Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset todisteet ehdotti, että eturauhassyövän varsi /kantasolujen (CSC) ovat vastuussa syövän aloittamisen sekä taudin etenemisen. Valitettavasti tavanomaiset hoidot ovat tehokkaita vain kohdentamisessa eriytetymmällä syöpäsoluja ja säästäisi CSCS. Täällä, me raportoimme että PSP, aktiivinen komponentti erotetaan sieni Turkki häntää (tunnetaan myös nimellä

Coriolus versicolor

), on tehokas kohdistaminen eturauhasen CSCS. Huomasimme, että käsittely eturauhassyöpäsolulinja PC-3 PSP johti alas-säätely CSC markkereita (CD133 ja CD44) ajassa ja annosriippuvaisesti. Samaan aikaan, PSP kohtelu ei vain tukahdutetaan kyky PC-3-solujen muodostamiseksi prostaspheres alle tarttumaton viljelyolosuhteissa, mutta myös esti niiden kasvainten muodostumiseen

in vivo

edelleen todistaa, että PSP voi tukahduttaa eturauhasen CSC ominaisuuksia. Tutkia, anti-CSC vaikutus PSP voi johtaa eturauhassyövän kemopreventiossa, siirtogeenisiä hiiriä (TgMAP), joka spontaanisti kehittävät eturauhasen kasvaimia suun ruokittiin PSP 20 viikon ajan. Kun taas 100% hiiristä, jotka syötetään vettä vain kehitetty eturauhasen kasvaimia kokeen lopussa, ei havaittu kasvaimia voisi löytyä millään hiirellä syötetään PSP, viittaa siihen, että PSP hoito voi täysin estää eturauhassyövän muodostumista. Tuloksemme paitsi osoittanut kiehtova vastaisen CSC vaikutus PSP, mutta myös paljasti, ensimmäistä kertaa, yllättävä chemopreventive omaisuutta suun PSP kulutuksen eturauhassyöpää vastaan.

Citation: Luk SU, Lee TK-W Liu J, Lee DT-W, Chiu YT, Ma S, et ai. (2011) chemopreventive vaikutus PSP kohdistamalla Eturauhassyöpä Stem Cell-Like Väestö. PLoS ONE 6 (5): e19804. doi: 10,1371 /journal.pone.0019804

Editor: Kelvin Yuen Kwong Chan, Tsan Yuk sairaala, sairaala Authority, Kiina

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2010 Hyväksytty: 16 huhtikuu 2011; Julkaistu: 16 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Luk ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: varakansleri Research Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on miesten yleisin maligniteetti länsimaissa ja se muodostaa merkittävän sairauksista maailmassa. Kun diagnosoitu pitkälle edenneessä vaiheessa, jossa leikkaus ei ole enää mahdollista, ainoa etulinjassa hoito käytettävissä on hormoniablaatioterapia. Valitettavasti suurin Eturauhassyövän potilaista lopulta relapsi ja kehittää hormoniresistentti PCa (HRPC), kohtalokas ja terminaalivaiheessa pidetään parantumaton [1].

kemopreventioon on ihanteellinen strategia taistelee eturauhassyöpä, ja useat kemoterapeuttisia aineita tai luonnollista ravintolisiä parhaillaan testataan niiden potentiaalia estämällä eturauhassyövän kehitystä. Esimerkiksi finasteridi, 5-alfa-reduktaasin erityisiä inhibiittorin on osoitettu vähentävän eturauhassyövän ilmaantuvuus 25% kliiniseen tutkimukseen [2]. Samoin dutasteridi, analogi finasteridia, on myös raportoitu merkitsevästi estävän eturauhassyövän kehitystä [3]. Huolimatta lupaava seurauksena sivuvaikutuksia liittyy finasteridi hoitoon edelleen suuri huolenaihe, että sitä käytetään laajalti eturauhassyövän kemopreventiota. Siksi bioaktiivisten ruoka yhdisteet, kuten epigallocatechin-3-gallate tai resveratrolin [4], [5], [6] on houkutteleva vaihtoehto eturauhassyövän kemopreventiossa, lähinnä niiden suhteellisen alhainen myrkyllisyys. Valitettavasti useimmat aikaisemmat tutkimukset ovat tuottaneet selkeitä tuloksia koskevat heidän chemopreventive potentiaalia.

Viimeaikaiset tunnistaminen eturauhassyövän kantasolujen (CSCS) [7] on tarjonnut uutta tietoa eturauhasen syövän synnyn. Kyky Näiden syövän kantasoluja itse uudistaa ja erilaistuvat bulk syöpäsoluja ehdotti, että ne voivat olla peräisin eturauhassyövän [7]. Lisäksi erittäin kestävä luonne CSCS eri chemotherapies ehdotti, että CSCS voi myös edistää hoidon epäonnistumisen ja sairauden uusiutumisen [8]. Mielenkiintoista on, että useita bioaktiivisia elintarvikkeiden yhdisteiden on äskettäin osoitettu olevan anti-CSC vaikutus. Olemme esimerkiksi raportoi äskettäin, että gamma-tokotrienoliin uutettu palmuöljystä estää prostasphere muodostumista kyky ja tuumorigeenisyystesti eturauhassyöpäsolujen [9], mikä viittaa siihen, että gamma-tokotrienoliin on tehokas tukahduttamaan eturauhasen CSC ominaisuuksia. Lisäksi triterpene uutetaan hedelmistä havaittiin myös estävän itseuudistumisen kyky maksan CSCS ja herkistää maksan kasvain sisplatiinihoitoon [10]. Nämä havainnot korostavat mahdollisuuksia bioaktiivisten elintarvikkeiden yhdisteiden CSC kohdistaminen aineena joko ehkäisemiseen tai hoitoon eturauhasen syöpä.

Tässä me osoitimme, että polysaccharopeptide (PSP) uutettu Turkki hännän (tunnetaan

Coriolus versicolor

tai Yun-zhi) tavoitteet eturauhassyövän CSCS in vitro ja estää kasvaimen muodostumiseen in vivo. Hoito eturauhassyöpäsolulinja PC-3 PSP johti alas-säätely CSC markkereita (CD133 ja CD44) ajassa ja annosriippuvaisesti. Samaan aikaan, muodostuminen prostasphere, merkittävä ominaisuus eturauhasen CSCS, oli täysin vaimentaa PC-3-solujen läsnä ollessa PSP. Lisäksi PSP esikäsittely merkittävästi tukahdutti kasvaimen aloittamisesta PC-3-solujen immuunipuutteisilla hiirillä, mikä viittaa siihen, että PSP vaimentaa tuumorigeenisyyden PC-3-soluja. Vielä tärkeämpää on, ruokinnalla suun kautta siirtogeenisiä hiiriä (TgMAP), joka spontaanisti kehittävät eturauhasen kasvain PSP havaittiin täysin estävän eturauhasen kasvaimen muodostumisen. Meidän havainnot tukevat että PSP voi olla voimakas chemopreventive aine eturauhassyöpää vastaan, mahdollisesti kohdentamiseen eturauhasen CSC väestöstä.

Tulokset

Vaikutukset PSP CSC merkki ilmaisun

PSP on aiemmin osoitettu olevan syövän ominaisuuksia [11], [12], [13], vaikka taustalla mekanismit ovat vielä epäselviä. Voit testata, syövän vaikutusta PSP on kohdistamalla CSC ominaisuuksia, ensin selvitettävä, jos PSP hoito vaikuttaa ilmaus eturauhasen CSC merkkiaineiden PC-3 solulinja, joka on raportoitu sisältävän CSCS. PC-3-soluja käsiteltiin 250 ja 500 ug /ml PSP joko 48 tai 72 tuntia, ja ilmaus CSC markkereita, kuten CD133 tai CD44 tutkittiin western blottauksella. Kuten kuviossa 1B on esitetty, proteiini ilmentymistä CD133 oli merkittävästi alassäädetty jälkeen PSP hoidon ajan ja annoksesta riippuvalla tavalla. Downregulation CD44 havaittiin myös, kun PSP hoidon, vaikka vaikutus oli vähemmän ilmeinen. Kuitenkin tarkastelu mRNA-tasolla sekä CD133 ja CD44 paljasti, että downregulation molempien proteiinien PSP ei estämällä geenin transkription (data ei esitetty). Kuitenkin nämä tiedot viittaavat siihen, että PSP voi olla tehokas kohdentamisessa otaksuttu eturauhasen CSCS.

A) Western blottaus eturauhasen CSC markkereita CD44 ja CD133 PC-3-solujen jälkeen PSP hoidon. Huomaa, että PSP merkittävästi alas-säätelee kantasolujen merkkiaineita annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. B) elinkelpoisuus PC-3-solujen hoidon jälkeen 5, 25, 125, 250 ja 500 ug /ml PSP 48 tai 72 tunnin ajan mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. C) Virtaussytometria-analyysi PC-3-solujen käsittelyn jälkeen 250 ug /ml PSP 72 tuntia. Huomaa, että ei ole merkittävää eroa solusyklin jakautuminen havaittiin. D) Western blot tulokset apoptoottisia markkereita (vasen paneeli) ja kantasolujen ylläpito proteiineja (oikea paneeli) PC-3-solujen jälkeen PSP hoidon. Huomaa, että mitään muutoksia Bax ja Bcl-2 tai lohkeaminen PARP havaittiin.

Voit testata, jos alas-säätely CSC merkki ilmaisun PSP johtuu lasku solujen elinkelpoisuuden, PC- 3-soluja käsiteltiin PSP eri annoksilla (0, 5, 25, 125, 250 ja 500 ug /ml) 24, 48 tai 72 h tutkittiin MTT-määrityksellä. Mielenkiintoista on, että 48 h PSP hoito ei ollut havaittavia vaikutuksia solujen elinkelpoisuuteen, vaikka samaa hoitoja havaittiin merkittävästi estää ilmentymisen CSC markkereita (kuvio 1 B 1C). Samalla PSP hoito myöskään aiheuttaa solukierron pysähtymisen tai apoptoosin, on osoituksena siitä, ettei osa-G1 väestön tulos virtaussytometria-analyysi (kuvio 1 D). Tämä vahvistettiin lisäksi tutkimalla apoptoosin liittyvien proteiinien (ts Bax, Bcl-2 ja pilkottiin PARP) (kuvio 1 E). Kuitenkin Akt /β-kateniinin reitin, joka vastaa rikastamista CSCS rintasyövässä, rajusti inhiboi PSP hoitoa. Kuten kuviossa 1D, aktivointi AKT fosforylaatio on ser 473 estyi PSP molemmilla annoksilla, jotka oli liitetty täydellinen häviäminen β-kateniinin ilmentymistä (kuvio 1 E).

PSP estää prostasphere muodostumista eturauhasen syöpäsolut ei-tarttuva viljelyolosuhteissa

kyky muodostaa prostaspheres ei-tarttuva kulttuuri on yksi ominaisuuksista eturauhasen CSCS [14], [15], [16]. Sen vahvistamiseksi, että PSP hoito voi estää eturauhassyövän CSC ominaisuuksia, prostasphere muodostumista PC-3 tutkittiin, kun läsnä tai poissa PSP. Kuten kuviossa 2A on esitetty, viljelemällä sekä PC-3 ja DU145-soluja 14 päivää ei-tarttuva olosuhteissa johtaa muodostumista prostaspheres, edelleen vahvistaa, että läsnä on varren kaltainen perusjoukko molemmissa solulinjoissa. Silmiinpistävän, lisäys PSP keskipitkällä rajusti esti prostasphere muodostumista molemmissa solulinjoissa. Erityisesti ei prostaspheres havaittiin joko solulinjassa läsnä ollessa 500 mg /ml PSP, viittaa siihen, että PSP hoito merkittävästi eliminoida eturauhasen CSCS. Edelleen osoittautui, että PSP estää tehokkaasti prostasphere muodostumiseen, ensisijainen prostaspheres rikastettua CSC väestön hajotettiin ja uudelleen ympättiin tarttumattomat kulttuurin edellytys, jotta muodostumista toissijainen prostaspheres. Yhdenmukainen tulos ensisijaisen sferoidi muodostumista määrityksessä, PSP hoitoja merkittävästi estää määrä prostaspheres Jokaisessa solulinjassa, mutta korkeampi annos PSP (500 mg /ml) ei pystynyt täysin poistaa kaikki toisen prostaspheres. Kuitenkin, nämä tulokset viittaavat siihen, että PSP on tehokas tukahduttamaan CSC ominaisuuksia eturauhasen syöpäsoluja.

A) sferoidi muodostumisen määritys suoritettiin PC-3 ja DU145-soluissa. Kaksisataa-solut ympättiin polyHEMA pre-päällystetyille levyille ja käsiteltiin joko 500 ug /ml PSP tai ajoneuvon 14 päivää. Määrä prostaspheres muodostettu laskettiin, ja tulos esitettiin keskiarvona ± S.D. Huomaa, että γ-T3 hoito tehokkaasti estää pallomainen muodostumista kyky PC-3-solut. Kuva prostaspheres otettiin kiinni mikroskoopilla. Huomaa, että ei prostaspheres löytyy soluissa, joita käsiteltiin 500 ug /ml PSP. (B) PSP inhiboi johdetun prostaspheres. Ensisijainen prostaspheres hajotettiin ja uudelleen ympättiin polyHEMA pre-päällystetylle levylle. PSP lisättiin 24 tunnin jälkeen pinnoitteen. Huomaa, että prostasphere muodostuminen inhiboitui enemmän kuin 70% ja 90%, kun läsnä oli 250 ug /ml ja 500 ug /ml PSP vastaavasti. *

P

0,001, **

P

0,0001,

t

testiä.

PSP vähentää merkittävästi tuumorigeenisyyden eturauhasen syöpäsolut

in vivo

Koska CSC vastaa syövän aloittamista, on mahdollista, että PSP hoito voi inhiboida kasvaimen muodostumisen kyky PC-3-soluja in vivo. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin käsitelty PC-3-soluista, jotka stabiilisti ilmentävät lusiferaasia proteiinia (PC-3-Luc), PSP 72 tuntia, ennen kuin ortotooppisesti ruiskutetaan ne SCID-hiirissä. Tutkittuna bioluminesenssi kuvantaminen, kaikki hiiret, jotka oli injektoitu vehikkelillä esikäsitellyn PC-3-luc solut muodostivat kasvaimia kahden viikon kuluttua implantaatiosta (kuvio 3A). Kiehtovan, kolme kahdeksasta hiiriä, joihin injektoitiin PSP esikäsitelty PC-3-luc solujen onnistuneet kehittämään kasvaimia jopa viikon neljän post istutusta (Kuva 3A B). Puute kasvaimia PSP-pre-käsitelty ryhmä vahvistettiin lisäksi tutkimalla hiiren eturauhasen rauhasten kokeen lopussa (kuvio 3C). Yhdessä tuloksemme ehdotti, että PSP oli tehokas vähentämään Tuumorigeenisuustutkimuksissa eturauhasen syöpäsolujen, joka on oleellinen ominaisuus CSCS.

A) Bioluminescent kuvia SCID-hiirten ortotooppisesti pistetään PC-3-luc-solujen kahdeksi viikoksi. SCID-hiiriin ylärivissä injektoitiin apuaineella hoidettuihin PC-3-luc-soluissa, kun taas hiiret alarivissä injektoitiin PSP-käsitelty PC-3-luc-soluissa. B) Taulukossa yhteenveto prosenttiosuudet hiirten kehittää havaittavissa kasvaimia viikolla 2. Noin 40% hiiristä PSP esikäsitelty ryhmä ei muodosta havaittavissa kasvaimia, kun taas 100% kasvainmuodostusta todettiin kontrolliryhmässä (p = 0,07). C) Valitut

ex vivo

kuvia eturauhasen molemmista ryhmistä. Huomaa, että PSP-käsitellyissä hiirissä on negatiivinen Lusiferaasisignaali, ei näkyvää kasvainta havaittiin eturauhasen kudosta.

suun kautta PSP ei inhiboida eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN) kehitys TgMAP hiirillä

vaikutus PSP eturauhasen CSCS tukee oletusta, että se voi olla kemopreventiivisiä vaikutuksia eturauhassyöpää vastaan. Tämän hypoteesin testaamiseksi, olemme palkanneet siirtogeenisen hiiren mallia kehittää spontaanisti adenokarsinooma eturauhasen (TgMAP) [17], [18]. TgMAP hiiret kehittävät PIN 16-20 viikon iässä ja edetä eturauhasen adenokarsinooma jälkeen viikon 24 (kuvio 4A). Koska PIN pidetään premaligneja vaurio ja tärkein riskitekijä eturauhassyövän [19], ensin testata, jos PSP hallinto vaikuttaa PIN kehitystä TgMAP hiirillä. Viisi TgMAP hiiriä (14 viikkoa vanhoja, vähintään 2 viikkoa ennen PIN kehitys) syötettiin 200 mg /kg PSP 4 viikkoa. Neljä hiiret samanikäisiä ruokittiin pelkällä vedellä saman ajanjakson ajan. Kaikki hiiret lopetettiin 20 viikkoa vanhoja ja eturauhaskudoksista kerättiin ja leikattiin histologiaa varten. Kuten kuviossa 4B Eosiini-värjäys eturauhasen kudoksia TgMAP hiirillä. Huomaa, että sekä ohjaus- ja PSP-käsiteltyjen TgMAP hiirille kehittyi eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN), kuten on osoitettu nuolilla.

pidentäminen PSP kulutuksen estää eturauhassyövän kehityksestä TgMAP hiirillä

epäonnistuminen estää PIN muodostumista PSP hoito voi johtua riittämätön annos tai hoidon pituudesta. Siksi testata, jos suurempi annos ja pidemmän PSP kulutus voi vaikuttaa eturauhasen kasvainten muodostumiseen käyttäen samaa mallia. Viisi TgMAP hiiriä (8 viikon ikäisiä) syötettiin 300 mg /kg PSP yhteensä 20 viikkoa (kuvio 5A). Neljä hiiriä samassa iässä jälleen syötetään vettä ainoastaan ​​samaa aikaa. Kaikki hiiret lopetettiin 28 viikkoa vanhoja kun eturauhasen kasvaimia muodostettiin, jossa eturauhaskudokset kerätään ja leikattiin histologiaa. Kuten kuviossa 5B on esitetty, kasvainten havaittiin eri osissa eturauhanen kaikista hiiristä, jotka oli ruokittu vain vedellä. Yllättäen, tutkittaessa kaikki eturauhasen osassa paljasti, että yksikään hiiristä, jotka syötettiin PSP synnytti tahansa eturauhasen kasvaimia (kuvio 5C), mikä viittaa siihen, että PSP käsittely inhiboitui täydellisesti eturauhasen kasvainten muodostumista TgMAP hiirillä. Samaan aikaan, kun taas kolme PSP-syötetään hiiret havaittiin olevan PIN, muut kaksi hiirtä havaittiin olevan täysin normaali eturauhanen (kuvio 5D). Lisäksi sopusoinnussa alhainen myrkyllisyys PSP, pitkän aikavälin kulutus ei näytä olevan puolelle vaikutusta hiirillä, arvioituna kehon painon muutoksia ja fyysisiä oireita (tuloksia ei ole esitetty) (kuvio 5E). Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että suun kautta PSP voi olla turvallinen ja tehokas chemopreventive aine eturauhassyöpää vastaan.

A) Yhteenveto aikataulun PSP hoitoon. Kahdeksan viikon ikäisiä TgMAP hiiriä hoidettiin 300 mg /kg PSP letkulla suun kautta ruokinta 20 viikkoa ja tapettiin ikä 28 viikkoa. B C) edustaja kuvia hematoksyliinillä Eosiini-värjäys eturauhasen kudosten ajoneuvosta ja PSP-käsiteltyjen TgMAP hiirissä. Huomaa, että kasvaimia havaittiin kaikissa hiirissä, joita oli käsitelty vain vehikkelillä, mutta olivat poissa kaikista PSP-käsitellyissä hiirissä. D) Seuraavassa taulukossa esitetään yhteenveto tuloksista histologian tutkimisen eturauhasen kudosten ajoneuvosta ja PSP-käsiteltyjen TgMAP hiirissä. * P 0,05 verrattuna kontrolliin hoitoa Fisherin testiä. E) keskimääräinen paino hiirten aikana PSP hoidon.

Keskustelu

PSP on aiemmin osoitettu aiheuttavan apoptoosia ja estää kasvua laaja-syöpäsolujen, joka sisältää rintojen [20], [21], [22], maksa [23] ja eturauhassyövän [24], vaikka mekanismeista sen syöpälääkkeen vaikutuksia yhä puutteellisia. Täällä me osoitettu ensimmäistä kertaa, että PSP on anti-CSC vaikutuksia, on osoituksena downregulation CSC markkereita ja tukahduttaminen prostasphere ja kasvainten muodostumisen.

Eturauhasen CSCS ensin tunnistettiin Collins et al. vuonna 2005 käyttämällä CD44 + /alpha2beta1hi /CD133 + kuin solunpintamarkkereiden [25]. Käyttäen samanlaisia ​​lähestymistapoja, CSCS on myös tunnistettu eturauhassyövän solulinjoissa, kuten LNCaP [26], DU145 [26], [27] ja PC-3 [28], [29]. Nämä eturauhasen CSCS paitsi ilmaista korkeaa CD133 ja CD44, mutta ovat myös erittäin tuumorigeenisia verrattuna ei-CSC väestöstä. Se, että PSP voi merkittävästi estää ilmentymisen sekä CD133 ja CD44, sekä tuumorigeenisyyden PC-3-soluja, osoittaa selvästi tehokkuutta PSP kohdentamisessa eturauhasen CSCS. Kuten käy ilmi Hsieh et al [24], PSP on tehokas apoptoosin induktion ja soluproliferaation inhibointi LNCaP-soluissa. Kuitenkin sen vaikutus oli paljon vähemmän näkyvästi androgeeniriippumattomaksi eturauhassyövän solulinjoissa kuten PC-3. Tämä on todellakin vastaa meidän toteamuksen, joka osoitti, että PSP voi tukahduttaa CSC ominaisuudet aiheuttamatta mitään havaittavaa solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin. Kuitenkin havainto, että sekä Akt fosforylaation ja β-kateniinin ilmentyminen oli myös alas-säädellä PSP (kuvio 1 E) esittää, että PSP voi toimia inaktivoimalla PTEN /Akt /β-kateniinin väylän estää CSC uusiminen. Tämä äskettäin tunnistettu kantasolujen ylläpito koulutusjakson osoitettiin avainasemassa säätelyssä eturauhasen ja maitorauhasen kantasolukkoa [16], [30]. Poikkeava aktivaatio Akt /β-kateniinin reitti läpi pudotus PTEN havaittiin rikastuttaa rintarauhasen kantasolujen populaation, joka johtaa induktio hyperplastisten vaurioita hiiren [30]. Samoin, pudotus PTEN eturauhassyöpäsoluissa havaittiin myös parantaa prostasphere muodostumista kykyä ja tuumorigeenisyyden solujen [16]. Siksi menetys ”stemness” eturauhasen CSCS jälkeen PSP hoito voi johtua alas-säätely PTEN /AKT /β-kateniinin reitin.

Yksi tärkeimmistä ominaisuuksista kantasolujen on niiden kyky muodostamaan aloilla, tarttumaton, seerumittomissa olosuhteissa [31]. Todellakin, pallojakaantuminen muodostuminen määrityksiä on viime aikoina käytetty tunnistamaan ja rikastuttaa otaksuttu CSCS [16], [32], [33], [34]. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimusten sekä eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja DU145 pystyivät muodostamaan prostaspheres ei-tarttuva kulttuuri [16], mikä viittaa siihen, että läsnä on CSCS näissä solulinjoissa. Nämä ensisijainen prostaspheres, jotka ovat resistenttejä kemoterapia-lääkkeet [9], jotka ovat hyvin herkkiä PSP hoitoon (kuvio 2A). Lisäksi, toisen prostaspheres merkittävästi inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B), joka tukee, että PSP on tehokas poistamaan eturauhasen CSCS

in vitro

.

Eturauhasen CSCS uskotaan olevan alkuperä eturauhasen kasvain, joka on kyky itse uudistaa ja erilaistua pääosa kasvaimeen [35]. Se, että PSP esikäsittely voi merkittävästi inhiboida tuumorigeenisyyden PC-3-soluja (kuvio 3) ei ainoastaan ​​tuo esiin anti-CSC vaikutus PSP, mutta myös siitä, että PSP voi olla kemopreventiivisiä vaikutuksia eturauhassyöpää vastaan. Testasimme Tämän hypoteesin käyttämällä äskettäin kehitettyä siirtogeenisen hiiren mallia eturauhasen syöpä (TgMAP) [17], [18]. Vaiheittaista kehittämistä eturauhasen kasvain (alkaen huono laatu PIN brutto kasvain) on TgMAP hiiri erittäin jäljittelee patogeneesissä ihmisen eturauhassyövän, vaikka se ei täysin vastaa monimutkaisuus eturauhasen syövän synnyn. Siitä huolimatta se antoi meille mahdollisuuden kehittää optimaalisen PSP hoidon annostus ja aikataulu. Kun taas neljän viikon PSP nautittavaksi 200 mg /kg ei tuota mitään eroja PIN kehittämiseen, täydellinen esto eturauhasen kasvaimen muodostumisen saavutettiin 20 viikon kuluttua suun kautta PSP ruokinta 300 mg /kg. Samaan aikaan tukahduttaminen PIN muodostumista PSP Lisäksi ehdotetaan, että chemopreventive vaikutus PSP voi heikkenemisestä johtuen kasvaimen aloittamista varhaisessa vaiheessa. Erittäin alhainen myrkyllisyys ja erittäin voimakas anti-CSC vaikutus PSP optio tutkitaan tarkemmin sen chemopreventive vaikutuksia kliinisissä kokeissa ihmisillä.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, ensimmäistä kertaa, että PSP hoito ei ainoastaan ​​inhiboi CSC ominaisuudet, mutta myös tehokkaasti estää eturauhasen kasvaimen muodostumisen. Tuloksemme viittaavat siihen, että PSP voi olla tehokas aine eturauhassyöpää kemopreventiossa.

Materiaalit ja menetelmät

Polysaccharopeptide (PSP) B

PSP uutettu Yun-Zhi ystävällisesti ihme, yrtti Health Products, Ltd PSP jauhe liuotettiin autoklavoitiin Milli Q vedellä, jonka pitoisuus on 30 mg /ml sekoittamalla rotaattorin 4 ° C: ssa yön yli. PSP Liuosta säilytettiin 4 ° C: ssa. Soluviljelyyn tutkimuksessa, PSP varastossa oli steriloitu 0,2 um suodatuksella ennen käyttöä. Eläinten tutkimuksessa, PSP syötettiin suoraan hiirillä.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Eturauhassyöpä solulinjoissa PC-3 ja DU145 (ATCC, Rockville, MD) ylläpidettiin RPMI 1640 keskipitkän (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 1% (w /v) penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 5% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ympäristössä. Luciferase-ilmentävät PC-3 solulinja edellisessä tutkimuksessa.

TgMAP eturauhasen kasvain malli

TgMAP C57 /BL6-hiiriä viikolla 8 ja 14 annettiin PSP 200 mg /kg 4 viikkoa (n = 5) tai 300 mg /kg 20 viikon ajan (n = 5) vastaavasti letkulla suun kautta syöttämällä (5 päivää viikossa). Kontrolliryhmä ruokittiin pelkällä vedellä saman ajanjakson ajan. Hiiret lopetettiin (iässä 20 viikkoa 200 mg /kg hoitoryhmässä ja 28 viikkoa 300 mg /kg hoitoryhmän) ja eturauhaskudoksiin kerättiin, kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. Koko eturauhanen leikattiin 4 um: n leikkeitä ja yksi viidestä peräkkäisestä kohdat värjättiin H 0,05. Eläinten etiikka hyväksyi valiokunnan elävien eläinten käyttöä varten opetus ja tutkimus (CULATR) suostumuksella ilman. of 1694-08. Kaikki eläinten käsittelyyn menetelmät suoritettiin ohjeiden mukaan valiokunnan eläviä eläimiä opetus ja tutkimus (CULATR), University of Hong Kong.

Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys

sferoidi muodostumisen määritys muokattu aiemmin raportoitu protokollaa [36]. Lyhyesti PCA-solut (200 solua per rivi) ympättiin 12-kuoppaisille polyHEMA (Sigma) -päällystettyihin levyjä. Soluja kasvatettiin DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 14 päivää, jota oli täydennetty 4 gg /ml insuliinia (Sigma), B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF: ää (Sigma), ja 20 ng /ml perus-FGF (Invitrogen) ja PSP joko 250 ug /ml ja 500 ug /ml. Sillä sarjareittien ensisijainen aloilla, ensisijainen palloja käsiteltiin PSP edellä annokset 72 tuntia ja sen jälkeen talteen, erottaa trypsiinillä ja suspendoitiin uudelleen DMEM /F12 -alustassa edellä täydentää. Jokainen koe toistettiin kolmena kappaleena, ja jokainen datapiste edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeama. Tilastollinen ero määritettiin Studentin

t

-testin ja pidettiin merkittävinä, jos p 0,05.

solunelinkykyisyysmääritys

Solun elinkyky PSP hoito mitattiin 3 – (4,5-dimetyyli tiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), kuten aiemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PSP määritettynä ajankohtana. Lopussa hoidon, MTT: tä (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja kuoppia inkuboitiin 4 tunnin ajan RT: ssä. DMSO lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Levyä inkuboidaan vielä 5 min huoneenlämpötilassa, ja optinen tiheys (OD) mitattiin aallonpituudella 570 nm on Labsystem Multiscan mikrolevylukijalla (Merck Eurolab, Dietikon, Sveitsi). Kaikki yksittäiset kuopat analysoitiin kolmena kappaleena. Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuuden esitettiin OD suhde käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen ilmoitettuina pitoisuuksina.

Western-blottaus

yksityiskohtaiset koemenetelmät on kuvattu aikaisemmin [37]. Lyhyesti, solut lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% deoksikoolihappoa, 1% NP-40, 0,1% SDS) ja proteaasi-inhibiittoreita (1 mg /ml aprotiniinia, 1 mg /ml leupeptiiniä, 1 mM PMSF) ja proteiini-pitoisuudet määritettiin käyttäen D

C Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiinit ratkaistu SDS-polyakryyliamidigeelillä elektroforeesilla ja sitten siirrettiin Hybond-P PVDF-kalvolle (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Kalvot blokattiin 10% rasvatonta maitoa TBS-T- tai 3% rasvatonta maitoa TBS ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla huoneenlämmössä vastaan ​​Akt (ser 473), Bcl-2, PARP (Soluviestintä, Technology Inc, Beverly, MA), CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), CD44, β-kateniinin ja β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty TBS-T, kaivoa inkuboitiin joko anti-hiiri- tai anti-kani IgG sekundääriset vasta-aineet, ja signaalit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL plus western blotting-järjestelmä (Amersham, Piscataway, NJ).

solusyklin analyysi

Solut kiinnitettiin 1 ml: lla jääkylmää 70% etanolia 4 ° C: ssa. Kiinnityksen jälkeen solujen pelletit otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 500 ui PBS: ää, ja sitten inkuboitiin 4 ° C: ssa päivää ennen suorittamista virtaussytometrialla. Seuraavana päivänä solut värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) ja RNaasi (1 ug /ml) 30 minuutin ajan. Solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrillä EPICS profiili analysaattorin ja analysoitiin käyttäen ModFit LT2.0 ohjelmisto (Coulter, Miami, FL).

Orthotopic implantaation PC-3-luc-solujen

potilaalle tehdä malli luotiin kuvatut aiemmin [38]. Lyhyesti, kahdeksan viikon ikäisiä CB-17 SCID-hiiret nukutettiin ja asetettiin preparointimikroskooppia. Viilto on keskiviivan vatsan tehtiin, paljastaen selän eturauhasen pohjan virtsarakon. Yhtä suuret määrät elinkelpoisten PC3-luc-soluja (2,5 x 10

4) kanssa tai ilman sitä ennen PSP-hoidon jälkeen ruiskutetaan selän prostates hiirten. Elimet korvattiin, ja vatsa suljettiin. Kasvaimen kehitystä seurattiin mittaamalla bioluminescent signaalin kahden viikon välein kuuden viikon ajan kasvaimen istutuksen jälkeen. Hiiret lopetettiin lopussa kokeen ja eturauhasen kudoksia kerättiin lääkärintarkastus. Tilastollinen ero määritettiin kaksisuuntaista

t

-testin ja pidettiin merkittävinä, jos p 0,05. Kaikki kirurgiset ja eläinten käsittelyyn liittyvät menettelyt suoritettiin ohjeiden mukaan valiokunnan eläviä eläimiä opetus ja tutkimus (CULATR), University of Hong Kong.