Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiinikinaasi CK2 on usein koholla erilaisia ​​ihmisen syövissä. Hedgehog (Hh) signalointireitin on liitetty kantasolujen ylläpitoon, ja sen poikkeava aktivaatio on ilmoitettu useiden syöpätyyppien, kuten keuhkosyöpä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että CK2 on positiivisesti mukana Hh /Gli signalointi keuhkosyövän solulinjat A549 ja H1299. Ensin havaittu korrelaatiota CK2α ja Gli1 mRNA-tasot 100 ensisijainen keuhkosyöpä kudoksiin. Down-säätely Gli1 ilmaisun ja transkriptioaktiviteettia osoitettiin jälkeen vaiennettaisi CK2α keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi CK2α siRNA alassäädetty ilmentymistä Hh kohdegeenien. Lisäksi kaksi pienimolekyylisiä CK2α inhibiittorit johti annoksesta riippuvan inhibition Gli1 ilmaisun ja transkriptionaalista aktiivisuutta keuhkosyövän soluja. Käänteisesti, pakotetaan ilmentyminen CK2α lisännyt sekä Gli1 ilmaisun ja transkriptionaalista aktiivisuutta A549-soluja. Lopuksi estyminen Hh /Gli mukaan CK2α siRNA vähensi syövän kantasolun kaltainen puolella väestöstä, joka osoittaa korkeamman ABCG2 ekspressiotason. Siten me raportoimme että esto CK2α alas-säätelee Hh /Gli signalointi ja myöhemmin vähentää varsi kaltainen puolella väestöstä ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

Citation: Zhang S, Wang Y, Mao JH, Hsieh D, Kim IJ, Hu LM, et ai. (2012) esto CK2α down-regulation Hedgehog /Gli Signaling mikä alentaa varren-Like Side Population in Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (6): e38996. doi: 10,1371 /journal.pone.0038996

Editor: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 tammikuu 2012; Hyväksytty: 14 toukokuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työtä tukivat National Institutes of Health avustuksen R01 CA140654-01A1 (LY) ja Natural Science Foundation of Guangdong, PRC 2009 (9451008901003072). Olemme myös kiitollisia tukea Kazan, McClain, Abrams, Fernandez, Lyons, Greenwood, Harley Oberman Foundation, Inc; Estate Robert Griffiths; Jeffrey ja Karen Peterson Family Foundation; Paul ja Michelle Zygielbaum; Estate Norman Mancini; ja Barbara Isackson Lung Cancer Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteiinikinaasi CK2 (aiemmin tunnettu nimellä kaseiinikinaasi II) on erittäin konservoitunut seriini /treoniini-kinaasi, joka fosforyloi yli 300-proteiineja [1]. CK2 on hetero- rakenne, joka koostuu kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä (42 kDa α tai 38-kDa α) ja sääntelyn alayksikkö (28 kDa: n β), joka muodostaa kokoonpanoissa α2β2, αα’β2 ja α’2β2. CK2 on monitoiminen proteiinikinaasi [2], joka on osoitettu olevan mukana lähes kaikessa solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [3], [4], [5]. Taso CK2α ilmentymisen säädeltyä normaaleissa soluissa [6], ja nousi CK2α tasolla, ja aktiivisuus on johdonmukaisesti havaittu erilaisissa ihmisen syövissä [7], [8], [9]. Esimerkiksi korkea taso ja /tai ydinvoiman lokalisoinnin CK2α on merkkiaine huono ennuste potilaille, joilla on akuutti myelooinen leukemia, krooninen lymfosyyttinen leukemia, eturauhassyövän ja mahasyövän [10], [11], [12], [13] . CK2 vaikuttaa myös useita soluviestitykseen reittejä, kuten PI3K, NFkB ja Wnt [6], [14], [15].

Hedgehog (Hh) perheen eritettyjä proteiineja, joka koostuu Sonic, Indian ja Desert Hedgehog, on merkittäviä rooleja nisäkkään kehittämiseen ja kantasolujen ylläpitoon [16], [17]. Aktivointi Hh-reitin aloitetaan solun pinnalla, että Hh ligandin sitoutumista sen reseptoriin Patched (PTC), jolloin derepressiota efektori-proteiinin, G-proteiiniin kytketty reseptori, Smoothenedin (Smo) [18]. Lopulta Smo aktivoi Gli perheen transkriptiotekijöiden ja kohdegeenien. On olemassa kolme Gli proteiineja ihmisillä: Gli1 toimii aktivoida Hh kohdegeenien, Gli2 toimii sekä aktivaattorin ja repressorina Hh kohdegeenien, kun taas Gli3 toimii repressorina Hh kohdegeenien [19], [20]. Vapauttaminen Hh /Gli signalointi on osallisena kuin alku- tai ylläpitäminen tekijä etenemistä eri syöpien, kuten tyvisolusyöpien medulloblastoomien, leukemia, keuhkosyöpä, ruoansulatuskanavan, keuhkon, munasarja-, rinta- ja eturauhasen syöpiä [19], [21]. Esimerkiksi Gli1 geeni monistetaan ihmisen gliooman ja aktivoitu tyvisolusyöpä [22], [23], [24]. Siirtogeenisiä yli-ilmentyminen Gli1 hiirissä johtaa kehityksen tyvisolusyöpä [25]. Gli1 aktivointi on osoitettu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin ja kudoksiin [26].

Direct todisteita siitä, että Hh /Gli signaloinnin tärkeä rooli syövän kantasoluja (CSCS) peräisin sarjasta tutkimuksia eri kasvaintyypeissä [21]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ATP-sitova kasetti kuljettaja jäsen 2 G perheen proteiinin (ABCG2) on suora transkription kohteena Hh /Gli signalointi [27]. Alapopulaatio, nimeltään puoli väestöstä (SP) korkeamman ABCG2 ilmentymistaso ihmisen syöpäsoluja lukien keuhkosyövän A549-soluja, osoitti sarja CSCS ominaisuuksien [28], [29], [30]. Useat linjat tuoretta näyttöä viittaavat siihen, että hedgehog-signalointia säätelee varsi kaltainen puolella väestöstä ihmisen keuhkosyövän soluja. Esimerkiksi puolen väestö keuhkosyövän solulinjasta H460 ensisijaisesti ilmentää ABCG2 ja SMO, kriittinen välittäjänä siilin signalointi. Syklopamiinia, luonnollinen hedgehog-reitin estäjä, suuresti estää solusyklin etenemisen ja solujen lisääntymistä H460 solulinjan [30]. Syklopamiinia myös vähensi puolella väestöstä ihmisen syöpäsoluja [31]. Lisäksi Hedgehog-reitin estäjä GDC-0449, joka on FDA: n hyväksymä lääkeaine metastaattisen tyvisolusyöpä, vähentää tehokkaasti solujen kasvua ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Vaikutus välittyy eston varren kaltainen puolella väestöstä [32].

Toistaiseksi ei ole näyttöä, että suhde CK2 ja Hh /Gli signalointi nisäkässoluissa. Sen tutkimiseksi, CK2 on mukana Hh-reitin ihmisen keuhkosyövän soluja, testasimme aktiivisuus Gli1 jälkeen CK2 esto.

Tulokset

CK2α ja Gli1 Geenit aktivoituvat ja Correlated Human NSCLC

sekä CK2α ja Gli1 geenien on osoitettu olevan yliekspressoitu erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien keuhkosyöpä [26], [33]. Käyttämällä semikvantitatiivista RT-PCR: llä (kuvio 1A) ja Western blot-analyysillä (kuvio 1 B), olemme tutkineet CK2α geenin ja proteiinin kahdeksan NSCLC solulinjoissa. Tiedot osoittivat, että CK2α ilmentyy kaikissa näissä syöpäsoluissa. Niistä, vähintään viisi solulinjoja (A549, A427, H1299, H358 ja H838) osoitti suhteellisesti suurempi ilmentyminen CK2α sekä mRNA ja proteiini tasoilla. CK2α ekspressio on aiemmin osoitettu olevan vähäinen normaaleissa keuhkojen soluihin [34]. Gli1 geeni ja proteiini ilmaisuja Laajaa havaittiin kaikissa solulinjoissa, paitsi H358. On kiinnostavaa, että näytti olevan korrelaatiota ilmentymisen CK2α ja Gli1 näissä solulinjoissa. Suoritimme reaaliaikainen RT-PCR CK2α ja Gli1 100 ensisijainen NSCLC näytteitä. Mieto korrelaatio CK2α ja Gli1 mRNA-tasot havaittiin näissä kudoksissa (r = 0,37,

P

0,05) (kuvio 1 C). Myöhemmin kokeellisiin tutkimuksiin, A549 valittiin, koska aseman syöpään liittyvien reittejä A549-soluja on ollut hyvin tunnettu. H1299 valittiin myös, koska se on suhteellisesti korkeampi ilmentyminen CK2α ja Gli1 geenejä.

(A) RT-PCR: llä. (B) Western blot. CK2α geeni aktivoituu kahdeksan NSCLC solulinjoissa tutkittiin (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 ja H322), ja Gli1 geeni ilmentyy kaikissa solulinjoissa, paitsi H358. (C) Lineaarinen korrelaatio käyrä CK2α ja Gli1 mRNA-tasoja. Mieto korrelaatio (r = 0,37,

P

0,05) oli esillä lineaarinen korrelaatio analyysi SPSS. Ensisijainen NCSCL kudoksia potilailta, joille suoritetaan resektio kerättiin leikkauksen aikana ja heti snap-jäädytettiin nestetypessä. Nämä kudosnäytteet pidettiin -170 ° C: ssa nestemäisen typen pakastimen ennen käyttöä.

CK2α pudotus Estää Hh /Gli signalointi alas-säätely Gli1

Sen tutkimiseksi, CK2 tukahduttaminen vaikuttavat Hh-reitin, me vaiennetaan CK2 ilmaisua käyttäen CK2 alayksikköä-erityisiä siRNA. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, tehokkuus RNA-häirintää seurattiin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (kuvio S1). Vastaavan mRNA: n tasot kolme alayksikköä vähentynyt, ja pudotus on α ja α ’varmistettiin kotransfektoimalla niiden siRNA: iden. Ilmaus ilmoitettu Hh-reitin komponenttien määritettiin myös (kuvio S2). Kaiken RT-PCR tulokset osoittivat, että PTC1 ja Gli1 mRNA tasot A549 ja H1299 solut olivat jatkuvasti alassäädetty jälkeen CK2α tai CK2β Knockdown, kun taas vähäisiä muutoksia havaittiin muissa Hh-reitin osia. Reaaliaikaisella RT-PCR: ää varmistimme, että vaiennettaisi CK2α estivät merkittävästi Gli1 ilmaisua sekä A549- ja H1299 solulinjoissa (kuvio 2A). Hiljentäminen CK2β myös johti merkittävään lasku Gli1 molemmissa solulinjoissa (kuvio 2A). Lisäksi, Gli1 ekspressio oli vähäistä normaalin keuhkojen ohjaus. Proteiinitasolla, hiljentämisen CK2α johti 71% (A549) ja 73% (H1299) lasku Gli1, kun taas silencing of CK2β johti 67% (A549) ja 35% (H1299) lasku Gli1. Hoidon CK2α’ kohdistaminen siRNA tuottanut mitään ilmeistä eroa, eikä lasku Gli1 A549, ja tuotti 60%: n nousu H1299, sekä mRNA ja proteiini tasoja (kuvio 2B). Lisäksi olemme suoritetaan immunofluoresenssivärjäyksen monoklonaalisella anti-Gli1-vasta-aine, koska ydinvoiman lokalisointi Gli1 heijastaa aktiivisuus Hh-reitin [35]. Nuclear Gli1 proteiinit laski jyrkästi, kun läsnä on CK2α siRNA (kuvio 2C). Lisäksi vaimentaminen CK2α johti merkittävään laskuun (45% 25 uM ja 60% 50 uM, P 0,01) on Gli1-kasvatti Gli reportteriaktiivisuutta, verrattuna ei-kohdistuksen siRNA (kontrolli) (kuvio 2D) .

(A) Quantitative Gli1 mRNA-tasot hoidon jälkeen CK2 alayksikön erityisiä siRNA havaitsee reaaliaikaisen RT-PCR. Hiljentäminen CK2α vähensi Gli1 mRNA-tasoja sekä A549- ja H1299 solulinjoissa (50% ja 45%, tässä järjestyksessä). Hiljentäminen CK2β myös johti merkittävään lasku Gli1 molemmissa solulinjoissa. Vähäinen Gli1 mRNA tasolla havaittiin normaalissa keuhkoissa (NL). *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (B) Protein tasot havaittiin Western blot. Hiljentäminen CK2α johti 71% (A549) ja 73% (H1299) vähentäminen Gli1, kun taas hiljentäminen on CK2β johti 67% (A549) ja 35% (H1299) lasku Gli1. Käsittely CK2α’ kohdistamisen siRNA tuottanut mitään ilmeistä eroa, sen sijaan lasku Gli1 A549-, ja tuotti 60%: n nousu H1299 sekä mRNA ja proteiini tasoilla. (C) lokalisaatio Gli1 havaita vihreän fluoresenssin. Gli1 proteiini pääasiassa paikantuu ydinvoiman osastoon solujen, ja osoittaa suurta vähennys jälkeen CK2α knockdown. Mittakaava = 30 pm. (D) transkriptionaalista aktiivisuutta Hh-reitin A549 havaita Gli reportterimääritys. Hiljentäminen CK2α johti merkittävään laskuun (yli 40% 25 uM ja 60% 50 uM) transkriptionaalista aktiivisuutta, verrattuna kontrolliin siRNA. *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (E) Quantitative Gli1 mRNA-tasot hoidon jälkeen TBB ja CX-4945 reaaliaikaisella RT-PCR. Gli1 ilmentyminen A549 vähentynyt huomattavasti niillä annostasoilla, 1 uM CX-4945 ja 10 uM TBB, huomattavasti 10 uM CX-4945 ja 50 uM TBB (50% ja 60%). *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (F) Protein tasot havaittiin Western blot. Vuonna proteiini tasolla nämä vähennykset nousi 76% (10 uM CX-4945) ja 89% (50 uM TBB) A549-, ja 81% (10 uM CX-4945) ja 93% (50 uM TBB) in H1299, vastaavasti . (G) Proteiinin ilmentymistä Gli1 havaita vihreän fluoresenssin. Soluja käsittele 30 uM TBB tai ajoneuvon DMSO, immunofluoresenssikokeessa värjäys anti-Gli1 mAb viljellyissä soluissa osoitti selvästi alhaisempi vihreä florescence läsnäollessa 30pM TBB. (Scale bar = 30 pm). (H) transkriptionaalista aktiivisuutta Hh-reitin A549 havaita Gli reportterimääritys. 50%: n lasku havaittiin, kun läsnä oli 10 uM CX-4945 tai 10 uM TBB. *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi.

pienimolekyylisiä CK2α estäjät vaimennussäätelevät Gli1 Expression ja transkriptionaalinen aktiivisuus

edelleen vahvistaa roolia CK2α Hh-reitin, käytimme kaksi pienimolekyylisiä CK2α estäjät: TBB (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole), tunnettu estäjä CK2α [36], ja CX-4945 (5- (3-kloorifenyyliamino) bentso [c] [2], [6] naftyridiini-8-karboksyylihappo), ensimmäisen luokkansa, selektiivinen, suun estäjä CK2α tutkittavana vaiheen 1 kliinisissä tutkimuksissa [37].

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TBB (10, 30, 50 uM) tai CX-4945 (1, 3, 10 uM), tai ajoneuvon DMSO 48 tuntia. Hoitoja TBB tai CX-4945 johti annoksesta riippuva väheneminen Gli1 mRNA: ta ja proteiinia tasot sekä A549 ja H1299 solulinjoissa (kuvio 2E, 2F ja S3). Määrälliset mRNA-tasot havaittiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Kuten on esitetty kuviossa 2E, Gli1 ilmentyminen A549 vähentynyt huomattavasti niillä annostasoilla, 1 uM CX-4945 ja 10 uM TBB, ja laski merkittävästi 10 uM CX-4945 ja 50 uM TBB (50% ja 60%,

P

0,05). Proteiinitasolla, nämä vähennykset saavutti 76% (10 uM CX-4945) ja 89% (50 uM TBB) A549-, ja 81% (10 uM CX-4945) ja 93% (50 uM TBB) in H1299, (kuvio 2F). Immunofluoresenssivärjäyksen monoklonaalisella anti-Gli1 vasta-aineen vaikutus viljeltyihin soluihin osoitti huomattavasti alhaisempi vihreä fluoresenssi, kun läsnä on 30 uM TBB (kuvio 2G). Sitten osoitettiin, että pienet molekyylit inhiboivat Gli reportteri aktiivisuus A549-solulinjan, jossa merkittävä lasku (55%, P 0,01) havaittiin, kun läsnä oli 10 uM CX-4945 tai 10 uM TBB (kuvio 2H). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​sen kanssa, mitä löysimme siRNA tutkimuksissa.

Pakko Yli-ilmentäminen CK2α Gene Johtaa Gli1 Up-asetuksen ja transkription aktivointi

vahvistaa, onko CK2 geeni vaikuttaa positiivisesti transkriptionaalista aktiivisuutta Gli1, transfektoimme A549-soluja joko pcDNA3.1-CK2α tai valvontaa pcDNA3.1-LacZ plasmidia. Kuten odotettua, yli-ilmentyminen CK2α johtui aktivointi Gli1, että A549-solulinja. Yli-ilmentyminen CK2α havaittiin RT-PCR: llä (kuvio 3A) ja Western blot (kuvio 3B). Kohonnut Gli1 mRNA-tasolla havaittiin myös RT-PCR: llä (kuvio 3A). Western blot-analyysi, osoitimme kohonnut Gli1 proteiinin taso (2,35 taittuu) soluissa ektooppiseen yli-ilmentyminen CK2α (kuvio 3B). Lisäksi toimittaja määritys osoitti myös merkittävää ( 2 kippaa, P 0,01) lisäystä Gli1 transkriptionaalisen aktiivisuuden (kuvio 3C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen CK2α geenin johtaa säätely ylöspäin Gli1 geenin ilmentymisen ja transkriptionaalisen aktiivisuuden.

(A) A549-soluja transfektoitiin joko pcDNA3.1-CK2α tai valvontaa pcDNA3. 1-LacZ plasmidivektoreihin, yli-ilmentynyt CK2α ja säädelty Gli1was havaita reaaliajassa RT-PCR: llä. *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (B) Western blot. Proteiini taso Gli1 oli säädelty tässä järjestelmässä, jossa on kaksinkertainen lisäys. (C) Lisäksi reportterimääritys osoitti myös merkittävää (yli 2-kertainen) lisäys Gli1 transkriptionaalista aktiivisuutta. *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (D) In ​​proteiinin hajoaminen analyysi, A549-solut oli vähentynyt Gli1 proteiinia ajanhetkellä 2 tuntia sen jälkeen, kun on käsitelty CK2α siRNA.

vaiennettaisi CK2α Edistää Gli1 Hajoaminen

Olemme edelleen suorittaa aika-kurssi kokeilu tutkia Gli1 puoliaikaa. A549-soluja transfektoitiin CK2α tai ohjaus siRNA, ja Gli1 proteiinin tasot havaittiin ajanhetkellä 0, 1 ja 2 tuntia sen jälkeen, kun hoidon estäjää, sykloheksimidi. Vuonna CK2α pudotus ryhmä, Gli1 proteiinin taso vähennetään vähimmäisaktiivisuus 2 tuntia hoidon jälkeen sykloheksimidillä (verrattuna, että 0 tunnin ajan), mikä ehdotti, että puoliintumisaika Gli1 jälkeen CK2α siRNA pudotus on 2 tuntia. Nämä tiedot osoittavat, että CK2α pudotus johtaa hajoamiseen Gli1 (kuvio 3D). Tämä puolestaan ​​viittaa siihen, että CK2α säätelee Gli1 aktiivisuutta estämällä sen hajoamista.

CK2α Knockdown down-regulation Hh Downstream Geenit ja Vähentää SP Profile kautta ABCG2 A549

Hh kuulemma ohjaa leviämisen useita solutyyppejä erilaisten molekyylimekanismeja ja tavoitteet alavirran geenien, kuten PTC sykliini perheenjäseniä, ja itse induktio Gli1 [20], [38]. Analysoimme mRNA-tasot neljän (Gli1, PTC1, PTC2 ja sykliini E1) näiden geenien käyttämällä reaaliaikaisen RT-PCR: llä (kuvio 4A). Ekspression neljän Hh kohdegeenien väheni merkittävästi (

P

0,05), kun CK2α pudotus, mikä viittaa siihen, masentunut transkriptionaalinen aktiivisuus Hh-reitin.

(A) Hh alavirran geenien ilmentymistä havaitsee reaaliaikaisen RT-PCR. MRNA taso neljän Hh kohdegeeneissä (Gli1, PTC1, PTC2 ja sykliini E1) väheni merkittävästi jälkeen CK2α knockdown. *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin t-testi. (B) ekspressio ABCG2 laski CK2α-vaiennetaan A549-solut. (C) osuus SP-solujen laski 26,8%: sta 15,4%, ja 9,4%: sta 3,4%: n läsnä ollessa 50 uM verapamiilia, vastaavasti. Solut leimattiin Hoechst 33342 ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. (Oikealla) Tulokset, kun solut käsiteltiin 50 uM verapamiilia aikana merkintöjä menettelyn. SP on esitetty, ja esitetään prosentteina koko solupopulaation. Nämä kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. (D) Bar kaavion (C). (E) Malli Hh /Gli1 signalointi säätelee CK2. Yksityiskohdat on kuvattu tekstissä.

On osoitettu, että ABCG2 on ensisijainen tekijä SP fenotyyppi useissa syöpäsolulinjoissa mukaan lukien A549 [28]. SP fenotyyppi on tunnettu joukko tutkimuksia syövän kantasoluja, jotka ovat peräisin eturauhas-, rinta-, paksusuoli-, gliooma, virtsarakon, munasarja, kohdunkaula, ja melanooma [29], [39], [40], [41], [ ,,,0],42]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että ABCG2 on suora kohde Hh-reitin, joka on mukana kantasolujen ylläpitoon [27]. Ensin tutkitaan ABCG2 ilmaisun jälkeen CK2α Knockdown ja totesi, että ABCG2 taso laski jyrkästi CK2α-vaiennetaan A549-solut (kuva 4B). Johdonmukaisia ​​muiden havaintojen suhteellisesti suurempi prosenttiosuus (26,8%) ja A549-solut luokiteltiin SP solut tutkimuksessamme. Läsnäollessa verapamiilin, ABC transporter estäjä, osuus SP solujen laski 9,4%. Hoidon jälkeen CK2α siRNA, osuus laski 15,4% (ilman verapamiili) eli 3,4% (verapamiilin) ​​(kuvio 4C ja 4D). Sitten lajitellaan SP ja ei-SP-soluissa tässä järjestelmässä. Muissa analyysi semikvantitatiivinen RT-PCR, lajitellut SP solut osoittivat korkeampia ilmaus ABCG2 kuin teki kuin SP-soluissa, mutta ei eroa ABCG2 ilmaisun SP tai ei-SP-soluissa osoitettiin välillä CK2α siRNA ja ohjaus (kuvio S4). Lyhyesti, meillä oli 42,5% vähennys SP osuuden jälkeen CK2α knockdown.

Keskustelu

Tuloksemme viittaavat siihen, että CK2 on positiivinen säädin Hh /Gli1 signalointi ihmisen keuhkosyöpä. Tätä tukee useita rivejä todisteita. Ensinnäkin, korrelaatio CK2 ja Gli1 ilmaisuja havaittiin useissa keuhkosyövän solulinjat. Olemme lisäksi osoittaneet lineaarinen korrelaatio 100 ensisijainen NSCLC kudoksiin. Toiseksi estyminen CK2α siRNA tai pienimolekyylisiä estäjiä johti alas-säätely Gli1 ilmaisun ja transkriptionaalisen aktiivisuuden. Kolmanneksi pakko yliekspressio CK2α lisännyt Gli1 ilmaisun ja transkriptionaalisen aktiivisuuden. Lopuksi CK2α knockdown vähensi puolella väestöstä kautta alaspäin säätäminen ABCG2, välitön tavoite Hh /Gli signalointi [27].

Toistaiseksi ei ole näyttöä, että korrelaatio CK2 ja Hh /Gli signalointi ihmisen syöpäsoluissa, vaikka CK2 ehdotettiin positiivisena säätelijänä Hh signaalinvälitysreitin ja kaksi seriini jäämien Smo fosforyloitiin CK2 in

Drosophila

[43]. Tämä mekanismi Smo fosforylaation CK2 ei ilmeisesti soveltaa ihmisiin, koska nämä kaksi Smo jäämiä ei ole konservoitunut ihmisen Smo kun linjassa Clustal W [44] (kuva S5). Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että nisäkkäiden Smo ja

Drosophila

Smo säätelevät perusluonteeltaan erilaisia ​​mekanismeja [45], [46]. Äskettäin, Chen et ai. osoittivat, että nisäkkään Smo aktivoidaan kautta multi-site fosforylaatiota CK1α ja GRK2 ja ehdotti kaksivaiheinen mekanismi Smo fosforylaation nisäkässoluissa [47].

tutkia mahdollisuuksia mekanismi, jonka avulla CK2 säätelee positiivisesti ihmisen Gli1 ilme ja transkriptioaktiviteettia teimme proteiinien hajoaminen määrityksen Gli1 hoidon jälkeen CK2α siRNA. Tuloksemme osoittivat, että CK2 hiljentäminen vähentää puoliintumisaika ihmisen Gil1 proteiinin A549-soluja. Lisäksi sekä CK2 siRNA ja pienmolekyylisalpaajien alassäädetty Gli1 tehostettua transkriptionaalista aktiivisuutta. Lisäksi pakotetaan-ilmentyminen CK2α johti Gli1 transkriptionaalista aktiivisuutta. Lisäksi löytyi kaksi ennustettu CK2 fosforylaatiopaikat ihmisen Gli1 käyttämällä Scansite kanssa keskimääräisen ankarissa [48] (kuva S6). Tuloksemme viittaavat siihen, että CK2 voi säädellä Gli1 ihmisen syöpäsoluja samalla tavalla, että

Drosophila

. Esimerkiksi Jia et al. kertoi, että CK2 suoraan fosforyloi Ci in

Drosophila

, ja sitten estää sen ubikinaation ja hajoaminen [43]. Toisaalta, on ehdotettu, että glykogeenisyntaasikinaasi-3 beta säätelee negatiivisesti Gli1 transkriptiotekijöiden yhteistyötä muiden kinaasien, kuten PKA ja CK1s keuhkosyövän A549-soluja [49]. Siten kaksi vaihetta todennäköisesti mukana positiivinen säätely Gli1 mukaan CK2. Ensimmäisessä vaiheessa estämällä CK2 edistää Gli1 hajoamista, jota seuraa alentunut kertyminen Gli1 ydin- osastossa. Toisessa vaiheessa, kun avain transkriptiotekijän Hh-reitin, alennettu Gli1 proteiinin myöhemmin estää transkription Hh kohdegeenien. Tämä puolestaan ​​muodostaa takaisinkytkentäsilmukan edelleen pienentää ilmentymisen tasoa Gli1, joka toimii kohdegeenin reittiin (kuvio 4E). Vaikka mekanismi CK2 sääntelyn ihmisen syövissä vielä tunneta laajalti on todisteita siitä, CK2 on välttämätön Wnt /beeta-kateniinin signalointi [50], [51]. Esimerkiksi se oli sekaantunut että CK2 voivat sitoa ja fosfory- β-kateniinin ja edistää sen hajoamista [52]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CK2α voi stabiloida ihmisen Gli1 proteiinin suoraan fosforylaatio. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään tarkat mekanismit.

Hh-reitin transkriptiotekijän Gli1 säätelee ilmentymistä ABC transporter proteiinin ABCG2 suoraan sitoutumalla ABCG2 promoottori [27], ABCG2 on molekyyli tekijä SP fenotyyppi ja ilmaisi korkeammilla tasoilla SP-soluissa, verrattuna ei-SP-soluissa [28], [31]. SP solut kuulemma rikastunut syövän kantasoluja, koska ne osoittavat kantasolujen ominaisuuksia (erittäin tumurigenic ja Chemo kestävä). Aiemmat tutkimukset ovat havainneet SP ilmiasuun korkeamman ABCG2 ekspressiotaso ja sekaantunut ABCG2 kuin CSC merkkigeeninä keuhkosyövän A549-soluja [28]. Esimerkiksi SP solujen A549 osoitti enemmän tumurigenic potentiaalia [29]. Tutkimuksessamme kohdegeenin Hh /Gli signalointi ABCG2 oli alassäädetty jälkeen CK2α inhibition, jossa ABCG2-käytettävän puolen väestön vähennettiin myöhemmin. Siten me raportoimme että CK2 osallistuu CSCS huolto säätelemällä Hh /Gli signalointi.

Hh reitti voi avainasemassa ylläpito CSCS, mutta druggable tavoitteet Hh reitti on hyvin rajallinen. CK2 tarjota ylimääräinen tavoite inhibition Hh /Gli signalointi. CK2 estäjillä ei ole laajasti kehitetty terapeuttisina aineina johtuen osittain siitä, että ATP-sitoutuminen taskussa CK2 ei ole niin druggable kuin jotkut muut proteiinikinaaseja [50], [53], [54]. Tähän mennessä vain yksi pienimolekyylisiä CK2 estäjä on kirjattu kliinisiin tutkimuksiin mahdollisena syöpälääkkeen. CX-4945, erittäin selektiivinen CK2 pienmolekyylisalpaaja-, on lupaava ensimmäinen luokkansa suun terapeuttinen aine moniosaisia ​​ihmisen syövissä. CX-4945 näyttää suotuisa turvallisuusprofiili faasin I kliinisissä kokeissa [55]. Lisäksi CIGB-300 (synteettinen peptidi-pohjainen lääke kohdistaminen CK2 phosphoaceptor domain) on osoittautunut turvalliseksi ja kliinisen hyödyn faasin I kohdunkaulan syövän tutkimuksissa [56].

Yhteenvetona raportoimme että CK2 on positiivinen säädin Hh /Gli signalointireitin, sekä esto CK2α alas-säätelee Hh /Gli signalointi ihmisen keuhkosyövän soluja. Koska kasvavaa merkitystä Hh /Gli signalointi kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen, meidän havainnot ovat tärkeä näyttöä mahdollisista hyödyistä CK2 estäjien.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja pienimolekyylisiä hoito

Ihmisen NSCLC solulinjat (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 ja H322) hankittiin American Type Culture kokoelmat (Manassas, VA). Soluja ylläpidettiin rutiinisti RPMI-1640, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 ug /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Kaikki solut rutiininomaisesti viljeltiin 37 ° C: ssa kosteassa inkubaattorissa 5% CO2. Hoidon CX-4945 (Synkinase, San Diego, CA) ja TBB (Sigma, St. Louis, MO) liuotettiin DMSO: iin annettiin useita annoksia (1, 3 ja 10 uM CX4945, 10, 30, 50 uM TBB ). Soluja kasvatettiin väliaineessa 48 tuntia käsittelyn jälkeen.

siRNA ja plasmidi-DNA: n transfektio

CK2α, CK2α ”ja CK2β-spesifisten siRNA: iden (ON-TARGET

plus

SMARTpool) ja valvonta-RNA ostettiin Thermo Scientific (Waltham, MA). Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle, kuten 10

5 solua /kuoppa päivä ennen transfektiota, jossa tavoitteena on saavuttaa 30-50% konfluenssiin aikaan transfektion. Solut transfektoitiin 50 nmol /l siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Riittävä inhibitio siRNA-välitteisen knockdovvn-varmistettiin RT-PCR: llä. PcDNA3.1-CK2α tai valvontaa pcDNA3.1-LacZ plasmidivektoreihin sitten transfektoitiin A549-soluja (0,5 ug /ml 24-kuoppaisella levyllä) käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut kerättiin RT-PCR ja Western blot tai käyttää reportterin määrityksissä 48 tuntia transfektion jälkeen.

RNA: n eristäminen, cDNA Synthesis ja Semi-kvantitatiivinen RT-PCR

eristäminen RNA suoritettiin käyttäen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Human Lung Kokonais-RNA hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA). Viisisataa ng kokonais-RNA muutettiin 20 ui cDNA: ta käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA,) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. PCR-kaistoja visualisoitiin UV-valon alla ja valokuvattiin.

Real-Time RT-PCR

yhteensä 2 ui käänteistranskriptioreaktio käytettiin templaattina reaaliaikainen havaitseminen Gli1 ilmentymisen käyttäen TaqMan Technology Applied Biosystems 7000 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Geeniekspressio kvantifioitiin testattujen geenien (Gli1, PTC1, PTC2 ja sykliini E1) ja endogeeninen kontrolli geenin b-glukuronidaasi (GUSB) käyttäen aluketta ja koetinsekvenssit kaupallisesti (Applied Biosystems).

Western Blot-analyysi, ja immunofluoresenssivärjäys

Koko proteiini uutettiin M-PER Nisäkkäiden Protein Extraction Reagent (Thermo) solulinjoista lisätään fosfataasinestäjällä Cocktail Set II (Calbiochem, San Diego, CA) ja Complete proteaasinestäjä Cocktails (Roche, Lewes , UK) mukaan valmistaa ”protokollia. Proteiinit erotettiin 4-15% gradientti SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bellerica, MA). Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: anti-CK2α (Millipore), anti-Gli1 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-ABCG2 (Millipore), ja anti-GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD). Sen jälkeen, kun on inkuboitu sopivan sekundäärisen vasta-aineita, antigeeni-vasta-kompleksit havaita käyttämällä ECL blotting-analyysi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin. Tutkimus tehtiin Laserskannauksella konfokaalimikroskopia (LSM510, Carl Zeiss, Oakland, CA). Digitaalisia kuvia yhden konfokaali viipaleita valmistettiin käyttämällä Adobe Photoshop 6.0.

proteiinien hajoaminen Assay

CK2α- ja ohjata siRNA-transtected A549-solut altistettiin 50 ug /ml sykloheksimidiä ja korjattu klo ajankohtina 0 ja 6 tuntia. Solun totaali-proteiinit uutettiin ja analysoitiin western blot -analyysillä.

Luciferase Reporter määritykset

mittaamiseksi Gli-välitteistä Hh transkriptionaalisen aktiivisuuden, lusiferaasireportteri rakentaa, 8 x villityypin Gli sitoutumiskohdan (8 x Gli

paino- Luc) tai 8 x mutantti Gli sitoutumiskohdan (8 x Gli

mut Luc) plasmidit [57] ja ihmisen Gli1 ekspressiovektorin (pcDNA3.1-Gli1) kotransfektoitiin A549 solut 24-kuoppalevyllä.

Renilla

lusiferaasia PRL-TK-plasmidia (Promega, Madison, WI), jonka ilmentymistä ohjaa housekeeping tymidiinikinaasigeenin promoottorin, kotransfektoitiin normalisoimaan transfektion tehokkuutta. Kaikki transfektio kokeet suoritettiin käyttäen Iipofectamine2000 (Invitrogen) noudattaen valmistajan ohjeita. 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin, ja lusiferaasin määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [58]. Tulokset ilmaistaan ​​kertainen induktio, joka on suhde lusiferaasiaktiivisuuden indusoituu Gli-transfektoiduissa soluissa suhteessa perustason lusiferaasiaktiivisuus ohjaus transfektoiduissa A549-soluja. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena;