Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin eturauhassyövän (PCA) saavalle potilaalle androgeeniablaatio hoitoa lopulta kehittää kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC). Raportoimme aikaisemmin, että androgeenireseptorin hoito estää Skp2 ja c-Myc kautta androgeenireseptoria (AR) ja indusoi G1 solukierron pysähtymisen androgeeni-riippumaton LNCaP 104-R2 soluja, myöhäisessä vaiheessa CRPC solulinjassa malli. Kuitenkin mekanismi androgeeni asetuksen Skp2 in CRPC soluissa ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa tutkimme androgeeni sääntely Skp2 kahdessa AR-positiivisten CRPC solulinjan malleissa LNCaP 104-R1 ja PC-3

AR Solut. Entinen yksi on alkuvaiheessa androgeenista riippumaton LNCaP, kun taas myöhemmin yksi on PC-3-solujen uudelleen joka joko villityypin AR tai mutantti LNCaP AR. Leviämisen LNCaP 104-R1 ja PC-3

AR soluja ei ole riippuvainen, vaan on tukahdutti androgen. Olemme tässä tutkimuksessa havaittu, että androgeeni vähensi proteiinin ilmentymistä Cdk2, Cdk7, sykliini-A, sykliini H, Skp2, c-Myc, ja E2F-1; vähentynyt fosforylaatiota Thr14, Tyr15, ja Thr160 on Cdk2-; vähentynyt aktiivisuus Cdk2; aiheuttama proteiinin taso p27

Kip1; ja aiheutti G1 solukierron pysähtymisen LNCaP 104-R1 solut ja PC-3

AR soluja. Yli-ilmentyminen Skp2 proteiinin LNCaP 104-R1 tai PC-3

AR-solujen osittain tukossa kertyminen p27

Kip1 ja lisääntynyt Cdk2- mukaista toimintaa androgen hoito, joka osittain tukossa androgeeni tukahduttava vaikutus proliferaatioon ja solusyklin. Analysoida on-line-geenin joukko dataa 214 normaalisti ja PCa näytteitä osoitti, että geeni-Skp2, Cdk2 ja sykliini A: positiivisesti korreloi keskenään, kun taas Cdk7 negatiivisesti korreloi näiden geenien. Nämä havainnot viittaavat siihen, että androgeenireseptorin tukahduttaa leviämisen CRPC solujen osittain estämällä sykliini, Cdk2-, ja Skp2.

Citation: Kokontis JM, Lin HP, Jiang SS, Lin CY, Fukuchi J, Hiipakka RA, et al. (2014) Androgeenien estää leviämisen androgeenireseptorin-Positive kastraatio hylkivät syöpäsolujen kautta CDK2, CyclinA, ja Skp2. PLoS ONE 9 (10): e109170. doi: 10,1371 /journal.pone.0109170

Editor: Allen Gao, UC Davis Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 28 elokuu 2014; Julkaistu: 01 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Kokontis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat CA58073 ja AT00850 National Institute of Health USA SL; CS-103-PP-14 (National Health Research Institutes), CA-103-SP-01 (Terveys- ja hyvinvointi), MOST 103-2325-B-400-001 (Ministry of Science and Technology) Taiwanissa CPC ja National Core Facility Program for Biotechnology Taiwan (NSC 102-2319-B-400-001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vastaava kirjailija Dr. Chih-Pin Chuu on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, kuitenkin, kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vuonna 1941 Charles Huggins raportoitu että androgeeniablaatio terapia aiheutti regressio ensiarvoisen ja metastaattinen androgeeniriippuvaisissa eturauhassyöpä (PCa) [1]. Androgeeniablaatio hoito, käyttämällä luteinisoivaa hormonia vapauttavaa hormonia agonistit (LH-RH) tai kahdenvälisiä orkiektomia, on tullut ensisijainen hoito metastasoituneen eturauhassyövän [2]. Valtaosa potilaista kokevat aluksi nopea lasku PSA seuraa hitaampi laskevan aallonpohjan [2]. Kuitenkin 80-90%: lla potilaista kehittyy lopulta kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) 12-33 kuukautta sen jälkeen, kun androgeeniablaatio hoidon mediaani eloonjäämisaste 12-24 kuukautta [3]. Androgeenireseptorin (AR) näyttelee tärkeä rooli kehitettäessä, eteneminen, ja etäpesäkkeitä eturauhassyövän [4]. Kasvaa AR-mRNA: n ja proteiinin havaitaan CRPC kasvaimissa verrattuna ensisijaisen eturauhasen kasvaimissa [5], [6].

LNCaP on yleisesti käytetty solulinja perustettiin ihmisen imusolmukkeesta metastaattisen vaurion eturauhasen adenokarsinooma. LNCaP-solut ilmentävät androgeenireseptorin (AR) ja prostataspesifisen antigeenin (PSA) [7], [8]. Aiemmin olemme kehittäneet PCA etenemistä malliin käyttäen LNCaP. Androgeeniriippuvaisen LNCaP 104-S-soluja viljeltiin androgeeni-köyhdytettyä olosuhteet matkivat potilailla, jotka saavat androgeeniablaatio hoito [9] – [11]. Pieni populaatio kastraation-resistenttien solujen nimeltään LNCaP 104-R1 ilmennyt vasta 10 kuukautta [9] – [11]. Kun on kulunut vielä 8 kuukautta viljelemällä androgeenista köyhdytettyä väliaineessa, LNCaP 104-R1-solujen johti LNCaP 104-R2-soluja, jotka lisääntyivät huomattavasti nopeammin kuin 104-R1-soluja [10]. Leviämisen LNCaP 104-R1 ja 104-R2-solujen on androgeenista riippumaton, mutta on tukahdutti fysiologiset pitoisuudet androgeenien [9], [10], [12], [13]. LNCaP 104-R1 ja 104-R2-solut matkivat varhain ja myöhään CRPC solut, vastaavasti [14]. Sen jälkeen androgen hoito, enemmistöt LNCaP 104-R1 ja 104-R2 solujen koki G1 solu solujen pidätys ja kuoli lopulta vain pieni populaatio soluista selviytyi ja sitä jatkettiin kasvava, nimeltään R1Ad [10] ja R2Ad [15], vastaavasti. Kuitenkin leviämisen R1Ad solujen androgeeniriippuvaisissa ja voidaan ohjata androgeeniablaatio hoito [12], kun taas lisääntymistä R2Ad solujen androgen-herkkä ja ei vastaa edelleen hormonihoito [15]. Siksi potilas varhaisvaihetta CRPC kasvaimet voivat hyötyä androgen hoitoon. Raportoimme aikaisemmin, että androgeenireseptorin hoito estää S-vaiheen kinaasi liittyvä proteiini 2 (Skp2) ja c-Myc kautta AR LNCaP 104-R2 soluja, mikä asiakkuutta G1 solusyklin pysähtymiseen ja kasvun estäminen [15]. Onkogeeninen aktiivisuus ja androgeeni sääntely c-Myc on tutkittu perusteellisesti. Kuitenkin androgeeni sääntely Skp2 vuonna CRPC soluissa vähemmän ymmärretty.

Skp2, F-box-proteiinia, ja sen kofaktori Cks1 ovat alustan kohdistamisen alayksiköt SCF (Skp1 /Cul1 /F-box-proteiini) ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen. SCF on E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen, joka säätelee S vaihe solunjakautumisen indusoimalla hajoamisen sykliiniriippuvaisen estäjät p21

CIP1 ja p27

Kip1 [16], [17]. Skp2 tavoitteet p27

Kip1 fosforyloimalla p27

Kip1 at T187 varten ubikinaation ja hajoaminen [18] – [20]. Skp2 muodostaa stabiilin kompleksin sykliini A-sykliini-riippuvaisen kinaasin 2 (Cdk2) [20]. Skp2 fosforyloituu Cdk2- at Ser64 [20] ja Akt klo Ser72 [21]. Fosforylaatiota Ser64 ja Ser72 siitä Skp2 myötävaikuttaa vakauttamiseen Skp2 estämällä sen yhdessä APC /CCdh1 [17], [18], [20], [21]. Sekä luminaalisen ja pohjapinta epiteelisoluihin normaalissa eturauhasessa näytteille hyvin alhainen Skp2 tasot kuitenkin Skp2 taso kasvaa dramaattisesti sekä eturauhasen epiteelinsisäisen kasvain (PIN) ja PCa [22], [23]. Up-regulation Skp2 korreloi alentaa p27

Kip ilme, korkeammat Gleason pisteet, ja kehittyneempiä patologinen vaiheessa PCa [22], [24]. Up-regulation Skp2 PCA on myös itsenäisesti liittyy suurempi riski Eturauhassyövän uusiutuminen leikkauksen jälkeen [22], [24]. Skp2 yliekspressio PCa soluissa stimuloi PCa solujen lisääntymistä ja kasvattaa tuumorigeneesiä vierassiirrekokeissa tuumorin malli [25].

Cdk2 on jäsen sykliiniriippuvaisen kinaasin perheen Ser /Thr-proteiinikinaasien [26]. Complex Cdk2-sykliini E tarvitaan solujen siirtymistä G1 S-vaiheeseen, sitovat välillä Cdk2- ja sykliini A täytyy edetä S-faasin [26]. Aktivointi Cdk2 komplekseja edellyttää defosforylointia Thr14 ja Tyr15 on Cdk2- mukaan cdc25 fosfataasi ja fosforylaation Thr160 on Cdk2 [26], [27], mikä välittyy CAK, monimutkainen Cdk7 ja sykliini H [28]. Sykliini A on jäsen sykliiniperheeseen, ryhmä proteiineja, jotka toimivat säätelyssä etenemistä solusyklin läpi. Transkriptio sykliini A tiukasti säädeltyä ja synkronoitu solusyklin etenemisen mukaan transkriptiotekijä E2F on negatiivinen kierre [29].

LNCaP-solut ilmentävät mutantti AR (T877A), joka näyttää rento ligandia sitova spesifisyys [30 ], [31], me täten syntyvää AR-positiivisia PC-3-solut yli-ilmentämällä joko villityypin AR (PC-3

AR) tai LNCaP mutantti AR (PC-3

LNCaP-AR) AR-negatiivinen PC-3-soluja, kuten muut CRPC solun kiinnityksiä. Käytimme LNCaP 104-R1 solut, malli matkii alkuvaiheessa CRPC sekä PC-3

AR ja PC-3

LNCaP-AR solujen tutkimaan androgeeni sääntely Skp2 ja liittyvien sykliiniriippuvaisten kinaasien ( CDK: t) sekä soluproliferaation näissä CRPC soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Synteettinen androgen R1881 ja antiandrogeeni Casodex (bikalutamidi) saatiin Perkin Elmer (Boston , MA, USA) ja Astrazeneca (Wilmington, DE, USA), tässä järjestyksessä. [A-

32P] dCTP (3000 Ci /mmol) ja [g-

32P] ATP: tä (5000 Ci /mmol) oli yhtiöstä Amersham (Arlington Heights, IL, USA). Peptidit syntetisoitiin Chicagon yliopisto Cancer Research Center oligopeptidi synteesi laitokseen.

Soluviljely

LNCaP 104-R1 solut ja PC-3 alalinjoja olivat lahjoja tri Shutsung Liao (yliopisto Chicago, IL, USA). LNCaP 104-R1 solut olivat peräisin vanhempien androgeeniriippuvaisen LNCaP 104-S-solut, jotka oli tuotettu LNCaP FGC klooni (ATCC CRL-1740). LNCaP-104-R1-soluja ja PC-3 alalinjoja on kuvattu edellisissä julkaisuissa [10] – [13], [15], [32] – [34]. LNCaP 104-R1, PC-3, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaPAR soluja yllä DMEM 10% hiilellä erotettua FBS (CS-FBS).

Western blotting-analyysi

LNCaP 104-R1-soluja tai PC-3 alalinjoja pestiin PBS: llä ja hajotettiin 2 x Laemmli-puskuria ilman bromifenolisinistä väriainetta. Proteiinipitoisuus solulysaateista määritettiin Bradford-reagenssia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Vasta-aineen Skp2 ja p21

CIP1 /waf1 oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet sykliini E, Cdk2-, ja fosfori-Cdk2- Thr160 olivat Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Sykliini ja E2F-1 vasta-aineet olivat Milliporesta (Billerica, MA, USA). P27

Kip1 vasta-aine oli BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA). Fosfo-Cdk2- Tyr15 ja fosfo-Cdk2- Thr14 vasta ostettiin Epitomics (Burlingame, CA, USA). Cdk7 ja sykliini H olivat Abnova (Taipei, Taiwan). Detection of α-tubuliinin (Sigma, St. Louis, MO, USA) tai β-aktiini (Novus, Littleton, CO, USA) käytettiin lastaus ohjaus. SDS-PAGE Cdk2, pH-arvon säätö erottavan geelin puskuri 8,5 tarvittiin resoluutio nopeammin vaeltavat isoformi. Intensiteetti bändejä eri proteiinien määrä määritettiin Epson Stylus TX130 käyttäen YK-SCAN-IT geeli 6.1 ohjelmisto.

Soluproliferaatiomääritys

LNCaP 104-R1 soluja tai PC-3 alalinjoja ympättiin tiheys 3 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille 100 ul: lla DMEM, joka sisälsi 10% CS-FBS: ää. Proliferaatiomääritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13], [15], [33] – [39]. Kaikki lukemat normalisoitiin keskimääräiseen valvonnan edellytys kussakin kokeessa. Koe toistettiin kolme kertaa. Kymmenen kaivoja käytettiin kunkin kunnossa. Keskiarvo ja keskihajonta edustaa keskiarvon ja keskihajonnan vastaavasti tulokset kaikista 30 kaivoja kolme koetta.

virtaussytometrianalyysin

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 solua 6 cm ruokia. Virtaussytometriset määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13], [15], [35] – [37], [39].

Real-Time Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio

Kokonais-RNA oli eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja käsiteltiin DNaasi I: llä (DNA-free; Ambion, Austin, TX). Käänteistranskriptio suoritettiin sattumanvaraisia ​​heksameerejä ja Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Omniscript, Qiagen, Valencia, CA). TaqMan-aluke /koetin suunniteltiin käyttäen Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). 5′-päässä koettimen leimattiin reportteri-fluoresoivalla värillä FAM. 3 ’pää koetin leimattiin vaimenninväri TAMRA. Sekvenssit CDKN1B alukkeita, 5’-CCGGTGGACCACGAAGAGT-3 ’ja 5′-GCTCGCCTCTTCCATGTCTC-3′; CDKN1B koetin, 5’-AACCCGGGACTTGGAGAAGCACTGC-3 ’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI PRISM 7700-järjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen QuantiTect Probe PCR (Qiagen). RRNA valvonta Kit (Applied Biosystems) käytettiin normalisoimaan transkriptitasot näytteiden välillä.

eristäminen Skp2 cDNA

Skp2 cDNA eristettiin PCR-monistuksella peräisin LNCaP 104-R1 Lambda ZAP- II cDNA-kirjasto käyttäen seuraavia alukkeita, jotka ovat peräisin Skp2 sekvenssi: 5′-CAGCTCTGCAAGTTTAATGC-3 ’ja 5′-AAGAAGAGACACCATCCTGC-3’. Seuraavaa ohjelmaa käytettiin: pre-vahvistus 94 ° C: ssa 5 min, 55 ° C 2 min, 30 sykliä 72 ° C 2 min, 94 ° C 0,5 min, 55 ° C 0,5 min, minkä jälkeen 7 min 72 ° C. Pfu (Stratagene) käytettiin DNA-polymeraasia ja dimetyylisulfoksidia 10% lopullinen konsentraatio käytettiin monistusreaktio. 1345 bp monistettu tuote insertoitiin EcoRV-digestoituun pBluescript II -vektoriin automaattisen dideoksi-sekvenssianalyysillä. Yksi Skp2 klooni valittiin sekvenssin varmistamiseksi ja käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa. Skp2 cDNA siirrettiin tämän pBluescript klooni on pMV7 retrovirusvektori konstitutiivista ilmentämistä varten LNCaP-104-R1-soluja.

Stable infektoimalla retroviruksia Skp2

104-R1-solut infektoitiin pMV7 retrovirus sisältävät Skp2 inserttejä, jotka on tuotettu ΦNX-Ampho pakkaus- soluihin, käyttäen aikaisemmin kuvattua [10]. ΦNX-Ampho pakkaus solulinja saatiin Garry Nolan Stanfordin yliopiston. Pysyvästi infektoituja soluja valittiin G418: aa.

ilmentäminen GST-Skp2 proteiinin

Smal-Hindlll-fragmentit Skp2 cDNA insertoitiin Smal-Hindlll-cut pGEX-KG [40]. Plasmidit transfektoitiin E. coli BL-21-CodonPlus-RIL-soluja (Stratagene) ja isopropyyli-tiogalaktosidi indusoima glutationi rikin transferaasin (GST) -Skp2 fuusioproteiineja.

In vitro

määritys Cdk2 aktiivisuuden

Solulysaatit valmistettu LNCaP 104-R1 infektoiduissa soluissa MV7 tyhjä virus ja LNCaP 104-R1-solut yli-ilmentävät Skp2 kasvatettiin 3 päivää, kun läsnä tai poissa ollessa 10 nM R1881. Määritys Cdk2 aktiivisuuden käyttäen histoni H1 substraattina oli kuvattu aiemmin [10]. CDK2 fosforylaation synteettistä Skp2 peptidin, kaksi 12 tähteen peptidiä (GHPESPPRKRLK ja GHPEAPPRKRLK), jotka vastaavat asemia 60-71 villin tyypin Skp2 proteiinia ja käytettiin substraatteina kinaasin reaktioihin Immunopresipitoidun Cdk2. Solulysaatit valmistettu LNCaP 104-R1-soluja kasvatettiin 4 päivää, kun läsnä tai poissa ollessa 10 nM R1881. Eriä lysaattia (1 mg kokonaisproteiinia), joka valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [10], inkuboitiin 2 mg Cdk2 sitoutunut vasta-aine proteiini G-agaroosilla helmiä. Pesun jälkeen 3 kertaa lyysipuskurissa ja 2 kertaa kinaasipuskurissa (50 mM HEPES, pH 7,5; 10 mM MgCI2: ta, 0,5 mM DTT: tä ja 0,02% Triton X-100), helmiä inkuboitiin 10 mCi [g-32P] ATP: tä ja 20 mM peptidiä kokonaistilavuudessa 25 ml 30 min ajan 30 ° C: ssa. Reaktiot lopetettiin lisäämällä 3 ml 0,5 M EDTA ja 10 ml: n eriä täpliksi 2,5 cm P-81 suodatuskiekot (Whatman). Levyt pestiin 5 kertaa 0,5% H3PO4 ja kerran 50% etanolia /0,05% H3PO4 poistaa rekisteröimätön ATP. Incorporated etiketti määritettiin nestetuikelaskennalla spektrofotometrisesti. Aihiot koostui kinaasin reaktioita käyttäen vasta-ladattu -agaroosihelmien ei inkuboitu solulysaattia. Reaktiot suoritettiin neljänä kappaleena.

AR ja Skp2 yli-ilmentyminen PC-3-solujen

PC-3-solut transfektoitiin LNCX-2 plasmidi, joka sisälsi ihmisen villityypin AR tai LNCaP-solujen ”mutantti AR: n cDNA ja valittu neomysiinin G418 kuten aikaisemmin on kuvattu [32]. PC-3-solut yli-ilmentävät villityyppistä AR tai LNCaP mutantti AR sitten merkitään PC-3

AR tai PC-3

LNCaP-AR. PC-3

AR-solujen lisäksi transfektoitu LPCX sisältävän plasmidin Skp2 cDNA- tai LPCX ohjaus plasmidi valittiin kanssa puromysiini. Antibiootti-resistentit pesäkkeet laajennettiin ja seulottiin lisääntynyt kohdeproteiinin ilmentymisen Western blot -analyysillä.

Julkinen tiedot

Expression profiilit valikoivan geenien aineistot, jotka sisältävät tuumorin ja viereisen normaaleissa kudoksissa PCA potilailla, lukien GSE6919 [41], joka sisältää 23 normaalissa eturauhasessa ja 89 eturauhasen syöpä kudoksia, ja Singh eturauhasen aineistot [42], joka sisältää 50 normaali eturauhanen näytteitä ja 52 eturauhasen syöpä näytteitä, jotka ladattu Oncomine (http: //www.oncomine .com) sellaisenaan.

Data Analysis

Data esitetään keskiarvo +/- SD vähintään kolmen kokeen tai ne edustavat kokeita toistettiin ainakin kolme kertaa. Studentin t-testiä (kaksisuuntainen, pariksi) käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys tulosten proliferaatioanalyysi kokeita.

Tulokset

Androgeenien hoito tukahdutti leviämisen AR-rikas CRPC solujen

Käsittely synteettisillä androgen R1881 annosriippuvaisesti tukahdutetaan solujen proliferaatiota AR-rikas LNCaP 104-R1, PC-3 yliekspressoivia villityypin AR (PC-3

AR), ja PC-3 yliekspressoivia LNCaP mutantti AR (PC -3

LNCaPAR) soluja, mutta ei määräysvaltaa AR-negatiivinen PC-3-solut (PC-3

LNCX-2) (Fig. 1A). Antiandrogeeni Casodex estetty androgeeni tukahduttaminen, joka vahvistaa, että androgeeni Solujen proliferaation estyminen oli kautta AR (Fig. 1A). Hoito 10 nM R1881 laski prosenttiosuus solupopulaation S-vaiheessa ja indusoi G1 vaihe solukierron pysähtymisen LNCaP 104-R1, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaPAR soluissa, mutta ei hallita PC-3

LNCX-2-solut (Fig. 1 B, 1 C).

(A) LNCaP 104-R1 soluja, PC-3-solujen kontrolli plasmidin LNCX-2 (PC-3

LNCX-2) PC-3-solut yli-ilmentävät villityypin AR (PC-3

AR), ja PC-3-solut yli-ilmentävät LNCaP AR (PC-3

LNCaP-AR) käsiteltiin konsentraation kasvaessa synteettisen androgeenin R1881 tai antiandro- Casodex 96 tuntia. Suhteellinen solujen määrä määritettiin fluorometrisellä DNA-määritys on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja normalisoitiin solujen lukumäärä kontrolli soluja (ei käsittelyä). LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaP-AR-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 10 nM R1881: n 96 tuntia. Prosenttiosuus solupopulaation LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaP-AR solujen S-vaiheessa (B) ja G1 vaihe (C ) määritettiin PI-värjäys virtaussytometrialla. Arvot edustavat keskiarvoa +/- keskivirhe, jotka ovat peräisin 5 itsenäisestä kokeesta. Tähdellä *, ** ja *** tarkoittavat merkittävää eroa

p

0,05,

p

0,01,

p

0,001, vastaavasti, käsitellyt solut kontrolliin verrattuna soluihin.

Androgeenien käsittely vaikuttaa solusyklin säännellä proteiinien CRPC soluissa

Androgeenien hoito hieman lisääntynyt AR ilmaisua vaan lisääntynyt dramaattisesti solusyklin estäjä p27

Kip1 LNCaP 104-R1, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaPAR soluja (Fig. 2). Päinvastaisessa, androgeeni käsittely laski proteiinin ilmentymistä Skp2, Cdk2, fosfo-Cdk2 Tyr15, fosfo-Cdk2 Thr14, fosfo-Cdk2 Thr160, Cdk7, sykliini A, sykliini H, ja c-Myc LNCaP-104-R1, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaPAR soluja (Fig. 2). Proteiini taso p27

Kip1 oli käänteinen-korreloi Skp2 näissä CRPC soluissa, mikä oli yhdenmukainen sen kanssa, että Skp2 kohdistuu p27

Kip1 varten ubikinaation ja hajoaminen [18] – [20]. Runsaasti p21

CIP1 oli hieman vähentynyt LNCaP 104-R1 soluissa, mutta lisääntyi PC-3

AR ja PC-3

LNCaPAR soluja androgen. Runsaasti E2F-1 oli hieman laskenut LNCaP 104-R1 soluissa, mutta väheni dramaattisesti vuonna PC-3

AR ja PC-3

LNCaPAR soluja androgen. Runsaasti sykliini E ei vaikuta merkittävästi androgen hoitoon. Aktivointi Cdk2 komplekseja edellyttää defosforylointia Thr14 ja Tyr15 on Cdk2- mukaan cdc25 fosfataasi ja fosforylaation Thr160 on Cdk2 [26], [27], mikä välittyy CAK, monimutkainen Cdk7 ja sykliini H [28]. Vaikka fosforylaatiota Thr14 ja Tyr15 oli hieman pieneni androgen hoitoon, fosforylaatio Thr160 oli dramaattisesti tukahdutettiin androgen hoito, mahdollisesti johtuen vähentämiseen Cdk7 ja sykliini H proteiinin ilmentymisen (Fig. 2). Androgeenien hoito lisäsi p27

Kip1, sykliini A, ja c-Myc taas laski p21

CIP1 ja Skp2 valvonta AR-negatiivinen PC-3

LNCX-2-soluissa. Koska androgeenireseptorin ei vaikuttanut leviämisen ja solusyklin etenemisen PC-3

LNCX-2-solut, roolit näiden proteiinien PC-3

LNCX-2-soluissa ei ollut selvä. Skp2 tavoitteet p27

Kip1 varten ubikinaation ja hajoaminen [18] – [20]. Kuitenkin alle hoidossa 0,1 ja 10 nM R1881, geeniekspression taso CDKN1B (p27

Kip1) kasvoi 1,3 ja 1,7 kertaiseksi (Fig. 3A). Koska c-Myc on raportoitu tukahduttaa FOXO3a-välitteisen transkription CDKN1B [43], vähentäminen c-Myc aiheuttama androgen hoito voi osaltaan lisätä CDKN1B geenin ilmentymistä (Fig. 2). Siksi olemme sitä mieltä, että vähentäminen proteiinien hajoaminen ja lisätä geenikopioinnin molemmat kasvattivat p27

Kip1 proteiinia tasolle, joka voi siis aiheuttaa G1 solusyklin pysähtymisen CRPC soluissa.

Proteiinin ilmentymistä AR, Skp2, Cdk2, fosfori-Cdk2- Tyr15, fosfori-Cdk2- Thr14, fosfori-Cdk2- Thr160, Cdk7, sykliini E, cyclinA, sykliini H, p21

CIP, p27

Kip, c-Myc, ja E2F-1 oli määritettiin Western blotting-määritys LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, ja PC-3

LNCaP-AR soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuus R1881 96 tuntia. Proteiini runsaasti α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

(A) Geenien ilmentyminen on CDKN1B määritettiin LNCaP 104-R1 solut käsiteltiin 0, 0,1 tai 10 nM R1881 96 tuntia käyttäen qRT-PCR: llä. LNCaP 104-R1-soluja käsiteltiin 10 nm R1881: n läsnä tai poissa ollessa 5 um antiandrogeeni Casodex 96 tuntia. Tähdellä * tarkoittaa merkitsevää eroa

p

0,05 käsiteltyjen solujen verrattuna kontrollisoluihin. (B) Suhteellinen solujen määrä määritettiin fluorometrisellä DNA määrityksessä. (C) Suhteellinen solupopulaation S-vaiheessa määritettiin virtaussytometrialla analysointia. Tähdellä * tarkoittaa merkitsevää eroa (

p

0,05) käsiteltyjen solujen verrattuna kontrollisoluihin. (D) histoni H1 fosforylaatiota määritettiin käyttäen Cdk2 immunosaostettiin solulysaatista, joka sisälsi 2 mg proteiinia. Suhteellinen radioaktiivisuus määritettiin skannaamalla Storm 860 phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Proteiinin ilmentymisen taso Cdk2, p27

Kip1, ja β-aktiini määritettiin Western-blottauksella samasta solulysaateista. Runsaasti β-aktiini-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus.

Androgeenien hoito tukahdutti Cdk2 aktiviteetti

Cdk2 on histoni H1 kinaasi vastuussa fosforylaation histoni solusyklin aikana siirtymistä G1-S-vaiheessa [44] – [46]. Sen varmistamiseksi, että Cdk2 aktiivisuus tukahdutettiin androgen hoitoon, käytimme histoni H1 substraattina kinaasiaktiivisuuden määrityksellä. Vähentäminen soluproliferaatiota (Fig. 3B) ja väheneminen S-vaiheessa solupopulaation (Fig. 3C) LNCaP 104-R1 solujen aiheuttama androgen hoitoon osallistuivat tiiviisti laskua Cdk2 toimintaa havaitaan väheneminen fosforylaation histoni H1, supistaminen nopeammin liikkuvasta muoto Cdk2-, ja lisäystä CDK-estäjä p27

Kip1 runsauden (Fig. 3d). Nopeammin-muuttavien Cdk2- tunnistettiin aikaisemmin aktiivisena muoto Cdk2 joka fosforyloituu Thr160 [47]. Antiandrogeeni Casodex hoito esti vaikutuksia androgen soluproliferaatioon, solusyklin fosforylaatio histoni H1, ja aktiivisuus Cdk2 (Fig. 3B, C, D).

yli-ilmentyminen Skp2 estetty androgeeni tukahduttaminen LNCaP-104- R1 solut

Skp2 fosforyloituu ja aktivoituu Cdk2- [20] sekä muodostaa stabiilin kompleksin sykliini A ja Cdk2- [20]. Olemme aiemmin raportoitu, että yli-ilmentyminen Skp2 osittain estetty leviämisen LNCaP 104-R2-soluja [15]. Tässä tutkimuksessa määritimme suhde yli-ilmentymisen Skp2 ja Cdk2- toimintaa. N yli-ilmentyminen Skp2 LNCaP 104-R1 solut vapautettiin androgeeni tukahduttamisesta Cdk2 aktiivisuuden analysoituna on

in vitro

fosforylaatiota histoni H1 immunosaostettiin Cdk2- (Fig. 4A). Mittaus kinaasiaktiivisuutta Cdk4 immunosaostumissa Näistä soluista valmistettiin eivät osoittaneet eroa (tuloksia ei ole esitetty). N yli-ilmentyminen Skp2 LNCaP 104-R1 solut osittain pelkistetyt induktion p27

Kip1 (Fig. 4A), kasvun estäminen (Fig. 4B), ja G1 solusyklin pysähtymisen (Fig. 4C) aiheuttama androgen hoitoon. Pohjapinta taso p27

Kip1 in Skp2-yli-ilmentyy 104-R1 soluissa paljon vähemmän kuin vertailuryhmän 104-R1 solut (Fig. 4A). Tämä saattaa selittää, miksi 104-R1 solut yli-ilmentävät Skp2 lisääntyneet 1,42 kertaiseksi nopeammin kuin kontrolli 104-R1 solut (Fig. 4B).

(A) Proteiinin ilmentymisen taso Skp2 ja p27

Kip1 LNCaP 104-R1 solut infektoitiin pMV7 tyhjä retrovirus (kontrolli) tai pMV7 retrovirus sisältävä Skp2 määritettiin Western blotting. Soluja kasvatettiin 3 päivää läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 nm R1881. Cdk2 aktiivisuus mitattiin

in vitro

fosforylaatiota histoni H1 avulla cdk2 immunopresipitaatit. Runsaasti β-aktiini-proteiinin käytettiin latauskontrollina. (B) Solujen proliferaatio LNCaP 104-R1: llä infektoituneet solut pMV7 tyhjä retrovirus (kontrolli) tai pMV7 sisältävää retrovirusta Skp2 käsitelty tai ei ollut 10 nM R1881: ssa 96 tuntia, määritettiin käyttäen fluorometristä DNA määrityksessä ja normalisoitiin solujen lukumäärä kontrolli ryhmän (ei käsittelyä). (C) Suhteellinen LNCaP 104-R1-soluja S-vaiheessa määritettiin virtaussytometrialla. Soluja kasvatettiin 3 päivää läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 nm R1881. Tähdellä tarkoittaa merkitsevää eroa (

p

0,05) valvonnan soluja. (D) LNCaP 104-R1-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 10 nM R1881: n ja 3 päivää. Fuusioproteiinit ohjaus GST (kaistat 1-3) ja bakteereissa ilmaistuna GST-Skp2 (kaistat 4-6) sitoutunut glutationi-agaroosi-helmiä inkuboitiin 200 ug kokosolulysaateista käsittelemättömistä ja androgeenin-käsitelty 104-R1 solujen läsnä oli 10 pCi [

32P] -ATP: tä 30 min ajan huoneenlämpötilassa. ”Nl” edustaa koska mitään lysaattia. Fosforyloidut proteiinit eluoitiin Laemmli geelilatauspuskuria ja erotettiin 10% SDS-PAGE-geeli, joka kuivattiin ja valotettiin Kodak X-OMAT AR kalvon 3 päivää. (E) 104-R1-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 10 nM R1881: n ja 3 päivää. Fosforylaatiota eluoitu GST (kaistat 1-3) ja GST-Skp2 (kaistat 4-6) fuusioproteiinit määritettiin Immunopresipitoidun Cdk2-. Cdk2 immunosaostettiin eriä lysaattia, joka sisälsi 1 mg proteiinia, valmistettiin (kaistat 2, 5 ja 8) tai R1881-käsitelty (kaistat 3, 6 ja 9) 104-R1-soluja. Ohjaus kaistat (kaistat 1, 4, ja 7) on merkitty ”ni” ei osoittanut Immunopresipitoidun Cdk2-. Cdk2 aktiivisuus määritettiin kuvattujen menetelmien Materiaalit ja menetelmät.

Androgeenien säätelee fosforylaatio Skp2 kautta cdk2

Valitettavasti, vasta-aineet havaitaan fosforylaatiota Ser64 tai Ser72 on Skp2 ei ole kaupallisesti saatavilla olevaa . Sen määrittämiseksi, onko androgen hoito vaikuttaa fosforylaatiota Skp2, inkuboimme bakteereissa ilmennetyn GST-Skp2 fuusioproteiinit sitoutunut glutationi-agaroosi-helmiä kokosolulysaateista käsittelemättömistä ja androgeenin käsitellyn LNCaP 104-R1-solujen läsnä ollessa [g-

32P] ATP. Olemme havainneet, että lysaatti androgen-käsitelty 104-R1 solut sisälsivät vähemmän kinaasiaktiivisuutta, joka kykenee fosforyloimaan 74 kDa GST-Skp2 fuusioproteiineja verrattuna lysaatti käsittelemättömissä soluissa (Fig. 4D). Tämä tulos osoitti, että androgeenien hoito vähensi kokonais fosforylaatio Skp2. Sitten tutkittiin jos Cdk2- todella fosfory- Skp2. Kun GST-Skp2-fuusioproteiineja käytettiin substraatteina kinaasin reaktioihin Cdk2 immunosaostettiin LNCaP 104-R1 solulysaateista, havaittiin samanlaiset tulokset kuin kuviosta. 4D (Fig. 4E). Tämä tulos osoitti, että Cdk2- fosforyloidun Skp2 ja toiminnan Cdk2 fosfory- Skp2 tukahdutettiin androgen hoito LNCaP 104-R1 soluissa.

yli-ilmentyminen Skp2 estetty androgeeni tukahduttaminen PC-3

AR ja PC- 3

LNCaPAR solujen

Kuten LNCaP 104-R1-solujen yli-ilmentyminen Skp2 osittain estetty annoksesta riippuvia vaikutuksia androgeeni solujen proliferaation estyminen ja solusyklin etenemisen PC-3

AR-soluja ( kuva 5).

(A) proteiinin ilmentymistä Skp2 määritettiin Western blotting in PC-3-solujen uudelleen ilmentävät villityypin AR (PC-3

AR) soluja ja yli-ilmentävät joko ohjaus vektori tai Skp2 puuttuessa tai läsnä oli 10 nM R1881: n 96 tuntia. Vaikutus androgen soluproliferaatioon (B) tai solusyklin etenemisen (C) näiden kloonien käsitelty konsentraation kasvaessa R1881 96 h määritettiin 96-kuoppaisilla lisääntymisen määrityksessä ja PI-värjäyksellä virtaussytometriseen analyysiin, vastaavasti. Tähdellä * ja ** tarkoittavat merkitsevää eroa

p

0,05 ja

p

0,01, vastaavasti, välillä hoidon ja valvonnan soluja.

korrelaatio Skp2, Cdk2, sykliini A ja Cdk7 PCA kasvaimissa

mukaan se, että ilmaus ja aktiivisuus Skp2 säätelee Cdk2- ja sykliini A PCa soluissa ja että Skp2, Cdk2-, ja sykliini A: coordinately säätelemään solujen proliferaatiota PCa-soluissa, olemme arveltu, että geeni-ilmentymisen taso Skp2 (SKP2), Cdk2 (CDK2), ja sykliini A (CCNA2) voi osoittaa hyvää positiivinen korrelaatio PCa kasvaimia. Todellakin, analysointi oncomine tulokset osoittivat, että geenin ilmentymisen taso SKP2, CDK2, ja CCNA2 korreloivat positiivisesti hyvin sekä GSE6919 [41] (Fig. 6A) ja Singh eturauhassyövän aineistot [42] (Fig. 6B). Koska fosforylaatio Thr160 on Cdk2 välittyy Cdk7 [28], päätimme jos geenin ilmentymistä CDK7 korreloi CDK2, SKP2, ja CCNA2 PCA kasvaimia. Yllättäen geeniekspressiota CDK7 korreloi negatiivisesti CDK2, SKP2, ja CCNA2 molemmissa GSE6919 [41] (Fig. 7A) ja Singh eturauhassyövän aineistot [42] (Fig. 7B).

sirontakaavioissa osoittaa korrelaatio of osoitti geenien GSE6919 (A) ja Singh eturauhasen aineistot (B). R osoittama arvo korrelaatiokerroin. Probe tunnus CCNA2, CDK2, ja SKP2 olivat 40697_at, 1792_g_at, ja 1941_at vuonna GSE6919, ja 1943_at, 1792_at, ja 39449_at Singh eturauhasen aineisto.

sirontakaavioissa osoittaa korrelaatiota osoitti geenien GSE6919 ( A) ja Singh eturauhasen aineistot (B). R osoittama arvo korrelaatiokerroin.