PLoS ONE: sfingosiinikinaasin-1 on keskeinen androgeenisäädellyn Eturauhassyöpä Kasvu ja Survival
tiivistelmä
Background
sfingosiinikinaasin-1 (SphK1) on onkogeenisessä lipidikinaasiaktiivisuutta erityisesti mukana vastauksena syöpähoitoihin eturauhassyövässä. Androgeenit säädellä eturauhassyöpä solujen lisääntymistä, ja androgeenien puute hoito on tavanomaista hoitoa hallinnassa potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti. Täällä, selvitimme roolia SphK1 säätelyssä androgeeniriippuvaisen eturauhasen syöpäsolun kasvua ja selviytymistä.
Menetelmät /Principal Havainnot
Lyhytaikaiset androgeenin poiston aiheuttama nopea ja ohimenevä SphK1 esto liittyvä alennettu solujen kasvua in vitro ja in vivo, tapahtuma, joka ei ole havaittu hormono-herkkä PC-3-soluja. Tukeminen kriittinen rooli SphK1 eston nopean vaikutuksen androgeenireseptorin ehtyminen, sen yliekspressio voi heikentää solujen kasvun vähenemistä. Vastaavasti lisäämällä dihydrotestosteroni (DHT) ja androgeenista riistää LNCaP palautetaan, solujen lisääntymistä, kautta androgeenireseptorin /PI3K /Akt riippuvainen stimulaation SphK1, ja esto SphK1 voisi merkittävästi haitata vaikutuksia DHT. Sitä vastoin pitkäaikainen poistaminen androgeenin tukea LNCaP ja C4-2B solut johti asteittaiseen kasvuun SphK1 ilmaisun ja toimintaa koko etenemisen androgeenista itsenäisyyttä tila, jota leimasi hankinta neuroendokriinisten (NE) kaltaisia solu- fenotyyppi. Tärkeää on, estämällä PI3K /Akt-reitin-negatiivisesti vaikuttaa SphK1 aktiivisuutta voisi estää NE erilaistumista sekä solun malleissa, tapahtuma, joka voi jäljitellä SphK1 inhibiittorit. Kiehtovan, The reversability NE fenotyypin altistumisen normaalin kasvualusta liittyy voimakas esto SphK1 aktiivisuuden.
Johtopäätökset /merkitys
Me raportoimme ensimmäistä näyttöä siitä androgeenideprivaatio indusoi ero vaikutus on SphK1 toimintaa hormoniherkän eturauhasen syöpäsolun malleja. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että SphK1 aktivointi kroonista androgeenideprivaatio voi toimia korvaavana mekanismi, jonka avulla syöpäsolujen hengissä androgeenista köyhdytettyä ympäristö, tuen antamista sen estäminen mahdollisena terapeuttinen strategia viivästyttää /estää siirtymistä androgeenista riippumaton eturauhassyöpä syöpä.
Citation: Dayon A, Brizuela L, Martin C, Mazerolles C, Pirot N, DOUMERC N, et al. (2009) sfingosiinikinaasin-1 on keskeinen androgeenisäädellyn Eturauhassyöpä Kasvu ja Survival. PLoS ONE 4 (11): e8048. doi: 10,1371 /journal.pone.0008048
Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat
vastaanotettu: 23 heinäkuu 2009; Hyväksytty: 02 marraskuu 2009; Julkaistu: 26 marraskuu 2009
Copyright: © 2009 Dayon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat Inserm, CNRS, Fondation pour la Recherche médicale, Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la Eturauhasen, ja Institut National du Cancer (OC). AD on vastaanottaja Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ja La Ligue Nationale Contre le Cancer. CM on vastaanottaja Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Eturauhassyöpä on yleisin maligniteetti osuus 25% kaikista vasta diagnosoitu syövistä miehillä ja on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään [1]. Ensisijainen hoito leikkauksen tai sädehoidon potilailla, joilla elimeen rajoittunut eturauhassyöpä osoittaa yleistä 10 vuoden eloonjäämisluvut yli 75% [2], [3]. Siitä huolimatta, on arvioitu, että n noin 15% potilaista paikallisesti läsnä edennyt tai etäpesäkkeitä, ja noin 40%: lla potilaista uusiutumisen jälkeen paikallisen hoidon [4].
Eturauhassyöpä solujen lisääntymistä säädellään androgeenit ja androgeenien puute hoitoa (ADT) on tavanomaista hoitoa hallinnassa potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti. ADT on aluksi tehokasta, vähentää sekä eturauhasen kokoa ja prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot, mutta lopulta kaikki potilaat tulevat vastustuskykyisiksi hormonaalista manipulointia [4]. ADT saa aikaan muutoksia eturauhassyövän biologiassa edistää sen etenemistä androgeenisäädellyn tulenkestävä valtion tai hormonia tulenkestävä eturauhassyöpä (HRPC) fenotyyppi, jossa on liittyvä elinajanodote vain 15 ja 20 kuukautta. Ei ole selvää, miten syöpäsolujen tehdä siirtymistä androgeeniriippuvaisen androgeenipuutokseen-riippumattoman aseman jälkeen ADT. Niistä useita mekanismeja kiertää vaikutuksia androgeeniablaatio, aktivointi fosfatidyyli-3-kinaasi /Akt (PI3K /Akt) signalointia on kuvattu keskeinen reitti [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9]. Tärkeää on, kliiniset tutkimukset ovat vahvistaneet, että on tärkeää Akt aktivaation eturauhassyövän eteneminen androgeeniriippumattomuuteen ja huono kliiniseen tulokseen [10], [11], [12], [13], [14].
Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että, sen jälkeen kun pitkäaikainen ADT, eturauhasen syöpäsolujen hankkia neuroendokriinisten (NE) kaltainen fenotyyppi, joka johtaa kasvaimia rikastettu NE-soluissa. NE solut ovat ainoastaan vähäinen osa normaalista eturauhanen ja erittää useita neuropeptidejä, jotka voivat aiheuttaa mitogeenisia vaikutuksia vierekkäisten syöpäsoluja androgeenista köyhdytettyä olosuhteissa [15]. Vaikka NE soluihin on kuvattu vuosikymmeniä sitten, niiden toiminnallinen rooli eturauhassyövän etenemistä on vasta viime aikoina saanut paljon huomiota. Neuroendokriinikasvain ja seerumin biomarkkerit ovat säädelty seuraavat ADT eturauhassyöpäpotilailla indikoi huonoon ennusteeseen [16], [17], [18], [19]. Johdonmukaista kliiniset havainnot, androgeenin peruuttamisesta aiheuttama NE erilaistuminen näkyy myös soluviljelmässä ja eläinmalleissa [20], [21], [22], [23], [24], ja siirtogeeninen adenokarsinooma hiiren eturauhasen mallia eturauhasen (TRAMP) syöpä havaitaan merkittävä nousu eturauhasen neuroendokriinisolun väestöstä taudin etenemiseen [25].
Sfingosiini 1-fosfaatti (S1P) on lipidejä sovittelija, joka on tärkeä säätelevä rooli tuumorisolun kasvua, selviytymistä , invaasio, ja angiogeneesi [26]. Tasapaino solun tasojen S1P ja sen metabolisen lähtöaineiden seramidiksi ja sfingosiini pidetään kytkin, joka voisi määrittää, onko solu lisääntyy tai läpikäy apoptoosin tai kasvun pysähtymisen [27]. Keskeinen säädin Tämän tasapainon on sfingosiinikinaasin-1 (SphK1), entsyymi muuntaa sfingosiini osaksi S1P. SphK1 palvelee kahta toimintoa tuottaa kasvua edistävän, anti-apoptoottiset S1P, ja vähentää solunsisäisiä tasoja pro-apoptoottisten seramidi. Lisäksi tuetaan rooli SphK1 syövän edistämiseen, SphK1 on havaittu toimivan onkogeenin [28], sen mRNA: ta yli-ilmennetään, ja positiivinen immuunivärjäykseen SphK1 havaittiin erilaisten kasvainten [29], [30], [31], [ ,,,0],32], [33], ja lisäys SphK1 ilmaisun kasvainbiopsioissa korreloi lyhyt eloonjäämisaste potilailla, joilla glioblastoma ja rintasyöpiä [30], [34]. Lisäksi SphK1 entsyymiaktiivisuus ja ilmaisun suurenevat huomattavasti Tuumorinäytteissä eturauhassyöpään potilaista (verrattuna normaaliin kollegansa) korreloidaan muihin markkereita, kuten PSA, kasvaimen sekä kliiniseen tulokseen jälkeen eturauhasen (Malavaud ja Cuvillier, toimitettu). Vaikka SphK1 aktiivisuutta voidaan stimuloida monenlaisia kasvutekijöitä [26], olemme aiemmin osoittaneet eturauhassyöpäsolu- ja eläinmalleissa että syöpähoitoihin (kemoterapia-aineiden tai ionisoivan säteilyn) johtaa sen estäminen viittaa siihen, että SphK1 voisi toimia anturi syöpähoitoihin [35], [36], [37], [38].
tässä tutkimuksessa selvitimme mahdollista roolia SphK1 säätelyssä androgeeniriippuvaisen solujen kasvua ja selviytymistä hormoneja herkkä LNCaP eturauhassyövän solumallin. Ensimmäistä kertaa, osoitamme, että androgeenideprivaatio kiinnostavuus erottuvalla vaikutus SphK1. Vaikka lyhyen aikavälin androgeenin peruuttamista aiheuttama tilapäinen esto SphK1, krooninen androgeenireseptorin ehtyminen laukaisi säätely ylöspäin SphK1 korreloi NE erilaistumista LNCaP ja C4-2B solujen osallistumisen tukeminen SphK1 etenemisen kohti androgen-itsenäisyyttä.
tulokset
Short-Term androgeenideprivaatio Vähennykset Cell Proliferation LNCaP – mutta ei PC-3 Cells – ja liittyy pienentynyt SphK1 Activity
Solulisääntyminen merkittävästi alentunut ylitöitä CSS (androgeeni-väliaineessa) hoidetun LNCaP-soluja verrattuna FBS (joka sisältää pieniä määriä androgeenien) käsiteltyjen solujen (kuvio. 1A, vasen paneeli). Tukeakseen MTT tuloksia, solulaskennan (Fig. 1A, keskimmäinen paneeli) ja [
3 H] tymidiinin (Fig. 1A, oikea paneeli) mittaukset vahvistivat, että CSS olosuhteissa ollut dramaattisia vaikutuksia solujen määrä ja DNA-synteesi vahvistetaan, että MTT voitaisiin käyttää korvikkeena indeksi soluproliferaatioon meidän solumallin. Tämä korreloi myös eritystä PSA, joiden taso oli voimakkaasti alentunut sekä CSS-käsitellyissä soluissa verrattuna FBS-käsitellyt solut (Fig. 1 B). Päinvastoin, androgeenideprivaatio ei muuttanut kasvua PC-3 hormono tulenkestävä (HR) solut, joiden kasvu oli vain muuttunut seerumistarvaatio (Fig. 1 C) .Kun verrattuna FBS olosuhteissa androgeenireseptorin ehtyminen LNCaP aiheuttama huomattava vähennys in SphK1 toiminnan ensimmäisten 24 h (Fig. 1 D, vasen paneeli). Myöhemmin, rebound SphK1 aktiivisuuden havaittiin, josta tuli merkittävä yli 4 päivän kuluessa (Fig. 1 D, vasen paneeli). PC-3-solut, merkittävä ja pysyvä väheneminen SphK1 aktiivisuuden havaittiin vain alle seerumideprivaation olosuhteissa (Fig. 1 D, oikea paneeli). peilaus vaikutus soluproliferaatioon (Fig. 1 C). Kuten ennakoitiin PC-3-solut, jotka eivät vaikuta CSS olosuhteet, ei merkittäviä SphK1 muutokset voidaan osoittaa (Fig. 1 C, D).
Yön seerumia vailla LNCaP (
,
D
) ja PC-3 (
C
,
D
) soluja inkuboitiin, kun läsnä oli 5% FBS: ää, 5% CSS tai ilman seerumia (SFM) ja osoitetut ajat . Solujen lisääntyminen LNCaP (
,
vasen paneeli
) ja PC-3-solut (
C
) määritettiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina vertailusta alussa kokeen (päivä 0). Cell numero (
,
keskimmäinen paneeli
) ja DNA-synteesin (
,
oikea paneeli
) mitattiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kaksikymmentäneljä itsenäisen kokeen MTT-määritys ja kuusi koetta solujen laskenta ja DNA-synteesi;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001. Eritettyä PSA taso mitattiin kulttuurin median LNCaP (
B
).
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kuusi riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001.
D
, SphK1 aktiivisuus määritettiin sekä LNCaP-ja PC-3-soluja, ja ilmaistaan prosentteina FBS-käsiteltyjen solujen.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kaksitoista ja kuusi riippumatonta koetta varten LNCaP ja PC-3-soluissa;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; *,
P
0,05; ns, ei merkitsevä.
tehoa kastraatio vuonna ortotooppisesti ksenotransplantaatio SCID Hiiret liittyy SphK1 esto
vaikutus androgeenideprivaatio oli seuraava tutkittiin
in vivo
kirurgisella potilaalle tehdä istutusta (SOI) LNCaP ja PC-3-solut yli-ilmentävät GFP [36]. Yhdeksän ja kolme viikkoa sen jälkeen SOI LNCaP /GFP ja PC-3 /GFP-soluissa, SCID hiiret satunnaistettiin kahteen ryhmään ja alistettiin kastraatio tai näennäistä hoitoon. Kuten esitetty suurentavan mikroskopia edustavan ensisijaisen LNCaP /GFP kasvain, kastraatio aiheuttama dramaattinen väheneminen kasvaimen tilavuuden ja massan (Fig. 2A ja B) 7 päivän sisällä hoidon verrattuna valekäsiteltiin eläimillä. Tehoa kastraatio liittyy merkittävä väheneminen SphK1 aktiivisuuden kudosuutteet (Fig. 2B, oikea paneeli). Lisäksi vaikutus primaarikasvaimen rinnastettiin selvä vähentäminen etäpesäkkeitä leviämisestä kastraatio-hoidetussa ryhmässä (taulukko S1). Kuten odotettua, kastraatio ei vaikuttanut kasvainten kehittymistä SCID hiirillä ksenotransplantaatio PC-3 /GFP-soluja (kuvio. 2C). Kasvainmassoja ja volyymit olivat samanlaiset sekä valekäsiteltiin ja kuohituista eläimistä (Fig. 2D), ja SphK1 aktiivisuus (Fig. 2D, oikea paneeli) sekä etäpesäkkeiden levittämisen (taulukko S1) oli samanlainen molemmissa ryhmissä.
Yhdeksän ja kolme viikkoa sen jälkeen SOI LNCaP /GFP: n ja PC-3 /GFP-soluissa, SCID-hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään. Nämä eläimet alistettiin sitten kastraatio tai näennäistä hoitoon. Edustavia loisteputki ensisijainen LNCaP (
) ja PC-3 (
C
) kasvaimia sham- ja kastraatio hoidetuista eläimistä aikaan ruumiinavauksen (7 päivää hoidon jälkeen). Kasvain massa leikattiin ensisijaisen LNCaP (
B
,
vasen paneeli
) ja PC-3 (
D
,
vasen paneeli
) GFP-leimatun kasvain .
Sarakkeet
, tarkoittaa 8 eläimistä;
baareja
, SE. SphK1 aktiivisuus mitattiin kudosuutenäytteitä saatu sham-, ja kastraatio saaneista LNCaP (
B
,
oikea paneeli
) ja PC-3 (
D
,
oikea paneeli
) kasvain omaavilla eläimillä.
Sarakkeet
, tarkoittaa 8 eläimistä;
baareja
, SE. Kahden pyrstö
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; tai ns, ei ole merkittävä.
SphK1 Yliekspressio Renders LNCaP vähemmän herkkä Androgeenien väheneminen
Koska eston SphK1 aikana havaittiin lyhytaikainen androgeenideprivaatio
in vitro
(Kuva. 1 D) ja
in vivo
(Fig. 2B), me selvittämättä, onko transfektointi LNCaP-solujen SphK1 saattaisi estää näiden solujen enemmän vastustuskykyisiä androgen ehtyminen. Transfektiotehokkuutta todennettiin immunoblottauksella (Fig. 3A, vasen paneeli). SphK1 aktiivisuus SphK1 yli-ilmentäviä LNCaP (Fig. 3A, oikea paneeli) lisättiin ~1100 pmol /min /mg proteiinia (eli -30-kertainen verrattuna tyhjän vektorin transfektoitujen solujen). Instrumentaalinen rooli SphK1 inhibition alentuneeseen solujen kasvua varmistettiin solujen elinkelpoisuuden määritykset, jotka osoittivat, että LNCaP yli-ilmentävät SphK1 olivat merkittävästi vähemmän herkkiä vaikutuksille androgen ehtymisen (Fig. 3B). Samanaikaisesti SphK1 täytäntöön ilmentyminen liittyi korkeampi eritystä PSA CSS-käsiteltyjen LNCaP heijastaa sen vaikutukset soluproliferaatioon (Fig. 3C).
SphK1 ilmentyminen LNCaP analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä anti FLAG-vasta-ainetta (
,
vasen paneeli
). Lepo SphK1 aktiivisuus mitattiin LNCaP /neo ja LNCaP /SphK1 solut (
,
oikea paneeli
).
B
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin vastaavasti 5% FBS tai 5% CSS 6 päivää. Solujen proliferaatio määritettiin sitten ja ilmoitetaan prosenttia 5% FBS-käsitellyt solut.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kahdentoista riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001.
C
, erittyvän PSA taso mitattiin elatusaineissa alkaen LNCaP /Neo ja LNCaP /SphK1 soluja 24 tunnin inkuboinnin 5% CSS välineellä.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kuusi riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001.
dihydrotestosteroiniksi Nopeasti ja Ohimenevästi stimuloi SphK1 Aktiivisuus androgeenin reseptori /PI3-kinaasi-riippuvaisella tavalla
Koska alas-säätely SphK1 aktiivisuus korreloi poistamisen androgeenit LNCaP (Fig. 1 D), oli kiinnostavaa määrittää, onko tämä voitaisiin korjata antamalla lisäksi androgeenien. Under CSS olosuhteissa, lisäämällä dihydrotestosteroni (DHT) voivat johtaa varhain ja ohimeneviä stimulaation SphK1 (jo 15 min), jonka jälkeen SphK1 palautui perustasoille (Fig. 4A). Nopea stimulaatio SphK1 oli riippuvainen aktivaatio PI3K /Akt signalointia, joka on osoitettu välittävän nopean androgeenien [39], [40]. Todellakin, kun taas wortmanniini (WT) estämällä sekä aktivoinnin Akt (Fig. 4B, ylhäällä) ja SphK1 (Fig. 4B, alhaalla) aiheuttama DHT, The SphK1 estäjä SKI-2 ei vaikuttanut Akt fosfory- (Fig. 4B, top ). Stimulaatio PI3K /Akt /SphK1 polku oli kriittinen lähettämiseksi proliferatiivisia vaikutuksia DHT mukaisesti CSS olosuhteissa. Itse asiassa, samankaltainen kuin PI3K-estäjien WT ja LY294002 (Fig. 4C), The SphK1 inhibiittorit SKI-2 ja F-12509a voisivat haitata DHT-indusoitua solun proliferaatiota, DNA-synteesin sekä PSA-eritystä (Fig. 4D).
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin alle 5% CSS olosuhteissa ja käsiteltiin 10 nM DHT varten ilmoitettu kertaa. SphK1 aktiivisuus kvantitoitiin ja ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien solujen.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään kuusi riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; ns, ei merkittävää.
B
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin 10 nM DHT 45 min läsnä tai ei 2,5 uM SKI-2 tai 200 nM wortmanniini (WT). Solulysaatit määritettiin fosfo-Akt ja Akt ilmentymisen Western blot -analyysillä. Samanlaisia tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa (
Top). Yön yli seerumi riistää LNCaP-soluja inkuboitiin alle 5% CSS olosuhteet ja käsitelty tai ilman 10 nM DHT ja 200 nM wortmanniini (WT) 45 minuutin ajan, ja essayed varten SphK1 aktiivisuuden (
alhaalla
).
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: **,
P
0,01; ns, ei merkittävää.
C
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin FBS tai CSS olosuhteissa 6 päivän tai ilman 200 nM wortmanniini (WT) tai 1 uM LY294002 läsnä tai ei 10 nM DHT kuten. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina vertailusta alussa kokeen (päivä 0).
Sarakkeet
, keskiarvo on vähintään kahdeksan itsenäistä kokeita;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; ns, ei merkittävää.
D
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin FBS tai CSS olosuhteissa tai ilman 2,5 uM SKI-2 tai F-12509a läsnä tai ei 10 nM DHT 24 h (
top
), 48 h (
keski
) tai 6 päivää (
alhaalla
). Eritettyä PSA taso kvantitoitiin 24 tuntia sen jälkeen, kun ilmoitettu hoidon (
Top). DNA-synteesi ja MTT-pohjainen soluproliferaatiota mittauksen ilmaistiin prosenttia valvontaa hoidon alussa, 2 ja 6 päivää, vastaavasti.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; tai ns, ei merkitsevä.
Vaikutus androgeenireseptoriantagonistin oli seuraava tutkittiin bikalutamidin. Kuten odotettua, LNCaP soluproliferaatiota vaste 10 nM DHT oli täysin tylppäpäiseksi 10pM bikalutamidin (Kuva. 5A). DHT laukaisema stimulaation SphK1 toiminta oli myös estivät täysin läsnä ollessa androgeenireseptoriantagonistin (Fig. 5B).
Yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin alle 5% CSS olosuhteet ja käsitelty tai ilman 10pM bikalutamidi läsnä tai ei 10 nM DHT 2 (
,
top) tai 6 päivää (
,
alhaalla
). DNA-synteesi ja solujen laskenta mittaukset ilmaistiin prosenttia valvontaa hoidon alussa.
B
, yön seerumin riistää LNCaP-soluja inkuboitiin 10 nM DHT 30 min läsnä tai ei 10 uM bikalutamidia, ja SphK1 aktiivisuus kvantitoitiin ja ilmaistiin prosentteina vertailusta alussa hoidon.
Sarakkeet
, keskiarvo vähintään viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; tai ns, ei merkitsevä.
SphK1 osallistuu androgeenisesti väheneminen aiheutetun Neuroendokriininen Transdifferentiation LNCaP ja C4-2B Cells
vieressä tutkineet mahdollisia osallistumista SphK1 siirryttäessä androgeenireseptorin tulenkestävä tilaan, kun kroonista androgen peruuttamisen. Tätä varten, LNCaP ja C4-2B-solut, jotka on aiemmin raportoitu hankkia neuroendokriinisten (NE) fenotyyppi [20], [21], [23], [41], [42], [43] ylläpidettiin CSS edellytykset jopa 42 päivää. LNCaP-solut altistettiin hormoni puutosta väliaineessa tehtiin neuroendokriinisten (NE) morfologisia muutoksia (ilmeiseksi sen jälkeen n noin 7-10 päivää), kuten soma tiivistys ja kehittäminen pitkä ja haarautunut neuriittien laajennukset (Fig. 6A), kun taas kontrolli LNCaP emosoluilta säilytetään fusiform epiteelin morfologian (kuvio. 6A). Lisäksi morfologiset ominaisuudet, transdifferentiated NE-, kuten eturauhasen syöpäsolujen määritellään ilmaisu useita neurosecretory tuotteita, kuten kromograniini A (CGA) ja neuroni-enolaasin (NSE). CGA pidetään kaikkein luotettavia eturauhasen NE erilaistumista.
, edustava vaihe-kontrastin kuvia LNCaP alussa kokeen (päivä 0) ja 42 päivän inkuboinnin puuhiilellä puhdistettua olosuhteissa (päivä 42). Kromograniini A (CGA) pitoisuus arvioitiin immunoblottauksella ilmoitettuina aikoina (
alhaalla
) .Secreted Neuron enolaasin (NSE) taso mitattiin kulttuurin median LNCaP ilmoitettuina aikoina (
oikeassa paneelissa
).
Sarakkeet
, keskiarvo viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD. Kahden pyrstö
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001. SphK1 aktiivisuus (
B
,
vasen paneeli
) määritettiin ilmoitettuina aikoina LNCaP inkuboidaan CSS olosuhteissa.
Pisteitä
, keskiarvo viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD.
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001.
Inset
, S1P sisällön TLC osoitti.
Oikea paneeli
, ilmaus SphK1, fosfo-Akt, ja Akt analysoitiin Western blottauksella ilmoitettuina aikoina. Samanlaisia tuloksia saatiin viisi itsenäisestä kokeesta.
C
, ilmaus CGA ja fosfo-Akt (
vasen paneeli
) ja SphK1 aktiivisuus (
oikea paneeli
) analysoitiin 10 päivän kuluttua hoidon tai 1 uM LY294002 tai 200 nM wortmanniini (WT) alle puuhiilellä puhdistettua olosuhteissa.
Sarakkeet
, keskiarvo viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD. Kahden pyrstö
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001.
D
, erittyvän NSE taso mitattiin elatusaineissa 10 päivän kuluttua hoidon tai 5 uM SKI-2 alle puuhiilellä puhdistettua olosuhteissa (
vasen paneeli
). Expression of CGA ja fosfo-Akt analysoitiin western blot (
oikea paneeli
).
Sarakkeet
, keskiarvo viiden riippumattoman kokeen;
baareja
, SD. Kahden pyrstö
P
arvojen keinot ovat seuraavat: **,
P
0,01.
Yhdenmukainen aiempien havaintojen [41], [44], immunobloteilla osoitti CGA ilme oli hyvin pieni sekä vanhempien LNCaP (Fig. 6A, alempi paneeli) ja C4-2B (kuva S1) soluihin, kun taas sen ekspressiotaso oli suuresti parannettu ajan myötä hormonien puutosta väliaineessa. Lisäksi verrattuna ei hormonia riistää LNCaP (D0), 3-kertainen NSE eritys keskipitkän löytyi 42 päivän kuluttua alle CSS olosuhteissa osoitus NE kaltaisen fenotyypin (Fig. 6A, oikea paneeli). Perustuen aiempien havaintojen SphK1 toiminnan yhteydessä androgeenideprivaatio vasta lyhytaikaisesti inhiboitui merkittävästi rebound 4 päivän inkuboinnin CSS väliaineessa (Fig. 1 D), me sitten analysoineet SphK1 toimintaa 42 päivän aikana NE transdifferentiation prosessi. Merkillistä, SphK1 aktiivisuus (Fig. 6B) kasvoi progressiivisesti enintään 4-kertainen nousu 42 päivän kuluttua androgen ehtyminen. Tätä valaistaan edelleen selvästi lisääntynyt S1 P sisältöä (Fig. 6B, upotus). Samanaikaisesti SphK1 proteiinin ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (Fig. 6B, oikea paneeli). Aktivointi SphK1 korreloi stimulaation Akt (Fig. 6B, oikea paneeli), pro-selviytymisen signalointireitistä raportoitu sääteli aikana NE transdifferentiation LNCaP aiheuttama androgen ehtyminen [6], [7], [23 ], [45]. Vertailukelpoisia löydöksiä havaittiin C4-2B solussa malli (kuva S1).
Aiempien tutkimusten [6], farmakologinen esto PI3K /Akt-reitin voisi haitata NE transdifferentiation molempien LNCaP (Fig. 6C ) ja C4-2B (kuva S1) säilytettävä 10 päivän ajan CSS olosuhteissa. Huomattavaa on, että saarto CGA kertymisen aiheuttama PI3K inhibiittorit WT ja LY294002 oli merkittävästi yhteydessä matalaan sekä Akt-fosforylaation ja SphK1 aktiivisuutta (Fig. 6C, oikea paneeli ja kuvio S1).
Tutkiakseen toiminnallista roolia SphK1 NE transdifferentiation, tutkimme vaikutus farmakologisen inhibiittorin Ski-2 LNCaP ja C4-2B soluja. Läsnäollessa SKI-2 (5 uM), erillisten NE kaltainen morfologia havaittu pääasiallisesti kumottiin LNCaP näytteille pyöristetty morfologia lyhyet harvoin haaroittunut soluprosesseissa (ei kuvassa). Lisäksi sekä eritystä NSE (Fig. 6D, vasen paneeli) ja CGA kertymistä (Fig. 6D, oikeanpuoleinen paneeli ja kuvio S1) on merkittävästi vähentynyt, kun taas Akt-fosforylaation pysyi muuttumattomana siten viittaa siihen, että SphK1 inhibitio voi jossain määrin estää NE transdifferentiation .
fysiologiset tai farmakologiset aineet, jotka lisäävät solujen syklisen AMP (cAMP), voi indusoida kehittämistä NE morfologia LNCaP tai C4-2-solujen läsnä ollessa, steroidien [41], [44], [46 ]. Huomattavaa on, että cAMP nousu on aikaisemmin raportoitu liittyvän aktivoitumisen SphK1 osteoblastien [47]. Siksi tutkimme rooli cAMP mahdollisena ylävirtaan säätelijä SphK1 aikana NED. LNCaP ja C4-2B-soluja stimuloitiin adenylaattisyklaasiaktivaattorina forskoliinilla (FSK) ja fosfodiesteraasi-inhibiittorin IBMX, tai adrenaliinin (Epi), joka on β-adrenergisen reseptorin agonistia. Käsittely Fsk /IBMX tai Epi stimuloi vahvasti SphK1 aktiivisuutta (Fig. 7A), ja korreloi lisääntyneen cAMP-pitoisuuden (Fig. 7B) ja hankinta NE morfologian (tuloksia ei ole esitetty), tunnettu siitä, biokemiallisesti CGA kertyminen (Kuva. 7C). Mielenkiintoista on, että pharmacoligical inhibitio SphK1 ei ollut mitään vaikutusta cAMP-tasot (Fig. 7B), kun taas se ei merkittävästi estää NED (Fig. 7C). Merkillistä, alle androgeenideprivaatio olosuhteissa samanlainen nousu cAMP solunsisäisten tasojen havaittiin, jota ei voida estää farmakologinen esto SphK1 (Fig. 7D). Nämä tulokset herättävät rooli cAMP stimulointiin SphK1 toiminnan aikana NED.
, SphK1 aktiivisuus määritettiin LNCaP ja C4-2B soluja käsitellään 3 päivänä läsnäollessa tai ilman 10 uM Fsk /10 mM IBMX tai 10pM Epi.
B
, solunsisäisiä pitoisuuksia cAMP kvantitoitiin LNCaP ja C4-2B soluja käsitellään 3 päivää 5% FBS tai 10 uM Fsk /10 mM IBMX puuttuessa tai läsnä ollessa 5 uM SKI-2.
C
, kromograniini A (CGA) pitoisuus evalated immunoblottauksella LNCaP ja C4-2B solu-uutteet inkuboitiin 3 päivää tai ilman 5 uM SKI-2: n läsnä ollessa 5% FBS, 10 uM Fsk /10 mM IBMX: ää tai 10pM Epi. Samanlaisia tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.
D
, solunsisäisiä pitoisuuksia cAMP kvantitoitiin LNCaP ja C4-2B soluja ennen tai 14 päivän kuluttua hoidon tai 5 uM SKI-2 alle puuhiilellä puhdistettua olosuhteissa.
Sarakkeet
, tarkoittaa kolmen riippumattoman kokeen;
baareja
, SD. Kahden pyrstö
P
arvojen keinot ovat seuraavat: ***,
P
0,001; *,
P
0,05; tai ns, ei merkitsevä.
Sen määrittämiseksi, onko
in vitro
havaintoja mahdollisesta osallistumisesta SphK1 NE erilaistumiseen ollut merkitystä ihmisten sairauksien, osastoja edustaja potilas, jolle tehtiin lievittävää höyläysleikkaus paikallisen uusiutumisen alle täydellisen androgeenien saarto immunovärjättiin CGA ja SphK1 ilmaisun (Fig. 8). SphK1 värjäys rajoitettu solulimassa joidenkin solujen ollessa voimakkaammin värjätään kuin toiset (Fig. 8B, avoin nuolenkärki). Fibromuskulaarinen strooman ei värjäytynyt positiiviseksi SphK1. CGA värjäytyminen havaittiin vähemmistö syöpäsoluja, noin 10%, muodossa erittävien granuli (H, Kuva. 8D). Koekspressoimalla CGA sinisellä ruskea SphK1 johti voimakkaan tummanruskea signaali (kiinteä nuolenkärki). Huom kuvassa. 8A (alhaalla) ja Fig. 8C, neuroni näköisiä kaksinkertaisen leimattu syöpäsolun (kiinteä nuoli).
Dual immuunivärjäysmenetelmällä anti-SphK1 (ruskea) ja anti-CGA (sininen) on resektio mallin korjattu 84 yo mies T4NxM1 eturauhassyöpä alle täydellisen androgeenien saarto. Matala seerumin PSA ja positiivinen seerumi NSE ehdotti huonosti eriytetty syöpää neuroendokriini ominaisuuksia, kuten vahvistettiin patologinen tutkimus resektoitua näytteen näytetään korkealaatuista eturauhassyöpää (Gleason 9) positiivista värjäytymistä CGA. Blue rakeinen eritys ominaisuus neuroendokriini erilaistumista colocalized ruskealla SphK1 immunoreagoivuuden in neuroni kaltaisia soluja (kiinteä nuolenkärki).
Siirtyminen androgen tulenkestävä tilan aikana krooninen androgen ehtyminen on ominaista
vuonna vitro
jonka häviämisen androgeenin puutteellisista soluista joko FBS tai DHT [20]. Jo 7 päivää ja 14 päivää androgeenireseptorin peruuttamista, LNCaP olivat täysin välinpitämättömiä siirron jälkeen FBS olosuhteissa tai käsitelty DHT osalta solujen lisääntymistä (kuvio. 9A, vasen paneeli) tai erityksen PSA (Fig. 9A, oikea paneeli). Kuitenkin NE kaltainen fenotyyppi on palautuva, kun täydennystä median täydellinen seerumin aikana useita viikkoja [20]. Kun LNCaP androgeenista köyhdytettyä 42 päivän vaihdettiin takaisin normaaliksi FBS: ia, solujen kasvua jatkettiin aikana seuraavan viikon ja seuraavan 21 päivän FBS: ia, solun morfologia palasi että vanhempien LNCaP-soluja (tietoja ei esitetty). Kuten osoitettu kuvassa. 8B, nämä solut olivat nyt ei vain voi kasvaa normaalisti ja erittävät PSA läsnä FBS kuten vanhempien LNCaP (Fig. 1A), mutta myös vastata uudelleen lisäämällä DHT mukaisesti CSS kaltaisissa olosuhteissa emosoluista (Fig. 4C ja D). baareja, SD. baareja, SD. baareja, SD.