0109874

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 12 syyskuu 2014; Julkaistu: 27 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukee NIH avustuksen 5R01CA154755. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä vaatii 1,4 miljoonaa ihmishenkiä vuosittain (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html) [1], [2]. Keuhkosyöpä esiintyy seurauksena kumulatiivisen vahinkoa keuhkoepiteeliverrokkiin aiheuttamaa hengitettynä syöpää aiheuttavia aineita. Koska kumulatiivinen vahinko vaikuttaa koko hengitysteiden, vaurioitunut hengitysteiden epiteelin on altis kehittää uusia primaarikasvainten aikana yksilön eliniän [3]. Kaikki ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC) on peräisin keuhkoputken epiteelin kattavat suuria tai pieniä hengitysteihin aiheuttaen keskus- tai reuna-kasvaimia. Esimerkiksi levyepiteelisyöpä keuhkosyövän useimmiten syntyvät keskitetysti suuri keuhkoputkien, keuhkojen adenokarsinooman tyypillisesti kehittää perifeerisesti pienemmissä hengitysteissä, ja suuri solu keuhkokarsinoomia voi syntyä kummassakaan paikassa. Kuitenkin kaikki kasvaimet ovat peräisin transformoitujen hengitysteiden epiteelisolujen. Siksi valikoiva terapeuttisen intervention kasvainten rajoittuvat hengitysteihin olisi tehokkaasti estää tai viivästyttää niiden muodostumista aiheuttamatta systeemistä toksisuutta [4] – [7]. Valitettavasti ei hoitoja erityisesti suunnattu keuhkoputken epiteelin ovat tällä hetkellä saatavilla.

Tietoisuuden lisääminen alalla epigenetiikka ja syövän synnyn on johtanut siihen päätelmään, että poikkeava epigeneettisellä muutokset on tärkeä rooli aikana keuhkojen syövän synnyn; Lisäksi nämä muutokset säilyvät läpi koko prosessin sairauden etenemisen [8], [9]. Esimerkiksi vaimentaminen tuumorisuppressorigeeneille (APT) poikkeava hypermetylaation on todettu olevan tärkeä rooli syövän aloittamisen ja kehittämisen useita syövän tyypit [10] – [19]. TSG-promoottorin hypermetylaatio on myös osoitettu korreloivan huonon ennusteen ja kestävyys kemoterapiaa [20] – [26]. Erityisesti kaikki geneettiset vaurioista keuhkosyövässä, mukaan lukien p53 ja K-ras-mutaatioiden, voisi olla seurausta poikkeavasta epigeneettiset muutokset [10], [27], [28]. Epigeneettiset korjaantuvat karsinogeenisia tapahtumat [10], [29]. Syöpä-spesifisyys näiden epigeneettiset muutokset tekee niistä ainutlaatuisia tavoitteet erityisiä epigeneettisellä hoitoihin [30]. Siksi oletamme, että kohdistamalla hengitystiet epiteelin demetyloivan aineen aerosolina, voimme vaikuttaa suotuisasti Natural History keuhkosyöpään.

Aiemmin havaitsimme, että hypermetylaation että promoottorialueen Rassf1 geenin ihmisen NSCLC solulinja H226 voidaan kumota demetyloiva agentti atsasytidiini (atsa). Olemme myös osoittaneet, käyttäen kliinisesti merkittävää eläinmalli kehittämiä meidän lab, että henkitorven sisään injektio (samanlainen muoto paikallishallinnon koska aerosoli) ja Aza alemmilla toksisilla annoksilla voi lisätä eloonjäämistä hiirten ortotooppisesti istutettu H358 ja H460 keuhkosyövän [31 ], [32]. Tämä kliinisesti merkittävää eläinmallissa proof of concept että hengitysteiden kohdennetut epigeneettisellä hoito saattaa olla hyötyä ehkäisyssä ja hoidossa varhaisen NSCLC. Kirjoittajat raportoivat tehokkuudesta aerosolisoituneen Aza hoidossa potilaalle tehdä ihmisen NSCLC ksenograftimalleja hiirissä sekä Hoidon tehoa on demetylaatioon promoottorit Aitojen perinteisten kasvainkudoksessa. Valaisemiseksi epigeneettiset terapeuttinen mekanismeja, me resektoitiin kasvain kudokset ksenosiirrettyjä käsiteltyjen eläinten aerosoli Aza, analysoi metylaatiostatuksen promoottorit 24 keuhkosyöpään liittyviä APT, ja määritetään proteiinin ekspressiotasot näiden geenien osoitti merkittäviä promoottori demetylaatio jälkeen aerosoli Aza hoito.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

Ihmisen NSCLC solulinjat H226, H358, ja H460 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja ylläpidetään 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

Eläimet

Male ja naispuolinen ICR ja Kateenkorvattomia nude-hiiriin, ikä 6-8 viikkoa (Harlan) pidettiin eläimen laitokseen Albert Einstein College of Medicine. Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla (Protocol Number: 20130312) hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Albert Einstein College of Medicine. Selviytymisen tutkimuksessa eläimiä tarkkailtiin päivittäin. Humane päätepisteet käytettiin tämän tutkimuksen aikana: kuolemaisillaan oli inhimillisesti lopetettiin. Käytimme kahta kriteeriä tunnistamaan kuolemaisillaan olevat eläimet perustuvat eläinten käyttö protokolla: 1) hiiri on hengitysvaikeuksia, syöminen, tai juominen; 2) hiiren menettää ≥15% painon 4 päivää. Hiiret lopetettiin CO2 hengitykselle kammiossa seuraa verenlasku. Anestesia käytetään minimoimaan epämukavuutta intratrakeaalinen injektioita.

Intratrakeaalinen injektio

henkitorvensisäistä (IT) injektion, boluksena soluja suspensiossa tai huumeiden injektoitiin henkitorveen. Menettely, jota käytetään IT injektiota on kuvattu aiemmin meille [33]. Lyhyesti, hiiret nukutetaan kanssa Isofluraania höyrystin 2,5% isofluraania toimitetaan 2,0 PSI happea ja immobilisoidun käyttäen kiinnityslaitteella. Suu avataan pihdit ja pieni putkimainen kevyt laite asetetaan suuhun paikantaa henkitorven, jos tarvitaan. 22-G syöttöneulaa kiinnitetty 1 ml: n ruiskuun, joka sisälsi solususpensiota tai lääkeliuos lisätään henkitorveen. Noin 3 ui liuosta /g kehon paino on sitten pistetään henkitorveen. Hiiri vapautuu lähestymiskielto laitetta menettelyn päättymisen ja noudatettava, kunnes täydellinen toipuminen anestesiasta.

Orthotopic endobronkiaalinen keuhkosyöpä ksenograftimalleja

Kateenkorvattomia nude hiiret nukutettiin edellä kuvatulla ja ihmisen NSCLC syöpäsoluja suspensiota varovasti ympättiin henkitorven (noin 2-4 x 10

6 solua /hiiri) käyttämällä edellä kuvattua menetelmää. Näissä malleissa useita kasvaimia kasvaa sisällä keuhkojen hengitysteihin. Elinikä eläinten korreloi kasvaimen taakkaa, joka liittyy koko inokulaattia.

Aerosoliformulaatio

atsasytidiini (Sigma) liuotettiin steriiliin normaaliin suolaliuokseen 10 mg /ml juuri ennen annostelua. Aerodynaaminen koko aerosoli Aza määritettiin puristamiseen-sademäärä menetelmä käyttäen 7-Stage kaskadierottimen liittyy PARI n sumutinta järjestelmän valmistajan ohjeiden mukaisesti [34]. Aerosolina. Aerosoli tuotettiin käyttämällä PARI henkilökohtainen kompressori ja LC Star sumutinta järjestelmään. Aerosoli sukupolvi oli noin 0,25 ml /min. Nenä-vain valotusta järjestelmä (CH Technologies Inc. Westwood, NJ), jotka liittyvät PARI n aerosoli, joka on kiinni kemiallinen huppu käytettiin aerosolina annettavaksi hiirille. Aerosoli hallinto aika (min) (T) oli tiukasti kontrolloitua. Aerosoli annos talletetaan keuhkoihin (mg /m

2) (D) laskettiin kertomalla valotusaika (min), jonka aerosoli sisäänhengitysnopeus (ml /min) (R) ja lääkeaineen pitoisuus (mg /ml) (C), kuten on kuvattu aiemmin meille [34], eli D = TRCI /W, missä I on kehon pinta /painoindeksin (mg /m

2: mg /kg) (3 hiirtä) ja W on eläimen kehon paino (kg). Aikaisemmassa tutkimuksessa, mittasimme aerosoli sisäänhengitysnopeus hiirillä, määritellään tilavuus aerosoli nesteen talletetaan hiiren keuhkoissa 1 min 10

-4 ml /min 25 g hiiri [34]. Haluttu kerääntynyt annos saavutetaan ohjaamalla aerosoli kun T = DW /RCI. Esimerkiksi aerosoliannostus aika talletettu annoksella 2,5 mg /m

2 on 25 gm hiiri käyttäen 10 mg /ml Aza pitoisuus ratkaisu on T = 2,5 x 0,025 /10

-4 × 10 × 3 = 20,83 min.

Toksisuustutkimuksia

ICR (6 /ryhmä) käsiteltiin aerosoli Aza 2,5 tai 75 mg /m

2 päivässä x 7 päivää. Yksi ryhmä hiiriä käsiteltiin IT Aza suurimmalla siedetyllä annoksella 270 mg /m

2 positiivisena kontrollina keuhkojen myrkyllisyys. Keuhkot resekoitiin 7 päivää sen jälkeen, kun viimeinen aerosolina. Keuhkojen myrkyllisyys määritettiin patologisen arvioinnin (3 keuhkot /ryhmä) käyttäen aiemmin kuvatun menetelmän [34]. Lisäksi elinkelpoisuus hengitysteiden epiteelisolujen määritettiin myös (3 keuhkot /ryhmä). Lyhyesti keuhkokudoksen pilkottiin LiberaseÖ (Roche) ja suodatettiin, jolloin saatiin yksittäisten solujen suspensio, joka oli leimattu anti-hiiri-Ep-CAM-vasta-ainetta ja fluoresenssi-konjugoitua vuohen anti-rotta-sekundaarista vasta-ainetta (Biolegend, San Diego, CA), ja lajitellaan virtaussytometrialla. Prosenttiosuus elävien solujen määritettiin syrjäytyminen 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-värjäystä. Systeeminen toksisuus määritettiin mittaamalla veren solumäärät indikaattorina myelosuppression (suuret myrkyllisyyttä IV Aza) [35]. Verinäytteet otettiin ajankohtana eutanasia sydänpunktiolla 7 päivää viimeisen käsittelyn jälkeen. Kokonaismäärä valkosolujen (WBC) määritettiin poistamisen jälkeen punaisten verisolujen kuten aiemmin on kuvattu [32].

Pre-farmakokineettisen tutkimuksen

Normaali ICR-hiirille annettiin aerosoliksi Aza 2,5 mg /m

2 käyttäen edellä kuvattua menetelmää. Kussakin suunniteltu aikapisteessä (5 min, 20 min, 2 h, 6 h ja 24 h), kolme hiiret lopetettiin ja niiden keuhkot resekoitiin jälkeen oikean kammion perfuusion suolaliuoksella. Atsasytidiini keuhkoihin uutettiin ja määrällisesti mitattuna aiemmin raportoitu menetelmä, jossa käytetään LC-MS-järjestelmä [36]. Kvantitatiivinen havaitseminen suoritettiin Millis Scientific Inc. herkkyys oli 1 ng Aza /ml näytettä. AZA pitoisuus kudoksessa vs. aika analysoitiin ja simuloituja parhaiten sopivalla (korkein R

2 arvo) alle Microsoft Excel-ohjelman. Yhtälö on simuloitu käyrien C = f (t) käytettiin laskettiin AUC 0-24 tuntia AUC = ∫

0-24 f (t) dt. Korkeimmillaan aika (T) ja huippupitoisuus saatiin suoraan havainnointia käyriä.

kasvaimenvastainen teho

Kymmenen päivän kuluttua henkitorvensisäinen ymppäyksen kasvainsolujen, nude-hiiret jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään (6 hiirtä /ryhmä): 1) aerosolin Aza 2,5 mg /m

2 vuorokaudessa 7 päivän, 2) aerosolin normaalia suolaliuosta (ajoneuvo) vuorokaudessa 7 päivän, 3) tai IV atsa 75 mg /m

2 päivittäin 7 päivän ajan. Tässä selviytyminen tutkimuksessa eläimiä tarkkailtiin päivittäin. Humane päätepisteet eutanasian (edellä) käytettiin tämän tutkimuksen aikana ja kuolemaisillaan hiiret humaanisti lopetettiin ja hiiriä ruumiinavaus. Lisääntynyt elinikä (% ILS) [37] avulla arvioitiin tehokkuuden Kunkin testatun aineen.

Histologia keuhkosyöpään ksenograftien

Hiiret päässä antituumoritehoon tutkimus suoritettiin ruumiinavaus kuoleman jälkeen ja keuhkojen ja kasvainten näytteitä histologia kerättiin ja sijoitettiin 10% hermo puskuroituun formaliiniin. Näytteet siirrettiin 70% etanolia ja toimitettiin histologia ja vertaileva patologia resurssin Einstein tavanomaisesta jalostuksesta parafiinia. Leikeltiin 5 pm, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,5 mm) kappaleiksi Eppendorf-putki homogenisaattorilla. Jokainen kasvain näyte jaettiin kahteen erään: yksi metylaatiomääritystä ja toinen western blot. Metylaatiostatuksen promoottorialueiden 24 tuumorisuppressorigeeneille mukana keuhkojen karsinogeneesissä mitattiin käyttämällä metylaation qPCR array menetelmä Qiagen (SA Bioscieces), kuten aiemmin on kuvattu [38].

analyysi proteiinin ekspression keuhkotuumoreissa

toinen näyte keuhkojen kasvain näytteitä käytettiin määrittämään proteiinin ekspression APT. APT osoittaa merkittävää promoottori demetylaation jälkeen aerosoli Aza hoidon analysoituna Metylointilaitteistoon qPCR array valittiin arvioitavaksi western blot. Pakastetut kudokset homogenisoitiin kylmässä RIPA puskuriin proteaasiestäjäseostabletit (Sigma) käyttäen käsi-homogenisaattoria, minkä jälkeen käsittelemällä ultraäänellä. Proteiini Näytteet valmistettiin Western blot jälkeen rutiini protokollan Life technologies (Grand Island, NY). Ensisijainen vasta-aineita ihmisen H-kadheriinin, OPCML, Rassf1a (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), ja beeta-aktiini (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin tunnistamaan kohdennettuja proteiineja. LI-COR C-numeroinen Blot Scanner käytettiin skannaukseen western blotit; nauhojen analysoitiin Image Studio ohjelmisto (LI-COR). Tiheys suhde kohdeproteiinin vs. aktiini loading kunkin näytteen kontrollina käytettiin esittämään proteiinin ekspressiotasot semi-kvantitatiivisesti.

Tilastollinen analyysi

Erot eri ryhmien analysoitiin kahdella puolella log-rank (Mantel-Cox) testi. Ero oli tilastollisesti merkitsevä, kun p 0,05.

Tulokset

Orthotopic NSCLC mallit

NSCLC on sairaus hengitysteiden epiteelin seurauksena jatkuvan altistumisen ilmassa karsinogeenien . Jotta jäljitellä tätä erityisesti kasvaimen kasvua hengitysteiden in ksenograftimallia, me henkitorveen siirrostettiin ihmisen NSCLC-solujen suoraan hengitysteihin, ja sitten verrataan tässä tilassa elinsiirtojen IV kasvainsolujen injektion nude-hiiriin. Histologinen tutkimus keuhkojen osoitti, että kasvaimen levinneisyys ja kasvun malli oli samanlainen kuin ihmisen keuhkosyöpä IT implantaatiomallissa: suurin osa syöpäsolujen siementen pinnalle hengitysteiden epiteelin noin viikon kuluttua implantaatiosta. Vuoteen 3 viikkoa, pieni limakalvon kasvain kyhmyt olivat sijaittava hengitysteiden tai keuhkojen kudosta vieressä hengitystiet, jotka osoittavat pää- kasvaimen kasvua hengitysteiden ja invaasio on keuhkoparenkyymistä (kuvio 1 ylärivi). Kasvaimen kasvu ja koko ovat solujen line- ja inokulaatti koko- riippuvainen. Kokemuksemme mukaan H460 (suuri karsinooma) kasvaimia kehittyi nopeammin kuin H358 (bronchioalveolar karsinooma) ja paljon nopeampi kuin H226 (okasolukarsinooma), kun ympättiin IT hiirillä. Koska mitään väliintuloa, hiiret periksi keuhkokasvaimia päivän välillä 40 ja 102. ei ollut tunnistettavissa kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Sen sijaan, lähes kaikki näkyvä /havaittavissa IV istutettiin syöpäsoluja kylvetään kapillaarijärjestelmän keuhkojen ja suhteellisen kaukana hengitysteiden (kuvio 1 alin rivi), jotka muistuttavat enemmän metastaattisten kasvainsolujen siirtymisestä muista elimistä keuhkoihin. Kasvaimia kehittyi nopeammin jälkeen IT istutusta, ja hiiret yleensä kuoli päivinä 35-68 (tietoja ei esitetty). Tuloksemme viittaavat siihen, että IT implantaatio on sopivampi potilaalle tehdä ksenograftimallia varten jäljittelee ihmisen NSCLC kuin IV mallia tai muita kohdunulkoinen malleja.

malli luotiin henkitorveen ruiskuttamalla NSCLC H460 soluja nude-hiiriin. Top: H E värjättyä keuhkoleikkeissä IT ympätty hiiriin päivänä 35. kasvaimet (T) syntyä hengitysteihin ja kasvaa visinaalisesti osaksi keuhkoparenkyymistä. Pohja: H E värjättyä keuhkoleikkeissä päässä IV ympätty hiiriin päivänä 35. kasvaimet syntyä pieniä aluksia keuhkoparenkyymistä. Tavoitteena suurennus oli 40X. Asteikko palkit olivat 50 pm.

Aerosoliformulaatio

Olemme kehittäneet aerosoliformulaationa prototyyppiseen demetylaation agentti, atsasytidiini (Aza). Formulaatio koostuu Aza ja injektio puhdistettuun normaalia suolaliuosta tai vettä. AZA teho voidaan nopeasti liuottaa ( 30 s) vesiliuokseen juuri ennen aerosolina. On ehdotettu, että aerosolipisaroille 5 um, etenkin 3 pm, halkaisijaltaan talletus yleisimmin alempiin hengitysteihin ja siksi sopivat farmaseuttisen hengitysteitse aerosolivalmisteiden ihmisen [39] [40]. Mittasimme aerodynaamisen koon Aza aerosolivalmisteen alle meidän aerosolinmuodostusta järjestelmän kanssa puristamiseen-sademäärä menetelmä [34], ja havaittiin, että noin 80% pisaroista (paino%) oli välillä 0,25-5 um, ja noin 71% välillä 0.25~3 um (kuvio 2). Tuloksemme viittaavat siihen, että noin 71~80% pisaroiden tulisi tallettaa distaalisessa hengitysteiden ihmisellä [39] [40].

T määritetään puristamiseen-sademäärä menetelmä käyttäen 7-Stage kaskadierottimen liittyy PARI n henkilökohtainen kompressori ja LC tähden sumutinta järjestelmään. Atsa-liuosta (4 ml) aerosolisoitiin klo ilmavirran nopeudella 5 l /min. Tiivistetty aerosoli kerättiin 3 eri aikavälein, 1-1,5 min, 3-3,5 min, ja 5-5,5 min. Aerodynaaminen koko ja osa aerosoli tietyn kokoluokan mitattiin ja laskettiin valmistajan protokollan mukaisesti. Aineisto oli keskiarvo ± keskihajonta aerodynaamisen painoon perustuvan (kiinteät pylväät) ja kumulatiivinen paino (tyhjä palkit) 3 erilliselle kokeelle.

myrkyllisyyttä ja annosvalinnan

Mistä edellisessä tutkimuksessa olemme oppineet, että tehokas demetylaation pitoisuus Aza varten viljeltyjen solujen voisi olla 3 tukit pienempi kuin sen IC

50. Antitumoorinen tehokas annos (7,5 mg /m

2 x 3) intratrakeaalisessa injektio Aza hiirimallissa ei aiheuttanut keuhko- myrkyllisyyttä tai havaittavissa systeeminen välitön myrkyllisyys, ja keuhkojen myrkyllisyys tapahtui vain suurimmalla annoksella 270 mg /m

2, joka oli suurin siedetty annos IV injektiona [32]. Näiden tulosten perusteella, valitsimme annos aerosoli Aza että meillä ennusti olisi demetylaatio funktio ja terapeuttinen teho ilman merkittävää toksisuutta. Tulokset osoittavat, että valitut aerosoli annoksella 2,5 mg /m

2 (noin 21 min aerosoli altistuminen 25 g hiiri) vuorokaudessa 7 päivän tai korkeamman henkitorven sisään bolusinjektiona annoksella 75 mg /m

2 5 päivää ei aiheuttanut mitään havaittavaa keuhkojen myrkyllisyys (arvioitiin histologisesti) tai systeemisen toksisuuden (mitattuna myelosuppressio) päivänä 7 viimeisen antamisen jälkeen (kuvio 3A, B). Keuhkotoksisuutta (keuhkotulehdus) (kuvio 3C) ja myelosuppression (kuvio 3D) vain tapahtui, kun hiiret saivat korkeimman annoksen laskimoon tai henkitorven sisään injektiona Aza 270 mg /m

2 (MTD laskimoon Aza). Vastaavasti, aerosoli Aza valitun terapeuttisen annoksen ei aiheuttanut kuolemaa hengitysteiden epiteelisolujen määritettiin virtaussytometrialla, verrattuna positiiviseen kontrolliin käsitellyillä hiirillä, joilla on korkein IT annosta Aza 270 mg /m

2 ( Kuva 3E).

Lung kohdissa käsiteltyjen hiirien aerosoli Aza 2,5 mg /m

2 x 7 (A), IT Aza 75 mg /m

2 x 7 (B), ja IT Aza 270 mg /m

2 x 5 (C), tässä järjestyksessä osoita mitään toksisuutta 2,5 ja 75 2,5 mg /m

2 mutta keuhkotulehduksen 270 mg /m

2. Tavoitteena suurennus oli 40X. Asteikko palkit olivat 50 pm. Veren valkosolujen suhde (käsittelyn jälkeen verrattuna ennen hoitoa, n = 6), (D) ja elinkelpoisten solujen prosentuaalinen on järjestetty hengitysteiden epiteelisolujen (n = 6) (E) vastaavasti.

terapeuttinen teho

Systeeminen (IV) antaminen Aza on johtanut vain rajoitetusti tehoa pienisoluista keuhkosyöpää [41] [42], joka on toisteta meidän kokeellisia hiirimalleissa NSCLC käsitelty IV Aza, (kuva 4A-C). On itse asiassa vähän kokeellinen todiste käytön demetylaatio ainetta tehokkaasti estää keuhkosyöpää eläinmalleissa [43] [32]. Yksi mahdollinen syy on, että tämä erittäin epävakaa lääke ei toimittaa tehokkaasti keuhkoihin kasvaimia. Olimme ensimmäinen ryhmä ilmoittaa proof of concept tutkimuksessa, jossa hallinnon Aza suoraan hengitysteihin tehokkaasti lisäsi elinaikaa hiirillä, joilla potilaalle tehdä keuhkosyövässä [32]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme raportoi tuloksista käyttäen aerosoli Aza hoitoon ihmisen potilaalle tehdä NSCLC vastaan ​​hiirissä. Yksi tavoitteistamme oli osoittaa, että mukolyyttisten Aza sen hengitystie-epiteelissä voitaisiin tehokkaasti estää kasvun kliinisesti merkityksellisiä NSCLC malleja. Lisäksi nämä tutkimukset edelleen tarkoitus on tutkia, onko mukolyyttisten demetyloiva aineen voi estää kasvainten kasvua ilmateiden alhaisilla demetylaatio annoksilla sijaan sytotoksisia annoksia (kuvio 4A-C).

Hiiret henkitorveen inokuloitiin jossa solulinjat H226 (A), H358 (B), tai H460 (C) käsiteltiin aerosoli Aza (punainen paksu viiva) 2,5 mg /m

2 päivittäin 7 päivää tai aerosoli ajoneuvo (sininen ohut viiva) samalla määrällä. Hoito IV Aza (katkoviiva) on optimaalinen annos on 75 mg /m

2 päivittäin 5 päivän käytettiin kontrollina. Tilastollinen vertailu eloonjäämiskäyrien suoritettiin Log-rank (Mantel-Cox) testi. P-arvot H266, H358, ja H460 mallit olivat 0,0135, 0,0150, ja 0,0719, vastaavasti. Pre-farmakokinetiikkaa aerosolin Aza (D). ICR hiiriä hoidettiin aerosoli Aza 2,5 mg /m

2. Tiedot kussakin aikapisteessä oli keskimäärin ± keskihajonta prosenttia tietyn /alkuannoksen keuhkoista 3 hiirillä. Yhtälö Kunkin käyrän simuloitiin käyrä parhaiten sopivalla (korkein R

2 arvo) alle Microsoft Excel-ohjelman.

Tuloksemme osoittavat, että matalan annoksen aerosoli Aza pidensi merkittävästi elinikä että hiirillä, joilla keuhkoputkien kasvaimia. Että% ILS ja eloonjäämismediaani oli pidentää 5.1 ja 1.5-, (p = 0,0135), 6.4- ja 1.9- (p = 0,0150), ja 8.9- ja 1.6- (p = 0,0719) kertaiseksi potilailla, joita hoidettiin aerosoli Aza käyttäen annosta yli 20 kertaa pienempi kuin annos käytetty systeemistä hoitoa kontrolliryhmässä, että H226, H358, ja H460 malli, tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että aerosoli anto Aza at demetyloivan, ei-sytotoksisia annoksia on parempi kuin systeemisesti Aza kannalta kasvaimenkasvunestoaktiivisuuteen tehoa.

Pre-farmakokinetiikkaa

Voit selvittää laskeuma of Aza keuhkoissa teimme valmiiksi farmakokinetiikkaa tutkimuksissa in vivo. Injektoitiin laskimonsisäisesti Aza samalla annoksella käytettiin vertailun. Ensimmäisellä kerralla pisteen (3 min, mahdollisimman pian piste), voisimme takaisin -89% alkuperäisestä aerosoliannos keuhkoista. Kuitenkin, kun sama annos annettiin systeemisesti injektiona, huippupitoisuus keuhkoissa oli vain 1,62% alkuperäisestä annoksesta. Alla oleva alue ajan funktiona (AUC

0~24 h) aerosolin Aza oli 15-kertainen suurempi kuin IV Aza (taulukko 1). Aza annettuna molemmat reitit osoitti samanlaista laskua kuvio: nopeaan laskuun ensimmäisten 2 tunnin kuluttua annosta seurasi hitaampi lasku. Aerosolized Aza osoitti hitaampaa lasku hitaammassa vaiheessa kun IV Aza oli viivästynyt korkeimmillaan pitoisuus keuhkoissa (kuvio 4D). Nämä tiedot osoittavat, että aerosolimuodossa Aza on suurempi kudoksen pitoisuus keuhkoissa on ennustettavissa pienempi systeeminen altistus kuin IV Aza.

aerosoli Aza demetylaatio

Sen analysoimiseksi, onko Aza on demetyloivan vaikutus kliinisesti merkittävällä NSCLC malleja, me korjattu keuhkotuumoreiden päässä ksenograftimalleja käsitelty aerosoli Aza tai IV Aza ja määritetään metylaatiostatuksen promoottorialueissa 24 tuumorisuppressorigeeneille, jonka promoottori hypermetylaation on raportoitu merkityksellisiksi keuhkosyöpä kirjallisuus. Normaali keuhkoputken epiteelisolujen eläimistä ilman Aza hoitoa käytettiin metylointi peruskontrolli-. 24 APT valitut ovat APBA1, APC, CADM1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, PRDM2, WR, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, SLIT2, TCF21 ja TGFB1. Olemme havainneet, että 11 24 promoottorit hypermetyloitunut kasvaimen näytteissä 3 eri ksenograftimalleissa, ja että aerosoli Aza voisi demetyloimiseksi joista 5 (kuvio 5A). Vuonna sopimus, IV Aza samalla annoksella ei havaittu demetyloivan vaikutusta (kuvio 5B). Data esitetään kuviossa 5 esittävät metylaation tason havaitaan q-PCR metylaatio array ja ne on esitetty% metylaation koko CG sytosiini tietyn promoottorialueen.

Tumor-hiirille 3 ortotooppinen keuhkosyöpä mallit (H226-xeno, H358-xeno, ja H460-xeno) käsiteltiin aerosoli Aza (A) tai IV atsa (B) 2,5 mg /m

2 päivittäin × 7. Keuhkot resektoitiin 14 päivän kuluttua lopullisen hoidon ja kasvaimen kyhmyt suurempi kuin 1,5 mm eristettiin metylaation havaitsemisen qPCR array tekniikkaa Qiagen (SA Biosciences). Tiedot on% metylaatio koko CG sytosiini erityisen promoottorialueen.

TSG uudelleen ilmentymisen

Jotta analysoida, demetylaation klo promoottorialueen APT voi aktivoida APT, me resekoitu keuhkojen kasvaimet ja mitataan proteiinin ilmentymistä APT joiden promoottorit merkittävästi demetyloitunut jälkeen aerosoli Aza hoitoa. Western blot-määritystä käytetään havaitsemaan geenin ilmentymistä kasvainnäytteissä samasta hiiriä käytettiin demetylaation tutkimuksessa. Valitsimme 5 APT joiden promoottorit merkittävästi demetyloitunut jälkeen aerosoli Aza hoitoa. Huomasimme, että H-Cad ja Rassf1 että H266 kasvaimissa, H-cad, OPCML, ja SFRP1 vuonna H358 kasvaimissa, ja OPCML H460 kasvaimia uudelleen proteiinitasolla (kuva 6A ja B) jälkeen aerosoli Aza hoitoa. Expression näistä APT on osoitettu estävän tai viivyttää syövän kehitystä useita erilaisia ​​syöpiä, kuten keuhko- syöpä. Esimerkiksi olemme raportoineet aiemmin, että menetys H-kadheriinin ihmisen NSCLC liittyy kasvainten muodostumiseen [44]. Promoottorialueen Rassf1a löytyy myös voimakkaasti metyloitu keuhkosyövän [45]. OPCML, laaja tuumorisuppressori perin löydetty munasarjasyöpiä, löytyy metyloituja monissa keuhkosyövän solulinjat [46]. SFRP1 että Wnt-signalointireitin on transkriptionaalisesti vaiennetaan promoottori hypermetylaation NSCLC [47]. Tulokset tästä in vivo tutkimuksessa tarkoita, että aerosoli demetyloivan hoito voi olla tehokkaita estämään endo-keuhkoputken keuhkokasvaimia ja keuhkoputkien syöpää edeltävät vauriot.

Western blotting määritystä käytettiin määrittämään proteiinin ilmentymistä APT merkittäviä promoottori demetylaatio jälkeen aerosoli Aza hoidon tunnistetaan metylointi q-PCR array. Kasvain näytteet olivat samoja, joita käytettiin kuviossa 5; Histogrammi Länsi blotteja (B). Western blot photo films skannattiin ja tiheys suhde kohdeproteiinin vs. aktiini latauskontrollina kunkin näytteen esitettiin proteiinin ekspressiotaso.

Keskustelu

Keuhkosyöpä on katsottu kuten ”geneettinen sairaus” [48], [49]. Kun osoitus siitä, että APT deaktivointi ja onkogeeni aktivointi on keskeinen rooli syövän synnyssä, terapeuttiset ponnistelut ovat vähitellen siirtynyt optimoinnista epäspesifinen säteilyn ja kemoterapia hoitomuotoja, jotka pääasiassa tappaa nopeasti jakamalla solujen kehittää aineita, jotka kohdistuvat erityiset geneettiset muutokset . Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen suora suhde poikkeava epigeneettisellä muutosten ja syövän kehittymisen; se osoittaa, että syöpä on myös osittain epigeneettisestä sairaus. Toisin kuin geneettisiä muutoksia, epigeneettiset muutokset tapahtuvat aikaisemmin syövän etenemiseen ja ovat palautuvia. Siksi terapeuttinen strategia, jonka tavoitteena on kääntää poikkeava epigeneettisellä muutoksiin olisi tehokkaampi strategia kuin keskittymällä käytöstä epäspesifisiä sytostaattien tai kohdistaminen peruuttamattomia geneettisiä vaurioita.

mukaan kentän cancerization mallin [3 ] [50], kaikki keuhkoputken epiteelisolujen kerääntyä epigeneettisellä ja geneettisten vaurioiden kunnes yksi yksittäinen solu hankkii pahanlaatuinen fenotyyppi ja synnyttää invasiivisia kasvain, loput kentän jatkuu kertyvät epigeneettisellä ja geneettisiä vaurioita ja on vaarassa kehittää muita ensisijaisia keuhkosyövässä (toinen esivaaleissa) [51] [52]. Tämän prosessin aikana poikkeava epigeneettiset muutokset, kuten hypermetylaatiota promoottorit Aitojen perinteisten, esiintyy ennen ja aiheuttaa myöhemmin geneettisiä muutoksia, ja ne jatkuvat kasvainsoluissa läpi koko prosessin syövän.

Tällä