Krooninen sairaus

tiivistelmä

selenoproteins välittävät paljon syöpää ehkäiseviä ominaisuuksia välttämätön ravintoaine seleeni, mutta jotkut näistä proteiineista on osoitettu myös syöpää edistäviä vaikutuksia. Tutkimme osuudet 15kDa selenoprotein (Sep15) ja tioredoksiinista reduktaasin 1 (TR1) syövän kehitystä. Kohdennettu säätely alaspäin joko geenin esti kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja muodostumista kokeellisen etäpesäkkeiden hiiren paksusuolen syöpä CT26 soluja. Yllättäen yhdistetty puute Sep15 ja TR1 päinvastaiseksi syöpälääkkeen havaitut vaikutukset säätely alaspäin kunkin yksittäisen geenin. Olemme havainneet, että tulehdukseen liittyvät geenit säädellään Stat-1, erityisesti interferoni-γ-säännelty guanylate sitovia proteiineja, olivat erittäin koholla Sep15-puutosta, mutta ei TR1-vajaiden solujen. Mielenkiintoista, komponentit Wnt /β-kateniinin signalointireitin oli säädelty soluissa, joista puuttuu sekä TR1 ja Sep15. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Sep15 ja TR1 osallistua puuttumatta säätelyreittejä paksusuolen syöpäsoluissa. Kun otetaan huomioon muuttuva ekspressiotasot Sep15 ja TR1 tavataan väestöryhmä, meidän tulokset tarjoavat oivalluksia uusia rooleja selenoproteins syövässä.

Citation: Tsuji PA, Carlson BA, Yoo MH, Naranjo-Suarez S, Xu XM, hän Y, et ai. (2015) 15kDa Selenoprotein ja tioredoksiinista reduktaasin 1 edistää paksusuolen syövän erilaisia ​​reittejä. PLoS ONE 10 (4): e0124487. doi: 10,1371 /journal.pone.0124487

Academic Editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 30 joulukuu 2014; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2015; Julkaistu: 17 huhtikuu 2015

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista

Data Saatavuus: Seuraavat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray tiedot ovat saatavilla kautta Gene Expression Omnibus tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; liittymistä # GSE55488).

Rahoittajat: Rahoittajat Towsonin yliopiston Fisher College of Science and Mathematics (Jolla puheenjohtaja, PAT), National Cancer Institute Intramural tukea, National Cancer Institute syövän ehkäisemisen -jäsenyysohjelma (PAT), ja National Institutes of Health avustusten (CA080946, GM065204 ja VNG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien [1]. Täydentävät ruokavalion seleeni on raportoitu esiintymisen vähentämiseksi ja kuolleisuutta paksusuolen syöpää [2] ja eläinten kanssa optimaalisia seleeni tasot [3]. Nämä syöpää ehkäisevien ensisijaisesti välittyvät selenoproteins [4], mikä viittaa taustalla geneettinen alttius paksusuolen syöpä. Kolme selenoproteins ovat sekaantuneet sekä ennaltaehkäisy ja edistäminen syövän: Tällä 15kDa selenoprotein (Sep15) [5-7], tioredoksiini reduktaasin 1 (Txnrd1, TR1) [8], ja glutationiperoksidaasi 2 (GPx2) [9]. Lisäksi tutkimukset yhden emäksen monimuotoisuus paljasti yhdistys sekä TR1 ja selenoprotein P (SEPP1) kehittyneitä peräsuolen adenoomien ihmisellä [10]. Olemme aiemmin tutkinut dual persoonallisuudet kahden ensimmäisen selenoproteins [7,8,11,12], ja tässä olemme edelleen tutkineet niiden vuorovaikutusta niiden sääntelyä paksusuolen syöpä. Sep15 ja TR1 kuuluvat tioli-oksidoreduktaasi ryhmä selenoproteins [13]. TR1 on suuri redox-säädin nisäkässoluissa ja on myös mukana solujen lisääntymisen, angiogeneesin, transkriptio, ja DNA: n korjaukseen [14,15]. Fysiologinen tehtävä Sep15 edelleen huonosti ymmärretty, mutta se saattaa olla mukana uudelleenjärjestelyn disulfidisidosten tai toimia reduktaasi varten virheellisesti muodostettu disulfidisidoksia väärin laskostuneet glykoproteiinien sitoutuu UDP-glukoosi: glykoproteiini glukosyyli-transferaasi (UGGT) [16].

aiemmin osoitettu, että menetys TR1 päinvastaiseksi pahanlaatuinen ominaisuudet LLC1 hiiren keuhkosyöpään solujen [17]. Samoin menetys Sep15 päinvastaiseksi syövän fenotyypin hiiren [18] ja ihmisen paksusuolen syövän soluja [19]. Koska molemmat proteiinit ovat selenoproteins, on mahdollista, että niillä on additiivinen tai synergistinen vaikutus. Sep15 ilmentyy differentiaalisesti joissakin ihmisen syövissä [20,21], ja TR1 on säädelty monissa syövissä [14]. Tässä tutkimme suhdetta Sep15 ja TR1 hiiren CT26 paksusuolen adenokarsinoomasolua osalta niiden roolia selenoproteins paksusuolen kasvainten synnyssä. Mielenkiintoista, poistaa nämä kaksi selenoproteins näytti saavuttaa käänteinen syöpä fenotyyppien läpi hyvin erilaisia ​​reittejä, ja, yllättäen, yhdistetty puute Sep15 ja TR1 kompensoitiin säätely ylöspäin komponenttien Wnt /β-kateniinin signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

liittyminen koodit

Microarray data pääsee läpi Gene Expression Omnibus tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; liittyminen # GSE55488).

Materiaalit

Hiiren CT26 paksusuolen syövän solut hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA), ja vain pieni kanava numeroita käytettiin. PSilencer2.0 U6-Hygro-vektori oli Ambion (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), naudan sikiön seerumia, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), RPMI 1640, hygromysiini B, NuPAGE 4-12% polyakryyliamidigeeleillä, SeeBlue Plus2 proteiini markkereita, litium riumdodekyylisulfaatti (LDS) näytepuskuria, Iipofectamine2000, polyvinylideenidifluoridi (PVDF), ja TRIzol-reagenssia Invitrogen (Carlsbad, CA), ja 5,5′-ditiobis (2-nitrobentsoehappo) ja aurotioglukoosi Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Vasta-aineet Sep15 ja TR1 tuotettiin kaniineissa Epitomics /Abcam (Cambridge, MA) käyttäen synteettistä peptidiä (Sep15) tai rekombinanttiproteiinia (TR1) antigeeneinä, ja validoitu meidän lab tälle yritykselle. Kani-anti-alfa-fetoproteiini (AFP), vasta-ainetta ja piparjuuren peroksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta vastaan, vuohen saatiin Abcam (Cambridge, MA), ja hiiren anti-fosfo-β-kateniinin primaarinen vasta-aine, Cell Signaling (Danvers, MA). Vasta-aineet β-aktiini, α-tubuliinin, guanylate sitovan proteiinin 1 (Gbp-1), STAT1 (P84 /p91), ja interferoni-indusoidun proteiinin 44 (Ifi44) olivat Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta vastaan ​​kanin oli Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SuperSignal West Dura alustan ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-ainetta hiiren olivat Pierce (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), ja iScript cDNA Synthesis kit ja SYBRGreen Supermix Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Reaaliaikainen RT-PCR-alukkeet olivat Sigma-Genosys (St. Louis, MO), jalo agar Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ), ja musta Intiassa mustetta Winsor Newton. Muut reagenssit olivat korkeimmat kaupallisesti saatavissa laatua.

Kohdennettu alas-säätely Sep15, TR1, ja TR1 /Sep15

pU6-m3 vektori käytetään tuottaa lyhyitä hiusneula-RNA (shRNA) tavoitteet, ja vakaa transfektio shSep15 ja shTR1 CT26 paksusuolen syövän soluja rakennettiin, kuten on kuvattu [17,18,22], ja vain pieni kanava numeroita käytettiin kokeissa. Sep15- ja TR1-puutteellinen ja vastaava CT26 vanhempien solut transfektoitiin identtiset vektoreilla (katso [15,17] lisätietoja) lukuun ottamatta shRNAs. Olemme tutkineet kaksi shRNA oligonukleotidisekvenssiä, ja useat riippumattomat solukloonien näiden sekvenssien johti hyvin samankaltainen pienenemistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Kaksi shRNA oligonukleotidisekvenssejä Sep15 ja TR1 on aiemmin osoitettu johtavan samanlainen käänteinen syövän fenotyypin [17,18]. Kaksinkertainen Knockdown solujen sisällytetty molemmat validoitu konstruktioita. Solut kaksinkertaisella knockdovvn Sep15 ja TR1 yhdessä valmistettiin kuten kuvattu [22].

Soluviljely ja solujen kasvua määritykset

Hiiri paksusuolensyöpä CT26 soluja viljeltiin täydellisessä kasvualustassa (RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia ja 1% natriumpyruvaattia), kostutetussa atmosfäärissä (5% CO

2, 37 ° C). -Solut transfektoitiin stabiilisti shSep15, shTR1, yhdistelmä shTR1 ja shSep15 rakentaa, tai tyhjä pU6-m3 vektori (kontrolli) käyttäen Iipofectamine2000 valitsemalla soluja, kun läsnä oli 500 ug /ml hygromysiini B. Solujen kasvua seurattiin kylvö 1 x 10

5 solua /kuoppa kuuden kuoppalevyillä täydellisessä kasvualustassa ja laskemalla solut neljä päivää.

RNA-analyysi

Yhteensä RNA eristettiin solujen TRIzolia. cDNA syntetisoitiin iScript ja 1,5 ug kokonais-RNA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivista tosiaikaista RT-PCR: llä (qPCR), 1,5 ui cDNA: ta lisättiin 20 ul: reaktiot DNA Engine Opticon2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Alukkeet qPCR esitetään S1 taulukossa. mRNA selenoproteins laskettiin suhteessa ilmentymisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

), käytetään sisäisenä kontrollina.

Western blotting-analyysit

Proteiininäytteet uutetaan neljä stabiilisti transfektoitujen CT26 solulinjat elektroforeesi NuPAGE 4-12% polyakryyliamidigeeleillä seurasi siirtämällä PVDF-kalvoille. Membraanit inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1: 200-1: 2000) yli yön 4 ° C: ssa. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (1: 10000) levitettiin, membraaneja inkuboitiin kemiluminesenssisubstraatilla, ja valotettiin röntgenfilmille.

tioredoksiini-reduktaasin (TR) aktiivisuus

TR aktiivisuus oli määritettiin spektrofotometrisesti [23], joka perustuu muunnetun menetelmän Holmgren ja Björnstedt [24]. Lyhyesti, TR aktiivisuus määritettiin erotus TR aktiivisuus ja ajasta riippuvaisia ​​Absorbanssin kasvua 412 nm: ssä, kun läsnä on TR-inhibiittorin, aurotioglukoosi. Yksikkö aktiivisuus määritettiin 1,0 umol 5-tio-2-nitrobentsoehappo muodostettu /min /mg proteiinia. Proteiini mitattiin kanssa bikinkoniini- hapolla.

Soft agar määritys

Anchorage riippumatonta kasvua tutkittiin pehmytagar määrityksiä [17,18]. Toisin kuin useimmat solut, joilla on normaali fenotyyppi, monet syöpäsolut pystyvät kasvamaan niiltä puuttuisi kiinnekohta pehmeässä agarissa. Noin 3000 solua kutakin stabiilisti transfektoitu CT26 solulinjaa suspendoitiin 3 ml: aan 0,35% jalo agar täydellisessä RPMI 1640 ja levitettiin 60-mm astiat naamioitu pohjapinta kerroksen 3 ml 0,7% jalo agar mediassa. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kolmen viikon ajan, ja täydellinen kasvualusta levitettiin astiat kolmen päivän välein. Pesäkkeet tehtiin näkyviksi värjäämällä yön yli

p

-iodonitrotetrazolium violetti, skannattu ja laskettiin.

Solusyklianalyysiä

CT26-soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa 50% konfluenssiin, pestiin kaksi kertaa steriilillä PBS: llä, ja ylläpidetään seerumittomassa elatusaineessa 48 h indusoimaan G0-G1 solusyklin synkronointia. Soluja inkuboitiin sitten täysin kasvualusta 0, 6, 24 tai 48 tuntia, pestiin kahdesti PBS: llä, trypsinoitiin ja suspendoitiin PBS: ään (1 x 10

7-2 x 10

7 solua /ml) on jäätä. Jääkylmää 70% etanolia lisättiin vähitellen, ja solut kiinnitettiin yön yli. Solut sentrifugoitiin, suspendoitiin uudelleen RNaasi (100 yksikköä), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 min. Suspensio värjättiin propidiumjodidilla pimeässä 4 ° C: ssa yön, suodatetaan 50 um mesh, ja hankittu FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin analysoitiin ModFitLT versio 3.0 (Verity, Topsham, ME).

Eläinkokeet

Tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin NCI-Bethesda Animal Care ja Käytä komitea (luvan numero tätä tutkimusta varten on LCP-005). Muodostaminen kokeellisen keuhkojen etäpesäkkeiden upon

i

.

v

. injektion plasmidi-transfektoitujen ohjaus, shSep15, shTR1 tai shTR1 /shSep15 solut tutkittiin BALB /c-hiirten (Jackson Laboratories), joilla on sama geneettinen tausta CT26 adenokarsinoomasolut. Eläimet saivat vapaasti vettä ja seurattiin tarkasti kliinisten merkkien huonon terveyden koko tutkimuksen ajan. Kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia BALB /c-hiiriä ylläpidettiin torulahiiva-ruokavalio oli täydennetty riittävästi seleeniä (0,1 ug seleeniä /g ruokavaliota), kuten natriumseleniitillä (Harlan-Teklad, Indianapolis, IN). Kolmen viikon kuluttua, 5 x 10

5 CT26-solut 200 ui PBS: ää (

n

= 10 kukin plasmidi-transfektoitujen valvontaa, shSep15, shTR1 tai shTR1 /shSep15 solua) injektoitiin häntälaskimoon . Eläimet tapettiin, ja keuhkot tutkittiin 12 päivää injektion jälkeen. Kolme millilitraa 15% Intian muste /PBS-liuosta injektoitiin keuhkoihin henkitorven. Keuhkojen kudokset leikattiin ja ”valkaistu” ja Fekete liuosta (60% etanolia, 3,2% formaldehydiä, ja 0,75 mol /l etikkahappoa) 48 tuntia. Keuhkojen leesiot pinnalla kunkin lohkon laskettiin leikemikroskoopil-. Keuhkot 250 iholeesiot annetaan arvo 250, koska se on aina vaikea luotettavasti laskea yli 250 vaurioita /keuhko [18].

mikrosiruanalyysi

Yhteensä mRNA eristettiin plasmidi-transfektoidut ohjaus, shSep15, shTR1 ja shTR1 /shSep15 CT26-solut. Microarray analyysi tehtiin Affymetrix Hiiri 430_2.0A geenilastut. Neljä paneelit analysoitiin neljästä eri mRNA-näytettä per konstrukti. Robust Multi-Array analyysi algoritmia käytettiin tausta ja melun korjaus muuntaminen koetin tasolla geenien ilmentyminen tietoja. Ohjaimet ja solujen kohdennettua alas-säätely Sep15, TR1 tai TR1 /Sep15 verrattiin ANOVA. Geenit, jotka olivat merkittävästi erilaisia ​​plasmidista-transfektoiduista säätökennoja (

P

0,05) tehtiin funktionaalinen geeni analyysi Ingenuity Pathway Analysis (IPA, versio 7.5), joka tunnistaa verkostojen geenin ilmentyminen muuttuu mukaan toiminnallisten biologiseen prosessit sen sijaan että keskitytään enemmän dramaattisia muutoksia ilmentymisessä muutaman valitun geenejä. Aiemmin julkaistut, ja julkisesti saatavilla, microarray tietoja tutkimuksesta käyttäen Sep15 hiiriä näytetty vertailua varten [7].

Tilastolliset analyysit

Data esitetään keskiarvona ± SE analysoitiin yksi -way ANOVA seurasi Tukeyn usean vertailu

post-hoc

-testi GraphPad Prism (versio 5, La Jolla, CA). Merkitsevyystasoksi asetettiin α = 0,05, ja tilastollisesti merkittäviä muutoksia ilmoitetaan luvut seuraavasti:

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001, verrattuna kontrolliin. CellMiner n NCI-60 Analysis Tool, joka integroi molekyyli aineistoja 60 ihmisen syövän solulinjoja käytetään rutiininomaisesti farmakologisen seulontaan ja vertaileva molekyylitason analyysit, käytettiin geenien tunnistamiseen merkittävästi korreloi Sep15 ilme (https://discover.nci.nih.gov/cellminer, tietokanta versio 1.4), joka perustuu Pearsonin korrelaatiokerrointa, joiden asukasluku kooltaan 60, r = 0,254, ja

P

0.05 ilman monivertailuja korjausta. Geenitranskriptikuvion ekspressiomalleja verrattiin myös. CellMiner emäkset transkriptio intensiteetin taso mittauksiin viidestä mikrosiruja (Affymetrix HG-U95, HG-U133, HG-U133 plus 2.0, ja HuEx 1,0, ja Agilent Whole Human Genome Microarray) kuvatulla [25].

tulokset

Yksilöllinen ja samanaikainen puutos TR1 ja Sep15

hiiri paksusuolensyöpä CT26-solut transfektoitiin stabiilisti shSep15, shTR1, shTR1 /shSep15, tai vastaava pU6-M3- (tyhjä vektori) – ohjaus konstruktioita. Käytimme kaksi shRNA oligonukleotidien, ja useat riippumattomat solujen klooneja valittiin analysoitavaksi poissulkemiseksi vaikutukset johtuvat konstruktioita tai transfektion prosessia, joka on julkaistu [17,18]. qPCR ja Western blotting osoitti, että Sep15 mRNA: ta (kuvio 1A, ylempi paneeli) ja proteiinin tasot (kuvio 1A, alempi paneeli) olivat tehokkaasti ( 90%) laski transfektoiduissa soluissa shSep15 tai shTR1 /shSep15. qPCR, Western blotting ja katalyyttinen aktiivisuus määrityksissä osoitti TR1 mRNA (kuvio 1 B, ylempi paneeli) ja proteiinien ilmentyminen (kuvio 1 B, alempi paneeli), sekä katalyyttinen aktiivisuus (kuvio 1 C) pieneni 90% vuonna shTR1 ja shTR1 /shSep15 soluja. MRNA ilmentyminen glutationiperoksidaasit 1 (GPx1) ja 2 (GPx2) eivät muuttuneet merkitsevästi, ja selenoprotein M (Selm) oli vain hieman korkeampi shSep15 (

P

0,05) ja shTR1 /Sep15 soluja (

P

0,05), kuten odotettua (S1 kuvio).

Solut transfektoitiin stabiilisti kanssa pU6-m3 ohjaus, shSep15, shTR1 tai shTR1 /shSep15 (kuten on osoitettu). (A) Expression of Sep15 reaaliaikaisella RT-PCR (ylempi paneeli) ja Western-blottauksella (alempi kuva). (B) Expression of TR1 reaaliaikaisella RT-PCR (ylempi paneeli) ja Western-blottauksella (alempi kuva). (C) tioredoksiini Reduktaasiaktiivisuuden. Pylväät, keskiarvo (

n

= 3-6); baaria, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01 verrattuna kontrolliin).

shSep15 tai shTR1 estävät solujen lisääntymistä ja kehittymistä kokeellisia etäpesäkkeitä

Anchorage riippuvaista lisääntymistä sekä shSep15 ja shTR1 solujen väheni merkitsevästi (

P

0,001) (kuvio 2A). Kussakin tapauksessa oli 60% vähemmän soluja päivänä 4 verrattuna kontrolleihin. Yllättäen kasvu kuvio shTR1 /shSep15 soluissa oli samanlainen kontrollisoluihin. shSep15 ja shTR1 transfektoitiin CT26-solut muodostivat merkitsevästi (

P

0,001) vähemmän pesäkkeitä kuin kontrolli-solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun määrityksissä (kuvio 2B). Sen sijaan, TR1 /Sep15 Knockdown ei vaikuttanut pesäkekasvun pehmeässä agarissa.

(A) kasvuvauhdin shSep15, shTR1 ja shTR1 /Sep15 soluja verrattuna kontrolleihin (

n

= 6) . (B) Anchorage riippumatonta kasvua pehmeässä agarissa ja shSep15, shTR1 ja shTR1 /Sep15 soluja verrattuna kontrolleihin (

n

= 4-8). (C) muodostaminen kokeellisen keuhkoetäpesäkkeet jälkeen i.v. injektio 5 x 10

5-solujen (verrokki, shSep15, shTR1 tai shTR1 /shSep15) BALB /c-hiiriä (

n

= 10 /konstrukti). (

*** P

0,001, verrattuna kontrolliin).

Ohjaus solut muodostivat suuri määrä (188,6 ± 32,0) kokeellisten keuhkojen etäpesäkkeiden BALB /c-hiiriä ( kuvio 2C), kuten odotettua. Kuten myös aikaisemmin osoittaneet [18], kohdennettu vähentäminen Sep15 merkittävästi (

P

0,001) esti muodostavat tällaisia ​​keuhkojen etäpesäkkeiden (0,5 ± 0,2). Samoin shTR1 solut muodostivat vähemmän kokeellinen etäpesäkkeitä (2 ± 0,4) verrattuna kontrolleihin (

P

0,001). Hiiret injektoitiin shTR1 /shSep15 solujen kehitetty vähemmän kokeellinen etäpesäkkeitä kuin valvonta (100,4 ± 14,1;

P

0,001), mutta yli 50-kertaa enemmän (

P

0,01) verrattuna ruiskutettiin yhdellä knockdown soluihin.

shTR1 /shSep15 kääntää solusyklin fenotyyppejä havaittiin yhdellä knockdown soluissa

Räikein solusyklin muutoksia havaittiin shSep15 soluissa (kuvio 3A-3D), ja samaa mieltä meidän aiemmin julkaistu havainnot, että merkittävimmät erot shSep15 ja ohjaus solut näyttivät noin 24 tuntia viimeisen vapautumiseen seerumistarvaatio [18]. shSep15 solut oli huomattavasti suurempi prosenttiosuus väestöstä G2 /M-vaiheen (27,8 ± 0,8%) kuin kontrolli-soluissa (11,5 ± 2,1%;

P

0,001), ja pienempi prosenttiosuus S- vaihe (25,1 ± 0,9% vs. 42,3 ± 1,9%), samanlainen kuin aikaisempien havaintojen [18]. Kuitenkin shTR1 ja shTR1 /shSep15 soluja oli vähemmän soluja G2 /M-vaiheen (15,6 ± 1,2% ja 17,7 ± 0,7%, vastaavasti), verrattuna shSep15 solut (

P

0,001). shTR1 solut, jota on havaittu fibroblasti-johdettu DT-solut aiemmin [15], joka ilmenee viallinen etenemiseen S-vaiheen, näkyvissä kuin suuremman prosenttiosuuden solupopulaation 6 ja 48 h. CyclinB1 (CCNB1) mRNA-tasot eivät merkittävästi eroa (kuvio 3E), mutta mRNA-tasot CyclinB1-vuorovaikutuksessa olevaa proteiinia-1 (Ccnbip1) olivat voimakkaasti koholla shTR1 ja shSep15 solut (

P

0,01), mutta ei shTR1 /shSep15 soluja, verrattuna kontrolleihin, vastaavasti (kuvio 3F).

solujen prosenttiosuus, jotka kussakin solusyklin vaiheessa, kuten FACS-analyysillä määritettynä (A) 0 h; (B) 6 h; (C) 24 h; ja (D) 48 h vapautumisen jälkeen solujen synkronointi. mRNA ilmaus (E) CyclinB1 (

CCNB1

), ja (F) CyclinB1 Vuorovaikutus-Protein-1 (

Ccnb1ip1

), määritettynä reaaliaikaisen RT-PCR. Pylväät, keskiarvo (

n

= 3-9); baaria, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001).

Geenien ilmentyminen analysoidaan tunnistaa interferoni-γ- ja Wnt /β-kateniinin säädelty reittejä shSep15 ja shTR1 /shSep15 soluja, vastaavasti

Valaistaan ​​signalointireittien vaikuttavat Sep15- ja TR1-puutos koolonkarsinoomasoluissa, ja kääntyminen näitä vaikutuksia kaksinkertainen knockdown soluissa, globaali geeniekspressio analysoitiin microarray (N = 4 /konstrukti). Kahdenkymmenen eniten olennaisesti muuttunut geeni signaalit lueteltu S2 taulukossa. Valitut geenit tutkittiin qPCR suhteessa ilmaus sisäisen valvonnan,

GAPDH

, validoimiseksi mikrosirujen tuloksia.

voimakkaimmin säädelty geeni signaalit shSep15 solut interferoni-induced- proteiini-44 (

Ifi44

), ubikitiinispesifinen-peptidaasi-18 (

Usp18

), immuniteetti liittyvien-GTPaasi perhe-M-jäsen-2 (

Irgm2

), interferoni-sääntelyyn-tekijä-7 (

Irf7

), interferoni-γ-indusoidun GTPaasi

(Igtp

), erittäin suuri interferonilla indusoitavissa-GTPaasia

(Gvin1

), ja guanylate-sitovista proteiineista

Gbp-1

,

-2

ja

-6

. Merkittävästi lisääntynyt mRNA ilmentymistä

Ifi44

(

P

0,001, kuvio 4A, ylempi paneeli),

Irf7

(

P

0,001, kuvio 4B), ja

Usp18

(

P

0,05, kuvio 4C) in shSep15 soluissa kontrolleihin verrattuna validoitu kanssa qPCR. Proteiinin ekspressiotasoja Ifi44 (kuvio 4A, alempi paneeli), oli hieman lisääntynyt shSep15 soluissa. MRNA tasot

Gbp-6

(

P

0,05; kuvio 4D) ja interferoni-γ (IFNy) (

P

0,05; kuvio 4E) olivat merkitsevästi korkeampi shSep15 verrattuna shTR1 /shSep15 soluja. Tasot Gbp-1 mRNA aiemmin raportoitu olevan erittäin säädellään ylöspäin Sep15 hiirien [7]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, huomasimme, että Gbp-1 mRNA (kuvio 4F, yläpaneeli) ja proteiini tasoilla (kuvio 4F, alempi paneeli) lisääntyivät merkitsevästi yksinomaan shSep15 soluissa. Kekseliäisyyttä Pathway Analyysit (IPA) osoitti, että tulehdus liittyvät geenit säädellään ylöspäin shSep15 soluissa oli yhteinen solmu

Stat-1

(S3A kuvio), ja mukana

Gbp-2

(31,1 kertainen),

Gbp-6

(30,1-kertainen),

Nmi

(2,8-kertainen),

Irgm2

(20,7-kertainen), ja

Gbp -1

(14,3-kertainen; sisältyy ”Gbp-2 * ’). Muut merkittävästi säädelty

Stat-1

-associated geenien mukana

Usp18

(65,1-kertainen),

Irf7

(9,9-kertainen) ja

Irf9

(3,6-kertainen).

Stat-1

mRNA kvantifioitiin qPCR ja havaittiin huomattavasti vain shSep15 soluissa kontrolleihin verrattuna (

P

0,01, kuvio 4G, ylempi paneeli), mutta proteiinin tasot fosforyloitumaton Stat-1 pysyi ennallaan (kuvio 4G, alempi paneeli). Stat-1 ajatellaan edistää aktivointia eri kaspaasien, ja mRNA kaspaasi 6 (kuvio 4H) ja kaspaasi 12 (kuvio 4I) lisääntyivät merkitsevästi vain shSep15 soluissa (

P

0,05). Tukeminen tämä malli osallistumista interferoni-γ ja Sep15 muitakin vertailuja meidän aiemmin julkaistu microarray data [7], joka osoitti vaatimaton mutta merkitsevästi (

P

0,05) lisääntynyt mRNA ilmentymistä interferoni-γ- säännelty Stat-1, Stat-5A, IRF-2 ja IRF-3, in Sep15 poistogeenisiä hiiriä (N = 4) verrattuna pentueen mate valvonnan (N = 4). Geeni merkittävimmin säädellä vähentävästi shSep15 soluissa oli alfafetoproteiinigeenin (

AFP

). Mielenkiintoista, mRNA tasot

AFP

nousivat 1,5-kertaisiksi shTR1 /shSep15 solujen määritettynä qPCR (kuvio 4J), mutta proteiinin tasot pysyivät ennallaan (S2A kuvio).

Expression of ( A) Ifi44 mRNA (yläpaneeli) ja proteiini (alempi paneeli); (B) IRF-7-mRNA; (C) Usp18 mRNA; (D) Gbp-6-mRNA; (E) IFNy mRNA; (F) Gbp-1 mRNA (yläpaneeli) ja proteiini (alempi paneeli); (G) Stat-1 mRNA (yläpaneeli) ja proteiini (alempi paneeli); (H), Casp6 mRNA; (I) Casp12 mRNA; ja (J) AFP-mRNA: n. Ilmentyminen mRNA ohjaus, shSep15, shTR1, ja shTR1 /Sep15 soluista määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR, ja ilmaistu suhteessa

GAPDH

. Pylväät, keskiarvo (

n

= 3-6); baaria, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001). Proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blotting, ja ilmaistu suhteessa p-aktiini tai α-tubuliinin, kuten on osoitettu.

microarray analyyseja, geenien merkittävästi muuttunut ilmentyminen shTR1 soluissa verrattuna kontrolleihin (S2 taulukko) sisältyy kemokiinireseptori-1-tyypin (

CCR1

, 9,0-kertaisesti), joka oli myös lisääntynyt shTR1 /shSep15 soluja (5,1-kertainen), ja poikkijuovaisten edullisesti ilmennetyn geenin (

Speg

5,8-kertainen), jonka tiedetään inhiboivan solujen lisääntymistä [26]. Myöhemmät qPCR-analyysit osoittivat noin kaksi-kertainen nousu Speg mRNA ilmaisun shTR1 soluissa kontrolleihin verrattuna (

P

= 0,09, kuvio 5A), ja ainoa merkittävä nousu CCR1 mRNA ilmaisun shTR1 /Sep15 soluja verrattuna tarkastukset (

P

0,001, kuvio 5B). MRNA-tasot solusyklin säädin

Ccnb1ip1

, joka oli myös aikaisemmin raportoitu dramaattisesti lisääntynyt shSep15 CT26-soluja [18], lisääntyivät myös shTR1 soluissa (

P

0,01, kuvio 3F). Usp18 mRNA ilmaisu, joka microarray analyysit tunnistettu 16-kertainen (

P

= 0,09) in shTR1 soluissa, olivat myös huomattavasti (

P

0,05) kuin validoitu qPCR (kuvio 4C). Merkittävät geeni muutokset shTR1 soluissa mukana ne osallistuvat DNA: n korjaukseen, redox sääntely, ATP-sitova kasetti liikenne, ubikitinaation ja syöpään liittyvien reittejä.

mRNA tasoja (A) Speg; (B) CCR1; ja (C) Tnc; ja (D) APC valvonta, shSep15, shTR1, ja shTR1 /Sep15 soluihin, määritettynä reaaliaikaisen RT-PCR, ja ilmaistu suhteessa

GAPDH

. Pylväät, keskiarvo (

n

= 3-6); baaria, SE; (

** P

0,01,

*** P

0,001).

Yhdistetty säätely alaspäin Sep15 ja TR1 johti melko odottamaton muutokset. Microarray analyysit paljastivat, että kaikkein ajan geenien, jotka olivat yksinomaan muuttunut shTR1 /shSep15 soluja (S2 taulukko) verrattuna verrokkeihin Tenaskiini (

Tnc

, 9,0-kertainen) ja mitogeeni-säännelty prolaktiini-perhe -2 alaperheeseen-c-jäsen-2 (

Prl2c2

, 7,5-kertainen). Merkittävät ylössäätöä Tenaskiini mRNA (

P

0,01) myöhemmin varmistettiin qPCR (kuvio 5C). IPA suoritettiin varten 984 geeniä signaaleja, jotka olivat merkitsevää eroa shTR1 /shSep15 ja valvontaa, mutta eivät eronneet kummassakaan yhden pudotus soluja vastaan ​​kontrollit. Kaksi verkkoa mukana

APC /Wnt /β-kateniinin

reittejä tunnistettiin (S3B ja S3C kuvassa), joka voi kompensoida yhdistetyn menetystä Sep15 ja TR1. Mielenkiintoista tenaskiiniin oli epäsuorasti verkottunut

Wnt

(S3C kuvio). Ilmentymistasojen adenomatoottisen polypoosin coli-geeni (

APC

, S3B kuviossa) ja negatiivinen säätelijä wingless-tyyppi (

Wnt

) geenit,

Axin1

, olivat merkittävästi mutta vain hieman alennettu (1,4-kertaiseksi) mikrosirulähestymistavassa analyysit. Myöhemmät qPCR ei havaittu eroja

APC

mRNA: n ilmentymisen keskuudessa konstruktioita (kuvio 5D). Muut

Wnt

tyyppinen geenejä (

e

.

g

.,

Wnt10a

) ja β-kateniinin-vuorovaikutuksessa proteiini-1 (

Ctnnbip1

) olivat merkittävästi säädelty (1,9-kertaiseksi ja 1,6-kertaiseksi) mikrosirulähestymistavassa analyysit. Kuitenkin proteiinin tasot fosforyloitua β-kateniinin itse, analysoituna kautta Western blotting, ilmestyi ennallaan (S2B kuvio).

Sep15 ilmentyminen korreloi negatiivisesti Stat-1 /Stat-2 ja Usp18 NCI-60 cell linjat

NCI-60 solulinjoissa, CellMiner korreloivat negatiivisesti (

P

0,05) mRNA ilmentymä Sep15, mutta ei TR1, jossa Stat-2 (Pearsonin kerroin: -0,29) ja kanssa Usp18 (Pearsonin kerroin: -0,43), toiseksi korkein säädelty geeni signaalia soluissa, joista puuttuu Sep15. Vertailu solulinjan allekirjoitusten paljasti, että vastakkaisiin suuntiin mRNA transkriptin intensiteetin tulokset (z-arvoja) ja Sep15 ja Stat-1 (kuvio 6) oli erityisen merkittävä (r = -0,65,

P

0,01) varten ihmisen syövän solulinjat, jotka ovat peräisin keskushermoston, leukemia ja munasarjojen syöpien. Stat-1-proteiinin tasot NCI-60 solulinjat tukenut negatiivinen korrelaatio Sep15 mRNA ilmaisu (kuvio 6).

Vastakkaiset suunnat transkriptin intensiteetin tulokset (z-arvoja) ja Sep15 ja Stat-1 mRNA: t olivat erittäin merkitsevä (r = -0,646,

P

0,01) ihmisen keskushermostoon (CNS), leukemia ja munasarjasyövän solulinjoissa. Mean keskitetty keskimääräinen proteiinin aktiivisuuden kaavoja Stat-1 (Stat-1_20 aine) korreloi merkittävästi (r = 0,661,

P

0,01) ja Stat-1 mRNA: n ilmentymisen.

Keskustelu

Tavoitteenamme on ollut ymmärtää roolit selenoproteins Sep15 ja TR1 syövän aloittamisen ja kehittämisen [8,11,17-19,27]. Nykyinen tutkimus altistuvat odottamatonta monimutkaisuutta ja vuorovaikutukset näiden kahden selenoproteins niiden sääntelyä paksusuolen syöpä. Valossa lisääntymisen hyödyt seleenin saanti löytyy paksusuolen syövän ehkäisyyn [28,29], ja kiistelty tuloksia viime ihmisen kliinisessä tutkimuksessa VALINTA [30], jossa mitään hyötyä havaittiin, tuloksemme ovat erityisen merkityksellisiä ruokavalion seleeni syöpä -preventive ominaisuudet välittyy ensisijaisesti selenoproteins [31].

selenoproteins Sep15 ja TR1 on tärkeä rooli solujen redox-homeostaasin. Erot näiden kahden järjestelmän välillä ovat selvästi ilmi

in vivo

tutkimuksissa. Täydellinen puuttuminen sytosolin TR1 on alkion tappava [12], kun taas systeeminen Sep15 puute ei johda ilmeinen fenotyyppi hiirillä muu kuin muodostumista kaihi [32]. Kohdennettu alassäätöä näiden kahden geenin tarjoaa tehokkaan keinon tutkia niiden toiminta, sääntely ja vuorovaikutusta. Tuloksemme hiiren koolonkarsinoomasoluissa osoittavat, että erot solukierron säätelyssä saattanut osittain vaikuttaneet peruutukset havaitun syövän fenotyyppejä. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia nostattamaan tämä fenotyyppi näyttää vaihtelevan välillä soluja, joista puuttuu Sep15 versus joilta puuttuu TR1. Sep15 puutos on aiemmin havaittu estävän solujen lisääntymistä hiiren [18] ja ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [19], mutta ei hiiren keuhkosyöpään soluihin [18]. Sen sijaan ei ole TR1 vähensi kasvua hiiren keuhkosyöpään soluihin [17]. (

P

0.05).

doi:10.1371/journal.pone.0124487.s005

(DOCX)

Acknowledgments

We