Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Radikaalit muutokset sekä ilmaisun ja glykosylaatiomallissa transmembraanisen musiineja on havaittu eri syöpäsairauksia. Me ja muut ovat osoittaneet, että MUC1 ja MUC4, kaksi transmembraani- musiineilla, olla Sentinel rooli solujen signalointi tapahtumia, jotka ajavat useat epiteelin pahanlaatuisia kasvaimia. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet ilmentymisen profiili MUC1 ja MUC4 ei-neoplastisten virtsarakon uroteelin, eri pahanlaatuiset kasvaimet virtsarakon ja virtsarakon karsinooman solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

immunohistokemia suoritettiin kudososat virtsarakon koepaloja, resektion näytteitä ja kudossiruina (TMA) ja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä MUC1 ja MUC4. Tutkimme myös niiden ilmentymistä virtsarakon sinoomasolulinjoja RT-PCR: lla ja immunoblottaus.

Tulokset

MUC1 ilmentyy apikaalisella pinnalla tai sateenvarjon solujen normaalien ei-neoplastisten virtsarakon uroteeliin. Voimakas ilmentyminen MUC1 havaittiin myös urothelial karsinooma (UC). MUC1 värjäys nousi normaalista uroteeliin (n = 27, 0,35 ± 0,12) ja urothelial karsinooma (UC, n = 323, H-pisteet, 2,4 ± 0,22, p≤0.0001). Toisin kuin MUC1, MUC4 ilmaistiin kaikki kerrokset ei-neoplastisten virtsarakon uroteelin (n = 14, 2,5 ± 0,28), sekä solukalvon ja sytoplasmaan. Verrattuna ei-neoplastisia uroteelin, menetys MUC4 ilmentyminen oli havaittu uroteelin karsinooma (n = 211, 0,56 ± 0,06). Kuitenkin uudelleen ilmentäminen MUC4 havaittiin osajoukko metastaattisen tapauksista urothelial karsinooma (keskiarvo H-pisteet 0,734 ± 0,9).

Johtopäätös

Ilmaisu MUC1 on kasvanut ja MUC4 laski UC verrattuna normaaliin ei-neoplastisia uroteeliin. Expression sekä MUC1 ja MUC4 ovat kuitenkin huomattavasti korkeammat urothelial karsinooma metastaattisen tapauksissa verrattuna paikallisia UC. Nämä tulokset viittaavat ero ilmaus MUC1 ja MUC4 aikana kehittymistä ja etenemistä virtsarakon syöpä.

Citation: Kaur S, Momi N, Chakraborty S, Wagner DG, Horn AJ, Lele SM, et al. (2014) Altered Expression Transmembraaniaktivaattori Musiinit, MUC1 ja MUC4, vuonna virtsarakon syövän: Sairaalloinen Implications in Diagnosis. PLoS ONE 9 (3): e92742. doi: 10,1371 /journal.pone.0092742

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 tammikuu 2014; Hyväksytty: 25 helmikuu 2014; Julkaistu: 26 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Kaur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusten National Institutes of Health (RO1 CA 138791, U54 CA163120, UO1 CA111294, ja P50 CA127297). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BCA) on viides yhteinen syöpään Yhdysvalloissa eli lähes 72570 uutta tapausta ja 15210 syöpään liittyvien kuolemien aikana 2013 [1]. Urothelial karsinooma (UC) on yleisin histologinen tyyppi BCA jonka osuus 90%: n uusien diagnosoitujen tapausten. UCS aikaan diagnoosi vaihtelevat pinnallinen huonolaatuisen papillaarinen vaurioita (liittyy parempi ennuste) erittäin invasiivisia pahanlaatuisia karsinoomia (erittäin aggressiivinen, jolla on alhainen selviytymisen). Noin 70-80% vasta diagnosoitu UCS ovat ”ei-lihas- invasiivisia” jolloin sairaus rajoittuu virtsarakon limakalvoon tai lamina prop- riaan (vaihe Ta /T1 mukaan TNM-luokitus) [2]. Noin 10% -30% näistä kasvaimista edetä ”lihas-invasiivisia tauti” ( ”high grade” UC) (vaihe T2 /T3) [2]. Heikompilaatuinen papillaarinen syövät ovat yleensä ei-invasiivisia (vain 15% hyökätä virtsarakon seinä) ja sopivat näin ollen poistettu kirurgisella. Tapauksen korkealuokkaisesta invasiivisen karsinooman liittyy suurella todennäköisyydellä etäpesäkkeiden ja kuolleisuutta [3], [4]. Sytologia ja kystoskopia kanssa kudosbiopsia- edelleen tarkin käytettävissä olevat menetelmät havaita BCA asti mennessä. Sytologia on erittäin spesifinen korkealaatuisesta urothelial karsinooma mutta ei huonolaatuista urothelial karsinooma.

Viime vuosina poikkeava muutoksia ilmaisun ja glykosylaation musiineja on raportoitu tulehdusta, syöpää edeltäviin ja pahanlaatuisten sairauksien [5 ] – [10]. Musiinit ovat glykoproteiineja, jotka ovat ominaisia ​​läsnäolo korkea O- ja N-glykosylaatio yhdessä erittäin toistuvat lyhyet osuuksilla aminohappotähdettä (kutsutaan nimellä ”peräkkäistoistot”) [9]. Nämä ovat karkeasti jakaa kahteen ryhmään eli kalvoon sitoutunut musiinien ja erittävät /geeliä muodostavat musiineja. Tärkeää on, MUC1 ja MUC4 edustavat hyvin tunnettu transmembraaninen musiineja pelaa tärkeä rooli solun fysiologiaa. Nojalla niiden rakenteen ja biokemiallinen koostumus nämä musiineilla osallistuu voitelu ja nesteytystä solun pinnan, suojaa mikro-organismit (bakteerit ja virukset) ja hajottavia entsyymejä [11]. Vaihtelu ilmaisun ja glykosylaatiomallin MUC1 ja MUC4 on havaittu useissa epiteeli- maligniteetteja, mukaan lukien haima-, rinta-, paksusuoli-, eturauhas- ja keuhkosyöpä [7], [9], [12], [13]. Ne on osoitettu olevan ratkaiseva merkitys kasvaimen kasvussa, solunsisäinen ja solunulkoinen signalointi, kasvaimen strooman vuorovaikutukset, etäpesäke, ja kestävyys kemoterapeuttisten aineiden ja immuunivalvonnan [7], [11], [12], [14]. Saatavuus erittäin spesifisiä reagensseja (

esim.

Monoklonaalisia vasta-aineita), jotkut pystyy tunnistamaan muuttaa glykomuotojen on tehnyt musiineilla houkuttelevia kohteita varhaiseen toteamiseen epiteelin syöpäsairauksia. Altered ilmaisun ja lokalisaatio MUC1 on havaittu etenemisen pahanlaatuisia kasvaimia virtsarakon [15] – [18], mutta tähän mennessä on niukasti tietoa tilasta MUC4. Kun otetaan huomioon niiden suoja- ja voiteluaineet roolit, on tärkeää arvioida niiden toimintoja terveen virtsarakon ja muutos niiden ilmaisun aikana kehittymistä ja etenemistä urothelial karsinooma.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ekspressiomalleja MUC1 ja MUC4 epäneoplas- virtsarakon uroteeliin ja pahanlaatuiset kasvaimet virtsarakon kudosten kudossiruina (TMA) ja kudosleikkeiden alkaen virtsarakon koepaloja ja resekoitu näytteitä. Lisäksi korrelaatio ilmaisu näiden musiinien ja kasvaimen (laadut 1-4) tutkittiin määritellä diagnostisia ja fysiologinen merkitys TM musiineja aikana synnyssä UC.

Materiaalit ja menetelmät

kasvainsolulinjoja ja kudosnäytteiden

Arkistoidut formaliinilla BCA otettiin kudosnäytteet University of Nebraska Medical Center kudospankille. Tarkastelussa Valituslautakunta katsoi tämän tutkimuksen, jossa on poistettu tunnistetiedot tietokantaan, jotta vapautetaan Institutional Review Board tarkastelu. Virtsarakon TMA ostettiin USA Biomax- MUC1 värjäytymistä (cat # BL802), Accumax varten MUC4 (cat # A215II) ja virtsarakon TMA (2004) (ystävällinen lahja Dr. Henry Frierson University of Virginia Charlottesville VA). IHC värjäys suoritettiin käyttäen mAb HMFG2 (anti-MUC1-vasta-ainetta, ystävällinen lahja Dr. Gendler, Mayo Clinics), ja mAb8G7 (anti-MUC4 vasta-ainetta, tuotetaan vastaan ​​tandem-toisto-peptidiä, STGDTTPLPVTDTSSV laboratoriossamme ja reaktiivisia sekä natiivin proteiinin ja peptidi) [19]. Virtsarakon sinoomasolulinjoja [T24 ja HT1376, (johdettu transitionaalista rakkosolukarsinoomaa), TCCSUP (johdettu anaplatic siirtymäkauden cell carcinoma) SCaBER (peräisin virtsarakon levyepiteelisyöpä) ylläpidettiin American Type Culture Collection (ATCC) määritelty kulttuuri johon oli lisätty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco BRL, Grand Island, NY). Kasvualustat vaihdettiin joka toinen päivä ja solut trypsinoitiin 70% konfluenssiin.

immunohistokemia (IHC) B

analysointia MUC1 ja MUC4 ilmaisun pahanlaatuiset kasvaimet virtsarakon, IHC suoritettiin edellä kuvatulla aikaisemmin TMA ja kudosleikkeiden näytteiden virtsarakon [7]. Biopsia ja resektio näytteitä urothelial karsinooma tarkisti patologit (drakmaa. S Lele, AH Horn, ja PO Wagner UNMC) vahvistaa diagnooseja ja myös valita edustavia lohkoja immunohistokemiallista analyysejä. Kudosten IHC, 4 um: n paksuisia leikkeitä leikattiin parafinoidut kudosblokeista käyttämällä kudosta mikrotomia ja liimattiin kiinni veloitetaan lasi dioja. Virtsarakon TMA ja kudoksen leikkeitä inkuboitiin yön yli 56 ° C, minkä jälkeen deparaffinization käyttäen toistettuja pesua ksyleenin (5 min kukin), minkä jälkeen nesteytys kudosten kanssa porrastettu alkoholia. Sen jälkeen nesteytys, kudokset inkuboitiin metanolista liuosta 3% H

2O

2 sammutusta endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden. Indusoidaan lämmöllä antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla näyte 0,01 M sitraattia (pH 6,0, 95 ° C) puskuria 15 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Seuraavat antigeeni haku, leikkeet blokattiin hevosen seerumilla (ImmPRESS Universal-vasta-kit, Vector Laboratories) ja 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Levyjä inkuboitiin edelleen anti-MUC1 (HMFG2 at 1:05 laimennus rikastettua supernatantti PBS: ssä), MUC4 vasta-ainetta 8G7 (1:2000 laimennus 1.8mg /ml varastoliuosta PBS: ssä) [20] yli yön 4 ° C: ssa. Neljän pesun jälkeen PBS-T: n (PBS, joka sisältää 0,05% Tween 20), leikkeitä inkuboitiin anti-hiiri-vasta-ainetta (ImmPRESS Universal-vasta-kit, Vector Laboratories) 30 minuutin ajan. ja sen jälkeen, väri kehitettiin lisäämällä 3,3′-diaminobentsidiiniä liuosta (DAB substraattipakkausta; Vector Laboratories). Punaruskea sakka osoitti positiivista Immuunireaktiivisuuden. Levyjä pidettiin vasta-värjättiin Gillin hematoksyliinillä (Vector Laboratories), vesi väkevyydeltään etanolia, minkä jälkeen ksyleeni ja asennettu VECTA-mount kiinnitysväliaine (Vector Laboratories). Kaikki objektilasit analysoitiin käyttämällä Nikon Eclipse E400 mikroskooppi (Nikon Corporation, Tokio, Japani).

Jokainen kudos ydin arvioitiin uropathologists klo UNMC arvioida läsnäolo kasvain ja pisteytystä värjäystä. Lyhyesti, jokainen paikalla kudos array luokiteltiin perustuen värjäytymisen intensiteetti asteikolla 0-3 (0-no värjäystä, 1-heikkoa värjäytymistä, 2-väli värjäystä, ja 3-voimakas värjäytyminen). Niiden positiivisten solujen jolla on tietty intensiteetti kunkin näytteen määritettiin patologit. H-pisteet [alue: 0 (ei värjäystä tahansa solu) ja 3 (kaikki solut värjäämällä korkein (3) intensiteetti] laskettiin summattu tuotteen värjäystä intensiteetti (alue: 0-3) ja osuus solut värjäystä (alue: 0-1; 0-no cell värjätään ja 1-100% cell värjätty). Kuten kohti H-pisteet polttovälin reaktiivisuus vastaa H pisteet ≤0.1, lievä reaktiivisuus (H pisteet 0,1, mutta pienempi tai yhtä suuri kuin 1,0), kohtalainen reaktiivisuus (H pisteet 1,0 mutta ≤2.0) ja voimakas reaktiivisuus (H pisteet 2,0). Jos kudosbiopsioista takia rajoitettu määrä kunkin kudostyypin (hyvänlaatuinen, karsinooma in situ ja karsinooma) läsnä dia pisteytettiin sen voimakkuuspisteet ainoa. metastasoituneen tapauksissa osat pisteytettiin H-pisteytys samanlainen kudos paikkoja.

TILASTOANALYYSI

Data analysoitiin MedCalc for Windows-versio 9.6.4.0 ohjelmisto. varten analyysin, kunkin täplän pidettiin yksittäisen näytteen. intensiteetti musiiniekspressiota pidettiin jatkuvia muuttujia, mutta tyyppi patologian [UC, levyepiteelisyöpä (SCC), adenokarsinooma tai papillaarinen karsinooma] , grade syövän pidettiin kategorisen muuttujia. P-arvo on 0,05 katsottiin merkitseväksi.

eristäminen Kokonais-RNA ja käänteistransskriptaasi-Polymerase Chain Reaction

Cellular RNA viljellyistä soluista uutettiin RNeasy Kit valmistajan ohjeiden mukaisesti ( Qiagen, Hilden, Saksa). Kokonais-RNA kvantitoitiin käyttäen ultravioletti spektrofotometri (Peqlab ND-1000; Peqlab, Erlangen, Saksa) ja laatua ja eheyttä näytteiden arvioitiin 1,5% agaroosigeelillä. 2 ug kokonais-RNA: ta kustakin BCA-solulinjan kanssa, tehtiin käänteistranskriptio käyttäen ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrälliset reaaliaikainen PCR suoritettiin MUC1, MUC4, ja β-aktiini käyttäen seuraavia alukepareja: MUC1 (forward-aluketta 5′-GAACTACGGGCAGCTGGACATC’-3 ’ja reverse-aluke 5′-GCTCTCTGGGCCAGTCCTCCTG-3’), MUC4 (forward-aluketta 5 ”-CGCGGTGG TGGAGGCGTTCTT-3 ’ja reverse-aluke 5′-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3′), ja β-aktiini forward-aluketta (5’-TGGACATCCGCAAAGACCTG-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-CCGATCCACA CGGAGTACTT-3’) (IDT Cor – alville, IA, USA).

Western-blot-analyysi

Yhteensä proteiini uutetaan BCA solulinjoista, ratkaistaan ​​ja analysoitiin immunoblottauksella standardin protokollan. Lyhyesti, solut pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: ssä, raaputettiin RIPA-puskuria (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40, pH-8,0), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja annettiin hajottamaan varten vähintään 30 minuutin ajan jäillä ajoittainen vorteksoimalla. Solut altistettiin edelleen hajoamiselle yksi jäädytys-sulatus-sykli ja sentrifugoitiin 14,000g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit poistettiin varovasti ja proteiinin pitoisuudet määritettiin Bio-Rad DC-proteiinin arviointi kit. Sillä musiinin immunoblottauksella, elektroforeesi suoritettiin 2% SDS-agaroosigeelistä käyttämällä yhtä suuret määrät proteiinia näytteiden pelkistävissä olosuhteissa. Sillä β-aktiini, SDS-PAGE (10%) ajettiin samoissa olosuhteissa. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille ja tutkittiin anti-MUC1 (1:05 ​​laimennettu mAbHMFG2 supernatantti PBS: ssä) ja MUC4 (1:1,000 laimennus mAb8G7) vasta-aineita. Inkubaation jälkeen hiiren piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK), signaalia ei havaittu, joiden elektrokemiluminesenssin reagenssilla (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

Tulokset

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus profiilia transmembraanisen musiinien (MUC1 ja MUC4) in urothelial karsinooma kudosleikkeiden kolme kudosta TMA. Edelleen ekspressiotasot näistä musiineja arvioitiin virtsarakon sinoomasolulinjoja.

MUC1 Expression Analyysit aikana pahanlaatuiset kasvaimet virtsarakon

MUC1 ilmentymistä ei-neoplastisia virtsarakon uroteeliin.

Suurin osa ei-neoplastisia virtsarakon kudosten täplät TMA (16/27 eli 59%) olivat negatiivisia MUC1 lauseke (H pistemäärä = 0). Minor polttoväli värjäytyminen havaittiin joissakin tapauksissa 4/27 (15%). Muissa paikkoja, lievä positiivisuutta havaittiin (7/27 keskiarvo H-pisteet 0,58 ± 0,29 asteikolla 0-3) (Fig. 1A). Kaiken kaikkiaan keskimääräinen H-pisteet kaikista tapauksista yhdessä havaittiin olevan 0,15 ± 0,1 (taulukko 1). Kun useimmissa tapauksissa, voimakas MUC1 värjäys rajoitettu sateenvarjo solujen heikkoa värjäystä jäljellä soluissa uroteeliin (Fig. 1A, nuolenkärki). Kuitenkin muutamissa tapauksissa, intensiivinen MUC1 värjäytymistä (4/27 eli 15%) havaittiin pintakerros uroteelin (Fig. 1 B, esitetty nuolella). Yleisesti, värjäys oli hyvin voimakasta pinnallinen sateenvarjo soluissa kuin muiden kerrosten /solujen uroteelin. Samanlainen havainto huomattiin kudosleikkeiden kerätään UNMC joka osoitti kohtalaista voimakkaaseen värjäytymisen MUC1 (N = 3, keskimääräinen intensiteetti 1,7 ± 0,58, tarkoittaa H-pisteet 1,7 ± 0,58), joka oli rajoitettu pintakerros tai sateenvarjo soluja.

Virtsarakon kasvainkudossektioista tai täplät tutkittiin anti-MUC1 mAb (HMFG2) jälkeen epäspesifinen esto hevosen seerumia. Kaikki leikkeet tutkittiin mikroskoopilla ja immunoreaktiivisuus arvioitiin punaruskea värjäystä. Edustavia mikrovalokuvia on esitetty MUC1 värjättyä epäneoplastisis- virtsarakon uroteeliin (A B), huonolaatuisen papillaarinen karsinooma (C), virtsarakon karsinooma in situ (D), ja korkean asteen kohdunkaulan syöpä (E F). Normaalissa virtsarakon uroteelin, MUC1 ilmentyminen rajoittui sateenvarjo soluja (esitetty nuolenkärki paneeli A ja suurennetun upotus) on suurin näytteistä. Joissakin näytteissä, tuppi MUC1 mukiinia havaittiin yli uroteeliin (nuoli 1 B). Matalan asteen papillaarinen karsinooma, voimakas värjäytyminen MUC1 havaittiin luminaalipinnalla uroteelin ja alemman värjäytymisen intensiteetti havaittiin muissa kerroksissa uroteeliin (C). In urothelial carcinoma in situ, MUC1 ekspressio havaittiin kaikissa kerroksissa uroteelin, kuitenkin, värjäys oli verrattain voimakkaampi soluissa lähempänä luminaaliselle rajan (D). Invasiivisen korkealaatuista urothelial karsinooma, MUC1 värjäytyminen havaittiin soluissa tunkeutuvat yksittäin (E) tai pieniksi sisällä lamina propria (F).

MUC1 ilmentymistä ei-invasiivisia papillaarisen urothelial syöpä ja urothelial karsinooma in situ (CIS).

papillaarinen syövät ovat yleensä ei-invasiivisia (vain 15% hyökätä virtsarakon seinä) ja sopivat näin ollen poistettu kirurgisella. MUC1, papillaarinen karsinooma tapausta rajoitettu kudosleikkeiden yksin, koska ei kudos paikalla TMA vastasi invasiivisia tai ei-invasiivisia papillaarisen karsinooma. Kohtalainen tai voimakas MUC1 värjäytyminen havaittiin sekä matalan ja korkean asteen papillaarinen urothelial karsinooma päässä kudosnäytteiden (keskimääräinen intensiteetti 2,9 ± 0,1 ja keskimääräinen H-pisteet 2,1 ± 0,83 asteikolla 0-3, Fig. 1 C). Voimakas värjäytyminen MUC1 havaittiin luminaalipinnalla on uroepithelium vuonna huono laatu papillaarinen urothelial karsinooma. Värjäytymisvoimakkuus ja prosentuaalinen positiivisuus kasvoi soluista pohjapinta kerroksia apikaalisella kerrosta uroepithelium (Fig. 1 C, kuvattu nuolella). Lisäksi pintakerros solut osoittivat voimakkaampaa värjäytymistä verrattuna soluihin alla uroepithelial kerros, mikä osoittaa ei-yhtenäinen solusta soluun värjäyskuvio (Fig. 1 C). Mikäli karsinooma in situ, voimakas MUC1 värjäytymistä (keskiarvo intensiteetti 2,9 ± 0,1 ja keskimääräinen H-pisteet 2,48 ± 0,74) havaittiin (N = 10) kudosleikkeiden (Fig. 1 D).

MUC1 ilme perus- ja metastaattinen urothelial karsinooma.

urothelial karsinooma tapauksissa MUC1 värjäys vaihteli no reaktiivisuus (N = 38 tai 12%), polttoväli reaktiivisuus (N = 12 tai 4%, keskimääräinen H-pisteet 0,057 ± 0,01 ) tai kohtalainen (N = 147 tai 46%, keskimääräinen H-pisteet 1,02 ± 0,05) ja voimakas immunoreaktiivisuus (N = 117 tai 37%, keskimääräinen H-pisteet 2,86 ± 0,02) (Fig. 1 E ja 1 F). Invasiivisen tapauksissa, MUC1 värjäytyminen havaittiin pesäkkeitä (yksi tai pesä solujen) läsnä papillaarilihaksessa ytimen tai lamina propriassa (Fig. 1 E ja 1 F), jakelu MUC1 samalla sekä kalvo ja sytoplasman.

MUC1 ilmentymistä havaittiin 66% (8/12) etäpesäkkeiden ensisijainen UC eri paikkoihin

eli

. vatsan, selän, luu, aivot ja imusolmukkeiden (Fig. 2E ja F). Mikäli Metastasoituneen kudosleikkeiden (n = 28), absoluuttinen ilmentyminen MUC1 havaittiin kaikissa metastaattisen tapauksissa keskiarvolla H-pisteet 1,91 ± 0,15 ja keskimääräinen intensiteetti 2,72 ± 0,45. Mukaisesti nämä tulokset, ei MUC1 ilmentymistä ei havaittu normaalissa imusolmukkeiden samalla kun metastaattisen solujen imusolmuke on positiivinen reaktiivisuus (Fig. 2E). Havaitut MUC1 ilmaisua voidaan luokitella kolmeen eri malleja luminaali solukalvojen värjäytymistä (sateenvarjo solukerrokselle) vain, luminal plus sytoplasmista värjäytymistä (väli- ja pohjapinta kerrokset) tai värjäys vain eristettyjä soluja tai solujen ryhmiä.

edustaja mikrovalokuvia esitetty MUC1 värjäytymistä levyepiteelisyöpä (A), keratiinin helmet (B), adenokarsinooma (C) mucinous adenokarsinooma (D), etäpesäke luuhun (E), metastaattinen urothelial karsinooma imusolmuke (F). Vahva kalvomainen ilmentyminen MUC1 havaittiin levyepiteelisyöpä (A) ja myös keratiini helmiä sisällä levyepiteelisyöpä (B). Molemmat mucinous adenokarsinooma (C) ja adenokarsinooman osoittivat heikkoa värjäytymistä (D) MUC1. Voimakas ilmentyminen MUC1 havaittiin metastasoituneen urothelial karsinooma luun (E) ja imusolmukkeesta (F). Suuritehoiset mieltä osoitti, että MUC1 on lokalisoitu sekä sytoplasmaan ja kalvo etäpesäkkeitä (keskiösyvyys E F).

Kuten taulukosta 2, merkittävä ero H-pisteet MUC1 värjäytyminen havaittiin luokasta 1 (0,51 ± 0,1) luokkaan 2 kasvaimet (1,62 ± 0,155). Edelleen H-pisteet MUC1 värjäystä kasvoi asteen 3 4. asteen kasvaimet.

MUC1 ilmaisun Okasolusyöpä (SCC), adenokarsinooma ja mucinous adenokarsinooma virtsarakon.

Kohtalainen intensiivistä värjäytyminen havaittiin SCC (N = 33, 65% tapauksista), joissa keskimääräinen H-pisteet 2,33 ± 0,16 (Fig. 2A), kun taas toiset osoitti vain lievää positiivisuus MUC1 (N = 18 tai 35%, tarkoittaa H -score 0,66 ± 0,11, keskimääräinen intensiteetti 1,3 ± 0,11). Kohtalainen värjäys MUC1 havaittiin keratiini helmet, jotka ovat Piirre luokka 1 okasolusyöpä (Fig. 2B esitetty nuolella). Ei ollut mitään merkittävää eroa värjäytymisen intensiteetti väliin luokka 2 (N = 6, keskimääräinen H-pisteet 2 ± 0,3) ja 3. asteen SCC (N = 12, keskimääräinen H-pisteet 3,0 ± 0,7). 12 adenokarsinoomista täplät tutkittujen, 7 osoitti heikkoa värjäytymistä MUC1 (Fig. 2C), kun taas toisissa ilme oli täysin poissa. Suurin osa kudosta täplät mucinous adenokarsinooma oli lievästi positiivinen MUC1 (keskiarvo H-pisteet, 0,62 ± 0,14) (Fig. 2D).

MUC4 Expression Analyysit aikana syöpä Virtsarakon

MUC4 ilme ei-neoplastisia virtsarakon uroteeliin.

Kun analysoidaan normaaleissa kudoksissa (N = 14), korkea ilmentyminen MUC4 havaittiin uroteeliin ei-neoplastisten virtsarakon (Fig. 3A, keskimääräinen intensiteetti 2,54 ± 0,21 ja tarkoittaa H-pisteet 2,54 ± 0,21) (taulukko 3). Ilmentymistä MUC4 (normaalissa virtsarakon uroteelin) havaittiin sekä kalvon ja sytoplasmassa epiteelin solujen voimakkaampi ekspressio solukalvon kuin sytoplasmassa. Kuitenkin, toisin kuin MUC1, värjäytyminen on MUC4 oli yhtenäinen läpi kaikki kerrokset uroteelin (Fig. 3A). Mielenkiintoista, vahva ilmaus MUC4 havaittiin jopa riippuvaiseksi aggregaatteja urothelial solujen kutsutaan ”von Brunn pesiä” (Fig. 3B, kuvataan nuolella).

Virtsarakon kasvainkudossektioista ja kudosten mikrosirujen koetettiin anti -MUC4 mAb (8G7) jälkeen epäspesifinen esto hevosen seerumia. Kaikki leikkeet tutkittiin mikroskoopilla ja immunoreaktiivisuus arvioitiin punaruskea värjäystä. Edustavia mikrovalokuvia on esitetty MUC4 värjättyä normaalien ei-neoplastisia uroteeliin (A), von Brunn pesiä (B), ei-invasiivisia papillaarisen urothelial karsinooma (C), urothelial karsinooma in situ (D), matala (E) ja korkean asteen urothelial karsinooma (F). Vahva positiivisuus MUC4 havaittiin eri kerrokseen virtsarakon uroteeliin (A). Suurennettu kuva osoittaa, että jakauma MUC4 on sekä kalvomainen ja sytoplasman. Solut von Brunn pesä solut osoittivat voimakasta membranous värjäytymisen MUC4 (B). Menetys MUC4 ilmaisun aikana havaittiin ei-invasiivisia papillaarinen karsinooma (C), ja karsinooma in situ (D). Sekä matala ja korkea laatu urothelial karsinooma osoitti menetys MUC4 ilmaisun (E F).

MUC4 ilmentymistä ei-invasiivisia ja invasiivisen papillaarinen urothelial karsinooma ja urothelial karsinooma in situ (CIS).

Vaikka rajoitetuissa tapauksissa (N = 6) noninvasiivisten papillaarinen karsinooma oli läsnä kudoksessa paikkoja, suurin osa heistä olivat täysin negatiivisia (N = 4, intensiteetti-pisteet 0), kun taas muut ovat osittainen positiivisuus (N = 2, keskimääräinen intensiteetti-pisteet 2.5). Invasiivinen papillaarisen karsinooma (N = 2) osoitti täydellisen menetyksen MUC4 ilmaisun (Intensity-pistemäärä = 0). Edelleen, täydellinen menetys MUC4 ilmentymistä havaittiin sekä ei-invasiivisia (Fig. 3C) ja invasiivisia tapauksissa papillaarisen karsinooma (N = 10, keskimääräinen intensiteetti 0,8 ± 0,41; keskimääräinen H-pisteet 0,31 ± 0,39). MUC4 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua IVY alkaen TMA (N = 4, keskimääräinen H-pisteet 0, taulukko 3) sekä kyseessä kudosleikkeiden (N = 10; keskimääräinen intensiteetti 0,3 ± 0,1; p = 0,02 ja keskimääräinen H-pisteet 0,12 ± 0,06) verrattuna ei-neoplastisia uroteeliin (Fig. 3d). Kaiken menetys MUC4 ilmentyminen oli havaittu invasiivisen ja ei-invasiivisia papillaarinen karsinooma.

MUC4 ilmaisun invasiivisia urothelial karsinooma ja etäpesäkkeitä.

Kun useimmissa tapauksissa, polttoväli ilmentyminen MUC4 havaittiin in urothelial karsinooma (N = 122 tai 58%, keskimääräinen H-pisteet, keskiarvo intensiteetti 0) kun taas muissa tapauksissa osoittivat lievä positiivisuutta (N = 89 tai 42% tapauksista, tarkoittaa H-pisteet 0,68 ± 0,14, keskimääräinen intensiteetti 0,91 ± 0,19). Kaiken menetys MUC4 ilmentymistä havaittiin sekä matalan ja korkean asteen invasiivisia urothelial karsinooma (Kuva. 3E ja 3F). MUC4 ilme oli huomattavasti säädellä vähentävästi karsinoomasoluja verrattuna ei-neoplastisia uroteeliin (keskiarvo H-pisteet ei-neoplastisia virtsarakon uroteeliin ja UC 2,54 ± 0,21 [p 0,0001], ja 0,47 ± 0,05 vastaavasti) (dataa TMA). Mielenkiintoista, verrattuna urothelial syöpä, josta puuttuu ilmentymistä MUC4, suurempi osuus metastasoituneen tapauksia todettiin olevan positiivinen MUC4. Kaikista (N = 28) metastaattinen tapauksissa 57% tapauksista (N = 16) osoittivat heikkoa lieväksi MUC4 värjäystä (keskiarvo H-pisteet 1,27 ± 0,27) (Fig. 4D-F), kun taas missään niille keskuksille ilmentymistä havaittiin 43% tapauksista (N = 12; keskimääräinen intensiteetti = 0 ja keskimääräinen H-pisteet 0,025 ± 0,02). Sekä sytoplasminen ja kalvon värjäytyminen MUC4 havaittiin eri metastaattinen tapauksissa (4D-F).

edustaja mikrovalokuvia esitetty MUC4 värjäytymistä okasolusyöpä (A), adenokarsinooma (B), mucinous adenokarsinooma (C) ja metastaattinen urothelial karsinooma imusolmuke (D B). Immunoblottauksella tutkimukset anti-MUC1-vasta (HMFG2) ja anti-MUC4 vasta-aine (8G7) osoitti ero ilmentymä MUC1 ja MUC4 in TCCSUP, HT1376 ja SCaBER solulinjoissa (kuvio. 5C). Ei ilmaus MUC1 ja MUC4 havaittiin T24 virtsarakon syöpä solulinjassa. Edelleen, eri glykomuotoja MUC4 havaittiin levyepiteelikarsinooma solulinjassa verrattuna TCC solulinjoja.

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit MUC1 (A) ja MUC4 (B) osoittivat, että kaikki virtsarakon karsinooman solulinjassa, paitsi T24 ilmentää MUC1 ja MUC4. Korkein ilmaisun sekä MUC1 ja MUC4 havaittiin kasvainsolulinja HT1376. Ilmentämiseen analyysit musiini MUC1 ja MUC4 on proteiinin tasolla, proteiini lysaatit kaikkien virtsarakon sinoomasolulinjoja erotettiin 2% agaroosigeelissä ja tutkittiin anti-MUC1 (HMFG2) ja anti-MUC4 (8G7) vasta-aineet (paneeli C) . β-aktiinin eroteltiin 10% SDS-PAGE käytettiin latauskontrollina (paneeli C). Ei ilmaus mitään musiini MUC1 ja MUC4 havaittiin T24 taas muut solulinjat ilmensivät sekä musiineja. (D) taulukkomuodossa esityksiä MUC1 ja MUC4 ilmaisun aikana virtsarakon syöpä etenemisen. Merkittävät muutokset ilmentymisen sekä MUC1 ja MUC4 aikana havaittiin etenemisen urothelial carcinoma. Progressiivinen kasvu MUC1 ilmentyminen havaittiin kautta eri vaiheissa ja laatuja virtsarakon syöpä taas ilmaus MUC4 laski sairauden etenemistä. Alaryhmässä metastaattisen tapauksissa urothelial karsinooma, ilmentyminen MUC4 havaittiin.

Kaiken musiini MUC1 ja MUC4 analyysit virtsarakon syövän TMA ja kudosleikkeiden osoittivat, että ilmentyminen MUC1 on lisääntynyt, kun taas ja MUC4 laski UC verrattuna normaaliin ei-neoplastisia uroteeliin. Expression sekä MUC1 ja MUC4 ovat kuitenkin huomattavasti korkeammat urothelial karsinooma metastaattisen tapauksissa verrattuna paikallisia UC (Fig. 5D).

Keskustelu

Aberrant ilmaisua, lokalisointi ja glykosylaatio musiineja ovat tyypillisiä tapahtumat useiden maligniteettien (haima-, munasarja-, eturauhas- ja mahalaukun, keuhkojen ja rinnan). Joukossa eri perheenjäsenet, MUC1 ja MUC4 jotka osallistuvat kasvaimen kasvuun, solunsisäinen ja solunulkoinen signalointi, kasvaimeen strooman vuorovaikutukset, etäpesäke, ja kestävyys kemoterapia-aineiden ja immuniteetin [10], [12]. Kattavat tiedot ilmentymistä näiden musiineja puuttuu urothelial karsinooma. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin ilmentymisen TM musiinien MUC1 ja MUC4 virtsarakon kudoksessa microarray, kudosleikkeiden virtsarakon sinoomasolulinjoja. Vaikka poikkeava muutoksia havaittiin ekspression ja lokalisaatio MUC1 välillä hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset tapauksissa merkittävä downregulation MUC4 aikana havaittiin urothelial carcinoma verrattuna normaaliin ja /tai hyvänlaatuinen virtsarakon kudoksissa.

MUC1 on kalvoon sitoutunut

O

glykoproteiini, joka ilmentyy pohjapinta tasolla useimpien epiteelisolujen [21]. Sääntelemättömään ilmentymiseen MUC1 on merkittävä ominaisuus erilaisten syöpien ja tulehdussairauksien.