Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin osa uuden lääkkeen hyväksyntöjen syöpään perustuvat olemassa olevien terapeuttisten tavoitteiden. Eräs lähestymistapa tunnistaminen romaani tavoitteita on tehdä korkean suoritustehon RNA-interferenssi (RNAi) solujen elinkelpoisuus näyttöjä. Kuvaamme uudenlainen lähestymistapa, jossa yhdistyvät RNAi seulonta useissa solulinjoissa geenien ilmentyminen ja genomista profilointi tunnistaa uusia syövän tavoitteita. Suoritimme rinnakkain RNAi näyttöjä useita syöpäsolulinjoissa tunnistaa geenejä, jotka ovat välttämättömiä elinkelpoisuuden joissakin solulinjoissa, mutta ei muita, mikä viittaa siihen, että nämä geenit ovat avainasemassa solujen eloonjäämisen tietyissä syöpäsoluissa. Tämä lähestymistapa varmennettiin tunnistaminen

PIK3CA

, hiljentämisen joka oli selektiivisesti tappava MCF7-solulinja, joka satamat aktivoivan onkogeenisen

PIK3CA

mutaatio. Yhdistimme toiminnallista RNAi lähestymistapaa geenien ilmentyminen ja genomisen analyysin avulla voidaan havaita useita uusia kinaasien, mukaan lukien

WEE1-

, jotka ovat välttämättömiä elinkelpoisuuden ainoastaan ​​solulinjoilla, joilla on kohonnut ilmentymistaso tämän kinaasin. Lisäksi olemme määritelleet osajoukko rintasyövistä, että erittäin näihin WEE1- viittaa siihen, että WEE1- voisi olla uusi terapeuttinen kohde rintasyövän. Kaiken kaikkiaan tämä strategia edustaa uutta ja tehokas strategia tunnistamiseksi toiminnallisesti tärkeitä terapeuttisia kohteita syöpään.

Citation: Iorns E, Herra CJ, Grigoriadis A, McDonald S, Fenwick K, MacKay A, et al . (2009) Integrated Functional, Gene Expression ja Perimän analyysi tunnistaminen Cancer tavoitteet. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10,1371 /journal.pone.0005120

Editor: Toru Ouchi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 tammikuu 2009; Hyväksytty: 06 maaliskuu 2009; Julkaistu: 09 huhtikuu 2009

Copyright: © 2009 Iorns et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kiitämme läpimurto Rintasyöpä ja Uuden-Seelannin-aste komission rahoitusta tämän tutkimuksen. Tunnustamme myös NHS rahoitusta NIHR Biomedical Research Centre. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keski suunnitteluun uusia terapeuttisia strategioita syövän on tunnistaa geenejä, jotka ovat kriittisiä selviytymisen kasvainsolujen, mutta jotka ovat suurelta osin tarpeetonta normaaleissa soluissa [1]. Joka korreloi molekyyli muuttuu tuumorigeneesiä on antanut yhden reitin tunnistamiseksi mahdollisia lääkkeiden tavoitteita ja antaa taustalla pyrkimyksiä luonnehtia geneettistä vaihtelua ja geenin ilmentyminen kasvaimissa. Kuitenkin vastaavilla luonne näiden tietojen tarkoittaa sitä, että usein ei ole mahdollista määrittää, onko havainnot ovat aiheuttajaa tai pelkästään vaikutus tautitilan [2].

RNA-interferenssi (RNAi) on luonnossa esiintyvä mekanismin säätelee geenin ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla. Nisäkässoluissa, lyhyen häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) välittävät hajoaminen täydentäviä lähetti-RNA (mRNA) transkriptien sekvenssi-riippuvaisella tavalla [3]. Tämä sekvenssi-spesifisyys RNAi voidaan käyttää kokeellisesti vaientaa geenit jota transfektoimalla siRNA: iden nisäkässoluihin. Tämä tekniikka on laajennettu RNAi kirjastoihin käsittää reagenssit, jotka kohdistuvat erilaisia ​​selostukset, jolloin rooli useiden geenien soluprosessin arvioitava ennakkoluulottomasti tavalla [4], [5]. RNAi näyttöjä on käytetty geenien tunnistamiseksi tärkeää syöpäsolujen fenotyyppejä, mukaan lukien solujen elinkelpoisuuden [6], [7].

osoittaa, että RNAi näyttöjä voidaan käyttää tunnistamaan geenejä, jotka differentiaalisesti tarvitaan elinkelpoisuuden syövän solulinjat ja todisteena tästä periaatteesta, tunnistaa tunnetut onkogeeni

PIK3CA

olennaisina elinkelpoisuuden MCF7 solujen aktivoiva

PIK3CA

mutaatio. Osoitamme, että yhdistämällä toiminnallinen RNAi analyysi geenien ilmentymistä ja genomin analyysi antaa uuden strategian tunnistamiseksi keskeisistä moottoreista erityisiä syöpäsoluja, jotka ovat mahdollisia uusia lääkekohteita.

Tulokset

Parallel RNAi näytöt tunnistaa kinaasien välttämättömiä solujen elinkelpoisuus

toiminnallisesti tunnistaa tärkeät geenit ilmaistaan ​​syöpäsoluissa, käytimme RNAi seulontaan. Käyttäen erilaisia ​​ihmisen syöpäsolujen linjat ja lyhyt häiritsevä RNA (siRNA) kirjasto kohdistaminen 779 kinaasien, teimme viisi rinnakkaista kannattavuus näytöissä MCF7 (ER positiivinen, luminal rintasyöpä), CAL51 (ER-negatiivisen, mikrosatelliittimarkkereita epävakaa rintasyöpä), A549 (keuhkosyöpä), NCI-H226 (keuhkosyöpä) ja HeLa (kohdunkaulan syöpä) solulinjoissa (kuva 1a ja taulukko S1). Päätimme kohdistaa kinaasien, koska nämä proteiinit ovat suhteellisen vastaanottavaisia ​​farmakologinen esto ja niiden on osoitettu olevan tärkeitä tekijöitä monia erilaisia ​​syöpiä. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja transfektoitiin siRNA kirjastosta. Tässä käytimme SMARTpool kirjasto, jossa jokainen kuoppa 96-kuoppaisen levyn sisälsi allas neljä eri siRNA: iden (a SMARTpool) kohdistettu yhden geenin. Seitsemän päivän kuluttua jatkuvan viljelyn, solujen elävyys kunkin kuopan arvioitiin käyttämällä luminoivaa määrityksen mittaamalla solun ATP-tasot. Jotta vertailla menetystä elinkelpoisuuden vaikutuksia monissa solulinjoissa, me normalisoitui solujen elinkelpoisuuden tietoja kustakin solulinjasta keskiviivan kaikkien vaikutuksia, koska solulinjassa, jotka edustavat kutakin SMARTpool vaikutus kuin Z pisteet [8] jossa Z = 0 edustaa no vaikutus elinkelpoisuus ja Z tulokset alle -3 edusti merkittävää elinkyvyn häviämistä vaikutuksia. Tulokset viiden solujen elinkykyä näytöt arviolta normaalijakaumat, joka mahdollistaa vertailun yksilön siRNA varmistaminen koko solulinjoissa (kuva 1b).

a. Sirontakaavioissa Z pisteiden solujen elinkelpoisuuden näytöt toteutetaan rinnakkain MCF7, CAL51, HeLa, A549 ja NCI-H226 syöpäsolun linjat. Mustat timantit – yksittäisten siRNA SMARTpools kohdistaminen 779 kinaasi geenien kohti solulinjaa. Z scores≤-3 edustavat merkittävää menetystä elinkelpoisuuden vaikutuksia. b. Jakelu käyrät Z pisteitä rinnakkaisen siRNA näytöt. Z scores≤-3 edustavat merkittävää menetystä elinkelpoisuuden vaikutuksia. c. Kinaasit voidaan luokitella perusteella vaikutus hiljentäminen solujen elinkelpoisuuden kaikkien viiden syöpäsolulinjoilla. siRNA, jolla ei ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkelpoisuutta tahansa solulinjoista tutkitaan todennäköinen kohde-välttämättömiä kinaasien (tai siRNA oli epäkunnossa). siRNA: t, jotka aiheuttavat merkittävää solun elinkyvyn menetykseen kaikissa solulinjoissa tutkittiin todennäköinen kohde kinaasit, jotka ovat välttämättömiä elinkelpoisuuden useimmissa kasvaintyypeissä tai jotka ovat välttämättömiä elinkelpoisuuden sekä normaalien ja tuumorisolujen. siRNA että vain aiheuttaa merkittävää kuolleisuutta joihinkin mutta ei kaikissa solulinjoissa todennäköinen kohde kinaasien että ei voi olla kriittinen elinkelpoisuuden kaikkien solujen vaan edustavat kasvain-konkreettisia vaikutuksia. d. Parallel RNAi näytöt tunnistaa tunnetun onkogeeni,

PIK3CA

. Solujen elinkelpoisuus vaikutukset

PIK3CA

kohdistaminen on esitetty viisi solulinjoissa. MCF7-solut selektiivisesti herkkiä kohdentamiseen

PIK3CA

osoituksena Z pisteet ≤-3. siRNA, jotka aiheuttavat merkittävää kuolleisuutta joihinkin mutta ei kaikissa solulinjoissa todennäköisesti kohdistaa kinaasit, jotka eivät ole kriittisiä elinkelpoisuutta kaikkien solujen vaan edustavat kasvain-konkreettisia vaikutuksia. Joissakin tapauksissa tämä saattaa selittyä esiintyminen aktivoidun onkogeenin kuten on laita MCF7-soluissa, jotka tarjoavat sataman aktivoiva

PIK3CA

mutaatio.

perusteltu, että siRNA: illa aiheuttavat huomattavia solun elinkyvyn menetykseen (Z≤-3) kaikissa solulinjoissa määritettiin todennäköisesti edustaa kinaasit, jotka ovat välttämättömiä elinkelpoisuuden useimmissa kasvaimen tyyppiin tai todennäköisemmin olennaisia ​​elinkelpoisuuden sekä normaalien ja tuumorisolujen. Vastaavasti siRNA: t että ei ollut merkittävää vaikutusta elinkelpoisuutta tahansa solulinjoista ei joko toiminnallisia tai kohdistettu kuin keskeisiä kinaasien. Lopuksi arveltu, että siRNA että vain aiheutti merkittäviä kuolleisuutta joihinkin mutta ei kaikissa solulinjoissa, jonka tunnuksena kinaasit, jotka edustavat kasvaimen-konkreettisia vaikutuksia mahdollisesti tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita (kuva 1c). Voit selvittää vaikutuksen luonteen, siRNA: t luokiteltiin vertaamalla Z tulokset välillä solulinjoja (taulukko 1).

tunnistetiedot

PIK3CA

todistaa mukainen lähestymistapa

Meidän ensimmäinen analyysi osoitti, että

PIK3CA

hiljentäminen oli todennäköisesti kyse solulinjaan erityinen vaikutus. Hiljentäminen

PIK3CA

oli valikoivasti tappava MCF7-solut (Z pisteet -3,80), mutta ei HeLa, CAL51, A549 eikä H226 (kuvio 1 d ja taulukko 1). MCF7-solut ovat tunnettuja satamaan aktivoiva

PIK3CA

mutaatio (E545K), jolle nämä solut ovat riippuvaisia ​​selviytymisen [9], [10]. Lisäksi monistukset ja voitto-of-function mutaatioiden

PIK3CA

on liittynyt munasarjasyöpä [11], kohdunkaulan syöpä [12] ja rintasyövän [10]. Riippuvuus MCF7-solujen Olipa

PIK3CA

aktivoiva mutaatio, voi olla onkogeeni riippuvuuden vaikutuksia, joita voidaan hyödyntää terapeuttisesti [13]. Tapauksissa geenin riippuvuus, kasvaimen solut tulevat fysiologisesti riippuvainen jatkumistoiminto aktivoitujen tai yli-ilmentyy onkogeenien jotka ovat siis ilmeinen ehdokas terapeuttisia kohteita. Esimerkiksi tehoa imatinibin (Gleevec) hoidossa leukemioiden joissa BCR-ABL fuusio [14] tarjoaa yhden kliininen esimerkki onkogeenin riippuvuutta ja miten sitä voidaan hyödyntää terapeuttisesti. Tunnistaminen

PIK3CA

validoitu lähestymistapamme tunnistaa kinaasit, jotka ovat välttämättömiä kasvaimen solujen eloonjäämistä.

korrelaatio solujen elinkelpoisuutta geenin ilmentymisen

Vaikka solu-geenistä vaikutuksia tunnistettu RNAi näyttö saattaa johtua aktivoivia mutaatioita, kuten

PIK3CA

, on todennäköistä, että muut voisivat syntyy, koska hankinnan kohonnut taso geenin ilmentymisen. Tämän tutkimiseksi suoritimme genominlaajuisten geeniekspressioprofilointi solulinjasta paneeli käyttäen ihmisen-6 v2 Illumina BeadChips [15] ja verrattiin tämän RNAi-näytön (taulukko S2). Expression profilointi tehtiin kolmena kappaleena ja kinaasien on merkittäviä eroja eri geenien ilmentyminen välillä solulinjoista tunnistettiin varianssianalyysillä. Geenejä, joissa ainakin yksi siRNA vähensi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden (taulukko 1), selvitimme korrelaatio solujen elinkelpoisuuden seuraavat siRNA transfektion ja geenin ilmentymisen. Tämä analyysi tunnisti neljä geenejä, joissa solujen elinkelpoisuus korreloi käänteisesti geenien ilmentyminen;

ADCK2

,

NAGK

,

TLR6-

ja

WEE1-

(kuvio 2 ja taulukko 1). Kukin näistä korrelaatioita ehdotti, että kohonnut geenin ilmentymistä kyseessä voi olla välttämätöntä tuumorin eloonjäännin kannalta, ja se voi näin ollen edustaa uutta terapeuttinen kohde.

a-d. Z pisteitä siRNA näytöt, Z scores≤-3 on korostettu punaisella pilkullinen laatikko. e-h. Normalisoituja ekspressiotasot lasketaan Illumina ilmaisun profilointi. Korkea ilme korreloi herkkyys siRNA, korostettu punaisella pilkullinen laatikko. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM). Merkityksen erot geenien ilmentymisen välillä solulinjojen arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA ja p-arvo näytetään kullekin solulinjoja. i-l. vertaaminen Z arvojen normalisoitujen ekspressiotasoja. Katkoviiva edustaa Z = -3 kynnystä merkittävän menetyksen elinkelpoisuuden vaikutukset (p 0,0015). Neljän geenit esitetty, kohonnut ilmentymistaso on sopusoinnussa menetys elinkelpoisuuden jälkeen siRNA transfektion. Taulukossa 1 Pearsonin korrelaatiota Z vs ilmaisun.

Toll-like-reseptori 6, (TLR6) tiedetään aktivoida tumatekijä kappa-B signalointi, ehdokas terapeuttinen tavoite syöpään [16] ja aktivointi TLR-reitin on hiljattain ehdotettu olevan rooli tuumorigeneesiä [17]. Toiminto on

ADCK2

(aarF domain sisältävän kinaasi 2) on vähemmän vakiintunut. NAGK (N-asetyyliglukosamiini-kinaasi) muuntaa endogeenisen N-asetyyliglukosamiini (GlcNAc), joka on tärkeä osa monimutkaisia ​​hiilihydraatteja, mistä lysosomaalisen hajoamisen tai ravitsemuksellista lähteistä GlcNAc 6-fosfaatti, osana katalyyttisen pelastaa kautta. Toiminta WEE1- tarkastellaan jäljempänä.

korrelaatio geenien ilmentymisen kanssa genomisen analyysin

tutki suhteellisen kohonnut ilmentyminen neljän geenien tunnistettu meidän RNAi näyttö voidaan selittää muutoksia geenien kopiomäärä (ts kopiomäärä voittoja ja /tai geenimonistuman). Geenikopiomäärä tutkittiin käyttäen microarray-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) analyysi ja overlayed RNAi ja geenien ilmentyminen tietojen (kuva 3, kuva S1 ja taulukko S3). Tämä yhdistetty analyysi osoitti, että jonkin solulinjat, kohonnut ilmentyminen

ADCK2

,

NAGK

tai

WEE1-

liittyi kasvua geenin kopioluvun mahdollisesti tunnistaa syy kohonneita ilme. MCF7-solut olivat erittäin herkkiä

ADCK2

siRNA ja tämä heijastui säätelyä transkriptin ja kasvu geenikopiomäärä osoitteessa

ADCK2

. Vastaavasti kasvu geenikopiomäärä oli yhdenmukainen koholla ilme ja siRNA herkkyys

NAGK

A549-soluissa. Lopuksi, herkkyys HeLa-solujen

WEE1-

siRNA oli yhdenmukainen voimistumista tämän geenin ja genomin vahvistus (kuvio 3 ja kuvio S1).

sirontakaavioissa havainnollistaa suhdetta geenin kopioluvun ja geenin ilmentymistä. Vertical katkoviivat ilmaisevat kynnysarvon kopiomäärä voitot (AWS suhteet 0,12).

Lisäkarakterisointia of WEE1-

WEE1- on hyvin määritelty merkitys solusyklin Checkpoint ohjaus, jossa WEE1- toimintaa rajoitetaan pro-mitoottinen vaikutus cdc2 (aka CDK1) [18]. Niinpä menetys WEE1- kinaasiaktiivisuuden ja sen tuhoaminen on vaatimuksena mitoosiin [19], mikä viittaa siihen, että WEE1- aktiivisuus voi todellakin rajoittaa kasvaimen solujen kasvua. Koska meidän RNAi tiedot osoittivat, että WEE1- on joissakin yhteyksissä, kriittinen elinkelpoisuuden syöpäsolut yli-ilmentävät sitä, tutkimme roolia tämän kinaasin entisestään. Ensin vahvisti, että WEE1- proteiinia yli-ilmennetään HeLa ja CAL51 solut, jotka tukevat myös RNA-analyysi (kuvio 4a). Vahvista korrelaatio herkkyys siRNA ja WEE1- ilmaisun WEE1- hiljennettiin riippumaton altaan siRNA: iden tarkoituksena on vähentää off-tavoite vaikutukset (WEE1- ONTARGETplus). CAL51 ja HeLa solulinjat olivat huomattavasti herkempiä hiljentäminen on WEE1- kuin solulinjat, jotka eivät yli-ilmennä WEE1- (kuvio 4b ja Kuva S2). Pienet molekyylit on kehitetty estävän WEE1- sillä perusteella, että estäminen tämän kinaasin voi johtaa kumotaan G

2 /M tarkastuspiste. Monet syöpäsolujen näytteille viallisen G

1 tarkistuspiste johtaa riippuvuus G

2 /M tarkastuspiste aikana solunjakautumista ja sellaisenaan estämällä G

2 /M tarkastuspiste voi olla tappava tässä yhteydessä [20]. Käytimme pienimolekyylinen WEE1- estäjä (PHCD [21]) vahvistaa valikoiva herkkyys CAL51 ja HeLa solulinjat WEE1- eston (kuvio 4c). Tutkimme myös muita solulinjoja WEE1- ilmaisun ja herkkyys WEE1- kohdentaminen, eturauhasen sinoomasolulinjoja PC3 ja DU145, ja ei-tuumorigeeninen rintojen epiteelisolujen linja MCF10A. Mikään näistä solulinjat ilmensivät korkeita WEE1- (kuvio 4a), ja, kuten odotettua, mikään ei ollut herkkä WEE1- kohdistaminen (kuvio 4b ja 4c).

a. Western blot-analyysi lysaatit valmistettiin HeLa, CAL51, MCF7, A549, NCI-H226, PC3, DU145 ja MCF10A soluja. Tunnistavaa vasta-ainetta WEE1- käytettiin β-tubuliinia latauskontrollina. WEE1- ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt HeLa ja CAL51 soluja verrattuna MCF7 A549, NCI-H226, PC3, DU145 ja MCF10A soluja. b. Vasen paneeli: Solujen elinkelpoisuus määritys transfektoiduissa soluissa WEE1- ONTARGETplus SMARTpool tai ONTARGETplus siControl. WEE1- hiljentäminen oli valikoivasti tappava WEE1- jotka ilmentävät liikaa HeLa ja CAL51 soluja. Virhe palkit ilmaisevat SEM kolminkertaisista transfektioista. Oikea paneeli: Western blot-analyysi lysaatit valmistettiin CAL51 transfektoitujen solujen WEE1- ONTARGETplus SMARTpool tai ONTARGETplus siControl. Tunnistavaa vasta-ainetta WEE1- käytettiin β-tubuliinia latauskontrollina. WEE1- ONTARGETplus SMARTpool vähentää merkittävästi WEE1- proteiinin ilmentymisen verrattuna siControl transfektoitujen solujen. c. Solunelinkykyisyysmääritys käsitellyissä soluissa WEE1- estäjä. WEE1- inhibitio oli selektiivisesti tappava WEE1- yli-ilmentävät HeLa- ja CAL51 soluja. Virhe palkit ilmaisevat SEM kolminkertaisista solusta hoitoja. d. Vasemmanpuoleisessa paneelissa: Western blot-analyysi valmistetut lysaatit soluista, käsiteltiin 5 uM WEE1- inhibiittoria 0, 6, 24 ja 48 tuntia. Tunnistavaa vasta-ainetta PARP käytettiin β-tubuliinia latauskontrollina. 24 tunnin kuluttua WEE1- eston aiheuttama PARP pilkkominen (Clvd PARP) vuonna WEE1- yliekspressoivat HeLa ja CAL51 soluissa, mutta ei aiheuttanut PARP pilkkominen MCF7 ja NCI-H226-soluissa, jotka ilmentävät WEE1- normaalilla tasolla. Oikeanpuoleinen paneeli: Caspase 3,7 aktiivisuutta soluissa käsiteltiin 5 uM WEE1- estäjä 24 tunnin ajan. WEE1- esto indusoi kaspaasi 3,7 aktivaatio WEE1- yliekspressoivat HeLa ja CAL51 soluissa, mutta ei aiheuttanut kaspaasin 3,7 aktivaatio MCF7 ja NCI-H226-soluissa, jotka ilmentävät WEE1- normaalilla tasolla. Virhe palkit ilmaisevat SEM kolminkertaisista solusta hoitoja. e. Vasemmanpuoleisessa paneelissa: Western blot-analyysi valmistetut lysaatit soluista, jotka oli transfektoitu WEE1- ONTARGETplus SMARTpool tai ONTARGETplus siControl. Tunnistavaa vasta-ainetta PARP käytettiin β-tubuliinia latauskontrollina. Hiljentäminen WEE1- aiheuttama PARP lohkaisu WEE1- yliekspressoivat HeLa ja CAL51 soluissa, mutta ei aiheuttanut PARP pilkkominen MCF7 ja NCI-H226-soluissa, jotka ilmentävät WEE1- normaalilla tasolla. Oikeanpuoleinen paneeli: Caspase 3,7 aktiivisuutta transfektoiduissa soluissa WEE1- ONTARGETplus SMARTpool tai ONTARGETplus siControl. Hiljentäminen WEE1- aiheuttama kaspaasin 3,7 aktivaatio WEE1- yliekspressoivat HeLa ja CAL51 soluissa, mutta ei aiheuttanut kaspaasin 3,7 aktivaatio MCF7 ja NCI-H226-soluissa, jotka ilmentävät WEE1- normaalilla tasolla. Virhe palkit ilmaisevat SEM kolminkertaisista transfektioista.

Yhteenvetona tuloksemme antaa viitteitä siitä, että solulinjat näyttämällä suurempia WEE1- ilmaisun ovat herkkiä WEE1- esto. Tutkia mekanismi herkkyyden näissä solulinjoissa, tutkimme tasot apoptoosin seuraavista WEE1- inhibition. Kemialliset esto WEE1- aiheutti apoptoosin ainoastaan ​​solulinjoissa korkeasti WEE1- ilmaisun (kuvio 4d), havainto vahvisti myös käyttämällä WEE1- siRNA (kuvio 4e).

Kliininen merkitys WEE1-

Tuloksemme viittaavat siihen, että WEE1- yliekspressio voi olla välttämätöntä kasvainsolujen elinkelpoisuuden. Siksi me kuulustelivat ilmaus WEE1- julkisesti saatavilla aineistoja yksityiskohtaisesti ekspressioprofiilit ihmisen rinta- kasvaimen solulinjojen ja kasvaimia [22], [23]. Tämä analyysi osoitti, että WEE1- ilmentyminen korreloi

WEE1-

geenikopiomäärä (Spearman p = 0.039) ja näyttää suuntaus (t-testi p = 0,06, Mann-Whitney testi p = 0,07) korkeampi ilmentyminen solulinjoissa luminaa- fenotyyppi (tuloksia ei ole esitetty). Sen Näiden tietojen perusteella, tutkimme WEE1- ilmentymisen immunohistokemiallinen (IHC). Expression of WEE1- arvioi IHC on formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut solulinja pellettejä korreloi ilme mitattiin western blottauksella, todisteeksi erityisyyttä WEE1- vasta-aineella (kuvio 5a). Sitten tutkittiin hyvin selityksin sarjan rintasyövistä [24], [25], ja todettiin, että 35% esillä tasot WEE1- ilmaisun kaltaisia ​​CAL51 soluja, jotka ovat herkkiä WEE1- inhibitio (kuvio 5b). Lisäksi korkeat WEE1- ilmaisun olivat ensisijaisesti löydetty rintasyöpiä kanssa luminaaliselle fenotyyppi, jotka on määritelty Nielsen et al. [26], sopusoinnussa analyysi rintasyövän solulinjoissa. Yhteydessä edellisessä tietojen syytetään WEE1- syövän tavoite, nämä immunohistokemialliset tiedot viittaavat siihen, että käyttö WEE1- estäjät saattavat olla tarkoituksenmukaista merkittävä osajoukko rintasyöpäpotilaiden.

a. WEE1- immunohistokemiallista värjäystä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut rintasyövän solulinjoissa ja invasiivisen rintasyövän hoitoon. Huomaa alhainen WEE1- ilmentymisen H226-soluissa ja pohjapinta-kuin rintasyövän ja korkeita WEE1- ilmentymisen CAL51 soluissa ja luminaalisen ja HER2 rintasyöpiä. (Harris hema- /DAB-värjäys; alkuperäinen suurennos x 200). b. Korkea WEE1- ilmaisun etusijassa ilmaistaan ​​luminal rintasyöpiä. Tapauksissa pisteytettiin mukaisesti Allredin pisteytysjärjestelmän [36], kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kunkin kasvain kirjoita prosenttiosuus kasvainten korkea WEE1- ilme näkyy. Korkea WEE1- ilme tilastollisesti merkitsevä suoraa korrelaatiota ilmentymisen estrogeenin ja progesteronin reseptoreihin ja sykliini D1, ja merkittävä käänteinen korrelaatio kasvaimen kokoa, histologisia laatu ja ilmentyminen kasvutekijän reseptorin (EGFR), sytokeratiini (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-1 merkintää indeksin ja caveolins 1 ja 2. Ei korrelaatioita WEE1- immunohistokemiallisella ilmaisun ja läsnäolo lymfoproliferatiivisten verisuonten invaasio, imusolmuke etäpesäke, HER2 lauseke tai geenin monistamisen, p53 ilmaus, ja

CCND1

ja

MYC

geenien monistuminen todettiin [24], [37] (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki tapaukset luokiteltiin luminaaliseen, HER2 ja pohjapinta-kaltaiset ryhmät mukaan immunohistokemiallinen paneelin kuvanneet Nielsen et al. [26].

Keskustelu

Suurin osa uuden lääkkeen hyväksyntöjen syövän hoitoon perustuvat olemassa oleviin tavoitteisiin. Sen sijaan heijastaa puuttuminen tavoitteista, tämä on ehkä osoitus kustannuksia ja paljon aikaa identifioida uusia terapeuttisia lähestymistapoja. Parallel RNAi seulonta voi sallia yksinkertainen, suurikapasiteettisten, lähestymistapa toiminnallisten kohteiden identifiointi, ja muut ovat myös käyttää rinnakkain RNAi seulonta tunnistaa mahdolliset kuljettajia tuumorigeneesiä ja Ehdokaskohteiden [27]. Meidän tunnistaminen

PIK3CA

, tunnettu onkogeeni ja terapeuttinen kohde, harmaan RNAi näyttöjä tarjoaa vahvaa aihetodisteet tätä lähestymistapaa. Lisäksi parannuksia RNAi tekniikka voi tehdä rinnakkain RNAi seulonta paljon yksinkertaisempi ja kustannustehokasta [28], [29]. Parallel RNAi näytöt yhdistettynä kumppani lähestymistapoja, kuten ilmaisun profilointi, genomista profilointi ja suurikapasiteettisten histopatologista ja immunohistokemiallinen analyysi on mahdollista tunnistaa mahdolliset kohteet, jotka ovat arvoinen lisätutkimuksia. Kun kyseessä on WEE1-, yhdistelmä RNAi seulonta, transkriptin profilointi, genomisen profiloinnin ja histologinen analyysi on johtanut siihen, että tunnistamisen potilaiden alaryhmässä (luminaalisen rintasyöpä), jossa esto tämän kinaasin voidaan tutkia mahdollisena terapeuttinen strategia. Sisältävät tämän lähestymistavan tavanomaiseen lääkeaineen tavoite määritysprosessiin on potentiaalia tehostaa uusien hoitomuotojen kehittämiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, yhdisteitä, plasmidit ja siRNA

MCF7, CAL51, HeLa, A549, NCI-H226, PC3, DU145 ja MCF10A-solut saatiin ATCC: stä (USA) ja pidettiin mukaan toimittajan ohjeita. WEE1- estäjä (681637) saatiin yhtiöstä Calbiochem (UK). MCF7 ja HeLa-solut transfektoitiin SMARTpool siRNA: t käyttäen Dharmafect 3 transfektioreagenssia; A549 ja NCI-H226-soluja transfektoitiin SMARTpool siRNA: t käyttäen Dharmafect 1 transfektioreagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden (Dharmacon). CAL51 soluja transfektoitiin SMARTpool siRNA: t käyttäen Oligofectamine transfektioreagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). DU145-soluja transfektoitiin SMARTpool siRNA: t käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Kinaasin siRNA-kirjasto (siARRAY – kohdistaminen 779 tunnetaan ja otaksutun ihmisen proteiinikinaasi-geenit) saatiin kymmenessä 96-kuoppaisille levyille päässä Dharmacon (USA). Jokainen hyvin tässä kirjastossa sisälsi SMARTpool neljästä eri siRNA lajia kohdistaminen eri sarjoissa kohteena transkriptin. Jokainen levy täydennettiin siCONTROL (kymmenen kaivoja, Dharmacon (USA)). WEE1- ONTARGETplus SMARTpool ja ONTARGETplus siControl saatiin Dharmacon (USA).

Vasta

Vasta kohdistaa seuraaviin epitooppeja käytettiin: WEE1- (4936, Cell Signaling, UK), PARP (9542, Cell Signaling, UK) ja β-tubuliinin (T4026, Sigma, UK). Kaikki toissijainen käytetyt vasta western blot-analyysi tehtiin HRP konjugoituna.

siRNA näyttö menetelmä

Solut 96- kuoppalevyillä transfektoitiin 24 tunnin kuluttua siRNA (lopullinen pitoisuus 100 nM), kohti valmistajan ohjeet. Kukin siRNA levy täydennetty 10 kuoppiin siControl. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja jaettiin kolme samanlaista replikointimaljoja. Media täydennettiin 48 tunnin kuluttua ja 96 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin seitsemän päivää käyttäen CellTiter Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tiedot kustakin solulinjasta käsiteltiin seuraavasti: luminesenssin lukema kullekin hyvin lautasella oli log

2 muunnetaan ja ilmaistu suhteessa mediaani luminesenssin arvo kaikkien kuoppien samalla levyllä (levy keskitys). Näitä tietoja normalisoidaan sitten mukaan mediaani koko näytön tietoja käyttämällä mediaani absoluuttinen poikkeama (MAD) arvioida todellinen vaihtelu kussakin näyttö [30]. Tämä normalisointi edusti vaikutus kullakin SMARTpool kussakin solulinjassa kuin Z pisteet [30] ja annettiin vaikutuksia kunkin SMARTpool elinkyvystä voidaan verrata koko solulinja paneelissa. AZ score≤-3 otettiin merkitys kynnyksen alentunut solujen elinkelpoisuuden, edustavat kolmea ensiapuorganisaatioiden päässä mediaani ja suunnilleen kolme standardipoikkeamaa.

Transcript profilointi

RNA uutettiin solulinjoista kanssa Trizol ja uutetaan fenoli /kloroformilla ja sen jälkeen saostus isopropanolilla. REACH solulinja, kolmena kappaleena uuttoa ja profiilit tehtiin. Biotiini-leimattu cRNA valmistettiin avulla lineaarisen vahvistuksen kit (IL1791, Ambion, Austin, TX, https://www.ambion.com) käyttäen 250 ng laatu tarkistetaan kokonais-RNA syötteenä. Chip hybridisaatiot, pesu, Cy3-streptavidiini (Amersham Biosciences) värjäys ja skannaus suoritettiin koskevasta Illumina BeadStation 500 (San Diego, https://www.illumina.com) alustalla käyttäen reagensseja ja seuraavia protokollia valmistajan toimittamia. cRNA näytteet hybridisoitiin on Illumina ihmisen-6 v2 BeadChips, joka kattaa noin 47000 RefSeq selostukset. Satunnaisen jakautuminen suuret populaatiot oligonukleotidin päällystettyjä helmiä kaikkialla käytettävissä tehtävissä ihmisen-6 v2 siru mahdollistaa keskimäärin 30 intensiteettimittauksiin per RefSeq, jolloin saatiin kvantitatiivisia arvioita geenien ilmentymisen [15]. Kaikki perustiedot ekspressiotietojen analyysi suoritettiin käyttämällä valmistajan ohjelmiston BeadStudio 3.1. Illumina ekspressioprofiileja tehtiin kolmena kappaleena, raakatietoja Sitten varianssi stabiloivia muunnetaan ja vankka ura normalisoidaan käyttäen Lumi paketin Bioconductor ohjelmistojen [31], [32]. Expression arvot jokaisesta näytteestä olivat mediaani skaalata ja keskimääräinen ilmaisun määritettiin yli kolme toistoa. Geenejä, joilla on merkittävä ero ilmaisun välillä solulinjojen tunnistettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Tämä transkripti profilointitiedot on nyt julkisesti saatavilla (ArrayExpress liittymistä: E-TABM-610).

Korrelaatio siRNA Z pisteet kanssa geenien ilmentymisen

Korrelaatio siRNA Z pisteet ja normalisoitu geenien ilmentyminen oli tutkitaan geenien jossa siRNA aiheutti merkittävän menetyksen elinkelpoisuuden (Z -3). Z tilanne oli verrattuna normalisoitu geenin ilmentymistä käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Geeni otettiin parhaillaan korreloi merkitsevästi jos Pearsonin korrelaatiokerroin oli merkittävästi erilainen nollahypoteesia, korrelaatio oli käänteinen, ja vaihtelu geenien ilmentyminen solujen välillä linjat olivat merkittävästi erilaiset kuin arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA.

Array CGH analyysimenetelmä

Genominen DNA uutettiin solulinjoista käyttämällä QIAamp DNA veren Mini Kit (51104, Qiagen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Microarray-pohjainen CGH analyysi suoritettiin in-house 32K laatoitus polku BAC array alustan kuten aikaisemmin on kuvattu [33], [34]. Kopio numero korrelaatioita, keskimääräinen adaptiivisen paino tasoitetaan (AWS) suhteet BAC: ien, jotka sisältävät mielenkiinnon kohteena olevan geenin, käytettiin kopioluvun korrelaatioita, ja kopioi numero kuten aikaisemmin on kuvattu [35]. Lyhyesti, AWS tasoitetaan log2 suhdearvot -0,12 luokiteltiin tappioita, ne 0,12 kuin voittoja, ja siltä väliltä muuttumattomana. Amplifikaatiot määriteltiin tasoitetaan log2 suhde arvot 0,4 [35]. Tietojenkäsittely ja analyysi tehtiin R 2.0.1 (https://www.r-project.org/) ja Bioconductor 1,5 (https://www.bioconductor.org/), hyödyntämällä laajalti muokattuja versioita paketit aCGH, marray ja AWS erityisesti.

Solujen elinkelpoisuus määritys mittaamaan WEE1- siRNA herkkyys

Solut maljattiin 96-kuoppalevyillä transfektoitiin 24 tunnin kuluttua WEE1- ONTARGETplus SMARTpool tai ONTARGETplus siControl (lopullinen konsentraatio 100 nM), kuten valmistajan ohjeiden. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja jaettiin kolme samanlaista replikointimaljoja. Media täydennettiin 48 tunnin kuluttua ja 96 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin seitsemän päivää käyttäen CellTiter Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega, USA) ja ilmaistu suhteessa tarkoitetaan luminesenssin kuopissa transfektoitu siControl.

Cell elinkyvyn mittaamiseksi lääkeaineen herkkyys

Solut maljattiin 96-kuoppalevyille, ja altistetaan eri annoksia WEE1- estäjä (Calbiochem, Cat. No. 681637, 4- (2-fenyyli) -9-hydroksipyrrolo [3, 4-c] karbatsoli-1,3- (2H, 6H) -dioni (PHCD)) [21]. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin CellTiter Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega, USA) 48 tuntia myöhemmin ja eloonjääntifraktio jokaisen lääkeannoksen arvioi jakamalla luminesenssin arvo huumeiden hoitaa luminesenssin arvo ajoneuvon.

Western a.