Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli c-Crk (CRK) edistää etäpesäke kuvaa hyvin kuitenkin roolia CRK fosforylaation ja vastaava signalointi tapahtumia eivät ole hyvin selitetty. Olemme havainneet CRK-II seriini 41 fosforylaatiota korreloi käänteisesti p120-kateniinin ja E-kadheriinin ilmaisuja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. Siksi tutkimme rooli CRK-II seriini 41 fosforylaatio alas-säätely p120-kateniinin, solun liikkuvuus ja solujen invasiivisuus in NSCLC soluissa. Tätä tarkoitusta varten olemme ilmaistuna phosphomimetic ja phosphodeficient CRK-II seriini 41-mutanttien NSCLC-soluja. NSCLC-solut ilmentävät phosphomimetic CRK-II seine 41 mutantti osoitti alempi p120-kateniinin tason samalla CRK-II seine 41 phosphodeficient mutantti ilmaus johti korkeampiin p120-kateniinin. Lisäksi, A549-solut ilmentävät CRK-II seriini 41 phosphomimetic mutantti osoitti enemmän aggressiivinen haavan paranemista ja invaasio määritykset ja päinvastoin, ilmentyminen phosphodeficient CRK-II seriini 41 mutantti A549-soluja johti vähentyneeseen solun liikkuvuus ja invasiivisuus. Tarjoamme myös näyttöä siitä, että PAK1 välittää CRK-II seriini 41 fosforylaatiota. RNAi välittämä vaiennettu PAK1 kasvoi p120-kateniinin tason A549 ja H157-soluissa. Lisäksi PAK1 hiljentäminen vähentynyt soluliikkuvuus ja invasiivisuus A549-soluissa. Nämä vaikutukset kumottiin vuonna A549-solut ilmentävät phosphomimetic CRK-II seriini 41. Yhteenvetona nämä tiedot saataisiin näyttöä rooli PAK1 edistämisessä solun liikkuvuus, solu invasiivisuus ja alas säätely p120-kateniinin kautta CRK seriinin 41 fosforylaatiota NSCLC-solut.

Citation: Rettig M, Trinidad K, Pezeshkpour G, Frost P, Sharma S, Moatamed F, et ai. (2012) PAK1 Kinase Edistää soluliikkuvuus ja invasiivisuus kautta CRK-II seriinifosforylointi Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 7 (7): e42012. doi: 10,1371 /journal.pone.0042012

Editor: Frederic Andre, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 27 heinäkuu 2012

Copyright: © Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittäminen etäpesäkeleesioita useimmissa kiinteitä kasvaimia johtaa parantumaton tauti nykypäivän hoitomuotoja. Siksi ymmärtää tapahtumat, jotka edistävät kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden auttaa meitä leviämisen estämiseksi pahanlaatuisten kasvainten varsinkin jos varhaisessa vaiheessa ja ehkä oligometastatic sairaus. Jäsenenä vyöliitos, p120-kateniinin (p120ctn) on tärkeä rooli solu-kiinnikkeistä ja menetys p120-kateniinin ilmentyminen johtaa epävakautta kadheriinin-kateniinin kompleksin kautta edistää kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden [1], [2 ], [3], [4],. Ottaen huomioon downregulation p120-kateniinin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on kopiointia ajatellen välittämää [11], tutkimuksen alkupään signalointi tapahtumia, jotka voivat johtaa transkription tukahduttamista

p120-kateniinin (CTNND1),

johtaa meidät sovitin proteiinia CRK ja sen rooli tukahduttaminen p120-kateniinin [12].

c-Crk (CRK) kuuluu perheeseen laajalti ilmaisseet sovittimen proteiineja, jotka osallistuvat signaalin siirtoon useista reseptoreihin ja onkoproteiineja (esim, Bcr-Abl, Tel-Abl, erytropoietiini-reseptori, EGFR, GM-CSF, insuliini-reseptori substraatti, PDGF ja VEGFR [13], [14]). CRK, vuorovaikutuksessa useiden alavirran efektoreja kuten SOS1, DOCK1 JNK1 ja SP1. Tuloksemme osoittavat, että CRK säätelee negatiivisesti

p120-kateniinin (CTNND1) B transkription NSCLC soluissa vuorovaikutuksessa transkriptiotekijä SP1 [12]. Keskeinen asema CRK vuonna signa- vuoksi on todennäköistä, että CRK koskee useita loppupään tavoitteita, muu kuin

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottori, mikä edistää syövän etenemiseen, invaasio ja metastaasi.

lisäksi CRK yli-ilmentymisen kuin esikasvaintekijän ja sen rooli solujen transformaatio, CRK fosforylaatio on myös omiaan edistämään sen biokemialliset aktiivisuuden. Koska sovitin proteiinia, CRK ei sisällä katalyyttistä domeenia, mutta sekä tyrosiini- ja seriini-kinaasi toiminta on liittynyt CRK [15]. Proteiinit fosforyloidun tyrosiinin, seriinin tai treoniinin tähteet olivat havaittavissa immunosaostumassa CRK linnun sarkoomaviruksen (CT10) infektoituja soluja [15]. Tässä tutkimuksessa tuote CT10 viruksen (P47

gag-CRK

) itse myös erittäin fosforyloitiin pääasiassa seriini ja noin viisi prosenttia tyrosiinitähteillä. Useita solunsisäisiä signalointireitteihin osaltaan CRK fosforylaatioon. Esimerkiksi c-Abl fosforyloi Crk tyrosiini 221 aiheuttaen disassociation Crk peräisin Crk liittyvän alustan (CAS) siten estäen solujen vaeltamiseen ja apoptoosin edistämiseksi normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen [16], [17]. Abl on kriittinen toiminto muodostumiseen ja ylläpitoon vyöliitos kuten osoitettiin hiiren alkion fibroblasteissa [18], [19]. Tämä vaikutus Abl on vyöliitos näyttää välittyvät Crk ja Rac1 polku, jotka säätelevät kadheriinin-kateniinin adheesion monimutkainen. Nämä havainnot osoittavat sen, että CRK fosforylaatio on tärkeä rooli solun liikkuvuus ja etäpesäkkeiden edistämiseen.

Mitä tulee CRK seriinifosforyloinnin, kaksi seriini /treoniini-kinaasit, [eli hematopoieettisten esisolujen kinaasi 1 (HPK1; MAP4K1) ja kinaasi homologisia SPS1 /STE20 (KHS, MAP4K5)] jäsenet PAK seriini /treoniinikinaasi superperheelle, tiedetään välittävän fosforylaation CRK perheenjäsenten ja mahdollisesti osallistua CRK välitteisen JNK aktivointi [20], [21] . P21-aktivoitu kinaasien (PAK) ovat tunnettuja säätelijöinä solun tukirangan remontin ja soluliikkuvuus ja vaikuttaa siltä, ​​että PAK-kinaasien on rooli metastaattisen edistämisen pahanlaatuisia kasvaimia [22]. Esimerkiksi endogeenisen PAK konstitutiivisesti aktivoitu tietyissä rintasyövän solulinjat [23] ja ektooppinen ilmentyminen konstitutiivisesti aktivoitua PAK1 in nonmetastatic MCF-7-rintasyöpäsoluissa lisääntynyt solun liikkuvuus [24]. Lisäksi yliekspressio PAK1 äskettäin raportoitu NSCLC, lähinnä levyepiteelikarsinooma [25]. Edellä mainittu vahvasti siihen rooli CRK seriinifosforyloinnin metastaattisessa edistämisessä pahanlaatuisia kasvaimia. Biokemiallisia reittejä, jotka säätelevät CRK seriinifosforyloinnin ja rooli CRK seriinifosforyloinnin metastaasissa edistäminen eivät ole hyvin tutkittu tähän mennessä. Täällä voimme tarjota todisteita siitä, että PAK1 kinaasi välittää CRK-II seriini 41 fosforylaation kautta edistää solun liikkuvuus ja invasiivisuus in NSCLC soluissa.

Tulokset

CRK-II Serine 41 Fosforyloituminen korreloi käänteisesti

p120-kateniinin

Expression

raportoi äskettäin, että CRK välittää transkription tukahduttamisesta

p120-kateniinin (CTNND1) B in NSCLC soluissa. CRK voi olla fosforyloitu sekä tyrosiini- ja seriinitähteitä, joka sitten vaikuttaa sen vuorovaikutus loppupään tavoitteet [15], [16], [26], [27]. Siksi pyrimme tutkia tarkemmin, ovatko CRK fosforylaation asema, koska korvike aktivoitujen ylävirran signaalit, on mahdollisesti pelissä rooli CRK välittämä

p120-kateniinin (CTNND1)

transkription repression. Läheinen korrelaatio joko seriinin tai tyrosiinin CRK fosforylaatiomallissa p120-kateniinin ilmaisu osoittaisi läsnäolon ylävirran seriini /tai tyrosiinikinaasin, joka välittävät CRK fosforylaatiota siten p120-kateniinin downregulation. Tätä varten tutkimme fosforyloidun CRK-II tason sekä tyrosiini 221 ja seriini 41 ja korreloi että p120-kateniinin tasoilla paneeli NSCLC ja BEAS-2B-solut (kuvio 1). Tapauksessa tyrosiinin 221, fosforylaatiota tämän jäännöksen c-Abl on raportoitu johtavan solujen kulkeutumisen inhibition. Havaitsimme käänteinen korrelaatio fosfoseriini- 41 CRK-II kanssa, p120-kateniinin ja E-kadheriinin proteiinin tasot Western-blottauksella. Mielenkiintoista, fosforylaatio CRK-II Y221 ei korreloinut p120-kateniinin ilme. Nämä havainnot viittaavat siihen, että signalointi tapahtumia, jotka harjoittavat seriini /treoniinikinaaseja osallistuvat

p120-kateniinin (CTNND1)

transkription downregulation kautta seriinifosforyloinnin on CRK sovittimen proteiinia.

B- kvantifiointi CRK- II, fosfo-tyrosiini 221 CRK-II ja fosfoseriini- 41 CRK-II-signaalin voimakkuus joukossa NSCLC solulinjojen ja BEAS-2B-soluja.

CRK-II Serine 41 fosforylaatio säätelee

p120- kateniinin

Expression

jotta voitaisiin edelleen arvioida roolia CRK seriinin 41 fosforylaatio kopioinnin säätely on

p120-kateniinin (CTNND1) B, päätimme tutkia CRK-II seriini 41 manipulointi voisi olla mitään vaikutusta p120-kateniinin ekspressiotason. Siksi me eteni valmistautua CRK-II seriini 41 phosphodeficient ja phosphomimetic mutantteja. Sivusto mutageneesillä reaktio käytettiin korvaamaan CRK-II seriini 41 on joko glysiini [Ser41Gly (phosphodeficient)] tai asparagiinihappo [Ser41Asp (phosphomimetic)]. CRK-II konstrukti fuusioitunut Myc-leimaa käytettiin, kuten selkäranka kohdennetun mutageneesin reaktioiden vuoksi, kaikki tuloksena mutantteja sisälsi Myc tag samoin. Kaikki rakenteet tarkistettiin sekvensoimalla. Myöhemmin A549, Rh2 ja H157-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti tuloksena CRK-II mutanttien ja mittasimme

p120-kateniinin (CTNND1) B-promoottorin aktiivisuus sekä p120-kateniinin proteiinin tason western blottauksella transfektoidus- solut. Ilmentymistasojen CRK-II-mutanttien ja endogeenisen CRK-II on esitetty (kuvio S1). Verrattuna soluihin, jotka ekspressoivat villityypin CRK-II, merkittävä kasvu

p120-kateniini (CTNND1) B-promoottorin aktiivisuuden havaittiin soluissa, jotka ilmentävät phosphodeficient CRK-II. Toisaalta, lasku

p120-kateniini (CTNND1) B-promoottorin aktiivisuuden havaittiin soluissa, jotka ilmentävät phosphomimetic CRK-II seriini 41 mutantti (kuvio 2). p120-kateniinin proteiinin tason muutti myös seuraavat ilmaus CRK-II mutanttien yhtäpitäviä havaittuihin muutoksiin

p120-kateniinin

promoottorin aktiivisuuden muutoksiin kaikissa solulinjoissa. Nämä havainnot korostavat roolissa CRK seriinin 41 fosforylaatiota transkription säätelyyn

p120-kateniinin (CTNND1)

.

(2 tailed opiskelijan t-testi: * P 0,05; ** P 0,01; virhepylväät edustavat ± keskihajonta). B- Western blotit osoittavat muutoksia p120-kateniinin proteiinin tason edellä mainittuja solulinjoja seuraavista ohimenevän transfektion CRK-II ja CRK-II mutantteja.

CRK-II Serine 41 fosforylaatio on mukana NSCLC soluliikkuvuus ja Cell Invasion

vaikka havaitsimme CRK-II seriini 41 fosforylaatiota harjoittaa

p120-kateniinin (CTNND1) B transkription säätelyyn, ei ole selvää, onko fosforylaation CRK-II seriini 41 on muita merkittäviä biologista merkitystä. Koska ilmaus CRK on liittynyt aggressiivisempaa NSCLC kasvaimia [28], päätimme tutkia liikkuvien ja invasiivisia ominaisuuksia A549-solut seuraavista manipulointi CRK-II seriini 41 fosforylaatiota. Siksi me eteni valmiita A549-soluja, jotka stabiilisti ilmentävät meidän CRK-II seriini 41 mutantteja. A549-solut valittiin tähän kokeeseen, koska ne ilmaisevat suhteellisen alhainen endogeenisen CRK-II. Kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa, A549-soluja transfektoitiin CRK-II seriini 41 phosphodeficient ja phosphomimetic mutantit ja valittiin G418: n läsnäollessa. Yhdistetyt valitut solut käytettiin myöhemmin haavan paranemisen ja solujen invaasiota määrityksissä. Ilmentymistason mutanttiproteiineilla tarkastettiin western blot-määrityksellä (kuvio S2). Seuraavaksi käytimme tuloksena A549-soluja, jotka pysyvästi ilmensivät CRK-II seriini 41 phosphodeficient ja phosphomimetic mutanttien haavan paranemista ja matrigeelin soluinvaasiota määrityksissä selitetty Materiaali ja menetelmät jaksossa (kuva 3). Kuten odotettua, vertaa A549-solut ilmentävät tyhjän vektorin, villityypin CRK-II ilmentävät solut osoittivat aggressiivisempi käytös. Mielenkiintoista, A549-solut ilmentävät CRK-II phosphodeficient (Ser41Gly) mutantti oli vähemmän liikkuvia omaisuutta, melkein samanlainen kuin tyhjän vektorin ryhmästä ja soluissa, jotka ilmentävät phosphomimetic (Ser41Asp) mutantti oli eniten aggressiivinen haavan paranemista määrityksissä. Me tukkinut endogeenisen CRK siRNA kaikissa olosuhteissa, jotta voidaan vähentää häiriöitä endogeenisen CRK kanssa CRK-II mutantti proteiineja (kuva S2). SiRNA, jota käytettiin hiljentäminen endogeenisen CRK on suunnattu sekvenssin ulkopuolella CRK: n avoimen lukukehyksen, minkä vuoksi tätä siRNA ollut mitään vaikutusta ilmentymistä CRK mutanttien plasmidirakenteet. Laajempi näkemys tämän haavan paranemista määrityksessä ja matrigeelin kalvot esitetään (kuviot S3, S4). Samanlainen haavan paranemista määrityksissä, A549-solut ilmentävät CRK-II seriini 41 phosphodeficient mutantti oli vähemmän invasiivisuus verrattuna soluihin, jotka ilmentävät tyhjän vektorin, ja solut, jotka ekspressoivat CRK-II seriini 41 phosphomimetic mutantti oli eniten invasiivisia omaisuutta 24 tuntia. Vaikka endogeeninen CRK-II oli epätäydellisesti vaiennettu ryhmien kesken, suhde CRK-II mutantteja endogeenisen CRK-II lisättiin seuraavat hiljentäminen endogeenisen CRK. On syytä mainita, että nämä biologiset ei havaittu jos endogeeninen CRK ei vaimennettu.

Endogeeniset CRK vaimentuu kaikissa olosuhteissa siRNA. B- mittaus haavan pinta-ala 24 tunnin kuluttua perustamisen haavan kesken edellä mainittujen ryhmien. Keskimääräinen lasketaan seuraavan mittauksen kolmen erillisen kokeen. (2 tailed opiskelijan t-testi: ** P 0,01; *** P 0,001; virhepylväät edustavat ± keskihajonta) .C- Invasion määritykset inkuboinnin jälkeen stabiilisti transfektoitujen A549-solut ilmentävät joko pCMV vektori; villityypin CRK-II (WT); CRK-II (Ser41Gly) tai CRK-II (Ser41Asp) mutantteja. 1 x 10

5-soluja inkuboitiin yön yli, kuten on kuvattu menetelmät-osassa ja värjättiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. D- kvantitatiivinen mittaus hyökkäsi soluja. Viisi eri osiin hyökkäsi solut laskettiin. (2 tailed opiskelijan t-testi: ** P 0,01; *** P 0,001; virhepylväät edustavat ± keskihajonta).

Jotta tutkia muutoksia solujen lisääntymisen osallistuvat havaittu biologinen käyttäytyminen solulinjaa CRK-II-mutantit, solujen lisääntymisen määrä tuloksena solulinjoja mitattiin (kuvio S5). Maljaamisen jälkeen sama määrä A549-soluja, jotka on transfektoitu CRK-II ja CRK-II-mutantit, solut laskettiin 24 tunnin välein. Ei ole merkittävää eroa solujen lukumäärät havaittiin ryhmien kesken. Nämä havainnot vahvistavat osallistumista CRK-II seriini 41 fosforylaatio motiliteettia ja invasiivisuus NSCLC-solujen.

PAK1 kinaasi välittää CRK-II Serine 41 fosforylaatiomääritys

Kun otetaan huomioon rooli CRK-II seriini fosforylaatio on

p120-kateniinin (CTNND1) B transkription repression ja myös edistäminen liikkuvuuden ja invasiivisuus NSCLC soluissa, pyrimme tunnistamaan ylävirtaan kinaasi (t), jotka saattavat välittävät CRK-II seriini 41 fosforylaatiota. CRK seriinifosforyloinnin on raportoitu useiden jäsenten PAK seriini /treoniini-perheen kinaasien [20], [21]. Esimerkiksi Hematopoieettinen esisolut Kinase 1 (HPK1, MAP4K1) ja Kinase homologisia SPS1 /STE20 (KHS, MAP4K5) raportoidaan fosfory- CRK perheenjäsenten seriinitähteiksi. Siksi päätimme tutkia CRK-II seriini 41 fosforylaatiota voisi välittyvän PAK kinaasiperhe. Tätä tarkoitusta varten, päätimme vaientaa PAK1 siRNA vuonna H157 ja A549 NSCLC-solujen ja tutkia CRK-II seriini 41 fosforylaatiota western blottauksella. Verrattuna soluihin, käsitellään ei-hiljentäminen siRNA, PAK1 hiljentäminen johtaa dramaattisesti vähentää fosfoseriini- 41 CRK-II sekä H157 ja A549-soluja (kuvio 4C). Lisäksi aminohapposekvenssi CRK-II läheisyydessä seriinin 41 tulitikut tunnetun PAK1 fosforylaation konsensus-sekvenssit [29] (kuvio 4D). On huomattava, että RDSS aminohapposekvenssi CRK-II on identtinen PAK1 fosforylaation sekvenssin Raf. Nämä havainnot vahvistaa roolia PAK1 kinaasin yhtenä kinaasien jotka välittävät CRK-II seriini 41 fosforylaatiota.

B- kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR mittaus PAK1 ja PAK2 mRNA määrittämiseksi hiljentäminen tehokkuutta siRNA. C-Western blotit osoittavat fosfoseriini- 41 CRK-II ja p120-kateniinin ilmaisun seuraavat siRNA välittämä PAK1 hiljentämisen A549 ja H157-soluissa. D- PAK1 fosforylaatio konsensussekvenssi useissa PAK1 alustoille. Tähteitä, joita fosforyloituu PAK1 on korostettu harmaalla. Kiersi ovat alkupään arginiini tähteitä, jotka ovat tärkeitä PAK1 kohde fosforylaatiota.

PAK1 kinaasi vaimentaa

p120-kateniinin (CTNND1) B Promoottori Activity and Expression Level

Kun otetaan huomioon osallistumista PAK1 kinaasin välittämisessä CRK-II fosforylaatio seriinillä 41 ja myös rooli CRK-II seriini 41 fosforylaatiota

p120-kateniinin (CTNND1) B transkription repression, kysyimme, onko PAK kinaasit itse asiassa mukana in

p120-kateniinin (CTNND1)

tukahduttaminen. Jotta voidaan tarkistaa käsitystä, me vaiennetaan PAK1 ja PAK2 siRNA ja mittasi

p120-kateniinin (CTNND1) B-promoottorin aktiivisuus kaksi lusiferaasianalyysissä ja mitataan myös p120-kateniinin proteiinin tason western blottauksella (kuvio 4 ). Seuraavat siRNA-välitteisen hiljentäminen PAK1 A549-soluissa, havaitsimme, yli 100%: n lisäys lusiferaasiaktiivisuus

p120-kateniini (CTNND1) B-promoottori reportteri verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu ei-hiljentäminen siRNA (kuvio 4A). Lisäksi kasvu p120-kateniinin proteiinin tason havaittiin H157 ja A549-soluja seuraava siRNA välittämää PAK1 hiljentäminen (kuva 4C). Emme huomanneet mitään merkittävää muutosta

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottorin aktiivisuudesta siRNA välittämä PAK2 hiljentäminen. Nämä tiedot edelleen nostaa rooli PAK1 transkriptionaalisen säätelyn

p120-kateniinin (CTNND1)

.

Effects of PAK1 Kinase on

p120-kateniinin (CTNND1) B Promoottori aktiivisuus välittyy CRK-II Serine 41 fosforylaatiomääritys

lisäksi todeta syy suhdetta PAK1 ja CRK-II fosforylaatiota p120-kateniinin ilme, päätimme tutkia vaikutusta samanaikaisen PAK1 ja CRK-II seriini 41 manipulointi on

p120-kateniinin (CTNND1)

transkription säätelyyn. Niinpä me vaiennettu PAK1 A549-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti CRK-II seriini 41 phosphomimetic ja phosphodeficient mutantit (kuvio 5). Olemme myös tukkinut endogeenisen CRK siRNA vähentää ei-toivottuja vuorovaikutuksia endogeenisten CRK. Kuten odotettua, A549-solut ilmentävät villityyppistä CRK-II oli kohonnut tasolle

p120-kateniinin (CTNND1)

transkriptioaktiviteettia seuraavat PAK1 hiljentäminen. Tämä vaikutus PAK1 on

p120-kateniinin (CTNND1)

transkriptioaktiviteettia kumottiin soluissa, jotka ilmentävät joko phosphomimetic tai phosphodeficient CRK-II seriini 41 mutantteja viittaa siihen, että kyvyttömyys CRK-II muuttamaan fosforylaation asema seriini 41 (seurauksena lisätty mutaatioita) poistetaan vaikutus PAK1 on

p120-kateniinin (CTNND1)

transkriptio. Nämä havainnot tukevat edelleen roolia CRK-II seriini 41 fosforylaatio PAK1 välittämän

p120-kateniinin (CTNND1)

transkription säätelyyn. Vähäinen muutokset

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottorin aktiivisuutta, joita havaitaan CRK-II seriini 41 phosphomimetic mutantti ilmentävien solujen (tilastollisesti ei-merkitsevä) voisi olla seurauksena endogeenisen CRK-II fosforylaation muutos seuraavaa PAK1 hiljentäminen. On syytä mainita, että RNAi välittämää hiljentäminen endogeenisen CRK ei johda on täydellinen kaataa endogeenisen CRK-II (kuva S2).

Endogeeniset CRK vaimentuu kaikissa olosuhteissa siRNA. (2 tailed opiskelijan t-testi: * P 0,05; virhepylväät edustavat ± keskihajonta).

PAK1 Kinase Vaikuttaa soluliikkuvuus ja Cell invasiivisuus kautta CRK-II Serine 41 fosforylaatiomääritys

Kun otetaan huomioon (i) CRK-II seriini 41 fosforylaatio edistää solujen liikkuvuuteen ja invasiivisuus ja (ii) PAK1 välittää CRK-II seriini 41 fosforylaatiota, olimme edessä hän kyseenalaistaa PAK1 todellakin edistää solujen liikkuvuuteen ja invasiivisuus kautta CRK-II seine fosforylaatiota. Tähän kysymykseen tarkastelimme liikkuvuutta ja invasiivisuus A549-solujen samanaikaisen manipulointia PAK1 ja CRK-II seriini 41 fosforylaatiota (kuvio 6). Kuten odotettua, havaitsimme suuremman liikkuvuuden ja invasiivisuus A549 soluja, jotka ilmentävät CRK-II seriini 41 phosphomimetic mutantti verrattuna soluihin, jotka ekspressoivat villityypin CRK-II. Sen jälkeen siRNA välittämä vaiennettu PAK1, solut, jotka ilmentävät villityyppistä CRK-II osoitti vähentynyttä liikkuvuutta ja invasiivisuus. Mielenkiintoista on, PAK1 hiljentäminen ei ollut mitään vaikutusta motiliteettia ja invasiivisuus ilmentävien solujen CRK-II seriini 41 phosphomimetic mutantti. Vastaavia muita kokeita, endogeeninen CRK hiljennettiin siRNA kaikissa olosuhteissa, jotta voidaan vähentää vuorovaikutuksen endogeenisen CRK kanssa CRK-II phosphomimetic mutantti. Tämän vuoksi päättelemme, että PAK1 vaikutus edistää solun liikkuvuus ja invasiivisuus välittyy CRK-II seriini 41 fosforylaatiota.

Endogeeniset CRK vaimentuu kaikissa olosuhteissa siRNA. B- mittaus haavan pinta-ala 24 tunnin perustamisen jälkeen haava kesken edellä mainittujen ryhmien. Keskimääräinen lasketaan seuraavan mittauksen kolmen erillisen kokeen. (2 tailed opiskelijan t-testi: ** P 0,01; *** P 0,001; virhepylväät edustavat ± keskihajonta). C- Invasion määrityksiä inkuboinnin jälkeen stabiilisti transfektoitujen A549-solut ekspressoivat villityypin CRK-II (WT) tai CRK-II (Ser41Asp) mutantti. Kukin solulinja käsiteltiin PAK1 siRNA tai salattu järjestyksessä siRNA. 1 x 10

5-soluja inkuboitiin yön yli, kuten on kuvattu menetelmät-osassa ja värjättiin 36 tuntia inkubaation jälkeen. D- kvantitatiivinen mittaus hyökkäsi soluja. Viisi eri osiin hyökkäsi solujen kussakin Matrigel kalvo laskettiin. (2 tailed opiskelijan t-testi: ** P 0,01; *** P 0,001; virhepylväät edustavat ± keskihajonta).

Keskustelu

Ymmärtäminen signalointi tapahtumia edistää etäpesäke kiinteiden kasvainten auttaa meitä pin kohta hoitotavoitteet voidakseen puuttua etäpesäkkeitä prosessissa. Menetys solu-solu-kiinnikkeistä epiteelisoluissa on yksi varhaisimmista vaiheet kasvaimen leviämistä. Siksi menettää eheys vyöliitos ja sen jäsenten (eli kadheriineja ja catenins) on keskeinen rooli edistämisessä etäpesäke. Yksi usein havaitun tapahtumista NSCLC kasvaimissa on p120-kateniinin downregulation. Koska p120-kateniinin sorto NSCLC on kopiointia ajatellen välittämää [11], päätimme tutkia tarkemmin ylävirran signalointi tapahtumia, jotka lopulta johtaisi transkription tukahduttamisen

p120-kateniinin (CTNND1)

. Kautta yksityiskohtainen analyysi

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottori, rooli transkriptiofaktoreiden FOXC2 ja SP1

p120-kateniinin (CTNND1) B downregulation kirjattiin. Edelleen analyysi sidoskumppanien SP1 johtaa meidät tunnistaa roolin sovittimen proteiinin CRK tässä reitin [12] (kuva 7). Koska CRK vastaanottaa syötön useilta signalointireittien, on todennäköistä, että ylävirran onkogeenien jotka välittävät niiden signaalin CRK on merkittävä vaikutus downregulation p120-kateniinin, edistäminen soluliikkuvuus /invasiivisuus ja edistäminen tuumorimetastaasin. Näin ollen, kun korvike on aktivoitu ylävirran signaalit, tutkimme fosforylaation tilan CRK-II ja huomannut CRK-II seriini 41 fosforylaatio on käänteinen korrelaatio p120-kateniinin ilmentymistä tason paneelin NSCLC-soluja. Huomattavaa on, että tämä korrelaatio ei havaittu fosforylaation CRK-II tyrosiini 221. sovittimen proteiinia, CRK ei sisällä katalyyttinen domeeni kuitenkin sekä tyrosiini- ja seriini kinaasiaktiivisuudet on liittynyt CRK [15]. Tuloksemme osoittavat CRK-II seriini 41 fosforylaatiota manipulointi muuttaa

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottorin aktiivisuutta, ilmentymisen taso ja myös invasiivisia omaisuutta NSCLC-solujen.

Mitä CRK- I, näyttää siltä, ​​että korkeampi ilmentyminen CRK-I-onkoproteiinin itse korreloi kasvaimen kehittymisen. Tämä havainto on toisin CRK-II, jossa fosfo-CRK-II vahvistetaan vahva yhdessä kasvaimien syntyyn. Merkittävä lisäys CRK-I onkoproteiinin tason ja fosforyloidun isoformin (CRK-II) havaittiin NSCLC [28]. Samoin tässä vietämme tiivis ja käänteinen korrelaatio CRK-I ilmaisun sekä fosfoseriini- 41 CRK-II kanssa, p120-kateniinin ja E-kadheriinin meidän paneelissa NSCLC-solujen (kuvio 1).

CRK seriinifosforyloinnin ei ole hyvin tutkittu vaikka on empiirisiä raportteja koskien rooli PAK perheen seriini /treoniini-kinaaseja CRK seriinifosforyloinnin [20], [21]. Kirjoittajat raportoivat rooli P21-aktivoitu kinaasi 1 (PAK1) in CRK-II seriini 41 fosforylaatiota siten p120-kateniinin downregulation ja myös edistäminen soluliikkuvuus ja invasiivisuus in NSCLC soluissa. PAK kinaasiperhe ovat tavoitteita GTP sitovien proteiinien Cdc42 ja Rac1 [30] ja myös osallistuvat solun tukirangan uudelleenjärjestely. Osallistuminen PAK kinaasien edistämisessä soluliikkuvuus ja solujen muoto ovat myös hyvin tunnettuja [31], [32]. PAK kinaasit luokitellaan kahteen pääryhmään, ryhmä I (PAK1-3) ja ryhmä II (PAK4-6). Tämä luokitus perustuu lähinnä läsnäollessa autoinhibitorinen alueen I PAK jäseniä [33]. Rooli ryhmän I PAK: ien on selvemmin osoittaa syövän etenemistä kuin PAK1 yliekspressio nähdään on useita kasvaintyypeille. PAK1 yliekspressoituu rinta-, munasarja-, keuhko- ja pään ja kaulan alueen syövät [25], [34]. Lisäksi PAK1 ilme on tiettävästi koholla pahanlaatuinen etenemiseen ihmisen kolorektaalisyöpää [35]. Mielenkiintoista, PAK1 harjoittaa myös haavan paranemista ja sääntelyä kontakti esto epiteelisoluissa. Sen jälkeen ilmaus aktivoitu PAK1 MDCK epiteelisolujen, puute kasvun pysähtymisen havaittiin heti haavan [36]. Täällä, tutkimme rooli PAK1 ja PAK2 in CRK välittämän transkription säätelyyn

p120-kateniinin (CTNND1) B ja voi vain tunnistaa PAK1 säätelijänä

p120-kateniinin (CTNND1)

. PAK1 hiljentäminen alennettu CRK-II seriini 41 fosforylaatio A549 ja H157-solujen ja parannettu

p120-kateniinin (CTNND1) B promoottorin aktiivisuus ja proteiinin tason NSCLC soluissa. Lisäksi PAK1 hiljentäminen vähensi soluliikkuvuus ja invasiivisuus kautta CRK-II seriini 41 fosforylaatiota.

PAK1 on useita alavirran tavoitteita, jotka säätelevät aktiini organisaatio ja polymeroinnin, solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Esimerkiksi, PAK1 vuorovaikutuksessa filamiini A ja LIM-kinaasi [24], [37], jotka inaktivoivat F-aktiini epävakautta proteiinin cofilin, mikä johtaa aggregaatiota F-aktiini kuitujen [38]. Lisäksi säätelemällä tukirankansa, PAK1 on tärkeä rooli säätelyssä MAPK signalointireittien. PAK1 suoraan aktivoi Raf-1, fosforyloimalla seriini 338 [39] lisäksi PAK1 suoraan aktivoi MEK1, fosforyloivaan seriini 298 [40]. Muut kuin aktivoimalla ERK MAPK, yli-ilmentynyt PAK1 on raportoitu aktivoida p38 MAPK: [41], [42], vaikka yksityiskohdat tämän vuorovaikutuksen eivät ole hyvin ymmärretty. PAK1 näyttää myös olevan yhteydessä JNK toimintaan. Yliekspressio PAK1 eri tutkijoiden on tuottanut erilaisia ​​raportteja, joiden molemmat tehostettu [30], [41], [43] ja alentunut [44], [45] JNK aktiivisuutta. Lisäksi PAK1 on raportoitu olevan jäsenenä anti-apoptoottisen signalointiverkon kautta vuorovaikutusta Bad [46], [47], [48], [49]. Tiedot tarjotaan tässä käyttöön CRK-II toinen alavirtaan kohteena PAK1. Ottaen huomioon CRK-II seriini 41 on osa PAK1 fosforylaation konsensussekvenssin (kuvio 4D), on todennäköistä, että PAK1 fosforyloi suoraan CRK-II seriini 41.

Yhteenvetona, nämä tiedot kuvaavat yksi metastaattisen edistää reittejä NSCLC soluissa liittyy PAK1 kinaasi, CRK-II, SP1 ja p120-kateniinin. Toisin sanoen, CRK-II fosforylaation tuntuu olla osa välittämisessä signaalit alavirtaan PAK1. Yhdessä muiden painottava raportti PAK1 yli-ilmentymisen levyepiteelisyöpä NSCLC [25], [46], näyttää siltä PAK1 esto voi tarjota toimivaa strategiaa, jotta keskeyttää pro-metastasoitunut käyttäytyminen tiettyjen NSCLC alatyyppejä.

materiaalit ja menetelmät

Cell Cultures

A549, H157, Rh2 ja H358-soluja viljeltiin rutiininomaisesti RPMI, jota oli täydennetty antibiooteilla ja 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (Omega Scientific, Tarzana, CA). Kuolemattomiksi normaalin ihmisen epiteelisoluja (BEAS-2B) viljeltiin BEBM väliaineessa, johon kaikki lisäaineet (Lonza /Clonetics Corporation, Sveitsi; luettelo nro CC-3170).

mittaus p120ctn Promoottori Activity Dual Luciferase Pitoisuus

p120ctn

promoottorin konstruktio transfektoitiin NSCLC solulinjoja Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut pestiin PBS: llä ja lyysattiin käyttäen Branson Sonifier 1x passiivista hajotuspuskuria (Promega) huoneenlämpötilassa (RT). Reportterigeenin ilmentyminen arvioitiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega) valmistajan ohjeiden on TD-20/20 Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA). Olemme normalisoitu ohimenevän transfektion tehokkuus (eli tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuus) kotransfektoimalla on

Renilla

lusiferaasin ilmentävät kontrollivektorille (PRL-SV40). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja on raportoitu keskiarvoina ± keskihajonta (SD), ja kukin koe suoritettiin vähintään kahdesti.

siRNA Mediated Gene hiljentäminen

A549 ja H157-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​CRK, PAK1 ja PAK2. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). SiRNA duplex-sekvenssit, jotka käytimme vaientaa edellä mainitut geenit ovat seuraavat:

CRK: 5′-CUGCUUACCCUGAUUUAUUdtdt-3 ’

5′-AAUAAAUCAGGGUAAGCAUdtdt-3′.

PAK1 : 5′-GAAAGAGCGGCCAGAGAUUdtdt-3 ’

5′-AAUCUCUGGCCGCUCUUUCdtdt-3′.

PAK2: 5′-GGAUUUCUUAAAUCGAUGUdtdt-3 ’

5′-ACAUCGAUUUAAGAAAUCCdtdt-3′.