Krooninen sairaus

tiivistelmä

Angiogeneesi on keskeinen rooli kasvaimen kasvussa ja etenemisessä. Alhainen ilmentyminen mineraalikortikoidireseptoriin (MR) useilla pahanlaatuisia kasvaimia korreloi taudin uusiutumisen ja kokonaiselossaolo. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MR ilmentyminen on vähentynyt peräsuolen syöpä (CRC). Tässä oletamme, että vähentynyt MR lauseke voi edistää angiogeneesiä ja huono potilaan selviytymistä peräsuolen syöpäsairauksia. Kohortin CRC potilaita, analysoimme kasvain MR ilme, sen korrelaatio kasvaimen mikrovaskulaaristen tiheys ja sen vaikutusta eloonjäämiseen. Myöhemmin me kuulustelivat rooli MR angiogeneesissä in vitro mallissa, joka perustuu koolonisyöpäsolulinja HCT116, ingenierized uudelleen ilmaista fysiologisesti hallinnassa MR. CRC, vähentynyt MR ilmentyminen oli yhteydessä lisääntyneeseen mikrovaskulaaristen tiheys ja huono potilaan selviytymistä. Vuonna pchMR transfektoiduissa HCT116, aldosteronin tai luonnollinen seerumi steroidit pitkälti esti mRNA ekspressiotasoja sekä VEGFA ja sen reseptori 2 /KDR. CRC, MR aktivointi voi merkittävästi vähentää angiogeneesin suoraan estämällä säädeltyyn VEGFA ja hypoksian aiheuttaman VEGFA mRNA ilmaisun. Lisäksi, MR aktivointi vaimentaa ekspressio VEGF-reseptori 2 /KDR, mahdollisesti vaimentaa aktivoinnin VEGFA /KDR riippuvaisen signalointireitin tärkeää eloonjäämisen kasvainsolujen hypoksisissa olosuhteissa.

Citation: Tiberio.Seudun L, Nascimbeni R, Villanacci V, Casella C, Fra A, Vezzoli V, et ai. (2013) väheneminen Mineralokortikoidi- Receptor Drives angiogeenisen Pathways in peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (3): e59410. doi: 10,1371 /journal.pone.0059410

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 22 marraskuu 2012; Hyväksytty: 13 helmikuu 2013; Julkaistu: 28 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Tiberio.Seudun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen tukivat Adele ja Francesco Lonati Foundation, Brescia, Italia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mineraalikortikoidireseptoriin (MR) on tumareseptorin joka on klassisesti liittyy valvontaan ioni liikenteen epiteelisolujen, erityisesti munuaisissa ja paksusuolen. [1], [2] Tämä spesifinen aktiivisuus on keskeinen rooli säätelyssä elektrolyyttitasapainon ja verenpaine. Kuitenkin nyt tiedetään, että MR on myös ilmaistu sydänlihassoluissa, endoteelisolut ja neuronien, mikä viittaa siihen, että sillä on fysiologinen rooli useissa eri ei-epiteelisolujen. [3], [4] Klassisessa mineralokortikoidi- kohdekudoksissa, MR asuu enimmäkseen sytoplasmassa inaktiivisessa tilassa; sitoutumisen fysiologisia ligandeja kuten aldosteroni MR käy läpi konformaatiomuutoksia, dissosioituu molekyyli- chaperones ja translokoituu tumaan, jossa se säätelee ilmentymistä kohdegeenien erityisillä DNA-elementteihin. [5] On myös näyttöä siitä, että on olemassa ei-genomisia mekanismeja, jolla aktivoidaan MR vuorovaikutuksessa signalointireitin elementtejä ulkopuolella solun tumassa ja säädellä geeniekspressiota. [6] Kaikissa tapauksissa, läsnäolo eri MR isomuotojen, että erilaiset ligandin indusoiman translaation jälkeiset modifikaatiot reseptorin ja rekrytointi eri reseptoriin liittyvän korepressoreiden tai koaktivaattoreiden voi selittää solutyyppispesifisten vaikutukset MR sisällä eri mineralokortikoidireseptoreihin kohdekudoksissa. [7], [8].

Monet kirjallisuudessa tiedot osoittavat, että aldosteronisynteesiin kautta MR-riippuvainen mekanismeja, voidaan myös välittää haitallisia vaikutuksia patogeneesiin ja etenemiseen iskeemisten sairauksien, joissa angiogeneesi näyttelee tärkeä rooli pelastamiseen hypoperfused kudoksiin. [9], [10], [11] Todellakin, hoito MR antagonisteilla edistää nopeammin ja paremmin revaskularisaation pienentämisessä kudosvaurion iskeemisen raajan, mikä viittaa siihen, että aldosteronin kautta MR aktivointi, kykenee negatiivinen rooli angiogeneesissä. Tätä tulkintaa tukee lisäksi havainto, että tässä kokeellisessa ympäristössä, MR esto myös korreloi voimistunutta ilmentymistä pro-angiogeenisten tekijöiden. [12] Lisäksi aldosteroni heikentää verisuonten uudistumista luuytimestä johdettujen endoteelisolujen esisolut, prosessi eroaa angiogeneesiä, merkityksellisiä vakuudenantokiellon lähteen verenkiertoa vastauksena kriittiseen kaventuminen suuri valtimo [13].

rajattaessa molekyylitason mekanismeja adaptiivisen angiogeneesiä iskeemisten kudosten on paljastanut kriittinen rooli hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) on transkription säätelyyn koodaavien geenien angiogeenisten kasvutekijöiden, jotka välittävät uudelleen kasvua verisuonten verkkoon. [14] hypoksinen solut, aktivoitumisen heterodimeerinen transkriptiotekijä HIF-1 on pääasiassa aiheuttama puute posttranslational muutokset alfa-alayksikön (HIF-1α) happi-riippuvainen hydroksylaasin, mikä johtaa sen nopeaan hajoamiseen happiolosuhteissa . Tämän seurauksena matalan happikonsentraatiot HIF-1α on vakioitu, heterodimerizes kanssa βsubunit HIF-1β) ja sitoutuu hypoksia-vaste-elementit (HRE) in kohdegeenien [14].

Koska merkittävä ominaisuus kiinteitä kasvaimia on hypoksia, se on hyvin hyväksyttyä, että kasvain saa aikaan angiogeenisen vasteen pääasiassa seurauksena HIF-1α-ajettu kasvu angiogeenisen tekijän ilmentymistä, vaikka dysregulation, johtuen luontaisen geneettisiä mutaatioita, on myös otettava huomioon. [15] joukossa eri angiogeenisten kasvutekijöiden, erittyy sekä kasvain ja stroomasolujen ja sitä säätelee HIF-1α, VEGFA on keskeinen rooli neovascolarization syövässä. [16] Tarkemmin sanoen VEGFA on ollut mukana peräsuolen syöpä (CRC) eteneminen, on upregulated potilailla, joilla on paikallisesti sekä metastaattisen CRC. [17], [18] VEGFA ja muiden jäsenten VEGF-perheen sitoutuvat kolme liittyvän kalvoreseptoreihin (VEGFRs), eli VEGFR1 /Flt1- VEGFR2 /KDR ja VEGFR3 /Flt4, jossa VEGF-reseptori 2 /KDR Niillä on keskeinen asema välittämisessä solujen eloonjääminen, mitogeneesi ja erilaistumisen endoteelisoluissa. VEGF-reseptori 2 /KDR ilmentyy myös ihmisen syöpäsoluja, mikä viittaa siihen on voinut käyttää erityisiä rooleja. [19], [20] Todellakin, Calvani ja yhteistyökumppanit näyttöä siitä, että VEGF /KDR /HIF-1α autokriinisen silmukan sovittelee selviytymisen hypoksisissa viljelyolosuhteissa of HCT116, joka on koolonisyöpäsolulinja [21].

edellinen tutkimus kertoo, että laskua MR ilmaisu on varhainen tapahtuma CRC etenemistä ja ehdotti, että MR mahdollisesti toimii kasvaimen vaimennin. [22] Tämä käsite on yhdenmukainen viimeaikaisten raporttien, jotka osoittivat, että keuhkokasvaimia, MR ekspressiotasot verrattavissa löytyi normaalissa keuhkokudoksessa positiivisesti korreloi potilaiden eloonjäämisaika aikaa. [23] Lisäksi tutkimus CRC osoitti, että MR ali liittyy VEGF-reseptori 2 /KDR yli-ilmentymisen ja ehdotti, että ali-MR voi olla rooli angiogeneesiä kytkin kasvain. [22] Kuitenkin tähän mennessä ei ole ollut mekaaninen selitys tälle korrelaatio.

Tässä tutkimuksessa, ensin tutkittu MR ilmaisun, angiogeneesi ja potilaiden eloonjäämisen kohortin potilaista CRC ja osoittivat, että vähentynyt MR ilmaisu korreloi lisääntyneeseen mikroverisuonitiheys (MVD) ja vähenivät selviytymisen potilaalle. Sitten käytimme in vitro, joka perustuu koolonisyöpäsolulinja HCT116, geneettisesti manipuloitu ilmaista korkeita toiminnallisesti aktiivista MR, testata hypoteesia, että MR aktivaatio agonistit saattavat säädellä negatiivisesti kasvaimen angiogeneesiä. Olemme osoittaneet, että aldosteronin hoito MR-transfektoitujen HCT116-solujen vähentää ilmentymistä VEGFA mRNA, niin normoxic ja hypoksinen viljelyolosuhteet. Lisäksi osoitimme, että samat solut, aldosteroni vaimentaa ilmaus VEGF-reseptori 2 /KDR mRNA.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kolmekymmentä peräkkäisen potilailla, joille leikkaus ensisijainen satunnaista kolorektaalisyövän sisällytettiin immunohistokemian ja selviytymisen analyysejä. Kaikki potilaat ilmoitettiin ja antoivat kirjallisen suostumuksensa tutkimukseen ja anonyymiä käyttöä niiden tietojen ennen kirjoilla. Ihmisen hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Spedali Ċivili Brescian ja tutkimussuunnitelman oli mukaisesti Helsingin julistuksen hyvän kliinisen ohjeita.

MR ja CD34 immunohistokemia (IHC) ja Survival Analysis

Ensisijainen päätetapahtuma oli kasvain ilmaus MR ja CD34, molemmat arvioitiin immunohistokemiallisesti. CD34 endoteelimerkkiaineelle käytettiin, jotta voitaisiin arvioida kasvaimen mikroverisuonitiheys (MVD). [24] Seuraavia muuttujia arvioitiin voidakseen arvioida korrelaatio mainittujen päätepisteet: ikä ja sukupuoli potilaiden, paksusuolen päällä, vaihe, laatu erilaistumisen, mucinous alatyyppi, ja lymphovascular invaasio kasvaimen, tarkoituksen ja asettaminen mekaanisesti, yleistä 5 vuoden pysyvyys. Näytteitä tuumori- ja normaalissa peräsuolen limakalvo saatiin formaldehydiä kiinteä kirurgisista näytteistä. Parafiinileikkeet värjättiin hematoksyliini-eosiinilla, PAS ja PAS diastaasin. Sillä immunohistokemiallista arviointia seuraavat vasta käytettiin: MR (Ab2774, laimennus 1:250 Abcam, Cambridge, UK), kun pH 6 sitraattipuskuria hoitoa 40 minuuttia ja CD34 (CD34Ab1, laimennus 1:30 Thermo Scientific, Astmoor Runcon, UK) jälkeen 3 sitraattipuskuria pH 6 sykliä. Positiivisten solujen laskettiin kullekin potilaalle 10 HPF (HPF, x40) yksi patologi (VV), ja tulokset luokiteltiin kolmeen ekspressiotasot mukaan osuus positiivisten solujen MR ilmaus: alhainen tai MR 1+: 33%, väli- tai MR 2+: välillä 33% ja 67%, korkea tai MR 3+: 67%, CD 34 lauseke: alhainen CD34 1 + 33% , väli- tai CD34 2+: välillä 33% ja 67%, korkea tai CD34 3 +: 67%.

Solut

ihmisen koolonisyöpäsolulinja HCT116 oli ystävällinen lahja Dr G Melillo (National Cancer Institute, Frederick, MD, USA) [21]. Villityypin HCT116-solut ylläpidettiin RPMI eri pitoisuuden FCS, kun transfektoituja HCT116-soluja kasvatettiin McCoyn väliainetta, jossa eri pitoisuus hiilellä erotettua FCS tai FCS, kuten alla on kuvattu.

Plasmidit

PchMR, joka ilmaisee HMR [25] ja pFC31-luc, joka ilmaisee tulikärpäsen lusiferaasi valvonnassa tandem glukokortikoidin vaste-elementin sisältävien hiiren nisätuumoriviruksen promoottori [26] olivat ystävällinen lahja Dr. ME Rafestin-Oblin (INSERM U, Pariisi , Ranska); PRL-TK, joka ilmaisee

Renilla

lusiferaasia valvonnassa herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin promoottori hankittiin Promega; pcDNA3 ostettiin Invitrogen.

Ohimenevä transfektio

HCT116 transfektoitiin käyttäen FuGENE HD transfektioreagenssia (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. Transfektion tehokkuutta pchMR arvioitiin 24 tuntia transfektion immunohistokemiallisesti ja sen havaittiin olevan 53,5 ± 8%. Saat laaja kuvaus tästä analyysi, katso tekstiä S1.

perustaminen Hypoksia

normoksia ylläpidettiin kasvattamalla soluja 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 ilmassa. Hypoksia perustettiin pitämällä dosviljelypulloihin 37 ° C: ssa vakiovirtaus hypoksia kaasuseos koostuu 95% N

2 ja 5% CO

2 90 min kuvatulla tavalla. [27] Tämän jälkeen pullot suljettiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa haluttuun aikaan hypoksian.

Kulttuuri ja hoito ehdot pchMR-MR Transfektoituja HCT116 kasvatetuissa soluissa normoksia ja Hypoksia

Viisi tuntia transfektion jälkeen pchMR, HCT116-soluja inkuboitiin Mc Coy: n, joka sisälsi 10% hormonitonta hiilellä erotettua naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ilmassa 12 h (normoksia koetta) tai 24 h (hypoksia kokeiluja tai CoCl

2 hoitoa ). Soluja käsiteltiin sitten 3 nM aldosteroni (Sigma-Aldrich) ja /tai spironolaktoni (1 uM, annetaan 1 h ennen aldosteronin) (Sigma-Aldrich), ja inkuboitiin vielä 36 h ilmassa (normoksia), tai altistettiin 20 tunnin ajan joko alentaa hapen (hypoksia) tai 100 uM CoCl

2 hoitoa (CoCl

2). Vaihtoehtoisesti, viisi tuntia transfektion jälkeen pchMR tai pcDNA3, soluja inkuboitiin 10% FCS: ää täydennetyssä väliaineessa 48 tunnin ajan ilmassa (normoksia) tai inkuboitiin 24 tuntia ilmassa, jota seuraa altistus happipitoisuus on alhainen, 20 h (hypoksia).

kvantitatiivinen RT-PCR

RNA eristettiin ja retro- transskriboidun kuvatulla. [28] Transcript tasot analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä käytettäessä iCycler laitteessa (Bio-Rad, Milano, I) iQ SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad) olosuhteissa toimittajan suosittelemien. PCR-alukkeet, katso taulukko S1, saatiin Eurofinsille MWG Operon. Lähetti-RNA ekspressiotasoja normalisoitiin p-aktiini, jonka Q-geenin sovellus. [29] Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja PCR-tuotteet myös erotettiin 2,5% agaroosigeelissä valvontaa.

Western Blot analyysi

laaja kuvaus, katso tekstiä S1. Seuraavia vasta-aineita käytettiin havaitsemiseen: anti-ihmisen MR (laimennus 1:300, ystävällisesti lahjoitti Dr. Gomez-Sanchez, GV Sonny Montgomery VA Medical Center, Jackson, MS, USA) [30], anti-ihmisen HIF-1α ( turska. 610658, laimennus 1:800, BD Transduction Laboratories), anti-ihmisen GAPDH (sc-32233, laimennus 1:5.000, Santa Cruz).

Gene Reporter Assay

laaja kuvaus, katso teksti S1 verkossa täydentää. PchMR- tai pcDNA3- transfektoidut solut kotransfektoitiin plasmidilla, joka sisältää reportterigeenejä. Havaitsemista varten MR-ajettu lusiferaasin ilmentymistä, pFC31-luc ja PRL-TK toimi toimittaja tai coreporter geenin vektorin, vastaavasti. Tulokset on annettu normalisoitu suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus.

Immunofluoresenssikoe

laaja kuvaus, katso teksti S1 verkossa täydentää. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin anti-MR-vasta-ainetta (laimennus 1:100) ja Alexa Fluor 448 vuohen anti-hiiri-IgG, (Invitrogen). Solujen tumat vastavärjättiin DAPI. Solut kuvannetusta LSM konfokaalimikroskoopilla (Zeiss).

Tilastollinen analyysi

Yhteenvetotilasto jatkuvien muuttujien ei-normaali jakauma (arvioituna Kolmogorov-Smirnov testit) esitetään keskilinjan kun taas normaalisti jakautunut muuttujia tiivistää tarkoittaa ± SEM. Ryhmä erot analysoitiin Wilcoxonin-Mann-Whitney, Studentin t-testi tai ANOVA seurasi Bonferronin t-testi tarvittaessa. Korrelaatio ilmentymisen MR ja CD34 arvioitiin käyttämällä Cohen Kappa ja Kramer Phi testejä. Kaplan-Meier menetelmä ja logrank testiä käytettiin vaikutusten tutkimiseksi eri muuttujien eloonjäämiseen. Ei monimuuttuja-analyysi suoritettiin annettiin rajoitettu otoksen koosta ja alhainen suhde tapahtumien muuttujaa kohti. Tilastollinen analyysi on suoritettu käyttäen avoimen lähdekoodin tilastopaketilla R. Kaikki tilastolliset testit kaksisuuntaisia ​​ja suoritetaan p 0,05.

Tulokset

In kolorektaalisyöpää Potilaat Expression of mineraalikortikoidireseptoriin korreloi käänteisesti mikroverisuonitiheys ja huono ennuste

perustason kliiniset ominaisuudet ja tietoa 5-vuoden seuranta potilaan kohortin tutkimukseen sisältyvät on koottu taulukkoon S2.

pienten suonten tiheys, kuten arvioinut ilmaus endoteelimerkkiaineelle CD34, ja MR ilmentyminen arvioitiin IHC. Edustava kuvio CD34 ja MR ilmaisun CRC näytteessä verrattuna normaalin paksusuolen limakalvo on esitetty kuvassa. 1B ja 1A, vastaavasti. Tulokset vastaavat analyysit kasvaimen yksilöitä meidän potilaan kohortin perustuu suhteellisen osuuden määritys sekä CD34 ja MR positiivisia soluja eri tämän ryhmän jäsenet, osoittavat, että CD34: n ilmentyminen oli alhainen 12 potilaalla, välituotteen 2 aiheita, ja korkea 16 koehenkilöillä, kun MR ilmentyminen oli alhainen 17 aiheita, ja suuri 13 koehenkilöä (Fig. 1). Oli merkittävä käänteinen korrelaatio kasvaimen ilmentymisen CD34 ja kasvaimen ilmentymisen MR (Kramer Phi kerroin: 0,95, Cohenin kappa: -0,844, p 0,001). Ilmaisut Sekä CD34 ja MR liittyi (suoraan p 0,001, ja kääntäen p 0,001, vastaavasti) kanssa kasvaimen vaiheesta luokiteltu vaiheen I ja II toisin kuin vaiheen III ja IV. Muista kliinis-patologinen muuttujia, mikään ei ollut tilastollisesti liittyy CD34 tai MR ilme.

Yksittäisiä aluksia positiivisia CD34 lamina propria. (X20) ja (A oikea paneeli) Diffuusi ydinvoiman positiivisuutta MR crypts paksusuolen limakalvoa. (X40). (B) H (B) x20; (C), x40.

log rank -testi, yleistä eloonjäämistä havaittiin liittyvän ilmentymisen CD34 (p = 0,006), ilmaisemaan MR (p = 0,021) ( Fig. 2), ja tarkoituksena hoidon (p = 0,002). Mikään muu kliinis-patologisten muuttujia havaittiin olevan yhteydessä yleiseen eloonjäämiseen, mutta vaikutus kasvaimen vaiheen eloonjäämiseen oli raja on alueella merkittävä (p = 0,054).

VEGFA ja VEGFR2 /KDR Expression estyy mineraalikortikoidireseptoriin aktivointi on Colon Cancer solulinjaa

analysoimiseksi roolia MR angiogeneesiin in CRC ja ottaen huomioon tärkeä rooli angiogeenisten tekijöiden suoraan tuottama kasvainsolujen kasvainten synnyssä, pystytimme in vitro mallissa transfektoimalla HCT116, joka on koolonisyöpäsolulinja jossa endogeenisen MR proteiini taso oli tuskin havaittavissa (Fig. 3A, yläosa), tehokas MR geeniekspression järjestelmä (pchMR plasmidi) [25].

(A, ylempi paneeli)

MR ilmaisua.

kaikkiaan solulysaatteja villityypin ja pchMR-transfektoidut HCT116-solut analysoitiin western blotilla käyttämällä anti-MR-vasta-aineita. Ihmisen munuaissoluja (HEK293), toimi positiivisena kontrollina. Ihmisen GAPDH käytettiin proteiini latauskontrollina. Edustavia fluorograms kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta saadaan samankaltaiset tulokset esitetään (A, alapaneeli)

MR translaation jälkeiset modifikaatiot.

PchMR transfektoidut HCT116-soluja käsiteltiin 24 h 3 nM aldosteroni ja /tai 1 uM spironolaktoni vuonna Mc Coy keskipitkän 10% hiilellä erotettua FCS. Kokosolulysaateille analysoitiin Western blot käyttäen anti-MR-vasta-aineita. MR translaation jälkeiset modifikaatiot aiheuttama aldosteronin hoito on merkitty ylöspäin muutos liikkuvuutta MR. Edustaja fluorogram kolmesta itsenäisestä kokeesta, joissa päällekkäin tulokset on esitetty (B)

MR riippuvainen lusiferaasiaktiivisuus.

PcDNA3-transfektoitujen (harmaat pylväät) tai pchMR-transfektoitujen (valkoiset pylväät) HCT116-solut transfektoitiin pMMTV-Luc ja ilmaista tulikärpäsen lusiferaasi peräisin MR riippuvainen promoottori. Soluviljely, aldosteronin spironolaktoni hoitoon ja normoksia tai hypoksiaolosuhteisiin esitetään yksityiskohtaisesti Materiaalit ja menetelmät osassa. Arvot tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus aldosteronin stimuloitu pchMR-transfektoitujen solujen 10%: riisuttu FCS tai 0,1% FCS: ää, sekä normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa, verrattiin stimuloimattomien pchMR-transfektoitujen kontrollisoluja, asetetaan 1. arvot tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus pchMR-transfektoitujen solujen 10% FCS verrattuna pcDNA3-transfektoitujen kontrollisoluja, asetetaan 1. tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SEM (n = 4-6). ** P 0,005 ja *** p 0,001, kontrolliryhmään verrattuna soluihin,

# p 0,001 vs FCS- tai aldosteronin käsiteltyjä soluja, ANOVA seurasi Bonferronin t-testillä tai Studentin t-testi tarvittaessa. (C)

MR solunosasijaintia

. PchMR-transfektoidut HCT116-solut käsiteltiin aldosteronin (3 nM) ja /tai spironolaktoni (1 uM) 30 minuutin ajan ja värjättiin anti-MR-vasta-aine (vihreä) ja DAPI (sininen). Kuvat otettiin konfokaalisella laserkeilauksen mikroskooppi.

osoitti, että ainakin 50% HCT116 soluviljelytutkimuksista voitaisiin rutiininomaisesti transfektoida (katso

Materiaalit ja menetelmät

) ja ilmaista MR proteiini merkittävillä tasoilla, kuten vertaamalla niitä HEK293 soluihin, ottaa positiivisena kontrollina (kuvio. 3A, yläosa). [31] Lisäksi käytetään erilaisia ​​lähestymistapoja, osoitimme että pchMR-transfektoiduissa HCT116-solujen MR on funktionaalisesti aktivoitu agonistit. Sen jälkeen, kun tarjonta aldosteronin, MR tehtiin tiettyjä translaation jälkeisiä modifikaatioita (Fig. 3A, alempi paneeli), transkription MR reportteri plasmidi, joka sisälsi lusiferaasi-geenin voimakkaasti parannettu (Fig. 3B), ja MR kulkeutua soluun tuma odotettuihin kinetiikka (Fig. 3C). Erityisesti, aldosteronin annetaan soluja kasvatettiin elatusaineessa, mukana joko 0,1% tai 10% puuhiilellä puhdistettua vasikan sikiön seerumia merkittävästi parannettu tasot lusiferaasiaktiivisuuden (16 taittuu aldosteronin saaneilla pchMR-transfektoiduissa soluissa vs -untreated kontrollit). On huomattava, että lusiferaasiaktiivisuus aktivoidaan myös kasvattamalla soluja 10% vasikan sikiön seerumia, joka sisältää luonnollisesti MR-agonistit, ja muodostaa näin useamman fysiologisen tilan (5 taittuu pchMR-transfektoiduissa verrattuna pcDNA3-transfektoiduissa soluissa) (Fig. 3B). [32] induktio lusiferaasiaktiivisuutta aldosteronin hoitoa, samanlainen kuin mitä löytyy transfektoiduissa soluissa alle normoksia, havaittiin myös soluissa, jotka altistuvat alentaa hapen pitoisuus (Fig. 3B), jonka avulla voimme testata vaikutusta MR aktivaation myös soluja kasvatettiin hypoksisissa olosuhteissa. Osoitimme myös, että kilpaileva antagonisti spironolaktoni aiheutti katoaminen useimpien aldosteronin indusoima translaation jälkeisiä modifikaatioita samalla asiakkuutta itse muulla erityisvaatimusten (Fig. 3A alempi paneeli) ja suureksi osaksi, vaikka epätäydellisesti, poisti kasvua lusiferaasin aktiivisuuden aiheuttamien aldosteronin (Fig. 3B). On silmiinpistävää, ydinvoima translokaatiota MR aiheuttama aldosteronin ei voitu estää vaan aiheutettiin spironolaktoni yksinään (Fig. 3C).

toiminnallinen validointi meidän solumallin pystyimme tutkimaan mahdollisia välinen syy-yhteys MR aktiivisuus ja ilmentyminen muuttuu koodittavan mRNA eri angiogeenisten tekijöiden sekä normoxic ja hapenpuuteympäristössä. Osoitimme, että pchMR-transfektoiduissa HTC116 soluja kasvatettu happiolosuhteissa, MR aktivointi aldosteronin indusoi merkittävän laskun VEGF mRNA: n ekspression, vaikka se ei vaikuta mRNA ekspressiotasot muiden angiogeenisten tekijöiden, nimittäin bFGF, PGF2 ja EGF. Aldosteronin aiheuttama lasku VEGFA ilmentyminen oli nimenomaan, vaikkakin osittain, estyy kilpailutilanne MR antagonisti spironolaktonia (Fig. 4). Kokonaisuutena nämä tiedot huomauttaa VEGFA kuin angiogeneesiä geenin potentiaalisesti säätelevät MR aktiivisuutta.

Effects of aldosteroni VEGFA (A), bFGF (B), PGF2 (C) ja EGF (D) mRNA tasot pchMR-transfektoiduissa HCT116 soluilla normoxic viljelyolosuhteissa. Soluja käsiteltiin 3 nM aldosteroni 10% riisuttu FCS puuttuessa tai läsnä ollessa, 1 uM spironolaktoni ja analyysi mRNA tehtiin Real-time PCR. Kunkin paneelin, mRNA: n ekspressio arvot käsitellyn pchMR-transfektoituja soluja verrattiin stimuloimattomien pchMR-transfektoitujen kontrollisoluja, asetetaan 1. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 3). * P 0,05 vs pchMR-transfektoitujen kontrollisoluja, ANOVA seurasi Bonferronin t-testi.

On hyvin tunnettua, että hypoksia, jatkuva ominaisuus kiinteän kasvaimen mikroympäristössä, indusoi voimakkaasti VEGFA ilmaisua. Näiden tietojen perusteella olemme analysoineet vaikutuksia MR aktivoinnin VEGFA ilmentymisen tasossa alla alhainen happipitoisuus. Tällä varten ensin osoitti, että pchMR-transfektoiduissa HCT116-solujen tasot VEGFA mRNA lisätä sen jälkeen, kun he altistuvat hypoksia vastaavasti villityypin HCT116-solut ja että CoCl

2 hoitoa, joka jäljittelee hypoksia, kasvaa voimakkaasti VEGFA mRNA: n ekspression transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5B ja 5A, tässä järjestyksessä). Sitten osoitettiin, että lasku VEGFA ekspression aiheuttama aldosteronin pchMR-transfektoiduissa HCT116-soluja aikana normoksia (Fig. 4A) havaittiin myös alla CoCl

2 hoitamiseksi tai hypoksinen viljelyolosuhteet (Fig. 6A). Nämä tulokset ovat erityisen merkittäviä, koska osoitimme, että sekä hypoksia ja CoCl

2 hoitoa kasvaa voimakkaasti VEGFA mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4B). Lisäksi osoitamme myös, että MR aktivointi agonistit luontaisesti koko FCS voi vähentää VEGFA mRNA: n ilmentymisen sekä alle normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 6B).

Reaaliaikainen PCR-analyysi VEGFA mRNA induktion villityypin HCT116-solut altistettiin ilmoitettu ajat hypoksian (A) ja pchMR-transfektoiduissa HCT116-solut altistettiin normoksia, hypoksia tai CoCl

2 hoito (B). Paneelissa A arvot VEGFA mRNA: n ilmentymisen kullekin näytteelle verrattiin, että aika 0, asetetaan 1. paneeli B, arvot VEGF-mRNA: n ekspression pchMR-transfektoitujen solujen altistetaan hypoksia tai CoCl

2 hoitoa verrattiin kuin pchMR-transfektoitujen ohjaus altistettujen solujen normoksia, asettaa 1. tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 3-4). * P 0,05 ANOVA seurasi Bonferronin t-testi.

Reaaliaikainen PCR-analyysi VEGFA mRNA induktion (A) pchMR transfektoitiin HCT116-solut käsiteltiin 3 nM aldosteroni läsnäollessa tai Koska 1 uM spironolaktonin ja altistettiin CoCl

2 hoitoa tai hypoksia ja (B) pchMR- tai pcDNA3-transfektoitujen HCT116-soluja viljeltiin 10% FCS: ää yksin alle normoxic ja hypoksisissa viljelyolosuhteet. Paneelissa A arvot VEGFA mRNA: n ilmentymisen kullekin näytteelle verrattiin stimuloimattomien pchMR-transfektoitujen kontrollisoluja, asetetaan 1. paneeli B, arvot VEGF mRNA: n ekspressiota seerumissa aktivoitu pchMR-transfektoituja soluja verrattiin pcDNA3-transfektoidut kontrollisoluja, asetetaan 1. tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 3-4). * P 0,05 vs pchMR transfektoidut ohjaus soluja tai pcDNA3-transfektoiduissa soluissa, ANOVA seurasi Bonferronin t-testillä tai Studentin t-testi tarvittaessa.

Lopuksi perusteista viimeaikaisten raporttien Calvani ja yhteistyökumppanit roolista KDR ilmaistu HCT116-soluissa ylläpitämisessä solujen selviytymistä altistumisen jälkeen pitkittynyt hypoksia, analysoimme, vuonna pchMR transfektoiduissa HCT116-solut, mahdollinen syy-yhteyttä MR aktiivisuutta ja KDR ilme muuttuu. Itse asiassa nämä kirjoittajat osoittivat, että KDR välittää myöhään VEGF-riippuvainen induktio HIF-1α, mikä autokriininen tuotanto VEGFA, koska ne voivat estää sekä HIF-1α-induktion ja säilymisen hypoksisten HCT116-soluja, joko anti-VEGFA tai anti-KDR-vasta-aineita. [21] Siten kuin alustavassa kokeessa, osoitimme läsnäolo funktionaalisen VEGF /KDR /HIF1α autokriinistä silmukka meidän HCT116 solulinjassa, toistamalla puute myöhään induktion HIF-1α by VEGFA vasta soluissa kasvatettu hypoksisissa olosuhteissa (Fig. S1).

sitten osoitti, että pchMR-transfektoiduissa HCT116-solut, MR aktivointi indusoi merkittävän laskun tasot KDR mRNA. KDR mRNA: n ekspressio väheni aldosteronin stimuloitu pchMR-transfektoitujen HCT116-soluissa noin 65% suhteessa niiden stimuloimaton kontrolleihin (Fig. 7A), ja vielä suuremmassa määrin seerumin stimuloitu pchMR- transfektoitu HTC116 verrattuna pcDNA3-transfektoitujen valvontaa (Fig. 7B ). Silmiinpistävän, vaikka spironolaktoni ei merkittävästi muuta KDR ekspressiotasoja, se näytti kääntää vain osittain vaikutukset aldosteronin hoidon pchMR-transfektoiduissa HCT116-soluissa. Itse asiassa, vaikka samanlainen lasku KDR ilmentyminen havaittiin aldosterone- ja spironolaktonin-aldosteroni-käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolleihin, jälkimmäisessä tapauksessa lasku ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 7A). Syitä, jotka voi selittää eri spironolaktonia teho kääntämään vaikutuksia aikaansaama aktiivinen MR eri kohteisiin tai eri yhteyksissä käsitellään alla.

vaikutukset aldosteronin

(A)

tai seerumin

(B)

KDR-mRNA-tasot.

Soluviljely ja hoitoja olosuhteet olivat kuten kuviossa 4, tai kuvion 6 paneelista B-normoksia, vastaavasti. Analyysit KDR mRNA suoritettiin reaaliaikainen PCR ja tulokset (n = 5), on annettu kuviossa 5. * p 0,05 vs pchMR transfektoidut ohjaus soluja tai pcDNA3-transfektoiduissa soluissa, ANOVA seurasi Bonferronin t-testiä tai Studentin t-testi tarvittaessa.

keskustelu

koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MR ilmentymistä säädeltiin niin peräsuolen ja keuhkosyöpää, on ehdotettu, että MR voivat toimia kasvain-vaimennin geeni [23].

Tässä luoda yhteys ali MR, laskivat potilaan selviytymistä ja säätelyä tuumoriangiogeneesissa pitkälle syöpä vaiheessa. Käyttämällä in vitro malli perustuu koolonikarsinoomasolulinjan, jossa meidän pakko MR ilme, tarjoamme myös todisteita siitä, että aktivoitu MR voi vaimentaa ilmaus VEGFA ja sen reseptori 2 /KDR.

välinen yhteys MR ilmaisun ja angiogeneesiä CRC on aiemmin ehdottanut. [22] Tässä osoitamme, että laajuus MR positiivisten solujen korreloi käänteisesti MVD kasvaimen yksilöitä, tukee oletusta, että vähentynyt MR ilmaisu vapauttaa repressoivan rooli kohdistamaa MR kasvaimen angiogeneesiä. Antaa oivalluksia roolia MR CRC angiogeneesiin, osoitimme, että uudelleen ilmentymistä aktivoitua MR on koolonisyöpäsolulinja, jolle on ominaista melko alhainen MR proteiinia tasolla, siten matkien keskeinen piirre esiintyy CRC in vivo, johtaa tiettyyn väheneminen mRNA ilmaus VEGFA muun angiogeenisen tekijän analysoitava soluja normoxic viljelyolosuhteissa. Nämä tiedot tarjoavat suoran osoittamista ehkäisevästä roolin MR kasvainangiogeneesissä vetämänä pahanlaatuinen epiteelin. On huomionarvoista, että meidän havainnot paksusuolen solut ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia tuoreessa tutkimuksessa siirtogeenisessä hiirimallissa osoittavat, että pitkäaikainen

in vivo

MR yli-ilmentyminen, kun läsnä on fysiologisia määrän aldosteroni, erityisesti vaimentua VEGFA geenien ilmentyminen sydämessä [33].

tiedetään vain vähän sääntelyä angiogeenisten kasvutekijöiden kudoksen normoxic olosuhteissa.