Krooninen sairaus

tiivistelmä

kolmas jäsen muuttamassa happamien kiertynyt kela proteiini (TACC) perhe, TACC3, on osoitettu olevan tärkeä toimija sääntely sentrosomimäärän /mikrotubulusdynamiikan mitoosin aikana ja todettu vapautettiin erilaisissa ihmisen syöpäsairauksia. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TACC3 voi osallistua kohdunkaulan syövän etenemiseen ja chemoresistance, ja sen yliekspressio voi aiheuttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) aktivoimalla fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt ja ekstrasellulaarisen signaalin säätelemä proteiini kinaasien (ERK: t ) signaalintransduktioreitteihin. Kuitenkin ylävirran mekanismeja TACC3 välittämän EMT ja sen toiminnallinen /kliinistä merkitystä ihmisen kohdunkaulansyövän jäävät hämäräksi. Epidermaalinen kasvutekijä (EGF) on osoitettu olevan voimakas indusoija EMT kohdunkaulan syövän ja liittyy kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TACC3 on yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän ja voidaan saada aikaan, kun EGF stimulaation. Induktio TACC3 EGF riippuu tyrosiinikinaasiaktiivisuutta EGF-reseptorin (EGFR). Kiehtovan, ehtyminen TACC3 poistetaan EGF-välitteisen EMT, mikä viittaa siihen, että TACC3 vaaditaan EGF /EGFR-ajettu EMT prosessi. Lisäksi Snail, keskeinen toimija EGF-välitteisen EMT, on todettu korreloivan ilmentymisen TACC3 kohdunkaulan syöpä. Yhdessä tutkimuksemme esiin uudenlainen toiminto TACC3 in EGF-välitteisen EMT prosessi ja ehdottaa, että kohdentaminen TACC3 voi olla houkutteleva strategia hoitoon kohdunkaulan syöpiä ohjaavat EGF /EGFR signalointireittejä.

Citation: Ha GH, Kim JL, Breuer E-KY (2013) TACC3 on olennainen EGF-välitteistä EMT in Kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 8 (8): e70353. doi: 10,1371 /journal.pone.0070353

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2013 Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Ha et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet-mensenchymal siirtyminen (EMT) on erittäin säilytetyn biologisen prosessin, joka johtaa muuntaminen polarisoitunut epiteelisolujen mesenkymaaliset solutyyppejä ominaista menetys E-kadheriinin välittämä solu-solu kontakteja sekä hankinnan lisääntynyt muuttavien ja invasiivisia potentiaalit [1] – [9]. Transkriptiotekijöitä Snail, Slug, Twist ja Zeb1 on tunnistettu alipaineensäätöventtiileillä E-kadheriinin ja katsotaan olevan voimakkaita onkogeenisia indusoijia EMT [10] – [14].

Vaikka suuri menestys varhaisen seulonnan ohjelmia, kohdunkaulan syöpä on edelleen johtava syy gynekologisten kuoleman eri puolilla maailmaa naisten [15], [16]. Ihmisen papilloomavirukset (HPV) arvellaan olevan tärkein syy kohdunkaulan syövän; kuitenkin, tutkimukset ovat osoittaneet, että virus ei yksin riitä syövän kehittymiseen [15], [17], [18]. Epidermaalinen kasvutekijä (EGF) on osoitettu olevan yksi voimakkaimmista indusoijia EMT kohdunkaulan syövän ja liittyy kohdunkaulan strooman invaasion ja solmukohtien etäpesäkkeitä [15], [19]. Krooninen EGF hoito indusoi EMT kautta säätely ylöspäin EMT indusoivan transkriptiotekijä Snail kohdunkaulan syöpäsoluja, ja EGF-välitteistä EMT korreloi EGF-reseptorin (EGFR) yli-ilmentymisen ja kliiniseen etenemiseen kohdunkaulan syövän [15], [20]. Ilmentyminen EGFR on havaittu olevan yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän [21].

muuttamassa hapan kiertynyt kierrealue proteiini (TACC) perhe on tunnusomaista konservoitunut C-terminaalinen ”TACC domain”, olennaista vuorovaikutus tubuliinia ja mikrotubulusten [22] – [24] ja on tiedetty avainasemassa säätelyssä sentrosomimäärän ja mikrotubulusdynamiikan [22], [25] – [29]. On olemassa kolme TACC proteiineja on tunnistettu ihmisen: TACC1, TACC2 ja TACC3 [24], [30] – [32]. TACC3 on mukana kokoonpanossa ja organisointi mikrotubulusten ja kromosomin linjaus mitoosin aikana, ylläpito ydin- kirjekuoren rakenteesta ja solukasvun säätelyssä /erilaistumiseen ja geeni transkriptio [24], [26], [27], [29], [ ,,,0],33] – [38]. Ehtyminen

TACC3

aiheuttaa kasvun hidastumista ja alkion kuolleisuutta hiirillä lisääntyneen apoptoosin [39].

Vaikka roolia TACC3 ihmisen syöpä ei ole selvä, yhä enemmän todisteita viittaa siihen, että vapauttaminen TACC3 voi olla suoraan tai välillisesti sidoksissa tietyntyyppisten ihmisen syövän [24]. Geneettiset variaatiot kromosomissa 4p16.3, alueen, joka koodaa

TACC3

, esiintyy useissa eri ihmisen syövissä, [9], [24], [40] – [48]. Fibroblastikasvutekijän reseptori 3-geenin (

FGFR3

) ja

TACC3

läheisesti kromosomissa 4p16.3 [9], [32]. Äskettäin TACC3-FGFR3 fuusioproteiini raportoitu osajoukko glioblastoma multiforme (GBM) [49] ja virtsarakon kasvainkudoksissa ja solulinjoissa [50]. Tämä fuusioproteiini indusoi mitoosi vikoja ja aneuploidian ja aktivoi-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) signalointireitin [49], [50]. Toistaiseksi somaattinen mutaatio (E680K) ja kaksi perustuslailliset mutaatiota (S93L ja G514E) on

TACC3

on tunnistettu GBM ja munasarjasyövän, vastaavasti [40], [51], [52]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että säätely ylöspäin TACC3 löytyy glioblastooma, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja multippeli myelooma [40], [53], [54], ja se voi myötävaikuttaa lymphomagenesis [55], [56]. Geeniekspressioprofilointi analyysi on paljastanut, että

TACC3

on säädelty aikana siirtymistä duktaalikarsinooma

in situ

invasiivisia rintasyöpä ja munasarjasyöpä [57] – [59]. Olemme aiemmin ehdottaneet, että TACC3 voidaan suoraan tai epäsuorasti liittyvät taudin etenemiseen ja lääkeresistenssin kohdunkaulan syövän, perusteella saatuja tietoja mikrosiruanalyysi geenien tunnistamiseen säätelee TACC3 [24], [60]. Lisäksi meidän viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että ektooppinen ilmentyminen TACC3 parantaa leviämisen, muuttavien /invasiivisia kyky ja jalostuskapasiteettia HeLa kohdunkaulan syöpäsolujen ja näyttää enemmän mesenkymaaliset fenotyyppi, mukana alas-säätely epiteelin merkki E-kadheriinin ja säätely ylöspäin mesenkymaaliset markkereita N-kadheriinin ja vimentiinista sekä EMT indusoijat Snail ja Slug [9]. Toisaalta, ehtyminen TACC3 pystyy kääntämään /tukahduttaa EMT [9]. Vaikka havainto osoittaa, että TACC3 voi olla tärkeä rooli EMT, alkupään signalointi tapahtumien vastuussa TACC3 välittämää EMT jäävät vielä.

Tässä osoitamme, että TACC3 yliekspressoituu kohdunkaulan syöpä. TACC3 voidaan indusoida EGF: n ja EGF-välitteisen TACC3 induktio on riippuvainen EGFR aktivointia. Tärkeää on, että ei ole TACC3, EGF ei pysty indusoimaan EMT, viittaa siihen, että TACC3 on tarpeen EGF-välitteistä EMT kohdunkaulan syövän. Lisäksi löydämme korrelaatio TACC3 ja EGF indusoija Snail kohdunkaulan syöpä. Tutkimuksemme siis tunnistaa uudella mekanismilla, joka välittää EGF /EGFR aiheuttama EMT ja potentiaalinen terapeuttinen kohde kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

kudossiruina ja immunohistokemia

Kohdunkaulan syöpä kudossiruina (CR805, CR1003 ja CR1501) ostettiin USA Biomax (Rockville, MD). Tissue mikrosirujen potilastiedot on esitetty taulukossa 1. Kudos mikrosirujen dioja poistettiin parafiini, vedettömät ja lämpökäsitelty antigeenin haku ennen vasta-värjäystä [61]. Levyjä inkuboitiin anti-TACC3-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin sekundaarisen biotinyloitu vasta-aine ja Avidin Biotin kompleksin (ABC) mukaisesti Vectastain ABC-kitti protokollan (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kehityksen jälkeen väri diaminobentsidiinillä (DAB), objektilasit itsenäisesti arvioineet tekijöille. Värjäytymisen intensiteetti kirjattiin seuraavasti: 0 negatiivinen ilmaus; 1+ heikosti positiivinen ilmaisu; 2+ keskikokoisille positiivinen ilmaisu; ja 3+ erittäin positiivinen ilme. Photomicrograph (suurennus x 100) on ottanut DP12 mikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) varustettu DP71 digitaalinen kuvantamisjärjestelmä (Olympus).

Soluviljely, Antibodies ja reagenssit

ihmisen kohdunkaulan syöpä (HeLa, CaSki, SiHa ja C33A) ja HPV-kuolemattomiksi ectocervical epiteelin (Ect1 /E6E7) solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). HeLa-soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (HyClone, Logan, UT), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniliuosta (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). CaSki-soluja ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa (HyClone), joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä ratkaisu. SiHa ja C33A-soluja kasvatettiin MEM (HyClone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä ratkaisu. Ect1 /E6E7 soluja kasvatettiin Keratinosyyttien-Serum Free väliaineessa (Ker-SFM; GIBCO /BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) ja 0,1 ng /ml ihmisen rekombinantti-EGF: ää, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta, ja lisäksi kalsiumkloridia 44,1 mg /L (lopullinen konsentraatio 0,4 mM). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Anti-TACC3 vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineita E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinin, Snail, Slug ja EGFR ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-aktiini-vasta-aine ja EGF hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). EGFR-kinaasi-inhibiittori AG1478 hankittiin Selleckchem (Houston, TX).

shRNA ja transfektio

Solut transfektoitiin TACC3-spesifinen tai ohjaus shRNA (Santa Cruz Biotechnology) käyttämällä FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) mukaan valmistajan ohjeiden.

Western Blot analyysi

Ihmisen normaali kohdunkaulan kudos lysaatit ostettiin IMGENEX (San Diego, CA). Solu-uutteet valmistettiin lyysipuskurissa, joka koostui 50 mM Tris-CI (pH 7,4), 1% nonyyli phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 0,25% natriumdeoksikolaattia, 150 mM natriumkloridia (NaCl), 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) , 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 mM natriumfluoridia (NaF) ja täydellinen proteaasi-inhibiittori cocktailit (Roche Molecular Biochemicals). Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 13000 rpm: llä 10 minuutin ajan, ja supernatantit altistettiin Western blot -analyysiä. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyacrylamide geelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Blokkaamisen jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS) /0.1% Tween 20 (TBS-T), jota oli täydennetty 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 h, membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettuna blokkauspuskuriin 2 tuntia huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita (Bio-Rad, Hercules, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi, antigeeni-vasta-kompleksit on todettu tehostetun kemiluminesenssin (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (https://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) ja normalisoidaan p-aktiini.

Quantitative Real Time-polymeraasiketjureaktio (qRT -PCR) B

Yhteensä RNA: iden solut eristettiin käyttäen RNeasy® mini (Qiagen Sciences, Germantown, MD) ja sen jälkeen niille cDNA-synteesin avulla RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Life Sciences Euroopassa, Bremen, Saksa). Geenien ilmentymistä analysoitiin käyttämällä iQ ™ SYBR

R Green SuperMix (Bio-Rad) ja iCycler iQ5 reaaliaikainen PCR-tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad). Seuraavat pyöräily olosuhteita käytettiin: 95 ° C 5 min ja 30 s, mitä seurasi 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Aineisto analysoitiin normalisoitu geenien ilmentyminen menetelmä (ΔΔ Ct) [62] avulla iQ5 Optical System Software (Bio-Rad), ja

β-aktiini

käytettiin referenssinä normalisointi. Sekvenssit alukeparia olivat seuraavat:

TACC3

5′-gaactggggaagatcatgga-3 ’ja 5′-ctcttcgttcttgcggtagc-3’ [63];

β-aktiini

5actinINK \\ l \\ o ”Ulisse 2007 # 484” gtagc-3 ’CGG-3i [64]. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Transwell Migration Pitoisuus

Päällystämätön soluviljelmässä insertit (8 um huokosia, 24-kuoppa) (Greiner Bio-One, Monroe, NC) ympättiin 1 x 10

5 solua 200 ul seerumittomassa elatusaineessa. Alakammioissa täytettiin 750 ulissa täydellistä väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. 16 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen yläpintaan suodattimen pyyhittiin pois, ja solut, jotka olivat vaeltaneet alapintaan suodattimen kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä tai jääkylmällä metanoli 5 minuutin ajan, värjättiin 0,05% kristalliviolettia 20 min ja kvantitoitiin spektrofotometrisesti 490 nm: ssä.

invaasiomääritys

Invasion analyysit suoritettiin käyttäen QCM ECMatrix solun invaasiomääritys sarjat (Millipore, Temecula, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA). Merkitsevyys määritettiin

t

-testi ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Tukey monivertailutestillä. Pearsonin korrelaatiokerroin käytettiin mittaamaan korrelaatio kahden muuttujan.

p-arvo

alle 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

TACC3 yliekspressoituu Kohdunkaulan syöpä

tutkimiseksi kliinistä merkitystä of TACC3 ihmisen kohdunkaulan syövän, ensin tarkasteltiin ilmentymisen TACC3 mRNA kohdunkaulan syövän käyttäen julkisesti saatavilla Oncomine tietokanta (www.oncomine.org, Compendia Bioscience, Inc., Ann Arbor, MI) [65] ja todennut, että TACC3 on erittäin ilmaistaan ​​kohdunkaulan syövän [66], [67]. N yli-ilmentyminen TACC3 kohdunkaulan syövän edelleen vahvistettu useissa kohdunkaulan solulinjoissa, mukaan lukien Ect1 /E6E7 (HPV-16 E6 /E7 transformoitu ectocervical epiteelin), CaSki- (HPV-16), C33A (HPV-negatiivinen), HeLa (HPV-18 ) ja SiHa (HPV-16) verrattuna kolmen normaalin ihmisen kohdunkaulan kudoksissa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, ilmentymistä TACC3 näissä solulinjoissa oli suurempi kuin normaali kohdunkaulan kudoksissa. Mielenkiintoista on, että ei ollut merkitsevää eroa ilmentymisen TACC3 välillä HPV-negatiivisten C33A ja muiden kantavien solujen HPV-onkogeenien (Ect1 /E6E7, CaSki, HeLa ja SiHa), viittaa siihen, että HPV-infektio voi olla vastuussa yliekspressio TACC3. Olemme myös immunohistokemiallisesti analysoi ilmentymisen TACC3 käyttää kohdunkaulan syövän kudossiruina. TACC3 oli lähes mahdoton havaita normaalissa kohdunkaula, kun taas vahvan ilmentymistä havaittiin kohdunkaulan syövän kudoksissa (kuvio 1 B). Kuitenkin, ei ollut merkittävää yhdistyksen TACC3 ilmaisun kanssa kliinisessä vaiheessa tai luokan taudin (kuvio 1 C, 1D ja S1). Perustuen havaintomme, että ilmaus TACC3 on kohonnut kohdunkaulan syövän verrattuna normaaliin kohdunkaula mutta ei merkittävästi liittynyt taudin etenemiseen, ehdotamme, että lisääntynyt ilmentyminen TACC3 saattaa esiintyä alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä sekä välttämätöntä ylläpitämisessä kohdunkaulan kasvaimien syntyyn.

(A) ilmentymistä TACC3 in Ect1 /E6E7 (HPV-ikuisti ectocervical epiteelin), CaSki- (HPV-16), C33A (HPV-negatiivinen), SiHa (HPV-16) ja HeLa ( HPV-18) solulinjat määritettiin western blot -analyysillä. Ekspressiotasoja verrattiin kolmen normaalin kohdunkaulan kudoksissa. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (B) edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä kohdunkaulan syövän kudosta mikrosirun. Kvantitatiivinen analyysi kohdunkaulan syövän kudossiruina osoitti, että ilmentyminen TACC3 on suurempi kohdunkaulan syövän kuin normaalissa kohdunkaulassa, mutta sen ilmentymistä ei korreloi kasvaimen vaiheessa (C) tai luokka (D). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,001.

EGF Stimulation indusoi Endogeeninen TACC3 Ekspressio EGFR: ää ilmentävä soluja

edellinen tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen TACC3 indusoi EMT , mukana alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin Snail ja Slug, kun taas ehtyminen TACC3 kääntää EMT [9]. Lisäksi aktivointi Akt ja ERK signalointireitteihin on välttämätöntä TACC3-välitteisen EMT [9]. Täällä me pyrittiin määrittämään miten TACC3 osallistuu EMT. Monipuolinen kasvutekijät, kuten EGF, transformoiva kasvutekijä β (TGF-β) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF-1) on osoitettu aiheuttavan EMT ja liittyvät merkittävästi invasiivisuus, etäpesäke ja toistumisen kohdunkaulan syövän [ ,,,0],15], [68] – [70]. EGR on osoitettu aiheuttavan EMT kautta lisäävä säätely Snail kohdunkaulan syöpäsolut [15] ja aktivoi Akt ja ERK signalointireitteihin [71], [72]. Näiden tutkimusten nojalla, me arveltu, että TACC3 voi osallistua EGF-välitteisen EMT. Testata hypoteesia, käsittelimme HeLa, CaSki ja SiHa solujen 50 ng /ml EGF 24 tuntia ja sitten tutki morfologisia muutoksia solujen ja ilmaisun EMT markkereita. Kuten kuviossa 2A on esitetty, solut käsiteltiin EGF morfologisia ja fenotyyppiset ominaisuudet EMT. Kiehtovan, molemmat proteiinia (kuvio 2B) ja mRNA (kuvio 2C) tasot TACC3 lisääntyivät merkitsevästi yhteydessä EGF stimulaation, mukana alas-säätely epiteelin merkki E-kadheriinin ja säätely ylöspäin mesenkymaalisten merkki vimentiinista sekä EMT indusoijat Snail ja Slug HeLa, CaSki ja SiHa soluja (kuvio 2B). Kokeet, tehtiin myös tarkistaa induktion TACC3 kun EGF stimulaation. EGF aiheuttama jatkuva ilmaus TACC3 vuonna CaSki ja SiHa solut jopa 48 tuntia, kun taas nostetaan väliaikaisesti TACC3 ekspressio havaittiin HeLa-soluissa (kuvio S2). Olemme myös havainneet, että EGF edistää muuttavien ja invasiivisia valmiuksia HeLa ja SiHa soluja (kuvio 2D ja 2E), yhdenmukaisia ​​muiden tutkimusten [15], [73]. Emme nähneet mitään merkittäviä muutoksia solujen morfologiassa (kuvio 3A), ilmaus TACC3 ja muut EMT markkereita (kuvio 3B), tai motiliteetti (kuvio 3C) in EGF-käsiteltyjen C33A soluissa. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, C33A ilmaisee hyvin alhainen tai havaitsemattomia tasoja EGFR (kuvio 3D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EGFR tarvitaan EGF-välitteisen induktion TACC3 ja myöhempien EMT.

(A) Kohdunkaulan syövän solut käsiteltiin EGF osoitti elimellisen muutoksen liittyy EMT. (B ja C) Sekä proteiini (B) ja mRNA (C) tasot TACC3 olivat ajan säädellään EGF stimulaation yhdessä alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin vimentiinista, Etana ja Slug. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. MRNA taso TACC3 edusti suhteessa p-aktiini selostukset. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (D ja E) HeLa ja SiHa soluja käsiteltiin tai ilman EGF saatettiin transwell muuttoliike (D) ja matrigeelin invaasio määritykset (E) (katso materiaalit ja menetelmät). Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 50 ng /ml EGF: ää 24 tunnin ajan. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,005; ****,

p

0,001.

C33A soluja käsiteltiin EGF eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia solujen morfologian (A), ilmaus TACC3 ja EMT markkereita (B ), tai liikkuvuuden (C). Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 50 ng /ml EGF 24 tuntia ja sen jälkeen niille western blot ja siirtokuoppaan muuttoliike määrityksissä. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (D): n ilmentyminen EGFR Ect1 /E6E7, CaSki, C33A, SiHa- ja HeLa-solulinjojen määritettiin Western blot -analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

aktivointi EGFR Vaaditaan EGF-välitteisen induktion TACC3

Kuten tiedot osoittavat, että EGF-hoito voidaan lisätä ilmentyminen TACC3 EGFR-ilmentävien solujen me kyseenalaiseksi EGF-välitteisen induktion TACC3 riippuu tyrosiinikinaasiaktiivisuutta EGFR. AG1478 on tyrosiinikinaasi-inhibiittori, EGFR, joka estää EGFR-välitteistä signalointia tapahtumat [74], [75]. Hoidon 5 uM AG1478 poistetaan EGF-indusoitu morfologisia muutoksia (kuvio 4A) ja TACC3 induktio (kuvio 4B), ja sen seurauksena, EGF-välitteistä EMT estyi (kuvio 4B). Tämä data viittaa siihen, että aktivaatio EGFR tarvitaan EGF-välitteisen TACC3 induktio.

esto-tyrosiinikinaasin EGFR poistetaan morfologinen muutos liittyy EMT (A) ja EGF-välitteisen TACC3 induktio (B). Soluja käsiteltiin EGF: llä tai EGF + AG1478: ssa 24 tuntia ja sitten suoritettiin Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,001.

TACC3 tarvitaan EGF-välitteisen EMT Process

Koska sekä TACC3 ja EGF voi edistää EMT aktivoitumisen kautta PI3K /Akt ja ERK signalointireitteihin [9], [71], [72], ja TACC3 voi olla ajan säädellään EGF stimulaation (kuvio 2B, 2C ja S2), me kyseenalaiseksi TACC3 tärkeä rooli EGF-välitteisen EMT . Käsitellä tätä kysymystä, me köyhdytettyä TACC3 käyttäen lentivirusvektorilla toimittaa shRNA ominaisia ​​TACC3 HeLa ja SiHa soluja ja käsitelty tai ilman EGF. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [9], ehtyminen TACC3 johti säätely ylöspäin E-kadheriinin ja alas-säätely vimentiinista, Etana ja Slug HeLa ja SiHa soluja verrattuna ohjata soluihin (kuvio 5A). Kiehtovan, EGF kohtelu TACC3-köyhdytettyä soluja ei voinut palata ilmaus EMT merkkiaineiden (kuvio 5A), solujen morfologian (kuvio 5B), solumigraation (kuvio 5C) tai invaasio kapasiteetti (kuvio 5D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että TACC3 voi olla keskeinen rooli EGF-välitteisen EMT.

Koska TACC3, EGF ei pystynyt säätelemään EMT markkereita (A), muuttaa solun muotoon (B), tai parantaa solu muuttoliike ja invaasio-ominaisuudet (C ja D). Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti shRNAs, vastaan ​​(salattu,

shCon

) tai TACC3 (

shTACC3

) ja käsiteltiin kanssa tai ilman EGF: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin western blot, siirtokuoppaan muuttoliike ja Matrigeliä invaasio määrityksissä. Intensiteetti bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

*

,

p

0,01;

**, p

0,001.

positiivinen korrelaatio TACC3 ja Snail ilmentäminen Kohdunkaulan syöpä

Snail on tiedetty indusoituvan EGF , mikä puolestaan ​​johtaa EGF-välitteisen EMT [15], [76]. Olemme havainneet, että TACC3 indusoitui myös, kun EGF stimulaation (kuvio 2B ja 2C) ja säätelee positiivisesti ilmentymistä Snail [9]. Siksi me kyseenalaiseksi onko korrelaatio TACC3 ja Snail ilmaisun kohdunkaulan syöpä. Tärkeää on, huomasimme, että ilmaisu Snailin kohonnut kohdunkaulan syövän (kuvio 6A ja 6B), ja korreloi TACC3 ilmentymistä (kuvio 6C). Kuitenkin TACC3 ilmaisu ei korreloinut ilmaus Slug, toisen jäsenen Etana perhe (tuloksia ei ole esitetty).

(A) edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä TACC3 ja Snail on kohdunkaulan syövän kudosta mikrosirun. Kvantitatiivinen analyysi kohdunkaulan syövän kudossiruina osoitti, että (B) ilmaus Snail on korkeampi kohdunkaulan syövän kuin normaalissa kohdunkaula. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,001 (C) Snail ilmaisu korreloi TACC3 ilme (r = 0,80383,

p 0,0001

).

Keskustelu

on epäilty, että sääntelyn purkaminen (sekä ylös- ja alas-asetus) on TACC3 voi liittyä kehittämiseen erilaisten ihmisen syövän [24], [77], [78]. Toistaiseksi onko TACC3 toimii tuumorisuppressorina tai onkogeeni ei ole selkeästi määritelty johtuen eroista joukossa tutkimuksia [24], [79]. Vaihtoehtoisesti TACC3 voi olla eri toimintoja riippuen solun tai elimen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan toiminnallinen merkitys TACC3 kohdunkaulan syövän. Meidän kohdunkaulan syöpä kudos microarray analyysi paljasti, että ilmaus TACC3 proteiini on säädellään ylöspäin kohdunkaulan okasolusyöpä, yleisin kohdunkaulan syövän (noin 80-90%) [80]. Tämä on sopusoinnussa saatuja tietoja Oncomine [67] ja ehdottaa sen mahdollinen rooli onkogeenin kohdunkaulan syövän. Tutkimuksemme viittaa myös siihen, että ilmaus TACC3 ei saa säännellä HPV E6 /E7 onkogeenien kuitenkin tällä hetkellä, emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että TACC3 ilmentymistä säätelee HPV-onkogeenien tai korreloi tyypit HPV.

EGF laukaisee cascade signalointi tapahtumien vuorovaikutuksessa sen reseptorin, EGFR [81], ja on osoittautunut voimakas indusoija EMT kohdunkaulan syövän [15]. EGF /EGFR signalointi tapahtumia liittyy nopeutettua kasvaimen etenemistä kohdunkaulan syövän [15], [19], [82]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TACC3 was up-säädellään EGF stimulaation, ja ehtyminen TACC3 lakkautetaan EGF-välitteisen EMT prosessi kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi induktio TACC3 EGF onnistuneesti inhiboi EGFR estäjä AG1478, mikä osoittaa, että EGF-välitteistä TACC3 induktion ja myöhemmän EMT ovat riippuvaisia ​​EGFR aktivointia. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että C33A soluissa, TACC3 ilme oli huomattavasti korkeampi kuin CaSki- tai SiHa- soluja, puuttumisesta huolimatta EGFR. Vaikka tutkimus osoittaa, että EGFR aktivaatio voi olla yksi niistä mekanismeista vastaavan sääntelyn ilmentymisen TACC3, alkupään signalointi joka säätelee ilmentymistä TACC3 ei ole vielä määritelty. Siellä on toistaiseksi ollut vain yksi julkaistun tutkimuksen osoittamalla laski TACC3 proteiinin vakautta Cdh1 riippuvaisella tavalla [83]. TACC3 vuorovaikutuksessa aktivaattorin E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla anafaasia edistävän kompleksin /cyclosome (APC /C), Cdh1, ja sen vuorovaikutus vähentää TACC3 proteiinin vakautta Cdh1-välitteisen ubikitinaation ja hajoamisen aikana solusyklin etenemisen. Yksi mahdollisuus katsomme, että C33A solut voivat ilmentää alhaisempi Cdh1 kuin muihin soluihin, mistä nähdään säilytetään korkea TACC3. Mielenkiintoista, toisin kuin SiHa, CaSki- ja HeLa-solulinjojen, C33A solut eivät satama HPV genomeja mutta sisältävät p53 [84] ja pRb [85]. Lisäksi useita kasvutekijän reseptoreita ilmaistaan ​​C33A eroavat jonkin verran SiHa, CaSki- ja HeLa-solut [86], [87]. Siksi on mahdollista, että TACC3 ekspressiota voidaan säädellä eri signalointireittejä riippuen solutyypistä.

On yhä enemmän todisteita, jotka osoittavat yhdistyksen TACC3 EGFR signalointireittejä. TACC3 on todettu esiintyvän vuorovaikutuksessa kumppanina signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 5 (Stat5: n) [39], ja sen ilmentyminen on osoitettu korreloivan Aurora A: n eks- tietyntyyppisten syöpien [40], [63]. Kiehtovan, EGFR myös osakkuus ja yhteistyössä Stat5: n tavoite ja lisäämään ilmentymistä Aurora A, ja sen ilme on todettu korreloivan Aurora A: n eks- rinta- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [81]. Siksi on perusteltua ajatella, että TACC3 voi muodostaa kompleksin EGFR suoraan tai epäsuorasti sen vuorovaikutukseen Stat5: n, ja näin olla mukana EGFR signalointireittejä. TACC3 havaittiin myös kuin aryylihiilivetyreseptori (AhR) ydin- translocator (ARNT) -interacting proteiini [88]. ARNT kuuluu perus helix-loop-helix (bHLH) -eläkkeensaajaa-ARNT-Sim (PAS) perhe, joka dimerisoituu kanssa AhR ja hypoksia-indusoituva tekijä α (HIF α) on ympäristön stressi [89], [90]. Koska transkriptio kofaktorin, TACC3 pystyy säätelemään transkription aktivoituminen HIF suoran vuorovaikutuksen välityksellä ARNT [91]. Tuore tutkimus on osoittanut, että ARNT tärkeä rooli orvaskeden erilaistumisen säätelyn kautta EGFR-ERK signalointireittien [92]. Näin ollen on houkuttelevaa spekuloida mahdollisen osallistumisen TACC3 verkostossa ARNT-EGFR-ERK säädellä keratinosyyttien erilaistumista.

EGFR ilmentyy kohtuullisella korkeisiin kohdunkaulan syövän ja sen ilmentyminen liittyy kliinisessä vaiheessa ja huonon ennusteen [93], [94]. Mutaatiot

EGFR

on osoitettu olevan harvinainen korkealaatuisesta invasiivisen kohdunkaulan syövän [95]. Toistaiseksi vain muutama pieni mittakaavan kliinisissä kokeissa on testattu tehokkuuden arvioimiseksi EGFR estäjiä kohdunkaulan syövän. Valitettavasti EGFR estäjä ei yksinään ollut tehokas potilailla, joilla on toistuvia locoregionally levinnyt tai metastaattinen kohdunkaulan syövän [94], [96]. Yhdistelmät EGFR: n estäjien kemoterapiaa tai sädehoitoa tutkitaan parhaillaan.

Koska TACC3 yliekspressoituu kohdunkaulan ja muiden syöpien ja näyttää olevan avainasemassa EGF /EGFR-ajettu EMT prosessi, on mahdollista, että ehtyminen of TACC3 voi olla hyvä tapa hoitaa syöpiä, jotka ohjaavat EGF /EGFR signaalinvälitysreittien tai vastustuskykyisiä anti-EGFR hoitoa. Vaikka mutaatiot

EGFR

korkealaatuista invasiivisen kohdunkaulan syövän ovat harvinaisia, olisi tärkeää tutkia yhdistyksen välillä TACC3 ilmaisun ja

EGFR

mutaatioita. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot viittaavat siihen, että TACC3 tärkeä rooli EGF-välitteisen EMT ja voi toimia houkutteleva terapeuttinen kohde ihmisen syövissä ohjaavat EGF /EGFR signalointireittejä.

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentyminen TACC3 kohdunkaulan syövän suhteen taudin vaiheeseen, ja histologinen luokittelu. Ilmentyminen TACC3 eri sairauksien vaiheissa ja kasvaimen esiteltiin. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001

doi: 10,1371 /journal.pone.0070353.s001

(TIF) B Kuva S2.

EGF stimulaatio indusoi endogeenisen TACC3 ilme. TACC3 indusoitiin EGF hoitoon. Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 50 ng /ml, ja sitten kerätään ilmoitettuina ajankohtina western blot -analyysillä.