Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset raportit ovat ehdottaneet mahdollista osallisuutta määrätietoinen homologi 2 (SIM2) ihmisen kiinteiden syöpien, kuten eturauhassyöpä. Kuitenkin tarkka rooli SIM2 syövän yleensä ja eturauhasen syöpä erityisesti, vielä tunneta laajalti. Tutkimuksen tavoitteena oli valaista roolia SIM2 eturauhassyövässä käyttäen shRNA perustuva lähestymistapa PC3 eturauhassyöpäsolulinja.

Methods

Lentivirusvektorikonstruktit shRNAs käytettiin estämään SIM2 geeni ja proteiini tasot PC3-soluissa. Kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja haarautunut DNA evaluoimiseksi suoritettiin transkriptio ilmentymisen. SIM2 ekspressiotaso mitattiin western blot. Profilointi geenien ilmentymisen kattavat koko genomista, sekä napa-metabolomiikan useiden suurten metaboliareitit tehtiin tunnistaa suuria koulutusjakson säätelyhäiriöiden.

Tulokset

SIM2 geenin ja proteiinin tuotteet merkittävästi vaimentua by Lenti -shRNA PC3-solulinjassa. Tämä alhainen ilmentyminen SIM2 vaikuttaa geeniekspressioprofiili, paljastaen merkittäviä muutoksia suurten signalointireitteihin, verkostoja ja toimintoja. Lisäksi suuret metaboliareitit vaikutti.

Johtopäätös

Yhteenvetona tuloksemme viittaavat osallistuminen SIM2 keskeisillä piirteet eturauhaskasvainsolun biologian ja saattaa taustalla panos tämän transkriptiotekijän eturauhassyöpä puhkeamista ja etenemistä.

Citation: Lu B, Asara JM, Sanda MG, Arredouani MS (2011) rooli transkriptiotekijä SIM2 eturauhassyövässä. PLoS ONE 6 (12): e28837. doi: 10,1371 /journal.pone.0028837

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 26 elokuu 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu: 09 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee NIH-NCI Early Detection Research Network myöntää UO1-CA11391 (M. Sanda), puolustusministeriön Eturauhassyöpä Training Award W81XWH-09-1-0626 (B. Lu), ja Eturauhassyöpä säätiö Young Investigator Award (MS Arredouani ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

määrätietoinen homologi 2 (SIM2) geeni sijaitsee ihmisen kromosomissa 21q22.2 ja kuuluu perus helix-loop-helix PAS [per-Arnt-Sim] (bHLH-PAS) perhe transkriptiotekijöiden [1], [2]. SIM2 alunperin arvellaan vaikuttavan Downin syndrooma (DS) [3]. Transkriptiotekijänä (TF), hiiren SIM2 (mSIM2) välittää geeniekspressiota läpi CNS keskiviivan tehostajana (CME) elementti sen dimerisaation kumppanin ARNT kautta ARNT karboksipään [4]. Transkriptiotekijä C-myb säätelee SIM2 transkription glioblastoomasoluissa, ja tumalokalisaatiosignaalin (NLS) välittää ydinvoiman paikallistaminen SIM2 [5].

ennen

in silico

bioinformatiikan etenevää Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) tietokanta National Cancer Institute (NCI) tunnistettu SIM2 kuten liittyy paksusuolen, haiman ja eturauhasen karsinoomien, kun taas poissa vastaaviin normaaleissa kudoksissa [6]. Kaksi eri saumattu isoformeja SIM2 transkriptio, SIM2 pitkä (SIM2-l) ja SIM2-lyhyet (SIM2-s), on raportoitu, kun niiden ero toiminto ihmiseen ei vielä tiedetä [1]. SIM2-s nimenomaisesti ilmaistu alkuvaiheessa paksusuolensyöpä. Antisense esto SIM2-s ilmentyminen antisense oligojen aiheutti kasvun hidastumisen ja apoptoosin koolonisyöpäsolulinja RKO ja kasvaimen kasvua nude-hiirissä ja myös haimasyövän solulinjassa CAPAN-1 [7], [8]. Apoptoosi indusoitiin SIM2-s inhibition RKO koolonisyöpäsolulinja [9]. SIM2-s todettiin myös olla tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden rintasyövän [10]. Hyökkäyksen mahdollisuudet glioblastoma väheni merkittävästi SIM2s inhibitio, mikä on yhdenmukaista lasku ilmentymisen matriisin metalloproteinaasi 2 sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla [11].

Olemme aiemmin raportoitu SIM2 mahdollisena biomarkkerina ja immunoterapia kohdentaa ihmisen eturauhassyövän [12]. Vaikka SIM2-s ilmentyminen (mitattuna immunohistokemialla eturauhasen yksilöt) on liittynyt aggressiivinen histopatologia eturauhassyövässä, ja yli-ilmentämään kohdunulkoinen SIM2s tehostettu selviytyminen tietyissä olosuhteissa PC3AR + soluissa [13], [14], toiminnallista roolia SIM2 geenin eturauhassyöpäsolu- ei juuri tunneta.

tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään toiminnallista roolia SIM2 PCA käyttäen geenien lähestymistapaa ja luonnehdinta molekyyli- ja toiminnallisia muutoksia sekä geenien ilmentymisen profiloinnin ja metabolomic profilointia.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

ihmisen PC3, LNCaP, VCAP ja DU145 solulinjoja ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja viljeltiin kohti ATCC protokollan. Hyvänlaatuinen PrEC soluja, kuten on kuvattu Berger R et al, 2004, oli ystävällisesti Dr. W. Hahn Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA.

transduktiopartikkeleilla

pLKO 0,1-puro-ohjaus lentiviruksen transduktiopartikkeleilla, MISSION lusiferaasi shRNA ohjaus lentiviruksen transduktiopartikkeleilla ja MISSION SIM2 shRNA lentiviruksen transduktiopartikkeleilla käytettiin infektoimaan PC3-solulinjassa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

Näytteiden valinta, RNA puhdistus ja käänteinen transkriptio

Ten hyvänlaatuinen ja neljätoista kasvain eturauhasen otettiin kudosnäytteet ja koko RNA: t käsiteltiin kuten kuvattu edellisessä työssä [12]. Solulinja eristettiin kokonais-RNA käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettu RNA kvantitoitiin NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri (NanoDrop, Wilmington, DE). 500 ng kutakin solun kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen oligo-dT: ja yläindeksi III käänteistranskriptaasia (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) alla valmistajan ohjeita.

Geenin ilmentyminen mikrosiruja ja analyysi

250 ng kokonais-RNA monistettiin käyttämällä Ambion n MessageAmp II mRNA Amplification kit. Biotiini-UTP sisällytettiin aikana yön yli in vitro transkriptio vaiheessa mukaan valmistajan protokollaa. Geenien ilmentyminen arvioitiin käyttämällä Affymetrix n (Santa Clara, CA) GeneChip- U133 array (plus 2,0 chip) paneelit edustavat koko ihmisen genomin selostukset. 15 ug cRNA oli hajanaista ja hybridisoidaan taulukot ”mukaan valmistajan protokollia kuten aiemmin on kuvattu [15]. Laatu skannattujen paneelit kuvien määritettiin perusteella tausta-arvoja, prosenttia läsnä puhelut, skaalaus tekijät, ja 3′-5 ’suhde β-aktiinin ja GAPDH käyttäen Bioconductor R paketteja. Signaalin arvo kullekin Transkriptiä tiivistää käyttämällä PM-perustu pelkästään signaalin mallinnus algoritmi on kuvattu dchip. PM vain mallinnus perustuu algoritmin sadot vähemmän määrä vääriä positiivisia verrattuna PM-MM malli. Tällä tavoin signaalin arvo vastaa absoluuttisen tason ilmentymisen transkriptin [16]. Nämä normalisoitu ja mallinnettu signaalin arvot kullekin transkriptio käytettiin edelleen korkealla tasolla bioinformatiikan analyysi. Aikana laskeminen perustuvan mallin ilmaisun signaalin arvoihin, array ja koetin harha ovat kuulusteltu ja kuvat piikki käsitellään signaalia harha. Ulompien havaitseminen suoritettiin käyttäen dchip arvojen havaitsemiseen algoritmi. Siru pidetään Peränpitäjänä jos anturi, yhden tai array harha prosenttiosuus ylittää oletuksena raja on 5%. Kun verrataan kahta ryhmää näytteiden geenien tunnistamiseksi, joka on rikastettu tietyn fenotyypin, jos 90% alhaisempi luottamus sitoutunut (LCB) taitteen muutos (FC) ryhmien välillä oli yli 1,2, vastaavan geenin katsottiin ilmentyvät differentiaalisesti. LCB on tiukka arvio FC ja sen on osoitettu olevan parempaa sijoitusta tilastollinen [17] On ehdotettu, että kriteeri valittaessa geenejä, jotka on LCB edellä 1,2 todennäköisimmin vastaa geenien kanssa ”todellinen” kertainen muutos, joka on vähintään 2 geenien ilmentyminen [18]. Tiedot poimittiin CEL tiedostoja ja normalisoitu käyttämällä RMAexpress (https://rmaexpress.bmbolstad.com/). Aineisto analysoitiin MeV ohjelmistoa (https://www.tm4.org/mev/).

Cell signalointireitille analyysi

Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems®, http: //www.ingenuity.com) hakemukset käytetään tuottamaan verkkoihin ja arvioida tilastollisesti biofunctions, kanoninen polkuja ja verkostoja, jotka liittyvät ilmentyvät eri geenistä profiilit erotettu transcriptome tiedot.

Branched DNA ja määrällinen Real-Time PCR ( qRT-PCR) B

Branched DNA suoritettiin arvioimaan SIM2s ja SIM2L geenin ilmentymistä ihmisen eturauhasen kokonais-RNA-näytteet ja normalisoitu 2-ohjaus geenien ALSA1 ja HPRT (QuantiGene 2,0 Reagent System, Affymetrix Inc., Fremont, CA ). Kvantitatiivista RT-PCR: ää, 1 ui cDNA: ta käytettiin kunkin kuopan RT-PCR-reaktioissa. Näytteet tehtiin kolmena rinnakkaisena. Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin kaksivaiheista reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi Applied Biosystems 7900HT Prism väline. Taqman reaaliaikainen PCR-alukkeet GAPDH: lle (4310884E) ja SIM2L (hs00231925_m1) hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA). Taqman reaaliaikainen PCR-alukkeet SIM2s suunnitellut ryhmämme ja ostetaan Biosearch Technologies (Novato, CA). SIM2s forward-aluke: 5′-gtgccaagct acgaaggtg-3 ’; SIM2s reverse-aluke: 5’-acttagaagcagaaagagggcaag-3 ’; anturi: TCAGGTCTGCTCGTGGGGAAGGTG. Expression arvo SIM2s tai SIM2L tietyssä näytteessä normalisoitiin vastaavaan ilmentymisen GAPDH. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskemaan suhteellinen ilmentyminen SIM2 geenin kuten aiemmin on kuvattu [19], [20].

Lentivirusvektorikonstruktit transduktion ja stabiili solulinja valinnan

1,6 x 10

4 PC3-solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle ja niitä inkuboitiin 20 tunnin ajan. Väliaine poistettiin ja 110 ui tuoretta alustaa, joka sisälsi heksadimetriinibromidi loppupitoisuuteen 8 ug /ml lisättiin. Lentivirus- partikkeleita lisättiin sopiviin kuoppiin 5 MOI (Infection) ja inkuboitiin yön yli. Tuoretta väliainetta lisättiin sitten ja soluja viljeltiin 2 päivää, jonka jälkeen 10-12 päivä kulttuurin puromysiinin (2 ng /ml), lisättiin 3 päivän välein.

Transient transduktio saavutettiin yli 3 päivän inkuboinnin jälkeen.

Western blot

Solut pestiin kahdesti PBS: llä kaksi kertaa, ennen kuin ne on korjattu kaapimalla. Solulysaatit valmistettiin soluhajotuspuskurin (50 mmol /L Tris-HCI, pH 8,0, 20 mM EDTA, 1% SDS, ja 100 mM NaCl), joka sisältää entsyymi-seoksen tabletti (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) ja PMSF ( Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Yhteensä 20-50 ug proteiinia uutetta fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Immobilon-P, Millipore). Membraani blokattiin TBS-T: n (0,1% Tween 20 PBS: ssä), joka sisälsi 3% maitojauhetta ja inkuboitiin SIM2s primaarisen vasta-aineen (Santa Cruz, sc-8715, isoformi NM_009586) yön yli 4 ° C: ssa. Kolmen pesun jälkeen TBS-T, kaivoa inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen Ab: ssa 1 tunti ja sen jälkeen pestiin 0,05% Tween 20 PBS: ssä. Immuunikompleksien havaittiin ECL menetelmillä (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Metabolinen profilointi kohdistamalla Liquid-Chromatography tandem-massaspektrometriaa (LC /MS /MS) B

10

6 solua eksponentiaalisesti kasvavat ruselatusainetta dialysoitua seerumia kerättiin 3 ml: aan 80% v /v HPLC-laatuista metanolia hiilihappojään lämpötilassa. Lisättiin tuoretta elatusainetta, 24 tuntia ja 2 tuntia ennen uuttamista. Liukenematon materiaali lysaatit sentrifugoitiin 4000 rpm 15 minuuttia ja saatu supernatantti (metaboliitti-pitoisuus) haihdutettiin käyttäen jäähdytettyä SpeedVac pellettiin. Näytteet suspendoitiin uudelleen käyttäen 20 ui HPLC-laadun vettä massaspektrometria analyysiä. 10 ui injektoitiin ja analysoitiin käyttämällä 5500 QTRAP kolmoiskvadrupolisen massaspektrometri (AB /Sciex) kytkettynä Vuoristo UFLC HPLC-järjestelmää (Shimadzu) kautta valitun reaktion seuranta (SRM) on yhteensä 255 endogeenisen vesiliukoisten metaboliittien vakaan tilan analysointi näytteet. Jotkut aineenvaihduntatuotteet olivat kohteena sekä positiivisia että negatiivisia ionimoodilla yhteensä 298 SRM siirtymiä. ESI jännite oli + 4900V positiivisionisella tilassa ja -4500V in negatiivisten ionien tilassa. Viipymäaika oli 5 ms kohti SRM siirtyminen ja koko jakson aika oli 2,09 sekuntia. Noin 8-10 datapistettä hankittiin kohden havaittu metaboliitti. Näytteet toimitettiin MS kautta normaalin faasin kromatografialla käyttäen 2,0 mm i.d. x 15 cm Luna NH2 HILIC pylvääseen (Phenomenex), 285 ul /min. Gradientit ajettiin alkaen 85% puskuria B (HPLC-laatua asetonitriili) 42% B 0-5 minuutin; 42% B 0% B 5-16 minuuttia; 0% B pidettiin 16-24 minuuttia; 0% B 85% B 24-25 minuuttia; 85% B pidettiin 7 minuuttia tasapainottua uudelleen pylvääseen. Puskuri A: ta, joka käsittää 20 mM ammoniumhydroksidi /20 mM ammoniumasetaatti (pH = 9,0) 95: 5 vesi: asetonitriili. Peak alueet kokonaismäärästä ioni nykyinen kullekin metaboliitille SRM siirtyminen integroitiin käyttäen MultiQuant v1.1 ohjelmisto (AB /Sciex).

Mittaukset tehtiin kolmena rinnakkaisena ja data normalisoitiin kohti solujen määrä. Vain aineenvaihduntatuotteita, joiden on määritelty kaikkiaan 6 näytettä pidettiin ja analysoitiin MetaboAnalyst [21], [22].

Tilastollinen

Geenien ilmentyminen array data analysoitiin kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Perustuen aiempaan työhön [12], me testattiin SIM2 säätelyyn ylöspäin kasvaimissa versus säätimet yksipuolinen t-testi ja verrataan p-kynnysarvo 0,05.

Quantitative Real-Time PCR (qRT -PCR).

Validation erilaisesti ilmaisi geenien suoritettiin qRT-PCR. 200 ng korkealaatuisia RNA-näytteet käänteistranskriptio ensimmäisen juosteen cDNA: ta ja 1 ui cDNA: ta käytettiin kunkin kuopan RT-PCR-reaktiossa. Näytteet tehtiin kolmena rinnakkaisena. SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin kaksivaiheista reaaliaikainen RT-PCR-analyysi Applied Biosystems 7900HT Prism väline. PCR-alukkeet ”sekvenssit kohdennettuja geenien on esitetty taulukossa S3. Sekvenssit GAPDH: GAPDH-F (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 ’) ja GAPDH-R (5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3’). Expression arvo kohdegeenin annetussa näytteessä normalisoitiin vastaavaan ilmentymisen GAPDH. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskemaan suhteellinen ekspressio kohdennetun geenejä.

Tulokset

SIM2 geeni ilmentyy differentiaalisesti eturauhasen normaaleissa ja syövän tai eturauhasen ja solulinjoissa

Olemme arvioineet SIM2 geeniekspressio yhteensä 24 normaalin ja kasvaimen eturauhasen näytteet on esitetty taulukossa 1. Koska SIM2 geeni esiintyy kaksi isoformia, SIM2 lyhyt (SIM2s) ja SIM2 pitkä (SIM2L), varmistimme ilmaus molempien isoformeja RNA uutetaan eturauhasen käyttäen haarautunut DNA tekniikalla (Fig. 1A 1 B). SIM2s ja SIM2L osoitti merkittävää yliekspressio Tuumorinäytteissä verrattuna hyvänlaatuinen näytteitä, joissa p 0.000003 ja p 0,00005, vastaavasti. Kuitenkin suhde SIM2s ja SIM2L ekspressio ei ollut eroa hyvänlaatuinen ja kasvaimen (taulukko 1, T-testi p = 0,85). SIM2s ja SIM2L ilmaisun olivat 7,03 ja 6,95 kertaa suurempi vastaavasti kasvainten vertaamalla avulla kahden ryhmän jälkeen loki säädön vakuuttaa normaaliuden ja jatkuva vaihtelu kussakin ryhmässä. Expression of SIM2s ja SIM2L arvioitiin myös ihmisen neljän eturauhassyövän solulinjoissa, PC3, LNCaP, DU145 ja Vcap, ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolulinja PrEC. Sekä SIM2s ja SIM2L isoformit olivat erittäin ilmaistaan ​​VCAP soluissa, vaikka oli kohtalainen ekspressiotaso PC3-soluissa ja hyvin heikkoa ilmentymistä DU145, LNCaP ja PrEC solut (Fig. 1 C). Koska on olemassa vain muutamia käytettävissä vasta SIM2 olemme vain pystyneet selvästi lyhyen isoformin SIM2 (SIM2s) in solun uutteiden Western blot. Tämä niukkuus vasta monimutkainen meidän tehtävään tutkia toiminta SIM2 pitkä isoformin. SIM2s ekspressiotaso oli yhdenmukainen sen geenin ilmentymistä eturauhasen normaaleissa ja syöpäsolulinjoissa. (Fig. 1 D).

kvantitatiivinen Expression of SIM2 lyhyitä isoformin (A) ja SIM2 pitkä isoformin (B) arvioitiin haarautunut DNA tekniikalla 10 normaalin ja 14 ihmisen syövän eturauhasen yksilöitä. Tiedot kvantitoitiin käyttäen ALSA1 ja HPRT kuin normalizers. (C) kvantifiointi SIM2 lyhyen ja pitkän isoformit ”ilmentymistä ihmisen eturauhasen normaaleissa ja syöpäsolulinjoissa reaaliaikaisella RT-PCR. Aineisto suuruutta kuvataan ΔΔC

T-menetelmä ja normalisoitiin GAPDH. Sarake valkoinen edustaa SIM2 lyhyt isoformi ja sarake harmaa edustaa SIM2 pitkä isoformin. (D) Western blot suoritettiin eturauhasen normaaleissa ja syöpä solulinjoja SIM2s.

hiljentäminen SIM2 ilmentymistä PC3-soluissa

saavuttaa korkeimman downregulation SIM2 ilmaisun avulla lentiviruksen shRNA, olemme valinneet PC3 solulinja mallina. PC3-solut transdusoitiin viisi eri SIM2 shRNA ekspressiovektoreita, joista neljä (shRNA48, shRNA49, shRNA50 ja shRNA51) osoitti merkittävää estävää vaikutusta verrattuna kontrolliin shRNAs. Yli 80% vaiennettu geeni-ilmentymisen saatiin aikaan käyttämällä shRNA51 (Fig. 2A B). Kaksi ohjaus solulinjoja käyttäen joko vektori, jotka ilmentävät stabiilisti shRNA kohdistaminen lusiferaasi tai tyhjän vektorin. Samanlainen estävä kuvio havaittiin SIM2L geeniekspressiota näissä vakaasti tartunnan PC3 solulinjoissa. Vastaavasti tehokas ohimenevä vaimentaminen SIM2S ja SIM2L saavutettiin PC3 (kuvio S1).

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena (A) ja proteiinin ekspressio arvioitiin Western blot (B). Ohjaus 1: lusiferaasia shRNA vektori, Control 2: PLKO vektori. sh48, sh49, SH50, SH50, SH51 ja sh52: ilmentävät shRNAs kohdistaminen SIM2 geenin eri kohtiin. Sarake ”*” edustaa merkittävää downregulation SIM2 geeniekspression shRNA vertaamalla molempiin valvonnan 1 ja ohjaus 2 (P 0,05).

vaikutus SIM2 hiljentäminen geenien ilmentymisen profiili PC3-soluissa

huolimatta epäillään rooli syövän, hyvin vähän tiedetään osuus transkriptiotekijä SIM2 sääntelyyn geeniekspression [23]. Siksi tutkittiin vaikutuksia downregulation SIM2 eturauhasen syöpäsoluja. Tätä varten shRNA joka tuotti korkeimman hiljentäminen määrä SIM2, ts shRNA51, valittiin. PC3-solut käsiteltiin shRNA51 verrattiin kontrollina shRNA (shRNAc).

geeniekspressioprofiilien PC3 SIM2

alhainen ja ohjaus PC3 solulinjoja arvioitiin käyttämällä Affymetrix GeneChip- U133 array (plus 2,0 chip), joka koostuu 52000 selostukset koko ihmisen genomin selostukset. Kuvio 1 on lämpö kartan geeni säätelyhäiriötä jälkeen kaatamalla ilmentymistä SIM2 PC3-soluissa. Ilmentymisen suuren määrän transkriptien osoitti, joka on vähintään 2-kertainen (kuvio 3A ja Taulukko S4). Pathway analyysi paljasti, että monet erittäin ilmentyvät eri transkriptien edustavat geenejä, jotka kuuluvat tunnetun signalointireittien, kuten PTEN ja PI3K /AKT signalointireittejä (kuvio 3B), joka on ollut mukana kasvainten synnyssä on dokumentoitu hyvin [24], [25]. Geenien mukana kussakin signalointireitillä on esitetty taulukossa S1. Niistä geenit, CCL5-, MAPK1, P38, DDR1 ja ERK oli keskeinen rooli koulutusjakson verkkoon (kuva 4). Geenit Tämän verkoston ovat olleet mukana solukuoleman, aineenvaihduntaa, solujen kehitystä, ja kasvaimen antigeenin esittelyä. Enemmän geenien korkeimman pistemäärän verkot on esitetty taulukossa S2. Lisäksi analyysi osoitti, että useita tärkeitä biologisia toimintoja väärin säädellystä seuraavat SIM2 hiljentäminen (kuvio 3C). Mielenkiintoista, useat solun liittyviä toimintoja aineenvaihduntaan, kuten huumeiden aineenvaihduntaa ja aineenvaihduntasairaus, ovat kärjessä sijoittui toiminnot.

. Ohjaus V: PC3 lusiferaasi shRNA; Ohjaus B: PC3 PLKO vektori; SIM2 C: SIM2 sh48; SIM2 D: SIM2 SH51. Geeniekspressioiden olivat joko ylös tai alas yli 2 kertaiseksi SIM2

alhainen listattiin. B. Top väärin säädellystä signaalireaktioteissä SIM2

alhainen PC3-soluissa. C. Top väärin säädellystä solujen toimintoja SIM2

alhainen PC3-soluissa.

Tämä verkko sisälsi 16 painopiste geenien pistemäärällä 29. Eri muotojen solmun edustavat eri ryhmien keskittyä geenejä. Intensiteetti solmun väri osoitti aste ylös (punainen) ja alas (vihreä) geeniekspression tasolla. Top toiminnot Tämän verkoston ovat solujen liike, immuunisolujen kaupan, organismin vammoja ja epämuodostumia.

Validation RT-PCR ryhmä erilaisesti ilmaisi geenien (taulukko S3) osittain vahvistettu meidän in silico analyysi vakaa ja ohimeneviä transfektantissa PC3-solujen (kuviot 5 6).

qRT-PCR validointi mRNA: n ekspression tasojen yksittäisten geenien suoritettiin kaksivaiheisella reaaliaikainen RT-PCR-analyysi Applied Biosystems 7900HT Prism instrumentti. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

qRT-PCR validointi mRNA: n ekspression tasojen yksittäisten geenien suoritettiin kaksivaiheisella reaaliaikainen RT-PCR-analyysi Applied Biosystems 7900HT Prism väline. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Mittaukset tehtiin kolmena rinnakkaisena ja tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

PC3 SIM2

alhainen solut osoittivat suurta muutoksia metabolointiprofiilista

pyrittiin määrittämään, onko geeniekspression muutoksia aiheuttavat huomattavia muutoksia metaboliareitit PC3 SIM2

alhainen soluja. Tämä osoitettiin mittaamalla 255 polar aineenvaihduntatuotteiden kohdistamalla massaspektrometriaa (LC /MS /MS). Vertailu metaboliaprofiilin kontrollisolujen shRNA-SIM2 käsiteltyjä soluja osoitti merkittäviä muutoksia useissa metaboliareitteihin ja tuotanto 39 aineenvaihduntatuotteiden (taulukot 2 3). Puriini metaboliareittiin oli alkuun yksi säädeltyyn polkuun 11 aineenvaihduntatuotteiden huomattavasti ylä- tai alassäädetty tasot pois yhteensä 92 aineenvaihduntatuotteiden tämän reitin vuonna SIM2 vaientamisessa PC3-soluissa. Pyrimidiiniä metaboliareittiin listattu toisena säädeltyyn polkuun 6 pois yhteensä 60 aineenvaihduntatuotteiden merkittäviä muuttuneen tasoa (taulukko 2, kuva. 7). Merkittävä muutoksia kyseisen nukleiinihappometaboliassa voi ilmoittaa tärkeä rooli eturauhassyövän kehitystä.

Metaboliitit poimittiin SIM2

alhainen ja normaali PC3-soluissa käyttäen metanolia ja runsaudesta 239 aineenvaihduntatuotteita mitattiin käyttämällä kohdistettuja LC /MS /MS: llä. Data analysoitiin käyttäen MetaboAnalyst ohjelmistoa. Metaboliateiden järjestetty mukaan pisteiden rikastamiseen analyysi (y-akseli) ja topologia analyysi (x-akseli). Kolmena kappaleena mittaukset suoritettiin.

Keskustelu

Aiemmissa biomarkkereiden tunnistamiseen ponnisteluja, olemme tunnistaneet SIM2 mahdollisena biomarkkereiden PCA. Kiitos sen yli-ilmentymisen eturauhastuumoreissa ja sen erittäin rajoitettu ilmentyminen ihmisillä ehdotimme käyttää SIM2 kuin immunoterapia tavoite ja pystyivät tunnistamaan 5 HLA-A2.1, SIM2 johdettu immunogeenisiä epitooppeja [12]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme yrittäneet luonnehtia rooli SIM2 eturauhassyövässä käyttämällä lyhyttä hiusneula-RNA-induced geenien lähestymistavan PC3-solujen mallina. Olemme keskittyneet profilointi sekä transcriptome ja Metabolomi in SIM2

alhainen ja normaali PC3-solut, ja arvioitu vaikutus SIM2 hiljentäminen solun signalointi ja toiminta.

SIM2s isoformi on raportoitu ilmaistaan ​​paksusuolessa , haima, ja eturauhasen kasvaimia, kun taas puuttuu vastaava hyvänlaatuinen kudoksia [8]. Huomasimme, että SIM2 geenit ovat havaittavissa kaikissa näissä eturauhassyövän soluissa reaaliaikainen PCR. Kuitenkin ilmaus tasot DU145 ja LNCaP ovat suhteellisesti alhaisemmat kuin muiden eturauhasen syöpäsoluja ja PC3-solut ilmentävät kohtalainen SIM2 geenejä, jotka vastaavat muiden raportissa [14].

Koko kirjo säätely geenin ilmentymisen transkriptiotekijän SIM2 on edelleen huonosti määritelty. Sääntelytaso voi näkyä esimerkiksi differentiaalinen ilmentyminen noin 200 geenien paljastetaan geeniekspressioprofilointi PC3 SIM2

alhainen soluja. Muut ryhmät ovat raportoineet tiettyjä geenejä, jotka säätelevät SIM2. BHLH /PAS transkriptiotekijä yksittäinen ajattelevien 2s ilmoitettiin edistämään maitorauhasen lactogenic erilaistumisen säätelyn Csn2 ilmaisun [26]. SIM2 säätelee MMP-2 ja TIMP-2, joka kuljettaa sen rooli glioblastoomasoluissa [11]. SIM2s tukahduttaa BNIP3, pro-apoptoottisen geenin kautta hypoksinen vaste-elementtiin PC3-soluissa [14]. Meidän geeniekspressioprofiili PC3 SIM2

alhainen solut osoittivat merkittävää muutosta PTEN, PI3K /AKT ja Toll-kaltainen reseptori (TLR) signalointireittejä jotka osallistuvat pitkälti syövän etenemiseen. PTEN negatiivisesti ohjaa PI3K signalointireitille solujen kasvulle ja selviytymisen defosforyloimaan 3-asemassa Fosfoinositidien [24], [25]. TLR säätelee solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen ja Keski molekyylejä mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) ja PI3K avainasemassa [27]. Meidän tiedot osoittavat, että inhibitio Sim2 geenin PC3-soluissa vaikuttaa useiden geenien ekspression, jotka koodaavat proteiineja, jotka on järjestetty verkon ympärille p38MAPK. Nämä proteiinit, jotka sisältävät CCL5, MAPK, ERK ja DDR1 (kuvio 4), on raportoitu olevan mukana kasvainten kehittymiseen. Kemokiiniryhmä CCL5- on raportoitu ilmaistaan ​​eturauhasen solujen ja vaikuttaa niiden kasvua ja selviytymistä. Aktivoinnin jälkeen MAPK p38 ja ERK1 /2 LNCaP-soluissa, ekspressio CCL5 kasvaa, mikä johtaa solujen lisääntymisen tehostuneen [28], [29]. PC3 soluproliferaatiota ja invaasiota olivat myös merkittävästi tukahdutti jälkeen DDR1 Knockdown siRNA [30], [31].

RT-PCR data paljasti eroavaisuuksia ohimenevää ja vakaa vaiennettu SIM2 PC3-soluissa. Tämä voi olla seurausta 1) läsnäolon kaksi isoformia SIM2 jotka on vaimennettu eri tahtiin molemmissa asetelmia, tai 2) SIM2 voi säädellä geeniekspressiota muiden geenien joko suoraan tai välillisesti.

Toimintoanalyysi myös paljasti, että kolme tehtävää liittyvät solujen aineenvaihduntaa oli väärin säädellystä että PC3 SIM2

alhainen soluja. Tämä viittaa siihen, että SIM2 voi olla metabolinen seurauksia. Olemme arvioineet tuotannon PC3 solujen 255 aineenvaihduntatuotteiden, jotka käsittävät useita ihmisen aineenvaihdunnan reittejä. Näiden, tulokset saatiin 239 metaboliitteja. Meidän analyysi osoitti merkittäviä muutoksia aineenvaihduntatuotteita, jotka muodostavat keskeiset reitit, kuten puriini- ja pyrimidiini- polkuja.

vastustamisesta SIM2 lyhyitä isoformin (SIM2s) antisense-oligonukleotidit vähensi kasvainten kasvua koolonkarsinoomasoluissa ja indusoi CAPAN-1 haima- solukuolemaa apoptoosin kautta [7], [8], [9]. SIM2s myös raportoitu olevan aggressiivinen eturauhassyöpä biomarkkereiden lähtien SIM2s proteiini liittyy lisääntynyt preoperative seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA), korkea histologinen luokka, invasiivisia kasvaimen kasvu ja kasvainsoluproliferaation [13]. Tuore tutkimus osoitti, että SIIM2s voivat heikentää solukuoleman prosesseja BNIP3 sorto PC3AR + soluissa. Kuitenkin knockdovvn SIM2s rintasyövän MCF-7-solujen määrä nousi kasvaimen kehittymisen ja siten osoittivat kasvaimia estävä aktiivisuus [32], [33]. Useimmat aiemmat tutkimukset keskittyi SIM2s joko sekaantumatta tai knockdovvn SIM2s, meiltä puuttuu tietojen selvennetään toiminnallista roolia SIM2 proteiinia mukaan lukien sen isoformit. Meidän tutkimuksessa raportoitiin yhdistetty rooli sekä isoformien SIM2 osallisena eturauhassyövän solu. Erottaminen roolit SIM2s ja SIM2L voi olla enemmän syvällinen merkitys ymmärtää toiminnallista roolia SIM2 eturauhassyövän etenemistä, joka on meidän seuraava askel paljastaa enemmän merkitystä tämän geenin.

tukeminen Information

Kuva S1 .

Ohimenevä vaiennettu SIM2s ja SIM2L ilmaisun PC3-soluissa. PC3-solut transdusoitiin joko ohjaus (Ctrl) tai shRNA51 (SH51) ja viljeltiin puromysiinin läsnä ollessa ja 3 päivää. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena arvioimiseksi geenin ilmentymisen SIM2 s (ylempi ruutu) ja SIM2L (alempi ruutu).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s001

(TIF)

Taulukko S1.

Top säädeltyyn signaalireaktioteissä SIM2

alhainen soluja. Top väärin säädellystä kanoninen polkuja tunnistettiin analysoimalla differentiaalisesti ilmaisi geenin tietoja käyttämällä Ingenuity Pathway Analysis paketti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s002

(DOC) B Taulukko S2.

molekyylien Korkein tulos Networks SIM2

alhainen soluja. Data edustaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien toimitettiin Ingenuity Pathway Analysis paketti ja korkeat pisteet verkkojen tunnistettiin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s003

(DOC) B Taulukko S3.

Luettelo käytetyt alukkeet RT-PCR kvantitoimiseksi ilmentymisen valittujen geenien. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Pimer3 ohjelmaa: https://frodo.wi.mit.edu/primer3/.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s004

(DOC)

Taulukko S4.

Gene ilmauksia, jotka olivat joko ylä- tai alassäädetty suurempi kuin 2-kertaiseksi SIM2

alhainen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s005

(XLSX) B