Krooninen sairaus

tiivistelmä

Puretaan transformoivan kasvutekijä-β (TGF) signalointireitin in munasarjan epiteelin syöpä on raportoitu, mutta tarkkaa mekanismia kohde-etuus häirinnyt TGFli signalointia tauti jää epäselväksi. Suoritimme chromatin immunosaostus ja sitä seuraava sekvensointi (chip kohdat) tutkimaan genominlaajuisten seulonta TGFp aiheuttaman Smad4 sitoutumisen epiteelin munasarjasyöpä. Seuraavat TGF stimulaatio A2780 munasarjan epiteelin syövän solulinja, olemme määritelleet 2362 Smad4 sitovan loci ja 318 ekspressoituu differentiaalisesti Smad4 kohdegeenien. Kattava tarkastelu Smad4 sitoutuneen loci, paljasti neljä erillistä sitovia malleja: 1) Basal; 2) Shift; 3) stimuloivat vain; 4) Stimuloimattoman Vain. TGF kannustanut Smad4 sidottuja loci olivat pääasiassa luokiteltu joko stimuloidun vain (74%) tai Shift (25%), mikä osoittaa, että TGF-stimulaatio muuttaa Smad4 sitova kuvioita epiteelin munasarjasyöpä soluja. Perustuen geeniregulatiivista verkostoanalyysi, että annettu TGFli aiheuttama, Smad4 riippuvaa sääntelyverkon oli silmiinpistävän erilainen munasarjasyöpää verrattuna normaaleihin soluihin. Tärkeää on, että TGFp /Smad4 kohdegeenien tunnistettu A2780 epiteelin munasarjasyövän solulinja olivat ennustaneet elossaololuku, joka perustuu in silico louhinta julkisesti saatavilla potilaan tietokantoja. Lopuksi tietomme korostaa hyödyllisyyttä seuraavan sukupolven sekvensointi teknologia tunnistaa genominlaajuisten Smad4 kohdegeenien epiteelin munasarjasyövän ja linkittää poikkeavaa TGFp /Smad signalointi munasarjojen kasvaimien syntyyn. Lisäksi tunnistetut Smad4 sitovan loci yhdistettynä geeniekspressioprofilointi ja in silico data mining potilaan kohorteissa, voivat tarjota tehokkaan lähestymistavan määrittämiseksi mahdollisten geeni allekirjoitukset biologisten ja tulevien translaatiotutkimusta munasarjojen ja muiden syöpien.

Citation: Kennedy BA, Deatherage DE, Gu F, Tang B, Chan MWY, Nephew KP, et al. (2011) chip seuraavissa määrittämät genominlaajuisten Kartta TGFp /Smad4 Targets: Implications kliinisten tutkimusten tulosten kanssa munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (7): e22606. doi: 10,1371 /journal.pone.0022606

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 22 helmikuu 2011; Hyväksytty: 26 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 25 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Kennedy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Institutes of Health U54CA113001, R01CA069065 ja National Cancer Institute CA85289 ja varoja Ohio State University Kattava Cancer Center ja The Ohio State University Biomedical Informatics. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

transformoiva kasvutekijä-β (TGFP) signalointireitin on tärkeä rooli säätelyssä proliferaatiota, erilaistumista, ja muiden solun prosessit, mukaan lukien kasvun munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) [1], [2]. Häiriöstä TGFp signalointi havaitaan usein epiteelin munasarjasyöpä (EOC), ja se voi olla ratkaiseva EOC kehittämiseen [3], [4]. Vaikutukset TGFp välittyvät kolme TGFli ligandien – TGFp 1, TGFβ2 ja TGFβ3 kautta toimivien TGFp tyypin 1 ja tyypin 2 reseptorit [5] – [7]. TGFBR2 on erityinen reseptori TGF ligandeja. Funktionaalinen reseptori kompleksi säätelee aktivointi loppupään Smad ja ei Smad polkuja [8]. Fosforyloidulla tyypin 1 reseptorin rekrytoi ja fosforyloi reseptori-säännelty Smad: ien R-Smad: ien). Viidestä R-Smad: ien nisäkkäitä koskeva TGFBR2-Alk 5 kompleksi aktivoi Smad2 ja Smad3, kun taas TGFBR2-ALK1 kompleksi aktivoi SMAD1, SMAD5 ja SMAD8 [9]. Aktivoitu R-Smad: ien muodostaa komplekseja yhteismarkkinoille kumppanin Smad (co-Smad; Smad4 nisäkkäillä) ja translokoituvat tumaan [6]. Koska affiniteetti aktivoitua Smad monimutkaisempia Smad sitova elementti ei riittäisi tukemaan yhdessä endogeenisen promoottorit kohdegeenien, Smad komplekseja täytyy liittää muihin DNA: ta sitova transkriptiotekijät säätelevän [7]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaiset perheet transkriptiotekijöiden, kuten forkhead, homeobox, sinkki sormi, LEF1, Ets, ja perus helix-loop-helix (bHLH) perheet, voivat toimia Smad4 kumppanina proteiineja saavuttaa korkea affiniteetti ja selektiivisyys kohde-promoottorit sopivan sitovat elementit [10] – [14].

A2780 ihmisen munasarjan epiteelin syövän solulinja on herkkä cis-diamminedichloroplatinum (II) (sisplatiini), yksi platina-tyypin aineita ( carbolatin tai sisplatiini), joita käytetään hoidossa munasarjasyöpä. Sen lisäksi, että se on hyödyllinen malli tutkimiseen huumeisiin herkkä sairaus, A2780 soluissa näyttää osittainen TGFli säätelyhäiriöihin merkitty vain vaatimaton kasvu Smad4 ilmaisun ja transduktio nykyisten Smad4 sytoplasmasta tumaan seuraavien TGFp stimulaatio [15]. Siten tämä solulinja on myös sopiva malli järjestelmän toteuttamiseksi genominlaajuisten kartoitus Smad4 kohdegeenien ja tunnistaa vapautuneilla TGFp /Smad4 kohdegeenien ja reittejä sekaantunut munasarjasyöpää sairastavilla potilailla.

Viimeaikaiset vertailuja siruihin seq (chromatin immunosaostus-sekvensointi) array lähestymistavat osoitti selvästi, että chip seuraavissa teknologia tuotti korkeamman resoluution, syvemmin ja parannettu kartoitus tarkkuutta transkriptiotekijän sitova ja histoni muutostöitä genomin laajuisesti [16] – [18]. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme chip seuraavissa tekniikka tutkia TGFli /Smad4 sääntelyn Platinasensitiivisten A2780 munasarjasyövän solulinja. Olemme profiloitu Smad4 sitovan loci seuraa TGF stimulaation. Käyttäen laskennallisia lähestymistapoja, olemme tutkineet Smad4 Sitoutuminen ja vertasi sitä Smad4 Sitoutuminen sekä normaali kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epitheilial solu (menettää tavallisesti) meidän edellisen tutkimuksen [12] ja ihmisen keratinosyyttien (HaCaT) alkaen Koinuma et al [11 ]. Edelleen, me syntyy TGFli /Smad4-säänneltyjen geeni allekirjoitukset ja hyödynnetään

in silico

kaivos lähestymistapa korreloida tunnistetut allekirjoituksia kliinisiä tutkimustuloksia kahdesta yleisesti saatavilla munasarjasyöpä potilasaineistoihin. Meidän integroiva lähestymistapa paljasti merkittävän yhteenliittymien TGFp /Smad4 säätelyverkkojen sekä ilman taudin etenemistä ja yleisen eloonjäämisen munasarjasyöpä potilaille. Tunnistamalla tuhansia Smad4 sitovan loci sekä geenien, tietomme tarjoavat sekä uusi resurssi tutkimiseen mekanismin taustalla säädeltyyn TGFli signalointia munasarjasyöpäsoluja sekä mahdollisia prognostisia biomarkkereita tulevien munasarjasyöpä translaatiotutkimuksen.

tulokset

genominlaajuisten Smad4 täyttöaste määritelty Chip-kohdat teknologia

Aiemmat tutkimukset [12], [15], [19], [20] ja muut [2], [ ,,,0],4], [21] – [23] ovat yrittäneet luoda ja luonnehtia molekyylimekanismeihin säädeltyyn TGFp-välitteisen signaloinnin munasarjasyöpäsoluja ja hankki sisplatiini kestävä munasarjasyöpäsoluja. Jotta voitaisiin edelleen selvittää yksityiskohtia taustalla olevien mekanismien, käytimme ChIP-kohdat tekniikka tunnistaa genomista sijainnit sitoo Smad4 A2780-soluissa ennen ja jälkeen TGFp stimulaation.

käyttäminen ChIP-kohdat, kaikki näytteet olivat aluksi sekvensoitiin tuottaa joukon raaka lukee (kukin lukea on pituudeltaan 36 bp) Illumina /Solexa GAII järjestelmä (taulukko S1) vaihtelevat ~43 miljoonasta ~51 miljoonaan lukee näytettä kohti. Sen jälkeen kartoitus UCSC Human HG18 kokoonpano, joukko noin 26 miljoonaa ja ~32 miljoonaa kartoitettu lukee ainutlaatuinen genomisen paikkoja saatiin Stimuloimattomia A2780 ja TGFp stimuloiman A2780 vastaavasti. Sitten sovelletaan myös huippu-kutsuvan tunnistus ohjelma, vyö, [24], [25] (katso materiaalit ja menetelmät) tunnistaa sitovan loci on Smad4 näissä kahdessa tilanteessa. Lyhyesti, meidän BELT ohjelma käyttää prosenttipisteisiin pisteytys menetelmä määrittämiseen rikastamiseen kynnysarvon kullekin alkuun prosentit kaikilta sitovat alueet, jota seuraa tunnistamalla kulloisenkin lokusten kullakin prosenttipiste tasolla. Sen määrittämiseksi merkityksen jokaisen prosenttipiste, joukko satunnaisesti simuloitu lukee on käyttää tausta arvioida väärien löytö määrä (FDR). Meidän ChIP-seuraavissa tiedot vahvistivat useiden Smad4 sitova loci aikaisemmin tunnistettu eri kudoksissa ja solutyypeissä kuten Gadd45A, CTGF, JAG1, LEMD3 [14], MYC [26], EDN1, RYBP, DST, ja BCAT1 [11].

Basal käyttöaikaa.

Havaitsimme 2009 Smad4 sitova lokusten vuonna (stimuloimaton) sairaudentilassa A2780 (taulukko S1). Olemme havainneet, että 1499 (74,6%) loci sijaitsivat +/- 100 kb tunnetun RefSeq geenin [27]. Yllättäen vain pieni osa (267 1499, 13,3%) oli sisällä promoottorialue (+/- 8 kb), geenin kun taas suurin osa sitovan loci oli joko 10 kb ylävirtaan 5’TSS tai 10 kb alavirtaan 3 ”TSS (Kuva 1A – punainen viiva). Tämä puolueeton koko genomin laajuinen sijainti analyysi ehdotti, että monet muut lähialueen genominlaajuisten perustuvat tutkimukset promoottori chip chip teknologia [11], [12], [28] voi vain tunnistaa osajoukkoja Smad4 kohdegeenien.

) jakautuminen sijainnin Smad4 sitovan loci histogrammina juoni perustuu niiden suhteen lähin tunnettu RefGene 5’TSS. B) luokittelu Smad4 sitovan loci neljään sitovia kuvioita. Stimuloidaan Vain sitova loci ovat ne, joiden liittyy RefGene sitovia lokusten ainoastaan ​​stimuloituun asetettu, samoin myös Stimuloimattoman vain. Shift sitova loci on sitova loci näkymisen saman geenin molemmissa olosuhteissa ja ne ovat suurempia kuin 1000 nt toisistaan. Basal sitovat loci näkyvät saman geenin molemmissa olosuhteissa, mutta ne ovat vähemmän kuin 1000 nt toisistaan. C) Kuvakaappaus osoittaa LRRC17 Sitoutuminen, jossa Smad4 sitoutuu 5’TSS of LRRC17 jälkeen TGFp stimulaation, ryhmitellään stimuloidun ainoa sitova. D) Runsaasti DNA seuraavista Smad4 ChIP kaatavat verrattuna DNA läsnä seuraavat kaatavat epäspesifistä IgG-vasta määritetty kvantitatiivisen syber vihreä PCR. U ja S käytetään edustamaan Stimuloimattomia ja stimuloidun sitovat alueet SLC40A1 vastaavasti. * Edustaa t-testi p-arvo on alle 0,05 ja merkitsee merkittävää rikastumista verrattuna IgG valvontaa.

TGFli stimuloimaa sitovia.

stimuloitaessa TGFli, 2362 Smad4 sitova loci tunnistettiin (taulukko S1). Kaiken jakelun sijainnin Smad4 sitovan loci jälkeen TGFli stimulaation on hyvin samanlainen kuin ennen stimulaatiota (Kuva 1A – musta linja stimuloituja ja punainen viiva varten stimuloimaton). Kuitenkin sitova kuviot kahden olosuhteissa (ennen ja jälkeen TGFP stimulaation) ovat dramaattisesti erilainen (kuvio 1 B). Ensin poistetaan nämä sitova loci sijaitsee kaukana kaikista tunnettujen RefSeq geeneistä (+/- 100 kb) ja luokitellaan sitten ne (1723 loci varten kannustanut ja 1499 loci for stimuloimaton) neljään eri sitova malleja: 1) Basal Sidonta – kaksi sitovaa loci liittyy sama geeni ja alle 1 kb päässä toisistaan ​​(eli sama sitova); 2) Shift Sidonta – kaksi sitovaa lokusta liittyy saman geenin molemmissa olosuhteissa, mutta ne ovat enemmän kuin 1 kb päässä toisistaan; 3) stimuloivat Vain Sidonta – sitovan loci liittyy geenin ainoastaan ​​kannustanut kunnossa; 4) Stimuloimattoman Vain Sidonta – sitovan loci liittyy geenin ainoastaan ​​stimuloitumattomassa kunnossa. Edellä esitetyn perusteella luokitusta, olemme päättäneet, että 74,2% (1279 ja 1723) ja 73,5% (1,102 of 1499) sitovan loci olivat stimuloidun Vain Sidonta ja Stimuloimattoman ainoa sitova luokat vastaavasti. Vaikka 24,8% (429 1723) ja 25,5 (382 1499) sitovat loci luokiteltiin Shift Binding luokka stimuloitu ja stimuloitumattomassa kunnossa vastaavasti vain 15 sitovat loci jokaisessa kunnossa (0,9% ja 1,0% vastaavasti) vaipui Basaali Binding luokka. Meidän genomista kartoituksen tulokset osoittivat, että TGFli stimulointi munasarjasyöpäsoluja voi muuttaa maisemaa Smad4 sitovia malleja. Täydellinen luettelo luokiteltu sitovia malleja on esitetty taulukossa S2.

Lisäksi, jotta voidaan varmistaa, että TGFli stimulaatio johti sitovien muutosten havaitsimme siru-seq data, me satunnaisesti valitsi joukon 22 tavoitteiden tunnistetaan analyysimme ja suoritetaan chip qPCR käyttämällä DNA eristetään immunosaostuskokeesta joka oli erillään DNA käytetty siru-kohdat. Meidän chip qPCR vahvistusten ei vain vahvisti tunnistettujen tavoitteiden sirulle-seq tietoja, mutta myös osoitti lisäksi, että aktivoitu eksogeeninen TGF signalointi pystyy tuottamaan suuria muutoksia Smad4 sitova kuviot (kuviot 1C, 1D ja kuviot S1A, B).

asetukseen TGFp-stimuloiduissa Smad4 kohdegeenin ilmentymisen A2780

Seuraavaksi suoritettiin geenin ilmentymisen mikrosiruja ekspression määrittämiseksi tilan Smad4 kohdegeenien jälkeen TGF stimulaation. A2780 mRNA kolmesta itsenäisestä biologisista rinnakkaisnäytettä sekä ennen että jälkeen 3 tuntia TGFp stimulaatio oli t valmistettiin ja analysoitiin Affymetrix U133 Plus 2 Platform. Kaiken kaikkiaan 3191 geenejä tunnistetaan olevan merkittävästi ylös tai alas-säädellä jälkeen TGF stimulaation vähintään 0,5 loki2-kertainen muutos ilmaisun ja p-arvo on alle 0,1 (kuvio 2A). Tutkittuaan korrelaatio 1443 TGFli stimuloimaa Smad4 kohdegeenien (vastaten 1723 Smad4 sitova loci on kannustanut kunnossa), suurin osa (2873 of 3191) geenien kanssa differentiaalikaavojen A2780 yllättävän puuttui Smad4 sitova loci, jossa 318 geenit oli at ainakin yhden Smad4 sitovan loci ja osoitti vähintään 0,5 Log2-kertainen ekspression muutos 3 tunnin TGFp stimulaatio (kuvio 2B). Tiedot 3191 merkittävästi differentiaalisesti ilmentyvien geenien löytyvät taulukoissa S4 ja 318 geenit taulukossa S5.

A) heatmap ilmaisun kertamuutoksia geenien välillä stimuloitumattomassa ja TGFp stimuloidaan kunnossa, näkyy kolme ryhmää geenejä , säädelty, ei muutosta, ja alassäädetty. Ylös ja alas geenien määritellään jonka loki2 kertainen muutos on suurempi kuin 0,5 tai pienempi kuin -0,5 vastaavasti. B) välinen vertailu geenien kanssa Smad4 sitovan loci (1443) in TGFp stimuloidaan kunnossa kaikki geenit osoittavat differentiaalikaavojen (3193), joka osoittaa kolmeen eri ryhmään, joilla on differentiaalikaavojen eikä Smad4 sitovaa loci, joilla ei ollut differentiaalikaavojen ja Smad4 sitova loci ja ne molemmat. C) GO huomautuksia kolmelle eri ryhmään geenit osoittavat, että Venn-kaavio (B). D) RNA ilmentymistaso määritettynä qRT-PCR suhteessa GAPDH ekspressiotasoja. Kokeet suoritettiin biologisen kolmena kappaleena. * Edustaa t-testi p-arvo on alle 0,05 ja merkitsee merkittävää eroa ilmaisun välillä stimuloimattomissa ja kannustanut olosuhteissa.

Gene ontologia analyysi osoitti, että ilmennetty eri geenien kanssa Smad4 sitovan loci olivat merkittävästi rikastettu geenejä mukana solun osan morphogenesis ja kehitykseen proteiineja (kuvio 2C-Gene Loci), linjassa aiempien tutkimusten eri solutyypeissä [12], [36]. Olemme myös havainneet, että Smad4 sitova liittyvien geenien puuttuu differentiaalikaavojen rikastettiin geenien kanssa EGF-kaltaisen domeenin ja polymorfismi viittaa siihen, että eri signalointireittejä saattaa välittää Smad4 muita tehtäviä kuin TGF signalointi (kuvio 2C-Loci vain), kun taas suuri joukko erilaisesti ilmaistuna geenit puuttuvat Smad4 sitovan loci olivat mukana immuunijärjestelmän toimintojen ja proteiinipitoiset soluväliaineen. Tutkittuaan enemmän rajoite p-arvo 0,05 ja taita muutos 0,5 TGFp stimuloidut ilmentyvät eri geenit, saimme joukon 1763 geenejä. Näistä geeneistä, löydettiin 184 (10,4%) geenejä on ainakin yksi TGF stimuloitiin Smad4 sitoutumiskohta (taulukko S6). Tämä prosenttiosuus on hyvin samanlainen kuin aineisto, josta 318 (10%) ja 3191 differentiaalisesti ilmentyvien geenien on ainakin TGFli kannustanut Smad4 sitoutumiskohta (taulukko S5). GO-toiminto analyysi oli myös hyvin samanlainen top ryhmiin (kuva S2). Edelleen vahvistaa ero ilmaistaan ​​Smad4 suunnattu geenit johtuvat TGFli stimulaatio, me satunnaisesti valitsi joukon 18 tavoitteita tunnistetaan analyysimme ja suoritettiin RT-qPCR. Yli 70% (13 18) geenien todensi RT-qPCR kuten kuvassa 2D ja kuvio S3. Luettelo suunniteltu alukkeiden on esitetty taulukossa S7.

Smad4 riippuvaisen geeniregulatiivista verkkoja TGFli aiheuttama munasarjasyöpäsoluja

edellisessä tutkimuksessa [12] ja tutkielma Koinuma et al [ ,,,0],11] ovat tunnistaneet joukon 150 TGFp kannustanut Smad4 kohdegeenien menettää tavallisesti (ikuiseksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja) ja joukko 92 TGFp kannustanut Smad4 kohdegeenien HaCaT (immortalisoitua keratinosyyttisolulinjaa). Ei ollut yllättävää, rajallinen päällekkäisyys vain 6 150 menettää tavallisesti, 6 92 HaCaT, ja 1 kaikissa kolmessa tutkimuksessa yhteistä 318 Smad4 kohdegeenien tässä tutkimuksessa (kuvio 3A), sillä vain yksi, A2780, on syövän solulinja, ja kaksi muuta ovat normaaleja solulinjoja. Toinen mahdollisuus niin alhainen päällekkäisiä hinnat on, että se voi johtua vähäisestä tavoitteet tunnistettiin käyttäen promoottoria array (chip promoottori-chip). GO analyysi [29] osoitti myös kohdegeenien HaCaT ja menettää tavallisesti olivat pääasiassa mukana solujen jakautumisen (tai anti-apoptoosin) ja kehitysprosessia (kehittyneet lihakset), jotka eroavat kohdegeenien A2780 (kuva 3B).

A) Venn-kaavio esittää vertailun TGFp /Smad4 kohdegeenien kolmea eri solutyyppejä. B) GO huomautuksia varten ainutlaatuisen geenien kunkin solutyypin.

edelleen vertailla ero TGFp stimuloimaa Smad4 riippuvan geeni määräys näiden kolmen solutyyppien, haimme laskennallinen analyyttinen lähestymistapa me aikaisemmin kehittäneet [30] rakentaa Smad4 riippuvan säännellään verkkojen HaCaT, menettää tavallisesti, ja A2780, vastaavasti (kuva 4). Lyhyesti, meidän laskennallinen analyyttinen lähestymistapa alkoi siru perustuu aineistot ja geenien ilmentyminen tietoja. Jokainen Smad4 sitova loci wa sovitetaan tunnetaan RefSeq geeniä ID joita sitten tutkitaan ero geenien ilmentyminen. Joukko ilmentyvät eri Smad4 kohdegeenien jälkeen TGFli stimulaation käytettiin edelleen löytää merkittävin transkriptiotekijä (TF) sidoskumppanien by ChIPMotifs [31] tai ChIPModudles [32], jota käytettiin Hub-TF: iä. Hub TF-geenin yhteys määritettiin skannaamalla Hub TF: iä ”pulssinleveysmodulaattorit kaikissa sitova loci ja permutaatio testiä käytettiin testaamaan luotettavuutta kunkin yhteyden verkkoon. Saatu sääntelyverkon tehtiin näkyväksi Cytoscape [33].

tunnistettu kuusi Hub TF: iä, GFI1, NR3C1, SOX17, STAT4, ZNF354C ja TCF8 318 Smad4 riippuvaisten kohdegeenien A2780 soluissa, kun taas neljä Hub TF: iä, LEF1 (TCF), ELK1, COUPTF (NR2F5), ja E2F, havaittiin menettää tavallisesti soluissa edellisessä tutkimuksessa käyttäen samanlaista lähestymistapaa (CART malli) [12]. Meidän laskennallinen analyyttinen lähestymistapa myös tunnistettu kolme Hub TF: iä, E2F1, SP1, ja USF varten 92 Smad4 riippuvaisten kohdegeenien HaCaT soluissa, joka oli hyvin samankaltainen kuin TF motiiveja tunnistettiin päässä Koinuma et al. Tutkimuksessa [11]. Top motiivi raportoitu tutkimuksessaan, AP1, oli jäänyt meidän tuloksiin johtuen kehittynyt luokitus algoritmi meidän ChIPModules [32] ja pystyy poistamaan ne TF motiiveja, jotka ovat myös rikastunut satunnaisessa sarjoiksi. Kiinnostavaa kyllä, myös löytyi yksi Hub TF E2F (E2F1) oli yhteinen kahden normaalit solut, mutta ei yhteistä A2780 soluissa. Yhdessä GO funktioanalyysivalikon, tuloksemme osoittivat, että E2F voi toimia merkittävänä Smad4 co-transkriptiotekijä kumppani välittämisessä solujen lisääntymisen normaaleissa soluissa, mutta hävisi karsinoomasoluja. Saatu geeniregulatiivista verkkojen (GRN) kaikki kolme solua on esitetty kuviossa 4. Yleisesti myös geeniregulatiivista verkon analyysi osoittaa vahvasti, että TGF stimuloi eri Smad4-riippuvaisen säätelymekanismi munasarjasyöpäsoluja verrattuna normaaleihin soluihin, eli Smad4 sääntely verkko on tullut ”rewired” in munasarjasyöpäsoluja.

Gene allekirjoitukset valinnan ja kliinisten tulosten

Yksi lupaavia sovellusmahdollisuuksia genominlaajuisten omiikka -tutkimukset solulinjaa järjestelmien tunnistus geenin allekirjoituksia, jotka voivat tarjota parempaa prognostista tietoa verrattuna standardin kliiniset ja patologiset parametrit [34], [35]. Vastatakseen suhdetta TGFp stimuloi Smad4 riippuvia kohdegeenien ja kliininen tulos munasarjasyöpä potilaiden, selvitimme 307 kohdegeenien tunnistettu A2780 soluissa tässä tutkimuksessa, joita ei ole yksilöity aikaisemmissa tutkimuksissa normaalien solujen, kahdessa eri kliinisessä munasarjojen syöpä kohorttitutkimukset joka oli raportoitu Eloonjääntitulokset [36], [37]. Ensin luokitteli potilaat eri alaryhmiin, joka perustuu niiden geeni allekirjoituksia, ja sitten korreloi tietoja potilaan selviytymisen tiedot. Kaivostoiminnassa 153 potilaan kohortin alkaen Bild et al [36], pystyimme käyttämään 187 307 geenien tunnistettu geeniekspression aineisto soveltaa hierarkkinen klusterointi menetelmä matkaan perustuvia toimenpiteitä oikeudenkäynnin-ja-erehdys näkökulma ja luokitella geenien neljään geenin ryhmään (kuvio 5A). Kunkin neljän geenin ryhmän, olemme edelleen ryhmitelty 153 näytettä neljään potilasryhmille (PG, kuvio 5B), ja korreloi PG niiden selviytymisen tietoja. 153 potilasta, vain 124 on täysi selviytymisen tietoa, mikä käytettiin edelleen hengissä käyrä tontteja. Huomasimme, että allekirjoitus osajoukko 49 geenien (G2 geeni ryhmä), joka pystyi ennustamaan merkittävän selviytymisen korrelaatio 62 potilaalla on p-arvo 0,0471 (kuvio 5C, D). Erityisesti PG: 4 (25 potilasta) näkyy heikko eloonjäämismediaani oli 31 kuukautta verrattuna PG: 3 (37 potilasta), joiden mediaanielossaolosta 63 kuukautta. Elossaoloajan käyrä juoni kaksi potilasryhmille, PG: 3 ja PG: 4 satunnaisen 49 geenit (jos ne eivät sisällä 49 G2 geenien) osoittivat log-rank testi p-arvo 0,1558 (kuvio 5E). Vähäisen patologinen tietoa saatavilla tämän potilaan kohortin, emme pystyneet merkittävästi korreloivan meidän geeni allekirjoitukset muita kliinisiä tuloksia. Kuitenkin etenkin suuri osa vaiheen IV potilaiden ryhmittyneet PG3 vaikka kaikki vaiheessa IC ja kaksivaiheinen IIC potilasta ryhmittyneet PG4, vaikka sama määrä vaiheessa IIIC potilaista kummassakin (taulukko S8), ehkä osoittaa, että TGF /Smad4 säädeltyjen geenien voisi mahdollisesti käyttää luokitella alatyypin munasarjasyöpä potilaille.

A) hierarkkinen ryhmittely tulos 187 geenien neljään geenin ryhmään, nimittäin G1, G2, G3 ja G4. Pystyakseli edustaa geeniryppäät (187 geenit) ja vaaka-akseli edustaa erilaisia ​​näytteitä (153 potilasta). B) hierarkkinen klusterointi tulos 153 potilasta neljään potilasryhmät, nimittäin PG: 1, PG: 2, PG: 3 ja PG: 4 käyttämällä G2 ryhmä 49 geenejä. C) Survival käyrän kuvaaja G2 geenin ryhmä. Vaaka-akseli esittää selviytymisen kuukautta ja Pysty eloonjäämisprosentteina (%) sisällä, joka vastaa potilaan ryhmään. Täysin neljä potilasryhmät, eli PG: 1, PG: 2, PG: 3 ja PG: 4 analysoidaan G2 geenin ryhmä. D) Yksityiskohtainen selviytymisen käyrä juoni kaksi potilasryhmille, PG: 3 ja PG: 4, osoittaa merkittävää log-rank testi p-arvo 0.0471.E) Elossaoloajan käyrä juoni kaksi potilasryhmille, PG: 3 ja PG: 4 satunnaisen 49 geenit (jos ne eivät sisällä 49 G2 geenejä) osoittaa log-rank testi p-arvo on 0,1558.

Kun käytetään samaa

in silico

kaivos lähestymistapa toisen potilaan kohortin Lu et al [37], (koostuu 42 potilaalla ja 5 tavalliset ihmiset), tulokset osoittivat, että geeni allekirjoitus 19 307 geenien ennustetun parempi eloonjäämisasteesta PG4 ja Normals kuin muut PG joiden p-arvo 0,0078 (kuva S4).

keskustelu

Olemme ensimmäistä kertaa sovellettu chip seuraavissa teknologiaa koko genomin laajuinen kartoitus TGFp stimuloiman, SMAD4- riippuvainen geenien käytettäessä munasarjasyövän solulinja (A2780). Tuloksemme osoittavat, että verrattuna pohjapinta tila (ei TGFli stimulaatio), suurin osa Smad4 sitovien loci ovat joko äskettäin sidottu chromatin (74,2%) tai siirtynyt sidottu (24,8%), kun TGFli stimulaation, mikä viittaa TGFli stimuloi syöpäsolujen voivat muuttaa maisema Smad4 sitovia malleja. Lisäksi meidän GO analyysi paljasti silmiinpistävää yhtäläisyyksiä top 10 GO luokat 1443 ja 1316 Smad4 kohdegeenien stimuloidun ja Stimuloimattoman olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin 318 ilmentyvät eri geenit, jotka sisältävät vähintään yhtä stimuloidaan Smad4 sitova loci, merkittävästi rikastettu tarkempia GO termejä, kuten solujen osaksi morphogenesis ja kehittävän proteiineja. Tämä tulos osoittaa, että Smad4 voi säädellä hyvin erityinen joukko kohdegeenien vastauksena TGFli signalointi, jotta helpotetaan tiettyjä toimintoja, jotka solutyypin läpi tätä erityistä signalointireitille. Todellakin, GO analyysi Smad4 kohdegeenien ilman geenin ilmentymisen taso muuttuu jälkeen TGFli stimulaation löytyi yksi rikastetun geenin luokkia on ”EGF kuin signalointi”, joka tarjoaa lisätodiste siitä, että muut signaalinvälitysreittien voivat moduloida Smad4 riippuvaisten geenien munasarjasyövän. Yksi esimerkki voi olla luun morfogeneettisen proteiinien (BMP: t), jotka ovat myös ylävirtaan Smad4 ja siten voi kyetä säätelemään joitakin näistä Smad4 kohdegeenien. BMP: t on osoitettu olevan keskeinen säätelijöinä munasarjojen fysiologian ja mukana munasarjasyövän kehitykseen ja muiden syöpien [38] – [40]. Jatkossa tutkimuksissa osuus kunkin signalointipolkujen ”sääntely tunnistettu Smad4 kohdegeeneissä yrittää olla yksikäsitteistetty.

Kuten muillakin havainnot transkriptiotekijät, kuten estrogeenireseptori alfa (ERa) [41] – [43 ], androgeenireseptorin (AR) [44], ja peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori (PPAR) [45], havaitsimme, että suurin osa ( 70%) Smad4 sitovan loci sijaitsee enemmän kuin 8 kb päässä 5’TSS of tunnettu RefSeq geenin. Tämä saattaisi viitata siihen TGFp sitovan loci tulevat lähelle promoottorin avulla kromosomi silmukoiden yhteydessä TGF stimulaatiota. Mielenkiintoista, meidän

de novo

motiivi analyysi havaitsi myös Smad kaltainen motiivi joukko 5-distaalisen sitovia lokusten muttei joukko 5′-promoottorin loci (tuloksia ei ole esitetty). Meidän genominlaajuisia sijainti analyysi osoittaa myös, että on tärkeää koko genomin laajuinen sekvensointiteknologioihin, koska osoitimme monet sitovan loci ovat kaukana 5’TSS tunnetun geenin ja siksi promoottori-array tekniikka voi jäädä monta kohdetta sitova loci transkriptiotekijän. Tulevaisuuden tutkimukset keskittyvät suorittaa chip 3C-qPCR vahvistaa, onko nämä distaalista sitovan loci ovat todellakin liittyvät näihin tiettyjen geenien, mahdollisesti paljastamiseksi taustalla olevan mekanismin TGFp /Smad4 välittämä geenin sääntelyä.

Yksi tärkeä näkökohta tässä tutkimuksessa on käyttää

in silico

louhintaa julkisesti saatavilla potilaan kohortin tietoja identifioidaan alaryhmä TGFp /Smad4 kohdegeenien kuin geenin allekirjoituksen ennustamiseen kliininen (selviytymisen) tuloksia. Sikäli kuin tiedämme, tämä on ensimmäinen tutkimus yrittää käyttää TGFli signalointi reagoiva Smad4 säännelty geenejä luokitella munasarjasyöpä potilaiden eri alatyyppiä potilasryhmien sekä ennustaa huono elinajan hyvä selviytymisen populaatioiden kanssa tilastollista merkitystä (kuva 5). Siten yhdistämällä chip kohdat tunnistettu sitovan loci, geeniekspressioprofilointi, ja

in silico

louhintaa potilasaineistoihin voi tarjota tehokkaan lähestymistavan tunnistaa mahdolliset geeni allekirjoitukset biologisten ja kliinistä merkitystä.

Lopuksi todettakoon, että tutkimus tarjoaa ensimmäisen kattavan genominlaajuisten kartta tuhansia TGFp /Smad4 tavoitteiden saavuttamista munasarjasyövän solulinja, joka voisi lisäksi käyttää opiskeluun Smad4 toimintojen kasvainten synnyssä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus yhdistää TGFli /Smad4 geenien kliiniseen tietoa munasarjasyöpä potilaiden selviytymisen ja tunnistaa mahdolliset geeni allekirjoitukset ennusteen munasarjasyöpä. Meidän tulevissa tutkimuksissa, me tekee chip seuraavissa analyysi TGFp /Smad4 sitoutumiskohtia käyttäen paneelia munasarjasyövän solulinjoissa, jotka edustavat erilaisia ​​histologisia alatyyppejä ja munasarjasyövän aloittamista soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja TGFp stimulaatio

A2780-soluja [15] viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia 37 °, 5% CO

2-inkubaattorissa. Ennen TGFli stimulaation, solut jaettiin klo -70% konfluenssiin ja tarkastetaan päivittäin. Siru, 80% konfluentteja soluja optimaalisesti stimuloitiin 10 ng /ml yhdistelmä-DNA-TGFp 1 (Sigma, St. Louis, MO) 1 tunnin ajan ennen formaldehydi silloitusaineen, kun ilmentymisen analyysi suoritettiin 3 tunnin stimulaation 10 ng /ml TGFp 1.

Kromatiini immunosaostuksella ja massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät

Kromatiini immunosaostuksella (chip) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [46], [47] joitakin huomautuksen arvoinen muutoksia. Lyhyesti, solut huuhdeltiin huoneenlämmössä PBS ennen silloitettu 1%: formaldehydiliuosta. Sitten solut otettiin talteen ja homogenoitiin, että proteaasin estäjien läsnä ollessa ennen DNA sonikoitiin. Magneettinen Dynal-helmiä (Invitrogen) yhdistettynä seoksella vasta-aineita (20% Smad4 # 9515 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja 80% Smad4 DCS-46 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin kaatamaan Smad4 yön yli. Puhdistettua DNA: ta käytettiin havaitsemaan kertainen väkevöimisen Syber Green qRT-PCR katso taulukko S3 on luettelo alukkeiden.

Yhdistelmät kirjastoja luotiin massiivisia rinnakkaissekvensointijärjestelmät käyttäen standardimenetelmiä. Lyhyesti, 500 ng avattavan DNA saatettiin loppuun korjaus, terminaali adenylaatiosignaalilla, ja sovitin ligaatio ennen fragmentit, joiden ~175-250 eristettiin 2% E-geelillä (Invitrogen). sen jälkeen standardisoitu 12 syklin PCR, DNA laatu arvioitiin DNA-1000 Bioanalyzer siru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ennen kuin ne toimitetaan sekvensointiin koskevasta Illumina GAII. Kaikki chip seuraavat tiedot talletetaan Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov /geo) ja ovat hakunumero GSE27526.

geeniekspressioprofilointi

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol (Invitrogen) ja microrarray analyysi koskevasta Affymetrix HGU133 Plus 2