Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maksasyövän on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien. Syvempi mekanistinen käsitys maksasyövän voi johtaa kehittämiseen tehokkaampia hoitostrategioita. Aiemmissa työssä, me seulotaan 646 miRNA ja tunnistettu 11, jotka säätelevät maksasyövän solujen vaeltamiseen. Nykyinen tutkimus osoittaa, että miR-525-3p on usein säädelty vahvistavasti maksasyövän kudoksissa, ja tehostettu ilmentyminen miR-525-3p voi edistää maksasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Sinkki sormi proteiini 395 (ZNF395) on välitön toiminnallinen tavoite geeni miR-525-3p, ja se on usein säädellä vähentävästi maksasyövän kudoksissa. Korkea ilmaus ZNF395 voi merkittävästi estää samalla knockdovvn ZNF395 ilmentymistä voidaan tehostaa merkittävästi migraation ja invaasion maksan syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että ZNF395 estää etäpesäke maksasyövän. Down-regulation ZNF395 voi välittää miR-525-3p aiheuttama maksasyöpä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lopuksi miR-525-3p edistää maksasyövän solumigraation ja hyökkäyksen välittömänä päämääränä ZNF395, ja se, että miR-525-3p ja ZNF395 molemmat tärkeitä rooleja maksasyövän etenemisen tekee niistä potentiaalisia terapeuttisia kohteita.

Citation: Pang F, Zha R, Zhao Y, Wang Q, Chen D, Zhang Z, et al. (2014) MiR-525-3p Parantaa Migration ja Invasion Maksan syöpäsolujen downregulating ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10,1371 /journal.pone.0090867

Editor: Hong Wanjin, Institute of Molecular and Cell Biology, Biopol’ia®, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 elokuu 2013; Hyväksytty: 07 helmikuu 2014; Julkaistu 5 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Pang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia National 973 Key Basic Research Program (2013CB910504), Shanghai Health Bureau (XYQ2011047, XBR2011039) ja valtion Key Project maksasyövän (2012ZX10002-009013). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäkkeitä ovat suurin syy syöpään liittyvät kuolemat [1], [2]. Systemaattisesti tutkia molekyylitason mekanismeja maksasyövän etäpesäke on erityisen tärkeää uusien terapeuttisten strategioiden. Tuumorimetastaasit on monivaiheinen monimutkainen prosessi, jossa kasvainsolut siirtyä ympäröiviin tai kaukana kudoksiin jälkeen irrottautua primaarikasvaimen. Tähän prosessiin kuuluu tuumorisolun kauttakulku soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvon paikallisen verisuonen [3], [4], [5], [6], [7], jota seuraa kulkeutumista isännän microenvironment [ ,,,0],8], [9], [10]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sen lisäksi proteiinia koodaavan geenien, ei-koodaavat RNA: t, kuten miRNA myös olla tärkeä sääntelyn rooli prosessissa etäpesäkkeiden [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],16]. miRNA ovat yksijuosteisia pienet ei-koodaavat RNA: t, ja niiden sekvenssit ovat erittäin konservoituneita eukaryootissa [17]. miRNA säädellä geeniekspressiota at transkription jälkeisellä tasolla sitoutumalla kohde- mRNA- [18], [19], [20], ja siten osallistumaan erilaisiin biologisen prosessin [21], [22]. Meng et ai [23] raportoitiin ensimmäisen että poikkeava ilmentyminen miR-21 voi välittää maksan syöpäsoluinvaasiota suoraan kohdistaminen PTEN. Äskettäin miR-151 ja miR-30d todettu sijaitsee genomisen hauras sivustoja ja liittyvät syövän etäpesäkkeitä [24], [25]. Hypoksia-indusoituvan ilmentymisen miR-210 säätelee VMP1-välitteisen hypoksian aiheuttaman maksavaurion syöpäsolumetastaasi [26].

seulomiseksi miRNA mukana maksasyövän etäpesäke, aikaisemmassa tutkimuksessa, seuloimme 646 miRNA käyttäen haavan paranemista määrityksessä elävien solujen kuvantamisjärjestelmä, ja 11 miRNA havaittiin tehokkaasti säädellä maksasyövän solumigraation [27]. Aikaisemmassa raportissa [28], tunnistimme jotkut kopioluvun vaihtelua alueita genomisessa DNA 58 paria maksasyövän kudosten käyttäen SNP Array 6.0. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-525-3p geeni sijaitsee kopiomäärä monistettu alue ja se voisi helpottaa maksasyöpää soluvaelluksen Transvvell- määrityksessä. Lisäksi miR-525-3p on usein säädelty vahvistavasti maksasyövän kudosten ja säätelee maksasyövän solumigraation ja hyökkäyksen alas-ekspressiota sääteleviä ZNF395. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-525-3p ja ZNF395 edustavat potentiaalisia maksasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Human Liver Tumor Näytteet /Ethics lausunto

Ihmisen maksasyövän ja viereisten nontumorous kudokset saatiin kirurgisen näytteen arkistoon Qidong Maksa Cancer Institute, Jiangsu, Kiina. Kaikki nämä näytteet saatiin kirjallinen lupa, ja protokollat ​​hyväksyttiin eettinen Review komitean WHO Center for Research in Human Tuotanto luvan Shanghain kaupunginhallitus. Erityiset käytetyt näytteet tässä tutkimuksessa on kuvattu edellisessä julkaisussa [29].

Cell Culture

HEK-293T, NCI-H1299, BxPC-3, PANC-1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7, A549, NCI-H460, Tera-1 ja Tera-2 hankittiin ATCC; Huh-7 hankittiin Japani Collection of Research Bioresources (JCRB), SMMC-7721 ja BEL-7402 ostettiin Tyypillisiä kulttuurin säilyttäminen Komissio solujen pankki, Kiinan tiedeakatemia (NCB); MHCC-97L ja LM3 olivat lahjoja Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston (Shanghai, Kiina); SMMC-7721, BEL-7402, MHCC-97L ja LM3 käytettiin tässä tutkimuksessa on kuvattu edellisessä julkaisussa [24], [30], [31], [32].

HEK-293T, NCI -H1299, BxPC3, PANC1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, Huh-7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, LM3, BEL-7402 ja MCF7-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). A549 ja NCI-H460-soluja viljeltiin RPMI1640-elatusalustassa täydennettynä 10% FBS: ää. Tera1 ja Tera2 soluja viljeltiin McCoyn 5a-elatusalustassa täydennettynä 15% FBS: ää. Kaikkia solulinjoja viljeltiin antibioottien esiintyminen 37 ° C: ssa 5% CO

2.

RNA ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin kanssa Prime-Script RT reagenssia (Takara). Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Esiseos Ex Taq (Takara). Aikuinen miRNA olivat käänteistranskriptoituneet ja kvantifioidaan TaqMan miRNA määrityksiä (Applied Biosystems). Koettimia ja alukkeita käytetään miRNA ja mRNA: n havaitseminen on lueteltu taulukossa S1 ja S2.

plasmidivektoriin konstruktit

ensisijainen miR-525-sekvenssi monistettiin genomisesta DNA: sta normaalien kudosten ja ligoitiin osaksi PGIPZ vektoriin (Open Biosystem). ZNF395 ORF-sekvenssi monistettiin ZNF395 vektorin (FulenGen) ja ligoitiin pWPXL vektoriin (lahja professori Didier Trono). ZNF395 3′-UTR monistettiin genomisesta DNA: HK-293T-soluihin, ja subkloonattiin suoraan alavirtaan lopetuskodonista lusiferaasigeenin lusiferaasireportterisysteemillä vektori. Mutantti 3’UTR saatiin kloonattu ZNF395 3’UTR käyttäen QuikChange salama kohdennetun mutageneesin kittiä (Agilent). Sekä villityypin ja mutantti-3’UTR sekvenssit varmistettiin sekvensoimalla (Invitrogen). Alukesekvenssejä on esitetty taulukossa S3.

lentivirustartunnat Tuotanto ja Cell transduktio

pakkaus plasmidi psPAX2 ja kirjekuoren plasmidi pMD2.G olivat lahja professori Didier Trono. Joko pGIPZ-miR-525 tai pWPXL-ZNF395 vektori kotransfektoitiin psPAX2 ja pMD2.G osaksi HEK293T-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virukset kerättiin 48 h transfektion jälkeen, ja viruksen tiitterit määritettiin. SK-HEP-1 ja SMMC-7721-soluja infektoitiin 1 x 10

6 rekombinantti lentivirus transduktion yksiköiden läsnä ollessa 6 ug /ml polybreeniä (Sigma, MO). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 ja SK-HEP-1-ZNF395 ovat altaat stabiileja soluja, jotka infektoitu käyttäen lentivirus GFP, stabiileja solulinjoja käyttää määrityksissä kanssa 95% vihreää fluoresenssia.

Oligonukleotidi transfektio

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua, 100 pmol miRNA matkivat (Genepharma), inhibiittori (Ribobio) tai siRNA transfektoitiin käyttäen 5 ui lipofektamiinia RNAiMax reagenssia (Invitrogen). Solut kerättiin 48 tuntia myöhemmin siirtokuoppaan määrityksiä tai lusiferaasireportterilla määrityksissä. SiRNA-sekvenssit on esitetty taulukossa S4.

transfektiotehokkuus Detection

Solut transfektoitiin 6-kuoppalevyillä käyttäen 100 pmol siRNA FAM (Genepharma) ja RNAiMax reagenssia (Invitrogen), kun 20-24 h, transfektion tehokkuus havaittiin käyttäen virtaussytometrillä (FCM).

soluproliferaatiomäärityksissä

Solulisääntyminen arvioi Cell Counting Kit-8 iinianalyysikitissä (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 x 10

3-soluja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, ja viljeltiin 90 ul: medium, 10 ui CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h, absorbanssi todettiin 450 nm: ssä, ja OD450-arvo korreloi elävien solujen lukumäärä.

Migration and Invasion Analyysit

Cell migraatiokokeessa : 5 x 10

4 solut suspendoitiin 200 ul seerumivapaassa DMEM-alustassa ja kylvetään saliin kunkin insertin. Sitten 800 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, lisättiin 24-kuoppalevylle. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa (SK-HEP-1:6-8 h; SMMC-7721:12-16 h), solut, jotka vaelsivat kiinnitettiin ja värjättiin 30 minuutin ajan väriaine, joka sisälsi 0,2% kristalliviolettia, ja 20 % metanolia. Cell invaasiomääritys: Chambers oli tasaisesti peitetty 40-80 ui matrigeelin (BD Biosciences) laimennettuna DMEM tiettyä prosenttiosuutta ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2-4 tuntia. Sitten 1 x 10

5 Solut lietettiin 200 ui DMEM ja kylvetään yläkammiot, ja 800 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa (SK-HEP-14-16 1 h; SMMC-7721 16-18 h), solut kiinnitettiin ja värjättiin.

Luciferase Reporter Assay

HEK293T-soluissa viljeltiin 96-kuoppaisen levyn ja transfektoitiin 50 ng pluc-3′-UTR, 10 ng Renilla lusiferaasiplasmidin ja 5 pmol miR-525-3p matkivat tai negatiivinen kontrolli. 48 tunnin kuluttua inkubaation havaittu lusiferaasiaktiivisuutta käyttäen dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega).

Western blot -määritys

Solulysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad), blokattiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi Tween-20 ja 5% rasvatonta maitoa 1 h, ja inkuboitiin ZNF395 polyklonaalisella vasta-aineella (Santa Cruz) (1:1000) tai β-aktiini (Sigma) ( 1:10000). Vasta-aine kompleksi havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (Pierce).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± standardipoikkeama keskivirhe (SEM). Erot ryhmien analysoitiin Studentin t-testiä (kaksisuuntainen, p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä).

Tulokset

Korkea Expression of miR-525-3p Parantaa Migration ja Invasion maksa Syöpäsolut

tutkia roolia miR-525-3p in maksasyövän kehittämiseen, ilmentymistason miR-525-3p havaittiin 136 maksasyövän ja pariksi viereisen noncancerous maksakudoksissa (NT). miR-525-3p merkitsevästi säädellään ylöspäin maksasyövän kudoksissa (kuvio 1A), jossa ylössäätöä havaittiin 60% maksasyövän kudosten (kuvio 1 B). Lisäksi olemme tutkineet ilmentymisen miR-525-3p eri syöpäsolulinjoissa. Tulokset osoittivat, että ilmentymistaso miR-525-3p on suhteellisen korkea maksasyövän solulinjoissa (kuvio S1 File S1). Tutkia biologisen toiminnan miR-525 HCC, stabiileja solulinjoja ilmentävät miR-525 rakennettiin ja nimettiin SMMC-7721-525 ja SK-HEP-1-525 (kuvio S2A File S1). CCK-8 määrityksissä viittasi siihen, että miR-525 ei vaikuttanut HCC solujen kasvua (kuva S3 File S1), kun taas siirtokuoppaan määritykset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-525 edistänyt SK-HEP-1 ja SMMC-7721 muuttoliikettä ja invaasiota (kuva 1C, D).

(A) miR-525-3p ilmentyminen määritettiin TaqMan Reaaliaikainen PCR maksasyövän ja viereisen noncancerous maksan kudosnäytteistä (NT) (n = 136). MIR-525-3p ilmentymistason normalisoitiin U6b snRNA. Suhteellinen ilmentyminen miR-525-3p raportoidaan rasiakuvaajan jossa log

10 Y-akselin asteikon. Päät laatikoiden määritellään 25

th ja 75

th persentiilit, ja viiva osoittaa mediaani. Tilastollinen analyysi suoritettiin pariksi t-testiä, ja tähdet osoittavat tilastollisesti merkittäviä tuloksia P 0,05 (*). (B) Piirakka kaaviossa osuudet maksasyövän kudosten jossa miR-525-3p ilmentyminen sääteli (60%), alassäädetty (5%) ja muuttumaton (35%). (C) TranswellTM muuttoliike määritykset SMMC-7721 ja SK-HEP-1 soluja, jotka ilmentävät miR-525 tai vektorisäätö. (D) TranswellTM invaasio määritykset SMMC-7721 ja SK-HEP-1 soluja, jotka ilmentävät miR-525 tai vektorisäätö. Kuvat ovat näkyvät vasemmalla, ja 3 satunnaisesti valittu kenttiä kvantifioidaan oikealla. Arvot kuvassa edustavat keskiarvoa ± SEM, ja tähdet osoittavat tilastollisesti merkittäviä tuloksia P 0,01, ** tai P 0,001, ***.

MiR-525-3p Post-kopiointia down-regulation ZNF395 Expression suoraan kohdistaminen sen 3’UTR

vieressä pyrki määrittämään kohdegeenien miR-525-3p. Mahdolliset kohdegeenien ennustettiin käyttämällä miRNA Ennustusalgoritmien TargetScan, Miranda ja DIANA. Yhteinen ennustukset kunkin kahden ohjelmiston yhdistettiin ja 30 kandidaattigeenit havaittiin (kuvio 2A). Ilmentymistasojen Näiden geenien havaittiin sen jälkeen, kun miR-525-3p jäljittelee tuotiin SK-HEP-1 ja SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 ja MLST8 inhiboi yli 40% (kuva S4 File S1). Ymmärtää, ovatko nämä viisi geeniä liittyvät maksasyövän, ekspressiotasot näiden geenien havaittiin 12 paria maksasyövän kudosnäytteistä. RANBP10, IRF1 ja ZNF395 todettiin säädellä vähentävästi maksasyövän kudoksissa, kun taas ekspressiotasot NACC1 ja MLST8 pysyi ennallaan (kuvio S5 File S1).

(A) Schema ehdokkaan geenien tuotettu eri ennustaminen algoritmeja. Jokainen ympyrä edustaa yhtä ennustusalgoritmi ja määrä geenejä, jotka se ennusti, ja mainitut luvut alueilla, joissa ympyrät päällekkäin edustavat useita geenejä ennustaa molemmat algoritmit. (B) Western blot määrityksiä ZNF395 proteiinin tasot SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa tartunnan miR525 tai vektorisäätö. (C) Mahdollinen sitovat sekvenssit miR525-3p sisällä ZNF395 3’UTR ihmisen (HSA), simpanssi (Ptr), Rhesus (mm), koira (CFA) ja kanin (Ocu). Seed sekvenssit on alleviivattu. (D) lusiferaasireporttiterilla plasmidit rakennettiin insertoimalla ZNF395 3’UTR ja vastaavat fragmentit osaksi alavirtaan lusiferaasigeenin. Ennustettu sitovat sekvenssit miR-525-3p on esitetty, mukaan lukien villityypin täyspitkä UTR (WT) tai mutantti-(MT, alleviivattu) sitoutumiskohtiin. (E) Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus määritettiin sen jälkeen, kun HEK-293T-solut ko-transfektoitiin WT tai MT ZNF395 3’UTR toimittaja plasmidit ja miR-525-3p. Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM, ja tähdet osoittavat tilastollisen merkitsevyyden P 0,01, **.

Kun haluat selvittää RANBP10, IRF1 ja ZNF395 ovat mahdollisia toiminnallisia kohdegeenien miR-525 -3p, nämä geenit pudotus käyttäen siRNA. Tulokset osoittivat, että häiriö IRF1 ilme voi estää migraation SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa, fenotyypin, joka on ristiriidassa fenotyypin miR-525-3p over-ilmaisua. Knockdown Endogeenisen RANBP10 ja ZNF395 ilmaisun pystyi edistämään muuttoa SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa. Tämä fenotyyppi on sopusoinnussa fenotyypin miR-525-3p yli-ilmentyminen. (Kuva S6 File S1). Sitten RANBP10 ja ZNF395 proteiinin tasot määritettiin SK-HEP-1-525 ja SMMC-7721-525-solut sen määrittämiseksi, onko miR-525 yli-ilmentyminen voi estää näiden proteiinien ilmentymisen. Tulokset osoittivat, että ZNF395 proteiinin taso oli merkittävästi vähentynyt SMMC-7721-525 ja SK-HEP-1-525-soluja (kuvio 2B). Kun taas RANBP10 proteiinin taso ei vaikuttanut merkittävästi (Kuva S7 File S1). Siten, ZNF395 valittiin jatkotutkimuksiin.

ZNF395 3’UTR sisältää sitoutumiskohdan miR-525-3p (ennustettu TargetScan), ja sitova sekvenssi on erittäin konservoitunut eri lajien, kuten ihmisen, simpanssi, reesusapina, koira ja kani (kuvio 2C). Sen määrittämiseksi, onko miR-525-3p suoraan säätelee ZNF395 kohdistamalla sen 3’UTR, joka on ZNF395 täyspitkä 3’UTR lusiferaasireportteri vektori rakennettiin. Lusiferaasiaktiivisuus väheni merkittävästi sen jälkeen transfektoimalla kanssa miR-525-3p matkivat ja lusiferaasin 3’UTR konstruktioita. Sitä vastoin, suhteellisen lusiferaasiaktiivisuutta ei muutu merkittävästi, kun mutantti-sitoutumiskohtia otettiin (kuvio 2D, E), mikä viittaa siihen, että miR-525-3p voi säädellä ZNF395 ekspression suoraan sitoutumisen 3’UTR.

ZNF395 on usein Down-säännelty Maksasyöpä ja voivat estää maksan syöpäsolu Migration and Invasion

sinkki sormi proteiini 395 on jäsenenä Kruppel C2H2-tyyppinen sinkkisormipolypeptidiin proteiini perhe, ja useimmat proteiinit tässä perheessä toimivat transkription aktivaattoreita tai inhibiittoreita. ZNF395 ei ole aiemmin raportoitu olevan mukana maksasyövän tai kasvaimen etäpesäkkeiden. Siksi vaikutukset ZNF395 kehitykseen ja etenemiseen maksasyövän ja mekanismin taustalla näitä vaikutuksia pitäisi tutkia. ZNF395 merkittävästi säädellä vähentävästi maksasyövän kudoksissa (kuvio 3A), jossa alassäätöä havaittiin 62% maksasyövän kudosten (kuvio 3B). Selventää vaikutuksen ZNF395 maksasyöpää solumigraatioon ja invaasio, vakaa solulinja SK-HEP-1-ZNF395 perustettiin (Kuva S2B File S1) ja siRNA: ita vastaan ​​ZNF395 tilattiin, The knockdown tehokkuutta ZNF395-siRNA: iden määritettiin todellisen -aika PCR (Kuva S2C in File S1), ja transfektiotehokkuus SK-HEP-1 ja SMMC-7721 olivat 89,5% ja 97,0% (kuvio S2 D, E, F, G File S1).

(A) Suhteellinen ekspressiotasojen ZNF395 HCC kudoksissa tai sovitettu noncancerous kudokset (NT) määritettiin käyttämällä kvantitatiivista Käänteiskopiointia PCR-määrityksissä. (B) Piirakka kaaviossa osuudet maksasyövän näytteitä joista ZNF395 oli alassäädetty (62%), ennallaan (32%), ja säädelty (6%). ZNF395 ilmentyminen määritettiin TaqMan Reaaliaikainen PCR maksasyövän ja viereisten noncancerous maksakudoksissa (NT) (n = 136), ja ZNF395 ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH. Suhteellinen ilmentyminen ZNF395 esitetään rasiakuvaajan. Tilastollinen analyysi suoritettiin parillista t-testiä. (C, D) Lentivirus-välittyy-ilmentymistä tai siRNA aiheuttama pudotus on ZNF395 ilmentymistä havaittiin Western blot SK-HEP-1. ((E) Suhteellinen ekspressiotasot kypsän miR-525-3p in ZNF395 yli-ilmentyminen tai pudotus SK-HEP-1-soluissa. (F) TranswellTM maahanmuutto ja invaasion määritykset SK-HEP-1cells ilmentävät stabiilisti ZNF395 tai vektorisäätö. ( G) TranswellTM maahanmuutto ja invaasion määritykset SK-HEP-1-solujen jälkeen knockdown endogeenisen ZNF395. kuvat ovat näkyvät vasemmalla, ja 3 satunnaisesti valittu kenttiä kvantifioidaan oikealla. Virhepalkit ilmaisevat SEM; tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä P 0,05, *; P 0,01, ** tai P 0,001, ***.

ZNF395 ekspressiotaso havaittiin western blot-määrityksellä (kuvio 3C, D). ja suhteelliset ekspressiotasot kypsän miR-525-3p ei ilmeisesti muuttunut ZNF395 yli-ilmentyminen tai pudotus SK-HEP-1-soluissa (kuvio 3E), jotta voidaan sulkea pois mahdollisuutta rajat sääntely miR-525 by ZNF395 . Tämä testi osoitti, että yli-ilmentyminen ZNF395 voisi merkittävästi estää SK-HEP-1 muuttoliike ja invaasiota (kuvio 3F), kun taas häiriöitä endogeenisen ZNF395 ilme voisi merkittävästi edistää muuttoliikettä ja hyökkäys SK-HEP-1-soluissa (kuvio 3G) .

palauttaminen ZNF395 Estää miR-525 aiheuttama Maksasyöpä Cell Migration and Invasion

yrittäessään testata onko ZNF395 on suora toiminnallinen välittäjänä miR-525 aiheuttama muuttoliike ja invaasio, joka on ZNF395 lentiviraalinen vektori, joka sisältää täyspitkän ORF mutta lukuun ottamatta 3′-UTR vietiin SK-Hep1-525 stabiili solulinja (kuvio 4A). Suhteellisten ekspressiotasojen kypsän miR-525-3p ei ilmeisesti muuttaa SK-HEP-1-525 ja SK-HEP-1-525-ZNF395 soluissa (kuvio 4B). Tulokset osoittivat, että korkea ZNF395 ilmaisu pystyi kompensoimaan miR-525 aiheuttamiin muutoksiin SK-HEP-1 muuttoliike ja invaasiota (kuvio 4C, D). Nämä havainnot osoittivat, että ZNF395 on välitön toiminnallinen tavoite geeni miR-525-3p.

(A) Western blot määritykset SK-HEP-1-vektorin tai SK-HEP-1-525 solujen kanssa tai ilman otetaan uudelleen käyttöön ZNF395. (B) Suhteellinen ekspressiotasot kypsän miR-525-3p in ZNF395 yli-ilmentyminen tai Knockdown SK-HEP-1-soluissa. (C, D) TranswellTM muuttoliike, invaasio määrityksiä SK-HEP-1-vektorin tai SK-HEP-1-525 solujen kanssa tai ilman uudelleen ZNF395. Nämä tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin t-testiä. Virhe pylväät edustavat S.E.M., ja tähdet osoittavat tilastollisen merkitsevyyden P 0,05, *; ja P 0,001, ***.

Keskustelu

miR-525 sijaitsee kromosomissa 19q13.42 ilman isännän geenistä. Ilmentymisen taso miR-525-3p kasvanut 6,8-8-kertaisesti kahdella sisplatiini-resistenttejä itusolutuumoritapauksia solulinjat [33]. Wang et al [34] havaittu miRNA ilmaisua käyttäen miRNA mikrosirujen ja totesi, että miR-525-3p oli säädellään ylöspäin kolme paria maksasyövän kudosten. Ei ole olemassa raportteja toiminta ja mekanismi miR-525-3p syövässä. Tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa, huomasimme, että kohonnut ilmentyminen miR-525-3p edistää maksasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. ZNF395 tunnistetaan välitön toiminnallinen kohde geeni miR-525-3p.

ZNF395 on jäsen Kruppel C2H2 tyypin sinkkisormen proteiinin perheen. Se ilmentyy laajalti, ja tunnistettiin alun perin transkription säätelee ihmisen papilloomaviruksen (HPV) ilmentymistä; siten se tunnetaan myös HPV-sitova tekijä (PBF) ja voi sitoutua HPV-promoottorialueen [35]. ZNF395 ilmaistaan ​​hypoksian aiheuttaman glioblastoomasolulinjoissa ja verisuonissa aikuisen glioblastoma kudoksissa [36]. Tsukahara et ai [37] havaitsivat, että ZNF395 on kasvaimeen liittyvän antigeenin. ZNF395 myös osoitettu säätelevän PI3K /Akt-reitin inhiboimaan solujen kasvua [38] aktivoimalla kaspaasi-3 edistää apoptoosia [39]. Ei ole raportoitu ZNF395 olla mukana tuumorimetastaasissa.

Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että ZNF395 on usein säädellä vähentävästi maksasyövän kudosten ja että miR-525-3p voi kohdistuvat erityisesti ZNF395 3’UTR . Yli-ilmentyminen ZNF395 voi estää maksasyövän solumigraatioon ja invaasio, vaikka palauttaminen ZNF395 estää miR-525 välittämä maksasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Yli-ilmentyminen ZNF395 ja miR-525 ei ole mitään vaikutusta NF-KB, MAPK-reitin, mutta voi säädellä PI3-K /Akt-reitin kautta muuttaminen tilasta p-Akt (Kuva 5, Kuva S8 File S1).

Western blot-analyysi PI3-K /Akt-reitin SK-HEP-1-525 ja SK-HEP-1-ZNF395 soluissa.

Yhteenvetona, tämä tutkimus osoittaa, että korkeat ilmentyminen miR-525-3p edistää maksasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. ZNF395 on suora toiminnallinen kohdegeeni miR-525-3p; miR-525-3p edistää maksasyövän solumigraation ja hyökkäyksen alas-ekspressiota sääteleviä ZNF395. Tämä havainto paljastaa uuden mekanismin maksasyövän etäpesäke ja uudet tavoitteet hoitoon maksasyövän.

tukeminen Information

Taulukko S1.

sekvenssit miRNA koettimet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090867.s001

(DOCX) B Taulukko S2.

reaaliaikainen PCR-alukkeiden ennustaa mahdollisten kohdegeenin ehdokkaita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090867.s002

(DOCX)

Taulukko S3.

Alukkeet miR-525, ZNF395, ZNF395 3’UTR ja mutantti 3’UTR kloonaus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090867.s003

(DOCX) B Taulukko S4.

siRNA sekvenssit vastaan ​​IRF1, RANBP10 ja ZNF395.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090867.s004

(DOCX)

Tiedoston S1.

tukeminen tietoa tuloksista, jotka sisältävät kuva S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 ja S8. Kuva S1. Ilmentymistasojen miR-525-3p eri syöpäsolulinjoissa. miR-525-3p ilmentyminen määritettiin TaqMan Reaaliaikainen PCR syöpäsolulinjoissa. Ilmaisu tasot normalisoitiin U6 snRNA. Kuva S2. Ilmentymistasojen stabiilien solulinjojen erittäin ilmentäviä miR-525 ja ZNF395. (A) Suhteellinen ekspressiotasot kypsän miR-525 in SMMC-7721-525 ja SK-HEP-1-525, ABI TaqMan miRNA määrityksiä käytettiin ja data normalisoitiin U6b snRNA. (B) suhteelliset ekspressiotaso ZNF395 SK-HEP-1 tai vektorisäätö, data normalisoitiin GAPDH. (C) Knockdown tehokkuus ZNF395-siRNA: iden. Seos ZNF393-siRNA-1, ZNF393-siRNA-2, ja ZNF393-siRNA-3 nimettiin ZNF393-siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G), transfektio tehokkuutta FAM-siRNA SK-HEP-1 ja SMMC-7721-soluja. Tähdet on merkitty osoittamaan merkitystä, P 0,01, **; P 0,001, ***. Kuva S3. miR-525 ei ole merkittävää vaikutusta HCC solujen kasvuun. Soluproliferaatiomäärityksiä varten SMMC-7721 (A) ja SK-HEP-1 (B): llä infektoituneet solut lentiviruksen ilmentävät miR525 tai vektorisäätö. Cell laskenta kit-8 (CCK-8) määritystä käytettiin arvioimaan solujen proliferaatiota. Keskimääräiset arvot piirretään esitetty, ja palkit osoittavat SEM kolmena kappaleena. P = ns (ei merkitsevä) Studentin

t

-testi. Kuva S4. Ilmentymistasojen ennustaa mahdollisten kohdegeenin ehdokkaita. Data normalisoitiin GAPDH, ja esitetään keskiarvona ± SEM. Kuva S5. Ilmentymistasojen ehdokas geenien maksasyövän kudoksissa. Expression of (A) RANBP10, (B) IRF1, (C) ZNF395, (D) NACC1 ja (E) MLST8 määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä määrityksissä maksasyövän ja viereisten noncancerous maksakudoksissa (NT) (n = 12 ). Data normalisoitiin GAPDH, tähdet on merkitty osoittamaan merkitystä, P 0,05, *; P 0,001, ***. Kuva S6. Häiriöt IRF1, RANBP10 ja ZNF395 ilmaisun voivat estää tai edistää SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa muuttoliike. (A) Interference IRF1 ilmaus voisi estää SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa muuttoliike. Interference RANBP10 (B) ja ZNF395 (C) lauseke voisi edistää SMMC-7721 ja SK-HEP-1-soluissa muuttoliike. Kuva S7. RANBP10 ilmaisua ei ilmeisesti muuttunut miR-525 yliekspressoidaan soluissa. Western blot määrityksiä RANBP10 ilmaisun SK-HEP-1 ja SMMC-7721-soluissa tartunnan miR525 tai vektorisäätö. Kuva S8. Yli-ilmentyminen MiR-525 ja ZNF395 ole vaikutusta NF-KB, MAPK-reitin tai EMT markkereita. Western blot-analyysi NF-KB (A), MAPK (B) reitin ja EMT markkereita (C) SK-HEP-1-525 ja SK-HEP-1-ZNF395 soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone .0090867.s005

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme professori Didier Trono (School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fe’de’rale de Lausanne, 1015 Lausanne, Sveitsi) varten antelias lahjoja pWPXL, psPAX2 ja pMD2.G plasmideja.