Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Signaalitransduktiota verkot ovat yhä tutkitaan matemaattista mallintamista lähestyy niistä kullakin on sopiva erityinen ongelma. Sillä asiayhteyksiä ja analysointi signaloinnin verkkojen vakaan tilan proteiini data tunnistimme probabilistic Looginen verkko (PBN) lupaavana kehys, joka voisi kaapata määrälliset muutokset molekyylitason muutoksia vakaan tilan minimaalinen parametroinnin.

tulokset ja johtopäätös

meidän tapaustutkimus, me menestyksekkäästi soveltanut PBN lähestymistapa mallintaa ja analysoida vapautuneilla verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) signalointireitin in GASTROINTESTINAALINEN STROOMAKASVAIN (GIST). Olemme kokeellisesti määritetty rikas ja tarkka aineisto vakaan tilan profiilit valittujen alavirtaan kinaasien PDGF-reseptorin alfa mutantteja yhdessä estäjän hoitoja. Soveltamalla työkalu

optPBN

, me asennettu kirjallisuudesta peräisin olevaa ehdokasta -verkostomalli koulutusta aineisto koostuu yhden hämminki olosuhteissa. Malli analyysi ehdotti useita tärkeitä ylikuulumisen vuorovaikutusta. Voimassaoloaikaa nämä ennustukset tutkittiin tarkemmin kokeellisesti osoittaa asiaa meneillään ylikuulumisen PI3K ja MAPK signalointi kasvainsoluissa. Hienostunut malli arvioitiin validointi aineisto sisältää useita häiriön olosuhteissa. Malli siten osoittivat erinomaista suorituskykyä, jonka avulla voidaan määrällisesti ennustaa kombinatorisista vastaukset yksittäisistä hoitotuloksia tämän syövän ympäristössä. Vakiintuneet

optPBN

putki on myös laajasti sovellettavissa ymmärtää paremmin muita signalointi verkkojen vakaassa tilassa on asiayhteyskohtaisia ​​tavalla.

Citation: Trairatphisan P, Wiesinger M, Bahlawane C , Haan S, Sauter T (2016) todennäköisyyksiin Boolen Network toimintamalli Analysis of Cancer-Specific merkinanto: Tapaustutkimus on vapautettiin PDGF Signalling GIST. PLoS ONE 11 (5): e0156223. doi: 10,1371 /journal.pone.0156223

Editor: Julio Vera, University of Erlangen-Nürnberg, Saksa

vastaanotettu: 21. 2016 Hyväksytty: 11. toukokuuta 2016 Julkaistu: toukokuu 27, 2016

Copyright: © 2016 Trairatphisan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki avustusten F1R-LSC-PUL-09PDGF ja F1R-LSC-PUL-11PDGF yliopiston Luxemburg. Panuwat Trairatphisan on vastaanottaja apurahojen jakamaa Fonds National de la Recherche Luxemburg (AFR lupanumeroon 1233900). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Signaalitransduktiota verkot ovat yksi keskeisistä toiminnallisten kerrosten soluissa. Ne välittävät sisäisen ja ulkoisen solun signaaleja kohti sääntelyviranomaiset jotka moduloivat ilmentymistä solun fenotyyppejä vastaavat tyypit ja pitoisuudet ärsykkeiden [1]. Yleensä signaalitransduktion verkko on suuri ja erittäin monimutkainen verkko, joka käsittää useita solunsisäisiä signaalireittejä, jotka ovat, kuten mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien (MAPK), fosfatidyyli-inositide-3-kinaasien /AKT /nisäkkään-target-of-Rapamysiiniä (PI3K /AKT /mTOR), ja fosfolipaasi C-gamma /proteiinikinaasi C (PLCγ /PKC) reitit [2]. Lisäksi on olemassa useita ylikuulumisen välinen vuorovaikutus näiden signalointireittejä jotka auttavat hienosäätää signaaleja ja säilyttää koko verkkojen eheys upon häiriöt [3-5]. Fysiologisessa tilassa signaalit erilaisiin ärsykkeisiin on integroitu ja transdusoitiin säädellä solun toimintoja ja ylläpitää homeostaasia solukomponenttien [6]. Kun siirto prosesseja nämä signaalit vapautettu, tulokseksi poikkeava signaalit johtavat usein poikkeavuuksia solujen toimintoja, jotka todettiin etiologian monien sairauksien, mukaan lukien hermostoa rappeuttavien sairauksien, metaboliset sairaudet, sekä syövät [7-9].

ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) ovat yleisimpiä ensisijainen mesenkymaalisten neoplasia ruoansulatuskanavassa. Nämä kasvaimet yleensä syntyvät vahvistuksen funktiona mutaatioiden tyypin III reseptorityrosiinikinaasien, eli KIT 78-90%: ssa tapauksista ja verihiutaleiden kasvutekijän alfa (PDGFRα) 5-7%: ssa tapauksista [10]. Kuten konstitutiivisesti aktiivinen pinta-reseptoreihin, nämä mutatoidut proteiinit ovat kaikkein alkupään komponenttien matkapuhelinverkon signaalitransduktion verkkoon. Ensilinjan hoitoa GIST on kirurginen resektio yhdistetään annon imatinibimesylaatti, tyrosiinikinaasin estäjän kanssa toimintaa vastaan ​​ABL, BCR-ABL, KIT, ja PDGFRα /β. Kliininen tulos ensilinjan hoito on 35% -49% 9 vuotta selviytymisen [11]. Tietyt pistemutaatiot GIST, esim. aspartaatti (D) valiini (V) mutaatio aminohapossa 842 on

PDGFRA

geeni, osoitettiin myös olevan yhteydessä lääkeresistenssi [12]. Hypoteesit ehdotti selittämään taustalla molekyylitason mekanismeja onkogeenisten PDGFRα perustuvia GIST muodostumisen kuten säilyttäminen onkogeenisten PDGFRα vuonna solunsisäisiin osastoihin [13] tai vapauttamisen alavirran onkogeenisten signalointireittien, katso myös [14]. Oletukset vaativat vielä lisätutkimuksia molekyylitasolla ymmärtää, miten signaalit transdusoitu ja käsitellään mekaanisesti tässä syövän ympäristössä.

Viime vuosina eri mallintamismenettelyissä systeemibiologiassa sovellettiin mallintaa ja analysoida ominaisuuksia signaalin transduktio verkkojen sekä fysiologisia ja patologisia tiloja. Tämä sisältää Bayes-verkot [15], Boolen verkot (BNS) [16], sumea logiikka mallit [17], tavallinen differentiaaliyhtälö (ODE) -pohjaisen mallit [18], osittaisdifferentiaaliyhtälö (PDE) -pohjaisen mallit [19] ja myös stokastisia malleja [20], luetella vain muutamia esimerkkejä. Jotkut mallinnuksen osoitti myös yhteyksiä vapauttamisen signaalitransduktion verkkojen patofysiologian sairauksien, esim. in aineenvaihduntasairaus [21] ja syöpien [22]. Valinta sopiva mallinnus puitteet on riippuvainen tutkimuksen kysymyksiin ja niihin liittyvät sovellukset.

Tutkimuksessamme pyrimme arvioimiseksi, ehdotetun ylikuulumisen vuorovaikutusten kirjallisuudesta yhteydessä vapautettu verihiutaleiden kasvutekijä ( PDGF) signalointia ruuansulatuskanavan stroomakasvain (GIST), joka perustuu vakaan tilan proteiini data. Kokeellisen osan, tutkimme yhdistelmä erilaisia ​​PDGFRα mutanttien ja signalointi pienmolekyylisalpaajien leikellä molekyylirakenteen vapailla PDGF signalointireitin ja tuottaa laajan vastaavat tarvittavat vakaan tilan proteiini data. Mallintamiseen osa, haimme probabilistic Looginen verkko (PBN) mallinnus, alun perin käyttöön Shmulevich et al. mallintaa geeniregulatiivista verkkojen yhteydessä epävarmuus [23], arvioida ylikuulumisen osuvuutta PDGF signalointi. Kun todennäköisyyksien on Boolean vuorovaikutteisuuden binarised tilan PBN pystyy kuvaamaan yksittäisiä sääntelyn vaikutuksia koodataan Boolen säännöt stokastinen tavalla ja soveltuu siten määrittämiseksi epävarma merkitystä ylikuulumisen vuorovaikutusta. Lisäksi molekyyli toimintaa vakaassa tilassa voidaan myös esittää vakaan tilan jakautuminen PBN puitteissa, joiden avulla ne voivat olla suoraan verrattuna normalisoitu (ei diskretoidaan) vakaan tilan proteiini data. Katso äskettäistä katso [24].

lisäksi PBNs on todettavissa monia muita mallintamistapoja tutkimiseen signaalitransduktion verkoissa. Kuitenkin jokainen niistä on joitakin haittapuolia, kun sitä sovelletaan tässä tapauksessa tutkimuksessa. Kuvaavat yhteydet molekyylejä kanssa ehdolliset todennäköisyydet on Bayes-verkot puitteet ilmaista suhteet määrällisesti, mutta tällaiset arvot eivät kaapata taustalla sääntelymekanismien molekyylien välillä, jotka voidaan yksinkertaistaa ja koodataan Boolen säännöt. Looginen verkot voivat kuvata sääntelymekanismit biokemiallisten vuorovaikutusten logiikka toimijoille. Kuitenkin tulokset eivät kerro tarkempia asteikolla määrällinen yksityiskohtia molekyyli kinetiikkaa. Variantti monet-arvostetaan logiikkaa verkot mahdollistavat hienosäädetymmin kuvaus molekyylien valtioiden, mutta silti kärsivät luontainen deterministinen luonteeltaan ja ei salli kaapata epävarmuus verkon vuorovaikutusta. Laajennukset Boolen verkkojen, esim. lisäämällä epävarmuutta verkon valtioissa (esim. antamalla satunnainen alkuehdot ja /tai satunnaisia ​​sekvenssejä panosten) ja varastointiin stokastiset tuloksia useilta ajoja voitaisiin soveltaa myös johtaa määrällisiä toimenpiteitä samasta järjestelmästä [6,25]. Kuitenkin yksi on nimenomaan asettaa näitä muiden näkökohtien päälle tavanomaisen Boolen verkon puitteissa, kun todennäköisyyksiin ominaisuus on jo integroitu alkuperäisen PBN lähestymistapaa. Enemmän kvantitatiivisia lähestymistapoja, kuten sumeaa logiikkaa tai ODE perustuvia malleja tarjota lisää mekanistinen yksityiskohtia verkkojen jatkuvalla asteikolla. Ne vaativat kuitenkin laajan määrän aiempaa tietoa määritellä sopiva matemaattinen kaava ja vaativat laajan joukon kokeellista tietoa voidakseen päätellä kineettiset parametrit.

Mitä PBN joka kuuluu ryhmään todennäköisyyksiin logiikkaa mallien , muut asiaan liittyvät mallintamistapoja samaan ryhmään kuten Dynamic Bayes-verkot (DBNs) ja Markov Tulo verkot (MLN: ää) on myös kuvattu. Kävi ilmi, että analyyttiset tulokset DBNs yleensä antavat samanlaisia ​​tuloksia kuin PBN kun valtio siirtymäkauden kaavio on perustettu [26]. Kuitenkin epälineaarinen toiminta biologisissa verkossa kuten kompleksin muodostumista ei voida suoraan edustaa ehdolliset todennäköisyydet dynaamisissa Bayes-verkko vaikka tällaisen vuorovaikutuksen voidaan yksinkertaisesti koodattu loogisia toimijoiden PBN puitteissa. Lisäksi osoitettiin, että PBNs myös edustettuina Yleisempi Markov Logic verkot (MLN: ää) [27]. Tämä lähestymistapa on usein sovellettu geneettiset tutkimukset, joissa verkon rakenne on pääosin tuntematon ja yhteydet muihin verkon osat voivat olla erittäin tiheä [28]. Kuitenkin, MLN: ää ei ehkä sovi tutkimukseen signaalitransduktion verkkojen meidän tapauksessamme, koska yhteydet molekyylien usein esiintyy yksi-yhteen tai yksi-useisiin tavalla ja suuntaava suhteet molekyylejä ovat enimmäkseen hyvin dokumentoitu. Siksi valitsimme ja soveltaa PBN meidän tapauksessamme tutkimuksessa, jossa voisimme osoittaa, että PBN malli soveltuu analysoidaan merkitystä ylikuulumisen vuorovaikutusta. Lisäksi olemme osoittaneet, että PBN malli voisi myös ennustaa kombinatorinen hoitotulokset yksittäisiltä stimulaation mittauksista suurella tarkkuudella.

Materiaalit ja menetelmät

biologiset materiaalit

PDGFRα-mutantti proteiinit tuotettiin perustuu pLNCX2-PDGFRα villityypin ekspressioplasmidi jalomielinen lahjoitus Prof. Andrius Kazlauskas (Boston). Tämä sekvenssi kloonattiin pcDNA5 /FRT /TO-vektoriin (Invitrogen ™) ja konstitutiivisesti aktiivisen onkogeeninen PDGFRα mutantti esiintyy GIST tuotettiin ottamalla käyttöön D842V pistemutaatio (PDGFRα-D842V-villityypin,

”DV-WT”

). Perustuu PDGFRα-D842V mutantti, kaksi PDGFRα-D842V-

”knock-out”

mutantteja rakennettiin tuomalla tyrosiini (Y) fenyylialaniinin (F) pistemutaatioista eli Y720F (PDGFRα-D842V-Y720F,

”DV-dMAPK”

) ja YY731 /742FF (PDGFRα-D842V-YY731 /742FF,

”DV-dPI3K”

), joiden on osoitettu kumota rekrytointi signalointimolekyylien kuten SHP2 ja PI3K että PDGFRα-villityypin reseptorin, vastaavasti. Kaikki pistemutaatiot otettiin käyttäen QuikChange (Stratagene) noudattaen valmistajan suosituksia.

analysoimiseksi signaloinnin käyttäytymistä mutantti PDGFRα proteiini, joka on isogeeninen Flp-In-™ solulinja rakennettiin perustuu HEK293-solulinja joka on luonnollisesti puuttuu endogeeninen ilmentyminen PDGFRα /β proteiineja. Sellaisenaan, HEK293-solut ko-transfektoitiin Flp-In ™ kohdepaikkaan vektorin (pFRT /lacZeo, Invitrogen ™) ja sääntelyn vektori (koodaa tetrasykliini repressoriproteiinia, pcDNA ™ 6 /TR /Invitrogen) käyttäen Transit®-LT1 transfektioreagenssi (Mirus) mukaan valmistajan suositusten. Cell kloonit valittiin kasvattamalla läsnä ollessa 10 ug /ml Blasticidin ja 100 mikrog /ml Zeocinia ™ (molemmat InvivoGen). Tämän perusteella isogeenisiin vanhempien solulinja ( ”293FR”), stabiileja solulinjoja paikkakohdennetun rekombinaatiolla kotransfektoimalla siirtogeenin ekspressioplasmidin (pcDNA5 /FRT /TO-pohjainen) yhdessä Flp-rekombinaasia ekspressioplasmidin (pOG44, Invitogen). Stabiilisti transfektoidut solut valittiin ja viljeltiin, kun läsnä on 100 ug /ml hygromysiini ja 10 ug /ml Blasticidin [13].

Cell hoitoon ja Western blot-analyysi

Kokeet suoritettiin ymppäämällä 250000 solua /kuoppa (12-kuoppalevylle) DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2% L-glutamiinia, ja 25 mM HEPES 12-kuoppaisille levyille 24-30 tuntia. Sitten kasvualustaa vaihdettiin ja proteiinin ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 5 ng /ml doksisykliiniä (Sigma) mukaisesti seerumin alennetaan (1% FBS) olosuhteissa 14 tunnin ajan ja vielä 3 tunnin ajan seerumivapaassa (0% FBS) olosuhteissa. Farmakologinen inhibitio suoritettiin lisäämällä joko 1 uM, että PI3K-estäjä Wortmanniini, 10 uM ja MEK1,2 inhibiittorin U0126, 1 uM pan-PKC-inhibiittorin GF109203X tai 500 nM PKC-α ja PKC-β1 spesifinen estäjä Gö6976. Wortmanniini ja Gö6976 ostettiin Sigma-Aldrich, kun taas GF109203X ja U0126 hankittiin Calbiochem.

Solut hajotettiin on astia 300 ui 1x Lämmlin puskuria. Solun proteiinien suoritettiin SDS-PAGE, siirrettiin nylon-kalvolle (Amersham Hybond ™ -N /GE Healthcare by ThermoFisher Scientific), blokattiin 10% BSA: ta ja tutkittiin vastaavan vasta-aineita. Alfa-tubuliinin koetettiin myös niin latauskontrollina. Fosfo-spesifisiä vasta-aineita vastaan, ERK1 /2 (pThr202 /pTyr204), PDGFRα (pTyr849) /β (pTyr857), AKT (pSer473) ja PKC substraatteja (pSER) ostettiin Cell Signaling. Fosfo-spesifisiä vasta-aineita Stat5: n (pTyr694) ja PLCγ1 (pTyr783) hankittiin BD Biosciences. Vasta-aineita PDGFRα (C-20) ostettiin Santa Cruz Biotechnology®. Kukin geeli koetettiin samanaikaisesti vastaan ​​alfa-tubuliinin sallia kompensointi lastaus vaihtelut (joko vasta-aine DM1A /Santa Cruz Biotechnology® tai PA1-38814 /Pierce ™). Toissijainen vasta-aineet kytkettiin IRdye, jolloin kuvantaminen LI-COR Odyssey järjestelmä. Suhteellisten intensiteettien Western blot kuvien kvantitoitiin Image Studio Lite-versio 4.0 käyttämällä vasen-oikea ja top-bottom tausta vähennyslasku. Kokeet tehtiin 3 biologinen rinnakkaisena 3 teknisiä rinnakkaista kustakin Western blot. Kalibraattori näyte valmistettiin varhaisessa kulkua DV-WT solulinja indusoi 5 ng /ml doksisykliini.

Normalisation putki ja aineistot mallintamiseen

Lähtien saatu raaka kokeelliset tiedot, laadukkaan ohjaus askel levitettiin luopumalla 1) datapisteille päällekkäisyydet epäspesifisiä tahrat ja 2) datapisteitä alhainen signaaleja johtuen blotting kysymyksiä. Lisäksi tiedot pistettä vastaavan tubuliinin signaali on alle 20 prosenttia verrattuna maksimisignaalissa samassa blot poistettiin analyysistä alhaisten signaalikohinasuhde.

Jäljellä olevat tiedot kohdat olivat ensin normalisoitiin tubuliinia (lastaus valvonta) ja sitten kalibraattori näyte korjaamiseksi erojen useiden blots. Normalisoitu keskiarvo teknisten kolmena rinnakkaisena kustakin biologisesta rinnakkaisnäytettä yhdistettiin ja uudelleen normalisoitu maksimiarvo luo lopullinen keskiarvo ja keskihajonta mallintamista tehtävään.

Jaoimme lähtökohtaisista kokeellista tietoa kahteen osaan . Koulutus aineisto koostuu 6 koeolosuhteissa myös negatiivinen kontrolli (kaikki signaalit oletetaan olevan nolla), positiivinen kontrolli (DV-WT) ja 4 koeolosuhteet yhdellä häiriöitä mukaan YF pistemutaatioita (DV-dMAPK ja DV-dPI3K) tai signalointi estäjät ( DV-WT-Wortmanniini ja DV-WT-U0126). Validointi aineisto käsittää 4 jäljellä koeolosuhteissa yhdistettyä häiriöitä.

Literature johdettuja PDGF signalointiverkolla

Rakensimme mutantti PDGF signalointiverkon lukien suuret loppupään signalointireittejä myös MAPK, PI3K /AKT /mTOR, PLCγ /PKC reitit sekä Stat5: n kuin toinen merkittävä signalointi tavoite alavirtaan onkogeenisel- mutantti (mutta ei alavirtaan villityypin reseptori) [13]. Vuorovaikutukset ja sääntelymekanismit mallinnettiin mukaan vakiintunut tieto [29,30]. Rekrytointi sivustot ylävirtaan signaloinnin molekyylien PDGFRα kuvattu aikaisemmin [31,32]. Niistä kolme suurta alavirran signalointia reittejä PDGF signalointi, on olemassa myös useita ylikuulumisen vuorovaikutusten ehdotti kirjallisuudessa lueteltu taulukossa 1. Lisäksi lisäksi kuvaa estäjien vaikutusten pääasiallista tavoitteista, olemme myös tiedot off-tavoite vaikutus Wortmanniini tavanomaisten PKC [33], joka saattaa olla välttämätöntä selittää saatua signalointi profiilien yhteydessä GIST.

PBN kuvaus PDGF signalointiverkolla

perustuen topologiasta kirjallisuudesta johdettujen PDGF signalointiverkolla, rakensimme vastaava PBN malli, joka käsittää 27 solmua (molekyylit) ja 40 reunat (vuorovaikutuksia). Useita vuorovaikutusta ohjaamalla yhdelle solmulle mallinnettiin erotettiin Boolen säännöt vastaavan valinnan todennäköisyydet. Olemme soveltaneet Looginen portti ”tai” yhdistää ei-yksinomaisen tuloa samaan luokkaan samalla estoja edustivat yhdistetty ”AND” ja ”EI” portteja. Lisäksi poimintatodennäköisyydet Boolen säännöt, jotka edustavat Haitallisia oli osoitettu olevan korkea lippu ”H”, kun taas on kiinnitetty pieni lipun kanssa ”L” kaikille crosstalk vuorovaikutusta. Tässä tehtävässä varmistaa, että optimoitu valinta todennäköisyydet vuorovaikutukseen (t) kanssa lippu ”H” on aina suurempi kuin vuorovaikutukseen (t) kanssa lippu ”L”. Esimerkiksi, jos on kaksi aktivoimalla vuorovaikutusta ohjaamalla kohti yhden kohdesolmun vaikka yksi on päässä polku ja toinen on peräisin ylikuulumisen vuorovaikutus, sidottu optimoidun valinnan todennäköisyys tärkein vuorovaikutuksen (lippu ”H”) on +0,5-+1,0 kun se on 0-0,5 varten ylikuulumisen vuorovaikutukseen (lippu ”L”). Tämä toteutus on integroitu uusimman version

optPBN

Toolbox (versio 2.2.3) saatavilla https://sourceforge.net/projects/optpbn. Koko joukko mallin kuvauksista ja täytäntöönpanoa Boolen sääntöjen mukaan luettuna luovutus ”H” ja ”L” lippuja löytyy S1 File ja laskennallinen skriptit ja PBN malleja, sekä esimerkkinä tulokset sisältyvät S2 File.

optimointi

soveltanut grid-pohjainen versio

optPBN

Toolbox (versio 2.2.3) suorittaa optimointi ja analyysi [39]. Malli kuvaus PDGF signaloinnin verkon PBN muodossa yhdistettiin vakaan tilan mittaustiedot 6 signalointimolekyylien myös fosforyloidun muodot PDGFRα, sekä PLCγ, sekä Stat5: n, PKC substraattien, sekä ERK1,2, ja AKT: , tuottaa optimoinnin ongelmaa. Tavoitteena optimointi on tunnistaa valinnan todennäköisyydet kunkin Boolen vuorovaikutuksen PBN malli palata vakaassa tilassa ominaisuudet, eli paikallaan jakaumat molekyyli valtioiden, jotka vastaavat mittaustiedot.

optPBN

puitteet, me edustavat dynamiikka PBN kuin ergodic Markovin ketju, jossa voimme varmistaa ergodisuus tuomalla pienenä häiriönä parametri ”p” satunnaisesti hämmentää todetaan [40]. Tuloksena ergodic Markovin ketju on siis

redusoitumatonta

(kaikki tilat voidaan saavuttaa muulla valtiot) ja

jaksottomien

(kaikki tilat voidaan uudelleen joka epäsäännöllisesti tavalla) siten jolla ainutlaatuinen kiinteät jakelu riippumatta alkuperäiseen ehtoja. Kahden valtion Markovin ketju lähestymistapa on sittemmin sovellettu lukumäärän määrittämiseksi riittävästi aikaa toimiin päästäkseen vakaassa tilassa ja lähentää syrjäytyneitä vakaan tilan jakautuminen jokaisen lähdön tila tietyllä tarkkuudella [41] (ks myös putkilinjan kuvassa 1). Kaikki parametrien arvot valittiin mukaan edellisessä tutkimuksessa [39] eli häiritseekin parametri ’p’ = 0,001, välillä tarkkuus parametrin r = 0,025, ja todennäköisyys saada tuloksia rajatulla tarkkuudella ’s’ = 0,95, varmistamaan luominen ergodic Markovin ketjujen perustuu satunnaisen häiriöitä, kun vakaan tilan jakautuminen kunkin solmun oli minimaalisesti häiritsi ja lähentäminen vakaan tilan jakauma on melko tarkka. Viimeisessä vaiheessa, neliön summan error (SSE) verrataan simuloitua molekyyli valtioiden ja mittaustietoja laskettiin indikaattorina hyvyys fit.

dynaaminen käyttäytyminen PBN malli edustettuina Markovin ketju. Pieni häiriön parametri ’p’ otettiin käyttöön varmistaa ergodisuus vastaavan Markovin ketju, joka on muuttunut

redusoitumatonta

(kaikki tilat voidaan saavuttaa muulla valtiot) ja

jaksottomien

(kaikki valtiot voidaan uudelleen joka epäsäännöllisesti tavalla) siten jolla ainutlaatuisen vakaan tilan jakautuminen riippumaton alkuehdot. Kahden valtion Markovin ketju lähestymistapa on sittemmin sovellettu lukumäärän määrittämiseksi riittävästi aikaa keinoin pääsemään vakaan tilan (burn-in aikana) ja kerätä riittävän suuri määrä näytteitä, jotta voidaan lähentää syrjäytyneitä vakaan tilan jakautuminen antotilojen tietyksi (säädettävä) tarkkuudella. Huomaa useiden arviointeja burn-in aikana ja kerätty näytteet saatetaan tarvita. Arviolta vakaan tilan jakauma vastaa todennäköisyyttä tuotoksen solmu (i) ollessa päällä, eli on 1, määritettynä kerätyistä näytteistä.

tutkittu PBN mallin PDGF signalointi, ylös 27 poimintatodennäköisyydet optimoitiin annetun Grid’5000 infrastruktuurin avulla 160 rinnakkaisia ​​ytimiä (Intel CPU @ 2.50Ghz, 16GB ram). 5000 näytteitä parametrisarjojen arvioitiin kaksi algoritmit, nimittäin differentiaalievoluutiota (DE) ja evoluutioalgoritmin (EA). Kolme kierrosta optimointi suoritettiin jossa havaittiin, että optimoinnin tuloksia syntyy DE algoritmia lähenivät jo jälkeen 1500 toistojen (tulos ei esitetty). Paras sovitus kustannukset siltä DE algoritmi valittiin vertailun istuva laadun välillä mallista riippuvainen yhdessä Akaike Information Criterion (AIC) [42,43] ja F-testi regressiomallin. Keskiarvo ja jakelu optimoidaan valinnan todennäköisyydet perustuvat parhaaseen 500 parametrisarjoihin analysoitiin myöhemmin.

mallintaminen vapailla PDGF signalointi BN ja ODE-pohjainen kehykset

soveltanut

BN /PBN Toolbox

[44] ja

Systems Biology Toolbox 2 (SBTB2) B tarkistus 72 [45] mallintaa ja analysoida vapautetuilla PDGF signalointi GIST myös BN ja ODE kehyksiä, vastaavasti. Mitä mallinnus BN puitteissa, poistimme kaikki negatiiviset palautteita solmun PDGFR, poistetaan pohjapinta toimintaa PTENin ja PDK sekä olettaa, että Wortmanniini ei estä PKC tehokkaasti, jotta saadaan paras mahdollinen sovitus BN puitteissa . Sillä ODE mallinnus, haimme lain massa toimia muuntaa vuorovaikutusta kuvaaja vapautettu PDGF signalointi joukoksi tavallisten differentiaaliyhtälöiden, katso esimerkkiä [20]. Lisäsimme myös deaktivointi /hajoaminen reaktioita ja niiden vastaavat parametrit jokaisen molekyylin tasapainottamiseksi aktivointi /synteesi. 20 itsenäistä optimointi ajojen ODEn mallin suoritettiin käyttäen 50000 parametrisarjoja soveltamalla hiukkasen parven algoritmi (globaali optimiser) ja sen jälkeen testaamalla toinen 50000 parametrisarjoja soveltamalla simpleksialgoritmi (paikallinen optimiser) parametrin välillä 0 100. sopivimmista kustannus ODE mallia verrattiin niitä pois BN ja PBN lähestyy samalla jakelun optimoituja parametreja kaikista 20 optimointiajot verrattiin niitä on PBN mallin. Täydellinen sarja laskennallisen skriptit ja mallinnuksen tulokset on saatavilla https://sourceforge.net/projects/optpbn.

Tulokset

Keskeneräinen esto ja mahdollisen vaikutuksen ylikuulumisen yhteisvaikutuksia ei havaittu kokeelliset tiedot

Tutkimme signalointi profiilit kolmen PDGFRα mutanttien eli DV-WT, DV-dMAPK ja DV-dPI3K kombinatorisen hoitoa kaksi signalointi estäjien, eli Wortmanniini ja U0126. Mukaan tulokset Western blot tutkimuksessa (kuvio 2), solu järjestelmä ja signalointi inhibiittorit toimivat kunnolla. Havaitsimme, että PDGFRα siirtogeenien esitettiin yksinomaan siihen, doksisykliini induktion ja pohjapinta fosforylaation signalointimolekyylien oli hyvin alhainen. Lisäksi, fosforyloitu PDGFRα (pPDGFRα) signaalit havaittiin olevan verrattavissa eri mutanttien (kuvio 2). Tämä havainto pätee myös fosforyloidun Stat5: n (pSTAT5) signaaleja. Fosforyloitu PLCγ (pPLCγ) signaalit laski DV-dMAPK mutantti, joka osoittaa, että SHP-2 rekrytoinnin motiivi Y720 vaikuttaa myös PLCγ aktivointi (katso kuvio 2). Samanaikaisesti, vähentynyt toiminta alavirran signalointimolekyylien, eli fosforyloitu ERK1,2 (pERK1,2) ja fosforyloitua AKT (Pakt) havaittiin mukaisesti on estäviä vaikutuksia YF mutanttien ja signaloinnin inhibiittoreita. Nämä tulokset osoittavat, että kumoamisen rekrytointi sivustojen pistemutaatioita ja signalointi-inhibiittorit toimivat tehokkaasti heidän ensisijainen tavoitteensa. Lisäksi olemme havainneet, että kumpikaan rakenteita meidän solusysteemi eikä estäjä hoitoja käytetään tutkimuksessa vaikuttavat ilmentymistason tutkittujen signalointi komponentit (katso [13] ja S1 kuviossa).

[A], An esimerkiksi joukko raaka tietojen Western blot kokeissa on esitetty kuviossa 2A. Kolme PDGFRα mutantteja, jotka sisältävät D842V pistemutaatio tutkittiin. Yksi mutantti ei sisällä ylimääräisiä YF pistemutaatio, eli villityypin (DV-WT) kun taas kaksi muuta sisältävät joko Y720F (DV-dMAPK) tai YY731 /742FF (DV-dPI3K) pistemutaatioiden joka kumoaa rekrytointisivustoja alkupään signalointi molekyylin MAPK ja PI3K /AKT /mTOR polkuja, tässä järjestyksessä. Nämä koeolosuhteet yhdistettiin hoidon kaksi signaloinnin inhibiittorit, eli Wortmanniini (W) [1 uM], jotka pääasiassa estää PI3K, ja U0126 (U) [10 uM], jotka pääasiassa estää MEK1,2. Doksisykliini käytetään indusoimaan transkription konstitutiivisesti fosforyloidun PDGFRα mutantteja. Koe suoritettiin 3 biologinen rinnakkaisena 3 teknisiä rinnakkaista. Signaalit kalibraattori näyte (C) on johdettu indusoidun DV-WT solulinja varhaisessa passage levitettiin kalibroida suhteellisten intensiteettien välillä Western-blotit. [B] Kootut määrälliset Western blot tiedot on esitetty kuviossa 2B. Signaalit normalisoitiin vastaan ​​tubuliinia ja myöhemmin kalibroidaan kalibraattorin signaaleja. Normalisoitu keskimääräinen teknisten kolmena rinnakkaisena kustakin biologisesta rinnakkaisnäytettä yhdistettiin ja uudelleen normalisoitu maksimiarvo luo lopullinen keskiarvo ja keskihajonta-arvot mallinnustehtävään. Merkitykset kahden datapisteen arvioitiin kanssa Student T-testiä; p-arvo 0,05 (*) ja p-arvo 0,01 (**).

Niistä estäviä vaikutuksia, jotka tutkimme, havaitsimme, että sekä Wortmanniini ja U0126 vähensi fosforylaatiota niiden alavirran signalointia tavoitteensa lähes kokonaan. Sen sijaan DV mutantit ylimääräisiä YF pistemutaatioita toimitetaan vain osittainen esto, esim. signaalien pERK1,2 ja pPLCγ DV-dMAPK mutantit vain vähentynyt puoleen. Samanaikaisesti jotkut todisteet ylikuulumisen vuorovaikutuksen havaittiin aineisto. Esimerkiksi estämällä PI3K wortmanniinilla myös vähensi pERK1,2 signaalin MAPK-reitin, samalla kun estetään MEK1,2 kanssa U0126 lisäksi lisäsi Pakt signaalin PI3K /AKT /mTOR-reitin (kuvio 2B). On huomattava, että rajat asetuksen kautta Wortmanniini eston on vahvempi kuin yksi kautta U0126, jopa 39% vähentynyt pERK1,2 signaalin verrattuna jopa 25% lisääntynyt Pakt signaalin verrattuna käsittelemättömiin olosuhteissa. Myös rajat sääntelyä Wortmanniini on merkittävä 2 ulos 3 mutanttien kun ristissä estävä vaikutus välittyy U0126 oli merkittävää vain DV-WT tilassa (kuvio 2).

lähtötiedot integraation PBN puitteet ehdotti tärkeä ylikuulumisen vuorovaikutuksia ehdokas verkko

integroitu tämän ensimmäisen aineisto osaksi kirjallisuuteen johdettuja PBN malli PDGF signaloinnin soveltamalla työkalu

optPBN

. Rakennemallia ja pilkkominen aineistot on esitetty kuviossa 3. Aluksi aloitimme mallin topologian ilman ylikuulumista vuorovaikutusta tutkia, jos malli, joka sisältää vain suuria kasvaimia synnyttävän reitit olisivat jo riittää sopivaksi koulutusta aineisto. Tulokset osoittivat, että alkuperäisen mallin asennettu hyvin pPDGFR, pSTAT5 ja Pakt tietoja, mutta silti voinut kaapata lasku pERK1 /2 signaaleja jälkeen Wortmanniini hoidon. Lisäksi olemme havainneet, että malli variantti kaikki-tai-ei mitään esto ei sovi hyvin joko pERK1 /2 tai pPLCγ data (katso S2 Kuva).

[A] Malli rakennetta kirjallisuuden -johdannainen PDGF signalointi on esitetty kuviossa 3A. Konstitutiivinen aktiivisuus mutatoidun PDGFRα (mPDGFR) on indusoitavissa doksisykliini (DOX). Alavirtaan mPDGFR sisältää 3 kanoninen solunsisäisiä signalointireitteihin: MAPK, PI3K /AKT /mTOR ja PLCγ /PKC reitit sekä sääntelyn mekanismeja PDGFRα. Lisäksi olemme mukana, Stat5: n, joka on osoitettu olevan melko aktivoida onkogeeninen PDGFRα mutantit [13]. SHP2, PI3K ja PLCγ, merkitty tähdellä, ovat tavoitteita YF mutantteja. Pohjapinta toiminta PTEN ja PDK edustivat bPTEN ja bPDK, vastaavasti. Neljä signalointi estäjiä, ts Wortmanniini, U0126, GF109231X (GF109), ja Gö6976 ja niiden tavoitteita ovat myös kuvattu.