Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mesothelin, eriyttäminen antigeenin läsnä sarjassa syöpäsairauksista, kuten mesoteliooma, munasarja-, keuhko- ja haimasyövän, on tutkittu markkeri diagnoosia ja immunoterapian kohteena. Olemme kuitenkin olleet kiinnostuneita vaikutuksia arvioitaessa kohdistaminen suoraan Mesothelin elinkelpoisuudesta syöpäsolujen ensimmäisenä askeleena kohti kehittämään uusia terapeuttisia strategia. Me raportoimme tässä, että geeni erityisiä hiljentäminen varten Mesothelin erillisissä menetelmillä (siRNA ja microRNA) väheni elinkelpoisuus syöpäsolujen eri alkuperää kuten mesoteliooma (H2373), munasarjasyöpä (SKOV3 ja Ovcar-5) ja haimasyövän (Miapaca2 ja Panc-1 ). Lisäksi, invasiivisuus syöpäsolujen väheni myös merkittävästi, kun tällaista hoitoa. Sitten tutkittiin pro-onkogeenisiä signalointi ominaisuuksia solujen upon Mesothelin-hiljentäminen, joka osoitti merkittävää laskua fosfori-ERK1 ja PI3K /AKT-vaikutusta. Molekyylimekanismi vähentää invasiivisuus on yhdistetty alennettu ilmentyminen β-kateniinin, joka on tärkeä markkeri EMT (epiteelin-mesenkymaalitransitioon). Ero1, proteiini osallistuu clearing taittamattomassa proteiineja ja jäsen ER-Stress (Endoplasmakalvosto-stressi) koulutusjakso on myös laskenut huomattavasti. Lisäksi Mesothelin hiljentäminen aiheutti merkittävän kasvun osa syöpäsolujen S-vaiheessa. Ensi vaiheessa munasarjojen syöpäsolujen (OVca429), jonka lentivirus ilmentävät anti-Mesothelin microRNA pienensi merkittävästi elinkelpoisuuden, invasiivisuus ja morfologisten muutosten. Siksi ehdotamme inhibitio Mesothelin mahdollisena uusi strategia kohdistaminen ihmisen syöpäsairauksia.

Citation: Wang K, Bodempudi V, Liu Z, Borrego-Diaz E, Yamoutpoor F, Meyer A, et al. (2012) esto Mesothelin uutena strategia kohdistaminen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10,1371 /journal.pone.0033214

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 syyskuu 2011; Hyväksytty: 05 helmikuu 2012; Julkaistu: 02 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus F. Farassati laboratorio tukee ”All in Cure”, ”mesoteliooma Applied Research Foundation (MARF)”, ”Marsha Rivkin Institute for munasarjasyöpä (MRC)” ja ”Lentoemäntä Medical Research Institute (FAMRI)”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mesothelin (MSLN), joka on solukalvon eriyttäminen antigeeni, ilmentyy huomattavalla useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien lähes kaikki mesotelioomatapausten [1] ja haiman adenokarsinooman [2], [3] kaivot kuin noin 70 % munasarjan syövistä [4], [5] ja 50% keuhkojen adenokarsinoomat [6], [7]. MSLN havaitaan yli 70% ohuella neulalla aspiraattien (STT) haiman adenokarsinooman [2]. Toinen tuore tutkimus osoitti pleuraalieffuusio MSLN hyödyllisenä markkeri havaitsemiseksi pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma [8]. MSLN ilmentyy myös pieniä määriä normaaleissa mesoteelisolut.

MSLN

geeni koodaa 69 kDa: n polypeptidi, joka sisältää hydrofobisen sekvenssin karboksyyli- pää, joka poistetaan ja korvataan fosfatidyyli. MSLN-geeni sisältää 17 eksonia ihmisen kromosomissa 16p13.3 ja MSLN cDNA on 2138-bp: n pituisia, avoimen lukukehyksen 1884 emäsparia.

mutantti-hiiriä inaktivoinnin kopioiden MSLN geenin tuotettiin opetukseen tehtävä tämän proteiinin vaikka mitään havaittavaa poikkeavuuksia raportoitu tähän fenotyypin [9] https://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 – B8 # B8. Toinen joukko tutkimuksia on otettu käyttöön MSLN olla mukana tarttumisen jälkeen NIH3T3-solut transfektoitiin MSLN ekspressiovektorilla oli vaikeampi poistaa viljelyastioista kuin ei-transfektoiduissa soluissa [1]. Mahdollisuus rooli MSLN tarttumisessa tukee tutkimus, jonka MSLN sitoutuu CA125 (MUC16), jäsen musiinin perhe glykoproteiineja, ja että tällainen vuorovaikutus välittää soluadheesiota [4]. Näiden tulosten perusteella, kirjoittajat ehdottivat, että voi olla merkittävä rooli CA125 ja MSLN Metastasoituneessa syövän leviämisen [4]. Myös Mesothelin vuorovaikutusta MUC16 ehdotettiin helpottaa vatsakalvon etäpesäkkeiden [10].

malleja, kuten munasarjasyövän, analyysit korrelaatio MSLN ilme, patologinen vaihtelevuus ja kliinisiin tuloksiin osoitti, että korkeat MSLN ilmentyminen positiivisessa yhteydessä kemiallis-resistenssi munasarjan epiteelin syöpä potilaiden ja lyhyen potilaan elinaika [12]. MSLN ja toinen merkki HE4 ovat äskettäin tutkittu niiden arvoa markkereita havaitsemiseen munasarjasyövän [5], [11]. Muista Maligniteetti homologinen MSLN geenin, nimittäin

Erc

havaittiin olevan yli-ilmentynyt rotan munuaissyöpä [12], [13]. Mahalaukun syöpäpotilaita, MSLN positiivinen ryhmässä oli merkitsevästi enemmän solmukohtien osallistuminen ja huomattavasti syvempi kasvaimen invaasio kuin MSLN negatiivinen ryhmä [14]. On mielenkiintoista, että 5 vuoden pysyvyys todettiin olevan suurempi MSLN positiivinen ryhmä tässä tutkimuksessa.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet merkittäviä vuorovaikutuksia signalointireiteissä osallistuvien kehittämiseen pahanlaatuisen fenotyypin ja MSLN. Esimerkiksi, MSLN havaittiin ekspression indusoimiseksi metalloproteinaasien 7 (MMP-7) [15], tai ilmentymisen tehostamiseksi tasoa interleukiini 6 (IL-6) [16]. Expression of Mesothelin väittää myös resistenssin apoptoosia vasteena tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-alfa) [17]. MSLN geeni säädellään eri tavalla jäsenet Wnt-signaalin transduktioreitin [18]. Myös C57MG hiiren maitorauhasen epiteelisoluissa, MSLN oli ajan säätelee Wnt-1. Mielenkiintoista, kasvaimia konstitutiivisen aktivoitumisen Wnt-signalointireitin, kuten munasarjojen ja haiman syövät, on korkea MSLN ilme. Muita tutkimuksia tarvitaan täysin määritellä MSLN toimintaa sekä roolia MSLN syövän synnyssä. Hyvin rajallinen jakautuminen MSLN normaaleista kudoksista kuvaa MSLN sopiva ehdokas kasvainspesifisiä hoito. Vaikka strategiat, kuten käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita kohdistettu MSLN on yrittänyt ennen [19], [20], [21], [22], [23], [24], vaikutus suoran inhibition MSLN elinkelpoisuudesta syöpä soluja vielä tutkittava. Sen lisäksi, että translaation seurauksia näiden tutkimusten, saatujen tietojen on hyötyä arvioitaessa roolin MSLN syövän biologian. Tässä työssä tutkittiin vaikutuksia hiljentäminen MSLN elinkyvystä, invasiivisuus ja solujen signaalireaktioteissä syöpäsolujen johdettu mesoteliooma, haima- ja munasarjasyövän. Lisäksi hiljentäminen MSLN jonka lentivirus ilmentävät anti-Mesothelin microRNA (miRNA) havaittiin myös vähentää merkittävästi elinkelpoisuutta ja invasiivisuus munasarjasyöpä soluja. Olemme myös tutkineet tuloksista hiljentäminen MSLN solun signalointi ominaisuuksista syöpäsolujen ja solusyklin etenemisen, jotta edelleen ymmärtää reittejä osallisena biologisessa roolissa tämän antigeenin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kemikaalien

Bxpc3, H2373, Ovcar5, ja SKOV3-solut (jotka kaikki saatiin American kudoksesta kantakokoelmaan, www.atcc.gov muut kuin H2373, joka on saatu National cancer Institute, NCI) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma, St Louis, MO). Ovcar3 on viljeltiin RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää, johon on lisätty 2 mM L-glutamiinia ja 10 ug /ml insuliinia. NIH3T3, Panc1, Maipaca2 (ATCC), ja OVca429 soluihin [25] viljeltiin Dulbeccon modifioituun Eaglen elatusaineessa (DMEM) (Sigma), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. HUVEC-soluja viljeltiin F-12K Medium, jota oli täydennetty 0,1 mg /ml hepariinia, 0,05 mg /ml endoteelisolujen kasvun täydentää, ja 10% FBS: ää. HT1080-soluja viljeltiin MEME täydennetty 10% FBS: ää. Edellä mainitut väliaineet täydennettiin penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml) (Sigma). 293FT-soluja viljeltiin DMEM: ssä (korkea glukoosi), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 0,1 mM MEM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1 mM L-glutamiinia ja 1 mM MEM-natriumpyruvaattia. HT1080, NIH3T3, ja HUVEC-solut ostettiin ATCC (Manassas, VA). 297FT solut ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Anti-Mesothelin siRNA tilattiin Qiagen (Valencia, CA). Se syntetisoitiin kaksijuosteinen muodossa Alexa Fluor 488 (AF488) konjugoituna 3′- päähän sen juosteen. SiRNA oligo suspendoitiin uudelleen sille varattuun puskuriin lopullisessa varastossa pitoisuudessa 20 uM.

siRNA elektroporaatio

10

7 5 x 10

7-soluja uudelleen suspendoitiin 270 ui Opti-MEM ja sekoitettiin 30 ul: aan 20 uM siRNA kantaliuosta ja elektroporoitiin (~240 V, yhden pulssin 20 millisekuntia), jotta lopullinen konsentraatio anti-Mesothelin siRNA oli 2 uM. Kirkkain solut, eli solut, joilla on suurin määrä siRNA, valittiin sen perusteella, että läsnä on Alexa Fluor 488 tag 3′-päähän siRNA-molekyyli käyttäen FACS: llä.

Soluproliferaatiomääritys

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttämällä WST-1 kit Millipore (Bedford, MA) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 2000-soluja (lajiteltu FACS) maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisen mikrolevyn lopullisessa tilavuudessa 100 ui. Sitten 10 ul /kuoppa WST-1-reagenssia lisättiin ja levyä inkuboitiin 1 tunti tavallisissa viljelyolosuhteissa. Inkuboinnin aikana elävät solut muuntavat WST-1-reagenssia osaksi formatsaanin väriaine solun mitokondrioiden dehydrogenaasi. Tämän inkuboinnin absorbanssi mitattiin 440/600 nm.

Cell invaasiomääritys

Matrigel hyökkäys kammiot ja haukka kumppani kudosviljelymaljalla saatiin BD Biosciences (San Jose, CA) . SiRNA kokeissa ohjaus ja anti-Mesothelin siRNA-käsiteltyjä soluja (30000 solua /kuoppa) maljattiin 24-kuoppalevylle ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut kiinnitettiin 100% metanolia ja värjättiin 0,05% kristalliviolettia ja valokuvattiin visuaalisesti laskea määrän hyökkäsi soluja. Sillä lentivirus liittyviä kokeita soluja esikäsiteltiin lentivirus ja 3 päivää, ja sitten esiteltiin Boyden kammion määritys ~21 tuntia.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin 5, 24, ja 48 tunnin kuluttua elektroporaatiolla 1 × soluhajotuspuskurin. Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiineja jokaisesta näytteestä ladattiin 4-20% SDS-polyakryyliamidigeelillä (Bio-Rad, CA). Proteiinit siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle. Membraani blokattiin, pestiin, ja niitä inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden, kuten Mesothelin (Abcam, MA ja LS Bio, WA) ja β-aktiini (Cell Signaling Technology, MA), mitä seurasi HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Kun perusteellinen pesu, blotti altistettiin ECL (GE Healthcare, NJ) ja autoradiografia.

Cell cycle määritys

Cell cycle määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, noin 10

6 solut pestiin kaksi kertaa käyttäen CycleTEST PLUS Puskuriliuos (BD Biosciences, Cat. 340242). Solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan samaa puskuria. Värjäämiseksi solut, 250 ui liuosta A ja 200 ui liuosta B lisättiin ja inkuboitiin 10 minuutin ajan RT: ssä. Kylmä liuos C (200 ui) lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Solut suodatettiin 35 um: n solusiivilän ja analysoitiin FACSort-virtaussytometrillä.

rakentaminen ilmentävää miRNA

suunniteltiin ja syntetisoitiin kolme miRNA jäljittelee kohdistaminen täyspitkä ihmisen Mesothelin geenin ( geeni pääsy numero: NM_005823.4). Jokainen suunniteltu miRNA matkivat oli 64 nukleotidin pituisia, kuten osittainen sivuavan sekvenssin, Mirna hiusneula, ja kypsä miRNA (kursivoitu /alleviivattu) johdettu kohdegeenistä seuraavasti: 1-TGCTG

ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA

GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT; 2-TGCTG

TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG

GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA; ja 3-TGCTG

TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT

GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.

Käyttämällä BLOCK-IT Pol II miR RNAi ekspressiovektoriin (Invitrogen, CA), me hehkutettu ja kloonattiin oligoja koodaavan suunniteltu ennalta miRNA kloonauskohtaan (ACGA ja CAGG) ja pcDNA 6.2-GW /EmGFP-miR vektoreita, jotka reunustavat molemmin puolin, jotta suunta kloonaus- tai asianmukaisen prosessin pre-miRNA. Pre-miRNA insertoitiin 3′-UTR EmGFP geenin-ohjaa Pol II- promoottoreiden. EmGFP mahdollistaa seuranta ilmaus miRNA, joka tarjoaa vahvan korrelaation EmGFP ja miRNA ilme. Kukin plasmidi sekvensoitiin vahvistamaan lisätään kaksijuosteisen miRNA oligojen. Ilmentävän plasmidit elektroporaatiolla Ovcar5 soluihin tai SKOV3- soluja, ja analysoitiin FACS asianmukaisen ilmentymisen miRNA vuonna munasarjasyöpäsoluja.

Generation lentiviruksesta hiukkasten ilmentävien miRNA

Merkintä klooni tuottamat yhdistämällä pMSLNmiR3 kanssa pDONR 221 konstruktilla käyttäen BP klonaasia II entsyymi. Mirna kasetti siirrettiin pLenti6.3 /TO /V5-DEST sisältävän vektorin ATTR1-attR2 käyttämällä LR-klonaasia II luoda lopulliset lentivirusvektorilla MSLNmiR3. Lisäksi loimme lentivirusvektorilla koodaus salattu miRNA (negatiivinen kontrolli) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen), joka ei kohdistu mitään tunnettujen ihmisen geeniä. Ilmaisu on miRNA ohjaa CMV-promoottori. Sekvensseillä on miR3 ja salattu miRNA varmistettiin sekvenssianalyysillä.

Production, titraus ja infektio lentiviruksesta hiukkasten

MSLNmiR3 tai Negative Control lentivirukselle transfektoitiin ViraPower pakkaus sekoitus (Invitrogen, CA ) ihmisen 293FT soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Opti-MEM I-alustassa (Invitrogen, CA) ja viljeltiin yön yli. Solut asetettiin blastisidiinia (10 ug /ml) valinta 72 tuntia. Supernatantti kerättiin ja lentivirus- partikkeleita konsentroitiin käyttämällä Lenti-X Concentrator (Clontech, CA). Lentivirusvektorikonstruktit varastossa laimennettiin kymmenkertaisesti sarja tartuttaa HT1080 soluja. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia infektion jälkeen solut arvioitiin FACS ja titraus laskettiin käyttäen kaavaa [FXC /V] xD, jossa ”F” on taajuus GFP-positiivisten solujen kanssa; ”C” on kokonaismäärä solujen hyvin aikaan transduktion; ”V” on tilavuus Inokulantit vuonna ml; ja ”D” on lentivirus laimennus. Ovca429 solut infektoitiin lentiviruksen hiukkasten MOI~30 läsnä polybreenin (10 ug /ml) yön yli. Solulisäkasvumääritykselle suoritettiin infektion jälkeen ilmoitettuina ajankohtina.

Virtaussytometria

Viljellyt solut hajotettiin soluhajotusprosessin puskurilla (Sigma-Aldrich, MO) ja pestiin kahdesti MACS-puskurissa (PBS plus EDTA: ta ja 0,5% naudan seerumin albumiinia) (Miltenyi Biotec, CA). Yhteensä 2 x 10

5-soluja (100 ui) inkuboitiin Mesothelin monoklonaalisella vasta-aineella (lopullinen pitoisuus, 1 ug /ml) (Cat # ab3362, Abcam, MA) jäissä 1 tunnin ajan pimeässä. Sitten solut pestiin kahdesti MACS-puskuria, suspendoitiin uudelleen 100 ul: ssa sekundaarisen vasta-aineen (1:200 laimennus, APC konjugoitu IgG, BD Biosciences, NJ), ja inkuboitiin jäillä 1 tunnin ajan pimeässä. Solut pestiin kahdesti ja analysoitiin LSRII analysaattori (BD Biosciences, NJ) ohjelmiston avulla FACS Diva version 6.1. Solut värjättiin sekundäärisellä vasta-aineella yksinään sisällytettiin todistaa spesifisyyden vasta-aine.

Tulokset ja keskustelu

Päätimme vaikutusten arvioimiseksi hiljentäminen MSLN käyttämällä lyhyen häiritsevä RNA (siRNA). Mekanistisesti nämä 19-21 oligomeerit voivat sitoutua tietyn matching sekvenssin tavoitteensa lähetti-RNA: iden (mRNA: t) ja merkitse ne on tarkoitettu hävitettäväksi monimutkainen kutsutaan RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC). Tämän saavuttamiseksi, sekvenssi MSLN mRNA analysoitiin erikoistunut ohjelmisto (Qiagen, CA), ja sekvenssit siRNA oligomeereja ei todettu. Yksi näistä sekvensseistä (5′-CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3 ’) valittiin, koska se on suurempi spesifisyys vastaan ​​MSLN. Anti-MSLN siRNA oligomeeriä syntetisoitiin (kaksijuosteisessa muodossa) ja konjugoitu Alexa Fluor 488 3’-päähän sen juosteen (Qiagen, CA). Kuvio 1A esittää mRNA-sekvenssin ihmisen MSLN ja sitoutumiskohta anti-MSLN siRNA.

(A) Anti-Mesothelin siRNA on suunniteltu keski-sekvenssin asema Mesothelin mRNA. (B) Kun elektroporaatio anti-Mesothelin siRNA, ilmentymisen tasojen Mesothelin väheni merkittävästi H2373-soluissa. Negatiivinen kontrolli siRNA eivät aiheuttaneet tällaisia ​​vähentäminen. Alapaneeli esittää tuloksia band-densitometrisesti vertaamalla intensiteetti Mesothelin ilmentymisen yhteydessä elektroporaatio H2373-solujen kanssa siRNA. (C) Anti-Mesothelin siRNA ei vaikuttanut ekspressiotasot β-aktiini, talon säilyttäminen proteiini, kuin todiste erityispiirteenä vastaisen Mesothelin siRNA sen kohde. (D) leviämisen nopeus H2373-solujen on merkittävästi (p 0,05) vähensi 48 tunnin kuluttua elektroporaatiolla 40% arvot negatiivisen kontrollin käsiteltyjen solujen. Rebound korkeampiin leviämisen hinnat havaitaan johtuen puhdistumaan siRNA soluista myöhäisemmässä vaiheessa sopusoinnussa aiempien tutkimusten. Kuvan kohta paneelit esittävät tiheyden solut kussakin ryhmässä tutkimuksen 48 tunnin kuluttua elektroporaatio. (E) NIH3T3-solut ovat vailla Mesothelin ja niiden leviäminen nopeus ei vaikuta altistuminen anti-Mesothelin siRNA (hiiri). Kuvan kohta paneelit osoittavat tiheys solujen 48 tunnin kuluttua elektroporaatio.

Jotta vaikutusten tutkiminen anti-MSLN siRNA ilmentymistä koskevat MSLN, käytimme H2373 ihmisen mesoteliooma solulinjaa. Kuten kuviossa 1B, kun elektroporoitiin anti-MSLN siRNA: n ilmentyminen MSLN on erityisesti vähentää jo 24-48 tuntia elektroporaation verrattuna negatiivisen kontrollin käsiteltyjen solujen. Muutoksia ei havaittu ilmentyminen β-aktiini (talon säilyttäminen geenituote) altistumisen jälkeen solujen anti-MSLN siRNA (kuvio 1 C).

päätti testata leviämisen nopeus syövän soluja tällaisissa olosuhteissa. Kuten nähdään kuvassa 1D, vähennetään merkittävästi (p 0,005) in leviämisen mesoteliooma solujen havaittiin jo 48 tunnin kuluttua elektroporaatio. On tärkeää huomata, että proliferaation nopeuden ohjaus siRNA-käsitellyt solut kussakin ajankohdassa mitattiin ja sitten skaalataan 100%. Leviämisen määrä anti-MSLN siRNA käsitellyt solut laskettiin ja skaalataan murto-osa kontrolliarvoihin. Kuvatekstiruudun paneelit edustavat solutiheys testin ja kontrollikäsitellyt populaatioiden osoitti ajankohtina elektroporaatio. Mielenkiintoista leviämisen nopeus siRNA-käsiteltyjen solujen alkoi kasvaa klo 72-96 tunnin kuluttua elektroporaatio. Tämä johtuu siitä, että tilapäinen luonne transfektion elektroporaatiolla, joka on menetelmä, jota käytetään näissä kokeissa käyttöön anti-MSLN siRNA soluihin. Toisin sanoen, kun aikaa kuluu, pitoisuus siRNA käsitellyissä soluissa vähentäisi mahdollistaa rebound leviämisen. Olemme havainneet tällaista ilmiötä meidän muissa tutkimuksissa, joissa geenispesifisistä hiljentäminen [26], [27]. Kun samaa menettelyä sovellettiin NIH3T3-soluihin (void MSLN), tilastollisesti merkittäviä muutoksia elinkelpoisuutta havaittiin (siRNA käytettiin tässä kokeessa, voi sitoutua hiiren MSLN mRNA) (kuvio 1 E).

seuraava askel, päätimme testata vaikutukset hiljentäminen MSLN muissa MSLN ilmentävien solujen kuten munasarjojen ja haiman syöpä solulinjoja ja vertaa tällaisia ​​vaikutuksia kanssa tietoja mesoteliooma soluja. Tasot ilmentymisen MSLN paneelissa haiman ja munasarjasyövän solut testattiin käyttäen western blotting, kuten on esitetty kuviossa 2A. Miapaca2, BxpC3 ja Panc1 (haimasyövän solulinjoissa) ja SKOV3 ja Ovcar3 (munasarjasyövän solulinjoissa) osoitti kohonneet MSLN ilmaisun taas HUVEC (ihmisen napalaskimon endoteelisolujen) ja NIH3T3-solut pysyivät negatiivisia MSLN odotetusti. Elektroporaatio kaikki edellä mainitut syöpäsolulinjoja johti merkittävään vähenemiseen niiden elinkelpoisuuden (kuva 2B-2D, tulokset esitetään SKOV3-, BxPC3 ja MiapaCa2). Jälleen kerran rebound leviämisen takia puhdistumaan siRNA haiman ja munasarjasyövän solujen havaittiin. Aikataulua tämä rebound oli vaihteleva näistä solulinjoista niiden suhteellisen puhdistuma siRNA.

(A) Mesothelin proteiini havaittiin haimasyövän solulinjoissa, Panc1, Miapaca2 ja Bxpc3 ja munasarjasyöpäsoluja SKOV3 ja Ovcar3. NIH3T3 ja HUVEC-solut, jotka ovat vailla Mesothelin käytettiin osoittamaan spesifisyys Mesothelin vasta-ainetta. (B) SKOV3- solut olivat vähentyneet lisääntymistä päivänä 3 jälkeisen elektroporaation anti-Mesothelin siRNA noin 50% negatiivisen kontrollin. Kuvan kohta paneelit esittävät tiheys solun kerta-pisteen. (C-D) kaksi haimasyövän solulinjoissa, Bxpc3 ja MiaPaca, testattiin tuloksista hiljentäminen Mesothelin niiden leviämistä. Molemmissa tapauksissa merkittävä menetys leviämisen havaittu, kuitenkin Bxpc3 lasku käynnistää myöhempinä ajankohtina verrattuna MiaPaca soluihin. Sekä solut jälleen rebound korkeampiin leviämisen hinnat havaitaan pitemmillä ajankohtina välyksen aiheuttamat siRNA soluista. Kuvan kohta paneelit esittävät tiheys solun kerta-pisteen.

Vaikka kaikki syöpäsolut osoittivat merkittävää vähenemistä elinkyky elektroporaation anti-MSLN siRNA, solut ilman ilmentymistä MSLN kuten NIH3T3 ei osoittavat merkittäviä muutoksia niiden leviäminen hinnat kerran elektroporatoiduissa anti-MSLN siRNA (kohdistaminen hiiren MSLN). Siksi normaalit solut, joilla on hyvin vähän tai ei lainkaan ilmentymistä MSLN eivät vaikuta strategia mikä spesifisyys biologiset vaikutukset MSLN hiljentäminen varten pahanlaatuisia soluja. Tämän vuoksi inhibitio MSLN voidaan pitää mahdollisena strategia kohdentamiseksi tuumoreihin, mesoteliooma, munasarjasyöpä ja haimasyöpä solun erityisellä tavalla. Viimeaikaiset kliiniset kokeet käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita MSLN on myös raportoitu olevan hyvin siedetty potilailla vahvistaa minimaalinen in vivo sivuvaikutuksia MSLN kohdistusstrategioihin [28], [29]. Tämä on erityisen tärkeää, koska rajallinen tasot Mesothelin ilmaisun keuhkopussin, sydänpussin ja vatsakalvon kalvot [30], [31].

Olimme kiinnostuneita myös tutkii seurausta hiljentäminen MSLN on invasiivisuus on syöpäsoluja. Etäpesäke kaikkein tuhoisa tulos maligniteettien on tärkeä rooli patogeneesissä syöpä. Siksi on looginen askel tutkimaan tuloksesta hiljentäminen Mesothelin ominaisuuksista syöpäsolujen hyökätä. Tämä on myös tärkeä huolenaihe huomioon invasiivisen luonteen maligniteettien tutkittu tässä työssä. Tätä tarkoitusta varten käytimme in vitro mallia, joka perustuu tutkimiseen valmiuksia solujen hyökätä kerroksen läpi Matrigel mallina etäpesäke (muokattu Boyden kammion määritys). Arvioimme invasiivisuus on H2373, SKOV3- ja BxPC3 solut kerran hoidettu anti-MSLN ja hallita siRNA (kuva 3A-3C). Kaikissa kolmessa tapauksessa merkittävä väheneminen invasiivisuus havaittiin. Vähentynyt invasiivisuus kaikkien testattujen syöpäsolut on erityisen kliinistä merkitystä, koska suuri metastaattisen luonne näitä sairauksia.

(A) Kun testattiin muunneltua Boyden kammion määrityksessä invasiivisuuden H2373 mesoteliooma solujen vähenee merkittävästi (p 0,05) kun Mesothelin hiljentäminen. Elektroporaatiolla solut esiteltiin hyökkäystä kammioihin tämän kokeilun ja tunkeutuu solut laskettiin ja valokuvattiin jälkeen 48 tuntia. Kuvan kohta paneelit edustavat tiheys hyökkäsi soluja värjättiin kristallivioletilla. (B-C) SKOV3- ja Bxpc3 solujen molemmat osoittavat merkittävää (p 0,05) vähenee niiden invasiivisuus upon Mesothelin hiljentäminen arvoihin alle 20% negatiivisen kontrollin. Kuvan kohta paneelit edustavat tiheys hyökkäsi soluja värjättiin kristallivioletilla. (D) hiljentäminen Mesothelin indusoi merkittävän laskun aktivointi (fosforylaatio) ERK1 (mutta ei ERK2) ja fosfo-AKT. Lisäksi, ekspression β-kateniinin, joka on tunnettu EMT markkeri, väheni. Slug, toinen transkriptiotekijä mukana EMT kasvoi hieman tässä tilassa. ER-stressi markkereita, Ero-1 aleni samalla Bip oli hieman koholla. (E) eteneminen solusyklin on muutettu Mesothelin hiljentäminen pääasiassa kasvuun solujen prosenttiosuus S-vaiheessa. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa on esitetty ylemmässä paneelissa ja edustavia virtaussytometrialla data tarjotaan alemmassa paneelissa. G1, S ja G2 poimii on merkitty kunkin kaavion kasvaen S-vaiheessa populaation soluja.

Tätä varten olimme havaittu menetys elinkelpoisuuden ja invasiivisuus alueella syöpäsoluja upon hiljentäminen MSLN. Jotta jonkin verran selvittämiseksi molekyylimekanismin taustalla kuten fenotyyppisiä muutoksia, arvioimme aktivointi /ekspressiotaso joitakin tärkeimpiä signalointi proteiineja, jotka liittyvät neoplastisten muutoksen H2373-soluissa (kuvio 3D). Efektori reittejä alas-virta esikasvaintekijän Ras [32], [33], [34] kuten aktivointia ERK1 /2 (solunulkoinen signaali liittyvä kinaasi), fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K /AKT) ja p38 (p38- kinaasi) tutkittiin tähän tarkoitukseen. Havaitsimme, että kun MSLN vaiennettu, fosfori-ERK1 ja fosfo-AKT aktivaation taso oli syvästi vähentynyt, kun taas tasot fosfo-p38 säilyi ennallaan (kuvio 3D). Jossa osallistuminen ERK proliferaatiossa ja etäpesäkkeiden [35], [36] ja myös osallistuminen PI3K /AKT-reitin suojaa apoptoosin [37], lasku aktivoinnin näiden signalointipolkujen voi selittää antiproliferatiivisia vaikutuksia hiljentäminen MSLN . Kuitenkin p38-reitin [38] (osallistuvien stressi signalointi, apoptoosin ja vanhenemista) näyttivät pysyvän muuttumattomana, kun esto MSLN. Koska p38-kinaasi toimii kasvua estävä reitti, on mahdollista, että solujen kapasiteetin tehdään kasvun inhibition ja /tai apoptoosin (sanelee p38-kinaasi-reitti) säilyy muuttumattomana hiljentämällä MSLN.

tulokset siRNA-välitteisen knockdovvn MSLN epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT) [39], [40], biologinen ohjelman parantamiseksi metastaattisen ominaisuuksia, tutkittiin myös tiimimme. EMT on tärkeä biologinen askel kohti saavuttamista metastaattisen fenotyypin syöpäsolut [41]. Beta-kateniini, yksi Wnt alavirtaan molekyylejä ja myös tärkeä toimija EMT, todettiin vähentää merkittävästi, kun hiljentäminen MSLN (kuvio 3D, keskimmäinen paneeli). Slug, toinen transkription repressori mukana EMT todettiin jonkin verran lisääntynyt, kun MSLN hiljentäminen [42]. Kanssa näkökohdat roolia Slug tukahduttamistoimiin E-kadheriinin [43] olisi looginen askel arvioida ekspressiotasot E-kadheriinin upon Mesothelin hiljentäminen. Kuitenkin, mitään merkityksellistä muutosta ei havaittu tasojen E-kadheriini (tuloksia ei ole esitetty). Siksi määrän kasvu tasoa tämän proteiinin ei saa vaikuttaa positiivisesti EMT ominaisuudet syöpäsolujen kerran Mesothelin on vaimennettu.

Olimme kiinnostuneita tutkimaan ekspressiotasoja merkkiaineiden osallisena säätelyssä ER- stressi. Stressitilanteissa keskeyttämättä ER toiminto lukemiin kertymistä taittamatonta proteiinien ER jota kutsutaan ER-stressi [44], [45]. Tällaisen olosuhteet integroitu paneeli signalointipolkujen aktivoituu johtaen levitetyssä proteiinivaste (UPR) [46], [47]. Sen jälkeen jatketaan UPR vasteen ja jos unfolded proteiineja ei selvitetty mekanismi aktivoituu aiheuttaa solukuoleman. Olemassaolo krooninen ER-stressi olosuhteissa käy yhä ilmeisemmäksi syöpäsoluissa [47]. Siksi olisi uusia ja mielenkiintoista nähdä muutoksia ER-Stress polku edistäisi tuloksesta MSLN hiljentäminen syöpäsoluissa.

ER-oleskelevien proteiini endoplasmic oxidoreductin-1 (Ero1), yksi molekyyleistä liittyy ER-stressi-reitin, hapettuu proteiini isomeraasi (PDI), joka puolestaan ​​esittelee disulfidi bändejä ER proteiineihin [48]. Huomattava väheneminen havaittiin Ero1 upon MSLN hiljentäminen saattaisi johtaa vähentynyt kapasiteetti syöpäsolujen taittaa ja selkeä proteiinien johtaa niiden lopulta kuolemaan (kuva 3D, alempi paneeli). Myös lisääntynyt ilmentyminen havaittiin BIP (Luminal sitovan proteiinin esiaste), molekyyli- chaperon mukana estämällä proteiinin aggregaation [49]. Tällainen havainto saattaa olla osoitus kohonneet proteiini piirtyy kun MSLN hiljentäminen kuten Bip tasot ovat yleensä esiin solun torjumiseksi aggregaation kehitettyjen proteiinien [50].

viimeinen fenotyypin ominaisuus tutkittu MSLN-vaiennettu soluissa oli etenemistä solusyklin. Suurin muutos havaitaan näissä soluissa kasvoi merkittävästi (-50%) on osa solujen S-vaiheen kuvaava saarrosta etenemistä S G2 vaiheessa (kuvio 3E).

Nykyinen lähestymistapa etenee estävä RNA hoidon esikliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia perustuu pääasiassa käyttämällä lentiviruksien osoitukseksi ja toimittaa siRNA molekyylit jatkuvalla tavalla [51], [52], [53]. Tätä varten, ja tuottaa translaation työkalu kohdistamista syöpäsolut perusteella esto MSLN, päätimme kehittää lentivirus ilmentävät anti-MSLN miRNA. Tällaisia ​​työkalua voidaan käyttää tulevaisuudessa arvioitava edelleen ennalta kliinistä arvoa MSLN geenispesifisistä hiljentäminen terapeuttiseksi lähestymistapa.

Koska lyhyt ribonukleiinihappo (RNA) molekyylejä (~22 nukleotidit) esiintyy kaikissa eukaryoottisissa soluissa, miRNA ovat posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaiset, jotka sitoutuvat komplementtijaksoja kohde-mRNA dokumenttinsa. Tämä johtaa translaation tukahduttamisen ja geeni erityisiä hiljentäminen [54], [55]. Kun sarjan kolme miRNA-sekvenssejä (miR1, miR2 ja miR3, suhteelliset sijainnit on esitetty kuvassa 4A, ylempi paneeli) valittiin, joista kukin kloonattiin ekspressioplasmidiin (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) ja elektroporaatio osaksi Ovcar5 soluihin. Kaikki plasmidit tehokkaasti elektroporaatiolla soluihin (perustuen GFP ilmaisu) (kuvio 4A, keskimmäinen paneeli). Kaksi suunniteltu miRNA (miR1 ja miR3) kolmesta vaiennettu MSLN tehokkaasti paljasti western blottauksella (kuvio 4A, alempi paneeli).