Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

Tissue MikroRNA (miRNA) voidaan havaita syöpien ja ennustaa ennustetta. Useat viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että kudos, plasma, ja sylki miRNA samanlaiset ekspressioprofiileja. Tässä tutkimuksessa tutkimme erottelukykyä syljen miRNA (mukaan lukien koko sylki ja syljen supernatanttia) havaitsemiseksi ruokatorven syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Agilent microarray, kuusi vapautettiin miRNA kokonaisesta sylkinäytteellä seitsemästä potilaalla on ruokatorven syöpä ja kolme tervettä verrokkia valittiin. Kuuden valitun miRNA alistettiin validointi niiden ekspressiotasot RT-qPCR käyttäen sekä koko sylki ja syljen supernatantin näytteitä riippumaton sarja 39 potilaalla, joilla ruokatorven syöpä ja 19 tervettä verrokkia.

Tulokset

Kuusi miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p, ja miR-634) on identifioitu Agilent mikrosirulla. Vahvistamisen jälkeen RT-qPCR, miR-10b *, miR-144, ja miR-451 kokonaan syljen ja miR-10b *, miR-144, miR-21, ja miR-451 syljessä supernatantissa merkittävästi voimistunut potilailla, jossa herkkyydet 89,7, 92,3, 84,6, 79,5, 43,6, 89,7, ja 51,3% ja erityispiirteet 57,9, 47,4, 57,9%, 57,9, 89,5, 47,4, ja 84,2%, tässä järjestyksessä.

Johtopäätökset

Olemme löytäneet erottuva miRNA ruokatorven syövän sekä koko syljen ja sylkeä supernatantti. Nämä miRNA hallussaan erottelukykyä havaitsemiseksi ruokatorven syöpään. Koska sylki keräys on noninvasive ja kätevä, syljen miRNA lupaavia biomarkkereina havaitsemiseksi ruokatorven syöpä alueilla on suuri riski.

Citation: Xie Z, Chen G, Zhang X, Li D, Huang J, Yang C, et ai. (2013) Syljen MikroRNA lupaavina biomarkkerit paljastaa ruokatorven syöpään. PLoS ONE 8 (4): e57502. doi: 10,1371 /journal.pone.0057502

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 29 lokakuu 2012; Hyväksytty: 22 tammikuu 2013; Julkaistu: 01 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä (EY) on kahdeksas yleisin syöpä ja kuudes johtava syy syövän kuolleisuus maailmanlaajuisesti [1]. Arviolta 482300 uutta EY tapauksissa ja 406800 kuoli vuonna 2008 maailmanlaajuisesti. Esiintyvyys vaihtelee kansainvälisesti lähes 16-kertaiseksi, ja korkeimmat hinnat Etelä- ja Itä-Afrikassa ja Itä-Aasiassa ja alin Länsi- ja Keski-Afrikassa ja Keski-Amerikassa sekä miehillä että naisilla. EY on 3-4 kertaa yleisempää miehillä kuin naisilla [2]. Sen esiintyvyys on kasvanut nopeasti länsimaissa viime puolen vuosisadan [3]. Chaoshan alue Guangdongin maakunnassa Kiinassa on korkea esiintyvyys EY ( 100/100000) [4]. Kuolonuhrien aiheuttamat EY Kiinassa osuus on yli 70% kaikista EY kuolemista maailmanlaajuisesti [5].

eloonjäämiseen osuus on pieni; vain 3-5% diagnosoiduista potilaista hengissä 5 vuotta [6]. Sen sijaan eloonjäämisprosentti kasvaa 90%: lla diagnosoitiin ensimmäisen vaiheen tauti (T1N0M0), jotka tehdään kirurginen resektio [7]. Siksi varhainen diagnoosi ja hoito ovat elintärkeitä. Tällä hetkellä kliininen diagnoosi riippuu lähinnä radiologian ja endoskooppinen biopsia. Nämä testit ovat kalliita, invasiivisia tai aiheuttaa epämukavuutta potilaille, ja useimmat potilaat ovat myöhäisessä vaiheessa tauti, kun tarkka diagnoosi on saavutettu. Siksi on tarpeen yksilöidä biomarkkereiden alkuvaiheen EY.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava ilmentyminen miRNA liittyy läheisesti patogeneesiin ja syövän kehittymisen, ja miRNA niillä erottelukykyä kuin syöpä biomarkkereita [ ,,,0],8]. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että miRNA ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​syöpäkudoksessa ja plasma potilailla, joilla on EY [9], [10]. Kuitenkin miRNA ilmentyminen syljen potilaita, joilla EY ei ole vielä raportoitu. Koska laaja verenkiertoa sylkirauhaset, sylki pidetään päätelaite tuote verenkiertoa, ja molekyylit, jotka ovat läsnä plasmassa ovat myös läsnä syljessä. Niinpä sylki uskotaan peilata terveysriskiä ja heijastavat olosuhteet kuten syövät, tartuntataudit, sydän- ja verisuonitaudit,

jne

. [11]. Tissue, plasma, ja sylki miRNA samanlaiset ekspressioprofiileja [12] – [16]. Tämä tutkimus käsitti kaksi vaihetta: Discovery ja validointivaiheet. Tietojenkeruuvaiheessa, kuusi miRNA jotka väärin säädellystä voimakkaimmin koko syljen potilaita, joilla on EY: n Agilent mikrosiruanalyysillä valittiin tavoitteita. Vuonna validointivaiheessa ekspressiotasoja kuudesta kohde miRNA todensi RT-qPCR käyttäen sekä koko sylki ja syljen supernatantin näytteitä.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden koko arvio

tietojenkeruuvaiheessa mukaan Agilent mikrosirun tulosten herkkyyttä miR-144 EY oli 85,7%. Kaava otoskoko arvio oli seuraava: n =

u

α

/2P (1-P) /

δ

2

.

tässä kaavassa

n

on määrä tarvitaan,

u

α

/2 testin taso,

α on

kynnysarvon kahden tailed normaalijakauma,

P

on odotusarvo herkkyys, ja

δ

on sallittua virhettä.

mukaan kyky saavuttaa otos tutkimuksessamme päätimme arvot

α

= 0.05 (

u

α

/2 = 1,96),

δ

= 0,11, ja arvot korvattiin kaavassa. Tuloksena oli

n

= 1.96

2 x 0,857 x (1-0,857) /0.15

2 ≈38.9 = 39. Eli validointivaiheessa Tämän tutkimuksen vähimmäismäärä tapauksissa tarvitaan n ryhmässä oli 39, ja 39 tapausta valittiin. Mukaan kykyä saavuttaa otos Tutkimuksessamme oletimme suhde tapausten n ryhmän, että terve ryhmässä on 2:01. 19 tapauksessa terveissä ryhmässä valittiin.

Aihe valinta

46 koko syljen ja 46 sylki supernatantti näytteitä 46 potilaista, joilla EY ja 22 koko syljen ja 22 sylki supernatantti näytteitä ikään, sukupuoleen , ja etnisesti sovitettua terveitä yksilöitä saatiin Guangdongin General Hospital heinä 2011 ja tammikuussa 2012. Patient histopatologia tulokset vahvistettiin endoskooppinen biopsia, ja EY: n potilaista ei ollut samanaikaista orgaanista, systeemistä, tai suun sairaudet, kuten hepatiitti, diabetes,

jne

, joka voi vaikuttaa EY merkki ekspressiotasoja. Syöpä lavastus perustui UICC /TMN pysähdyspaikan järjestelmä [17]. Vaiheet I, II, ja III perustuivat histopatologia tulosten jälkeen kirurgisen resektion. Vaihe IV perustui histopatologia tuloksiin punktio koepala metastaattisen solmujen tai PET-TT tuloksia. ”N /A (Not Available)” on valittu, kun potilaat kieltäytyi lisätestejä tai hoitoja. Terveillä henkilöillä kerättiin hallinta perustuu negatiiviset terveystarkastuksen tulokset verikokeita, rintakehän röntgenkuvat, suullisia kokeita, vatsan ultraäänitutkimukset, ulosteessa on verta testaus ja digitaalinen peräsuolitutkimuksiin. Mitään näistä valvonnan oli diagnosoitu minkä tahansa syöpätyypin joko ennen tutkimusta tai aikaan näytekokoelmatodistuksen. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board ja eettisen komitean Guangdongin General Hospital. Kaikki osallistujat tarjottiin kirjallisen suostumuksen tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan ja käyttää tutkimustarkoituksiin.

Sylki kokoelma

Oppiaineet pyydettiin pidättäytymään syöminen, juominen, tupakointi, ja suun hygieniaa menettelyt vähintään 2 tuntia ennen keräämistä. Stimuloimiseen rauhas syljenerityksen koehenkilöt saivat 2% sitruunahappoliuoksella levitettäväksi kahdenvälistä taka sivupinnat kielen pumpulipuikolla 5 s 30 s välein. Sitruunahappo stimulaatio jatkettiin 30 sekunnin välein läpi koko keruumenettelyssä. Jopa 5 ml sylkeä Kustakin koehenkilöstä otettiin talteen 50 ml: n sentrifugiputkeen. Yhteensä 2 ml syljen poistettiin putkesta koko sylkinäyte. Loput 3 ml sylkinäytteellä sentrifugoitiin 3000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa pysähtymään kuorinnan soluja, ja supernatantti siirrettiin mikrosentrifugiputkiin seuraa toinen sentrifugoimalla 12000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa täysin poistaa solukomponenttien syljen supernatantin näytteitä. Koko sylki on sylkeä, jota ei ole sentrifugoitiin. se voi sisältää kuorinnan ruokatorven syöpäsolujen regurgitated alkaen ruokatorven vuoksi tukkeutumista ruokatorven kasvain. Sylki supernatantti on sylki, joka on sentrifugoitiin, ja se ei sisällä mitään kuorinnan solujen ja muiden pellettejä. Näin ollen syljen supernatanttia pidetään päätelaitteen tuote verenkiertoa ja se voi heijastaa sisäistä ympäristöä meidän bodis. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Edellä mainitun menettelyn on valmis 2 tunnin sisällä [18].

Agilent microarray vuonna tietojenkeruuvaiheessa

Koska tämä on ensimmäinen tutkimus syljen MikroRNA havaitsemiseksi EY maailmassa, me vain valitsi 10 tapauksessa suorittaa mikrosirun. Seitsemän koko sylkinäytteellä EY: n ryhmässä ja 3 Terveistä ryhmä valittiin satunnaisesti. Patologian kaikki seitsemän potilasta, joilla EY oli okasolusyöpä; yksi oli vaihe I, yksi vaihe II, 3 vaiheen III ja kaksi vaiheen IV. Kaikkiaan 923 kypsä miRNA sekvenssit koottiin ja osaksi meidän miRNA mikrosirujen suunnitteluun. Raakadataa normalisoitiin kvantiiliestimaattorilla algoritmilla, Gene Spring Software 11,0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). 6 miRNA valittiin kohteeksi, ja niiden ekspressiotasot todensi RT-qPCR on validointivaiheessa. Valinta-menetelmä oli seuraava: gTotalGeneSignal arvo Agilent microarray oli ekspressiotason kunkin miRNA. Siksi sama miRNA, pylväskaaviot vedettiin mukaan gTotalGeneSignal arvo kunkin miRNA. Valitsimme viisi miRNA: miR-144, miR-10b *, miR-451, miR-486-5p, ja miR-634, joiden arvot oli yleensä paljon suurempi tai pienempi n ryhmässä kuin terveet ryhmässä ja joka myös läheisesti liittyvät kehittäminen deseases. Samaan aikaan useat tutkimusten mukaan miR-21 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​syöpäkudoksessa ja plasma sairastavien potilaiden EY [9], [10]; gTotalGeneSignal arvo miR-21 ei näytä tätä suuntausta, mutta oli myös valittu tavoitteeksi. Palkki kaavioita 6 tavoite miRNA esiteltiin kuvassa 1 (seitsemän palkit edessä ilmaisevat gTotalGeneSignal arvon EY ryhmästä, ja 3 takana edustavat gTotalGeneSignal arvon terve ryhmä. Y-akseli edustaa arvoa gTotalGeneSignal ).

A) lukuun ottamatta näytteen 4, arvot kuuden EY ryhmän näytteet olivat korkeammat kuin kolmen terveen ryhmä näytteitä. B) lukuun ottamatta näytteen 2 arvot kuuden EY ryhmän näytteet olivat korkeammat kuin kolmen terveen ryhmä näytteitä. C) Lukuun ottamatta näytettä 10, arvot seitsemän EY ryhmän näytteet olivat korkeammat kuin kahden terveen ryhmän näytettä. D) lukuun ottamatta näytettä 10, arvot seitsemän EY ryhmän näytteet olivat korkeammat kuin kahden terveen ryhmän näytettä. E) Kaikki EY ryhmän arvot olivat pienemmät kuin kolmen terveen ryhmän. F) Useat tutkimukset ovat raportoineet, että miRNA ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​syöpäkudoksessa ja plasmassa EY potilaiden; kuitenkin gTotalGeneSignal arvo miR-21 eivät eronneet n ja terve ryhmiä. Kuitenkin se oli myös valittu tavoitteeksi miRNA.

Validation vaihe

Ilmaisu tasot 6 valitun miRNA todensi RT-qPCR käyttäen sekä 58 koko sylkinäytteellä ja 58 sylki supernatantti näytteitä 39 potilaalla, joilla EY ja 19 tervettä verrokkia. Mirvana PARIS Kit (Ambion, USA) käytettiin eristämään kokonais-RNA: 1 ml koko sylkeä tai syljen supernatantin, mukaan valmistajan protokollaa. Lopuksi, RNA eluoitiin 30 ui esilämmitettyä nukleaasitonta vettä (95 ° C) ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Laatu ja pitoisuus eristetyn kokonais-RNA määritettiin käyttäen NanodropND-1000 (Thermo Scientific, Worcester, MA), jossa arvoa OD260 /280 noin 2,0 osoittaa laadukkaita tai puhtautta. Käänteiskopiointireaktio suoritettiin ensin 11 ui seosta, joka sisälsi 2 ui RNA-uutetta, 2 ui RT-aluketta (Ribo, Kiina), ja 7 ui nukleaasitonta vettä. 11-ul seosta inkuboitiin 70 ° C: ssa 10 min ja jäissä 2 min. Seuraava, 5 ui RT-puskuria, 2 ui dNTP: tä (2,5 mM), 0,5 ui RNaasi-inhibiittoria (40 U /ul), 0,5 ui käänteistranskriptaasi (200 U /ul), ja 6 ui nukleaasitonta vettä oli lisätään 11 ​​ul: seos. Käänteiskopiointireaktio jatkettiin 42 ° C: ssa 60 min, 70 ° C: ssa 10 min, ja 4 ° C: ssa ∞. cDNA-liuosta (3 ml) monistettiin käyttäen 9 ml SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa, Kiina), 2 ui miRNA forward-aluketta, 2 ui miRNA taaksepäin-aluketta, ja 4 ui nukleaasitonta vettä lopputilavuuteen 20 ml. Kvantitatiivinen PCR ajettiin Biorad CFX96 2,1 (Biorad Biosystems), ja reaktiota Seoksia inkuboitiin 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 50 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 10 s. Lopussa PCR-sykliä, sulamiskäyräanalyysillä suoritettiin vahvistamaan sukupolven odotetun PCR-tuotteen. Asettamalla sulamiskäyrä oli 65,0-95,0 ° C portain 0,5 ° C: ssa 0,05 min + levy lukea. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Kaikki Ct-arvot olivat 36. Ilmentymistasojen kohde-miRNA normalisoitiin että miR-16. miR-16 on eniten käytetty sisäisen valvonnan microRNA kehon-neste näytteitä, kuten plasma [10], [19]. Ja mikä tärkeintä, tietojenkeruuvaiheessa ja validointivaiheen, meidän tutkimus osoitti, että miR-16 voisi vakaasti ilmaista syljessä ja toimia sisäisenä kontrollina syljen miRNA. Raakadata tietojenkeruuvaiheessa voi ladata verkkosivuilta GEO: www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/linking.html ja hakunumero on GSE41268. Methodoloy, raakadataa ja kuvia validointi miR-16 sisäisenä kontrollina meidän tutkimus esiteltiin Data S1. Kaikki ekspressiotasoja laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [20]. Lyhyesti: näyte

iΔCt

tavoite miR = näytteen

iCt

kohde miR-näyte

iCt

miR-16; Näyte

iΔΔCt

tavoite miR = näytteen

iΔCt

tavoite miR – keskiarvo ACt

tavoite miR terveen ryhmän.

Tilastollinen

Expression tasot miRNA ja iät verrattiin käyttäen Mann – Whitneyn U-testiä tai Kruskall – Wallisin H-testi. Sukupuolet verrattiin käyttämällä χ

2 testiä. Monimuuttujafunktiokehitettiin logistinen regressiomalli varten perustettiin 4 riskitekijät: tupakointi, alkoholin nauttiminen, juominen tai syöminen kuuma lämpötila, ja Chaoshanese kansallisuus. Kertoimet suhteet (syrjäisimmille alueille) on 4 riskitekijöitä laskettiin eteenpäin LR. Jokainen TAI verrattiin käyttäen χ

2 testiä. Vastaanotin-käyttöominaisuudet (ROC) käyriä käytettiin arvioimaan erottelukykyä kunkin miRNA varten erilaistumiseen potilaiden ja verrokkien. Korrelaatio Kunkin miRNA ekspressiotason välillä koko syljen ja sylkeä supernatantti analysoitiin Spearmanin korrelaatiota testin. Erot syrjivä valtuuksien kohde miRNA verrattiin menetelmällä Delong avulla MedCalc12.2.1 ohjelmistoa. Muut tilastolliset analyysit tehtiin SPSS-ohjelmiston, versio 13,0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

p

arvo 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Koko sylki profiili

Ten koko sylkinäytteellä (7 potilailta EC ja 3 välillä terveiden verrokkien) arvioitiin Agilent mikrosirulla. Kaikkiaan 923 kypsä miRNA sekvenssit koottiin ja osaksi meidän miRNA mikrosirujen suunnitteluun. Kaikkiaan 461 miRNA havaittiin koko syljestä (anturin signaali arvo on miRNA oli läsnä vähintään yksi näyte). Näistä 461 miRNA, 452 havaittiin EY näytteitä ja 391 terveillä kontrollinäytteiden. Kaikkiaan 232 miRNA havaittiin kaikissa 10 näytettä. Kaikkiaan 261 miRNA havaittiin kaikissa EY 7 näytettä, ja 243 miRNA kaikki 3 kontrollinäytteistä. Kaksikymmentäviisi miRNA osoittivat merkittäviä eroja ilmaisun EY: n ryhmän ja terve ryhmä. 6 miRNA (miR-144, miR-10b *, miR-21, miR-451, miR-486-5p, ja miR-634) alistettiin validointi niiden ekspressiotasot RT-qPCR. Määrä miRNA kunkin näytteen esiteltiin taulukossa 1.

Ominaisuudet EY potilaiden ja terveiden verrokkien in validointivaiheessa

validointivaihetta, 39 potilasta, joilla EY oli valitaan, 32 (82,1%), joista oli okasolusyöpä, 4 (10,3%) oli adenokarsinooma, ja 3 (7,7%) oli pienisoluinen karsinooma. Syöpä lavastus potilaiden EY oli seuraava: 0 (0%) oli vaiheen I, 12 (30,8%) II vaiheessa, 11 (28,2%) vaiheessa III, 10 (23,6%) IV vaiheessa, ja 6 olivat käytettävissä. Tiedot koskevat EY potilaiden ja terveiden verrokkien on esitetty taulukossa 2. Kaikki potilaat, joilla EY olivat 40-vuotiaita, pääasiassa Chaoshan Guangdong raportoitu juominen tai syöminen korkeissa lämpötiloissa, ja alkoholi juovat, ja useimmat olivat tupakoivilla miehillä. Mukaan logistinen regressiomalli, syrjäisimpien alueiden sekä Chaoshanese yksilöiden ja juominen tai syöminen korkeassa lämpötilassa oli tilastollisesti merkitsevä (41,984 ja 31,594, vastaavasti).

syrjivä voimaa koko syljen ja sylki supernatantti miRNA varten EY

ilmentymisen tasot 6 valittu kohde miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p, ja miR-634) oli vahvistanut RT- qPCR käyttäen sekä koko sylki ja syljen supernatantin näytteitä. 3 miRNA (miR-10b *, miR-144, ja miR-451) kokonaan sylkeen n ryhmästä merkittävästi voimistunut (

p

= 0,001, 0,012 ja 0,002, vastaavasti, fold-muutoksia, 58,7 , 45,6 ja 42,4, vastaavasti). Toinen 3 miRNA (miR-21, miR-486-5p, ja miR-634) ei osoittanut mitään merkittäviä eroja EY ryhmän ja terve ryhmä (

p

= 0,110, 0,078 ja 0,157, tässä järjestyksessä). ROC käyrät perustettiin arvioimaan erottelukykyä kokonaisten syljen miR-10b *, miR-144, ja miR-451; AUC olivat 0,762, 0,706 ja 0,756, tässä järjestyksessä. Optimaalinen raja-arvo tarvitaan ROC käyrä määritellä erottelukykyä. Kun Younden indeksi (Younden indeksi = herkkyys + spesifisyys -1) saavuttaa maksimiarvon, vastaava raja-arvo on optimaalinen kynnysarvon [21].

raja-arvot 3 koko syljen miRNA (miR -10b *, miR-144, ja miR-451) määritettiin olevan 0,74530111, 0,78131771, ja 0,79964271, vastaavasti. Siksi niiden herkkyydet EY havaitsemiseksi olivat 89,7, 92,3 ja 84,6% ja erityispiirteet olivat 57,9, 47,4 ja 57,9%, tässä järjestyksessä.

4 miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-21, ja miR-451) oli merkitsevästi yläreguloituja EY ryhmässä syljen supernatantit (

p

= 0,013, 0,036, 0,015, ja 0,006, vastaavasti, fold-muutoksia, 4,5, 6,7, 9,7, ja 5,4, tässä järjestyksessä; AUC, 0,702, 0,671, 0,698, ja 0,725, tässä järjestyksessä). Kaksi muuta miRNA (miR-486-5p ja miR-634) ei osoittanut mitään merkittäviä eroja EY ryhmän ja terve ryhmä (

p

= 0,211 ja 0,524, tässä järjestyksessä). Laskemalla Younden indeksi, sulku arvot 4 syljen supernatantin miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-21, ja miR-451) oli päättänyt olla 1,05078691, 8,08243248, 0,88851054, ja 8,48817219, vastaavasti. Siksi niiden herkkyydet havaitsemiseksi EY olivat 79,5, 43,6, 89,7, ja 51,3% ja erityispiirteet olivat 57,9, 89,5, 47,4, ja 84,2%, tässä järjestyksessä.

raakatietoja ekspressiotasot kohde miRNA ja tietoa tutkimuskohteet tutkimuksessamme esiteltiin Data S2. Baarissa kaavioita ekspressiotasot poikkeavasti ilmaisi syljen miRNA edellä mainitut esitettiin kuvassa 2. ROC käyrät poikkeavasti ilmaisi miRNA esiteltiin kuvassa 3.

) Koko sylki miR-10b *. B) Koko sylki miR-144. C) koko sylki miR-451. D) sylki supernatantti miR-10b *. E) sylki supernatantti miR-144. F) syljen supernatanttia miR-21. G) sylki supernatantti miR-451. miRNA ekspressiotasoja laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä. Nämä miRNA merkittävästi voimistunut EY (n = 39) verrattuna terveiden (n = 19) ryhmässä.

) Koko sylki miR-10b *. B) Koko sylki miR-144, ja C) koko sylki miR-451. D) sylki supernatantti miR-10b *. E) sylki supernatantti miR-144. F) syljen supernatanttia miR-21. G) sylki supernatantti miR-451.

vertailu AUC

Mitä suurempi AUC, näennäisesti sitä merkittävämpää erottelukykyä. Kuitenkin diagnosoida sairaus käyttäen samoja näytteitä, se ei ole riittävä arvioida erottelukykyä yksinkertaisesti vertaamalla AUC-arvot [22], [23]. Tarkasti vertailla eri AUC, käytimme menetelmää Delong kanssa MedCalc ohjelmiston versioon 12.2.1. 3 koko syljen ja 4 syljen supernatanttia miRNA pystyivät havaitsemaan EY. miR-10b *, miR-144, ja miR-451 voisi havaita EY käyttäen sekä koko sylki ja syljen supernatanttia. AUC ei osoittanut merkittäviä eroja koko syljen miR-10b * ja syljen supernatantin miR-10b *, koko sylki miR-144 ja sylki supernatantti miR-144, ja koko sylki miR-451 ja sylki supernatantti miR-451 (

p

= 0,3413, 0,7050 ja 0,6867, vastaavasti). Syrjivyys toimivalta saman miRNA kokonaan syljessä ja syljen supernatanttia eivät olleet merkittävästi erilaiset. Lisäksi AUC on 3 koko syljen miRNA (miR-10b *, miR-144, ja miR-451), jotka voivat havaita EY verrattiin kahden miRNA. Tulokset osoittivat myös, ei havaittu merkittäviä eroja [

p

= 0,2356 (miR-10b *

vs

. MiR-144), 0,8959 (miR-10b *

vs

. MiR -451), ja 0,3248 (miR-144

vs

. miR-451)]. Lopuksi AUC on 4 syljen supernatantin miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-21, ja miR-451), jotka voivat havaita EY verrattiin kahden miRNA. Tulokset osoittivat myös, ei havaittu merkittäviä eroja [

p

= 0,8251 (miR-10b *

vs

. MiR-21), 0,7699 (miR-10b *

vs

. MiR -451), 0,7102 (miR-10b *

vs

. miR-144), 0,6079 (miR-21

vs

. miR-451), 0,8729 (miR-21

vs

. miR-144), ja 0,3529 (miR-144

vs

. miR-451)]. Lopuksi syrjivä valtuudet kaikkien miRNA sekä koko syljestä ja syljen supernatanttia oli samanlainen.

korrelaatio koko syljen ja syljen supernatanttia ekspressiotasot

Koko sylki ja syljen supernatanttia kerättiin kustakin aihe. Edellä tuloksiin, miR-10b *, miR-144, ja miR-451 oli merkittävästi voimistunut sekä koko syljen ja sylkeä supernatantti EY ryhmässä. Spearmanin korrelaatiota testiä käytetään arvioimaan korrelaatiot ekspressiotasot näissä 3 miRNA välillä koko syljen ja syljen supernatanttia. Ilmentymisen määriä näitä 3 miRNA kokonaan syljen ja syljen supernatantin osoittivat merkittäviä korrelaatioita [

p

= 0,000 (miR-10b *), 0,035 (miR-144), ja 0,003 (miR-451)].

väliset suhteet miRNA ekspressiotasot ja kliiniset ominaisuudet EY potilaiden

ekspressiotasot koko syljen miR-10b *, miR-144, ja miR-451 ja sylki supernatantti miR-21, miR -10b *, miR-144, ja miR-451 ei vaikuttanut iän, sukupuolen, residenssi, ruokailutottumukset, tupakointi, alkoholin kulutus, patologia tyyppi, syöpä pysähdyspaikan, syöpä erilaistumista tai solmukohtien etäpesäkkeitä sairastavia potilaita EY (taulukko 3 ).

keskustelu

miRNA jakaa kahteen ryhmään: solun ja solun. Solunulkoisen miRNA ovat läsnä plasmassa tai muiden kehon nesteiden; niitä kutsutaan myös sekretorisen miRNA. Useissa tutkimuksissa on todettu rodun erityispiirre ja vakaa miRNA profiilit kehon nesteiden. Solunulkoinen miRNA voi olla Parakriiniset molekyylejä ja Transduct solujen väliset signaalit virratessa [24].

mekanismit kuinka miRNA tulee ruumiin nesteissä solut eivät ole selkeitä. Kaosuka

et al

. [25] mukaan miRNA vapautuu soluista säätelee neutraalin sfingomyelinaasin 2 (nSMase2). Kun keramidiin kasvaa soluissa, nSMase2 edistää miRNA vapautumista. Esto nSMase2 kemiallisen inhibiittorin GW4869 vaikeuttaa miRNA vapautumista soluista.

RNaasi on läsnä plasmassa, syljen, virtsan ja muiden kehon nesteiden. Kuitenkin useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA kehon nesteistä ovat vakaita ja pystyy vastustamaan hajoamista korkeissa ja matalissa lämpötiloissa, on vahvoja happoja ja emäksiä, ja RNaasi. Tämä on todennäköistä, koska vapaa miRNA in kehon nesteiden kääritään ylös proteiinit tai tallennettu rakkulat [26] – [28].

Sylki on monimutkainen neste, joka käsittää eritteiden pää- ja sylkirauhasten. On 450-750 pieniä lisävaruste sylkirauhasten sijaitsee kielen, suun limakalvoja, ja kitalaen ilman etuosan kovan kitalaen ja ikenet [29]. Myös laaja verenkierto nämä rauhaset; Näin ollen, molekyylien läsnä plasmassa ovat myös läsnä sylkeä, kuten proteiinit, DNA, RNA,

jne

. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että syljen molekyylit voivat havaita suun ja muiden orgaanisten ja systeemiset sairaudet. Li

et al

. [30] on raportoitu, että syljen mRNA: ita DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL-8 ja IL-1 voi havaita suusyövän enemmän accuately kuin voi plasman mRNA: t näistä geeneistä. Mbulaiteye

et al

. [31] havaitsivat, että syljen testejä voitaisiin korvata verikokeita havaitsemiseksi EB virustartunta. Myös syljen C-erbB-2 ja CA153 proteiinit voivat olla uusia biomarkkereita rintasyövän [32] – [34].

Weber

et al

. [14] raportoi miRNA profiilit 12 kehon nesteiden ja löysi enintään 458 miRNA syljessä. Patel

et al

. [35] havaitsivat, että ekspressiotasot syljen miRNA olivat stabiileja ja miRNA tasot ovat toistettavissa sisällä aiheita. Park

et al

. [15] arvioidaan sekä koko sylki ja syljen supernatanttia miRNA potilailla, joilla on suun kautta syöpä, ja samankaltaiset miRNA profiileja. He myös kertoivat, että syljen miR-125a ja miR-200a merkittävästi vaimentua ja että molemmat saattavat olla uusia biomarkkereita suusyövän.

Agilent microarray, havaitsimme ilmentymistasojen 923 miRNA 10 koko sylkinäytteellä; 461 havaittiin. Ilmaisu tasot 25 miRNA osoittivat merkittäviä eroja EY ja terve ryhmiä. Käyttämällä samaa tekniikkaa, Weber

et al

. [14] havaittu 458 koko sylki miRNA 5 terveillä koehenkilöillä. Vahvistamisen jälkeen RT-PCR, kolme kokonaista sylkeä miRNA (miR-10b *, miR-144, ja miR-451) ja neljä sylki supernatantti miRNA (miR-10b *, miR-144, miR-451, ja miR-21) merkittävästi yläreguloituja potilailla, joilla EY. Perustuen Spearmanin korrelaatiota testin koko sylki ja syljen supernatantin miR-10b *, miR-144, ja miR-451 osoitti merkittävää korrelaatiota. Erot AUC eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Tämä viittaa siihen, että syrjivä valtuudet koko syljen ja syljen supernatanttia miRNA olivat samanlaiset. Kuitenkin suurin osa potilaista, joilla EY kun sairaalaan osoitti oireita nielemisvaikeuksia, pulauttelu, tai oksentelua, ja niiden sylki saattavat sisältää kuorinnan EY soluja regurgitated päässä ruokatorvi takia ruokatorven tukos kasvain. Siksi, jos syljen miRNA testausta käytetään seulomaan EY oireettomilla potilailla, sylki supernatantti on parempi vaihtoehto, koska solun osat on poistettu.

Biagioni F,

et al

[36] osoittavat että microRNA-10b * on päällikön säätelijä rintasyövän solujen lisääntymistä ja on vaimentua in kasvaimia näytteissä verrattuna Hyväksytty peritumoural kollegansa, he myös, että palauttaminen mikroRNA-10b * ilme saattaisi olla terapeuttista lupauksen. Mutta Tutkimuksessamme miR-10b * oli voimistunut syljessä EY potilaista. Koska alkuperä kiertävän miRNA ole selvää tällä hetkellä, niiden ekspressiotasot eivät vastaa Tissular -yövoide tai solun miRNA joskus. Esimerkiksi Coulouarn

et al

[37] ja Tsai

et al

[38] kertoi, että miR-122 säädeltiin vähentävästi vuonna maksasyövän kudosten, mutta Zen ja Zhang [39] ilmoitti, että se oli voimistunut seerumissa potilailla, joilla on maksasyövän. miR-10b * oli voimistunut syljessä EY potilaista, mutta vaimentua rintasyövän kudosta. Syy voi olla yhteydessä eri ilmentymistä miR-10b * kahdessa eri syöpiä. Lisäksi, se voi olla myös yhteydessä eri jakautuminen kudoksiin ja kehon nesteisiin. Rossing

et al

. [40] mukaan miR-144 säädeltiin vähentävästi kilpirauhassyövän hoitoon kudoksessa. Sureban

et al

. [41] kertoi, että nanohiukkasten perustuva toimitus siDCAMKL-1 kasvoi microRNA-144 ja esti peräsuolen syövän kasvaimen kasvua kautta Notch-1-riippuvaisen mekanismin. Konishin

et al

. [42] on raportoitu, että ilmentymistaso plasman miR-451 lisääntyi ennen leikkausta potilailla, joilla on mahalaukun syövän ja laski leikkauksen jälkeen (AUC = 0,96). Siten niiden tiedot viittaavat siihen, että plasman miR-451 on erinomaiset erottelukykyä mahasyövän. Brenner

et al

. [43] mukaan ylössäätely kudoksen miR-451 oli ennustava huonoon ennusteeseen mahasyövän potilaille. Sen sijaan, Bandres

et ai

. [44] kertoi, että downregulation miR-451 mahalaukun tai paksusuolen syöpä kudoksiin ennusti huono ennuste. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-451 mahalaukun ja peräsuolen syövän solut pienentää solujen lisääntymisen ja lisääntynyt herkkyys sädehoitoa. Siten niiden tiedot viittaavat siihen miR-451 on tärkeä kasvaimia estävä miRNA. Viimeisenä mutta ei vähäisimpänä, Wang

et al

[45] kertoi, että ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentyminen miR-451 aiheuttaman apoptoosin ja tukahdutetaan solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden ruokatorven karsinomasolulinjassa EC9706. Lisäksi injektio miR-451 inhiboi kasvaimen kasvua ksenograftimallia ruokatorven syöpään.

miR-144 ja miR-451 on osallisena patogeneesissä sydänlihasiskemian ja ylläpito punasolujen homeostaasin. Zhang

et al

. [46] on raportoitu, että synergistisiä vaikutuksia GATA-4-välitteisen miR-144/451 cluster suojattu simuloitu iskemia /reperfuusion aiheuttama cardiomyocyte kuolema. Wang

et al

.