Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen molekyyli kuljettajien syövän sekven- on selkäranka tarkkuus lääketieteen ja perusteella yksilöllinen hoito; kuitenkin, koepaloja primaarikasvainten tarjoavat vain tilannekuvan taudin kehitys ja voi jäädä mahdollisia terapeuttisia kohteita, etenkin Metastasoituneessa. Nestemäinen biopsia, muodossa soluttoman DNA (cfDNA) sekvensointi, on mahdollista kaapata välisiä ja kasvaimen heterogeenisuus läsnä etäpesäkkeitä, ja, kautta sarja veren tasapeliä, seurata kehitystä kasvain genomin.

sen määrittämiseksi kliininen hyöty cfDNA sekvensointi suoritimme koko-exome sekvensoinnilla cfDNA ja kasvaimen DNA kahdelta potilaalta etäpesäkkeitä; vain pieniä muutoksia sekvensointialustamme ja analyysi putkistojen tarvittiin sekvensointi ja mutaation kutsumus cfDNA. Ensimmäinen potilas oli metastasoitunut sarkooma ja 47 48 mutaatioiden läsnä primaarikasvaimen havaittiin myös soluvapaassa DNA. Toinen potilas oli metastasoitunut rintasyöpä ja sekvensointi havainnut

ESR1

mutaatio cfDNA ja metastaattinen sivusto, mutta ei primaarikasvaimen. Tämä todennäköisesti selittää kasvaimen etenemistä on anastrotsoli. Merkittävät heterogeenisyys välillä ensisijainen ja etäpesäkkeitä, jossa cfDNA mikä etäpesäkkeitä, ehdotti erottaminen primäärivamma aikaisin kasvaimen kehittyminen. Tämä on parhaiten havainnollistettu aktivoiva

PIK3CA

mutaatio (H1047R), joka oli klonaalisen ensisijainen kasvain, mutta täysin puuttuu joko etäpesäke tai cfDNA. Tässä osoitamme, että cfDNA sekvensointi toimittaa kliinisesti käytännöllisiä tietoja mahdollisimman vähän riskejä verrattuna metastaattisen koepaloja. Tämä tutkimus osoittaa, hyödyllisyyttä koko-exome sekvensointi soluttoman DNA potilaista, joilla on metastaattinen sairaus. cfDNA sekvensointi tunnistanut

ESR1

mutaatio, mahdollisesti selittää potilaan vastustuskykyä aromataasin inhibitio, ja antoi tietoa siitä, miten etäpesäkeleesioita eroavat primaarikasvaimen.

Citation: Butler TM, Johnson-Camacho K , Peto M, Wang NJ, Macey TA, Korkola JE, et al. (2015) Exome sekvensointi Cell-Free DNA Metastaattinen syöpäpotilaiden Tunnistaa kliinisen toiminnan Mutaatiot Erotuksena Ensisijainen tauti. PLoS ONE 10 (8): e0136407. doi: 10,1371 /journal.pone.0136407

Editor: Kristy L. Richards, Cornell University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 17 marraskuu 2014; Hyväksytty: 04 elokuu 2015; Julkaistu: 28 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Butler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki .bam sekvensointi tiedostot ovat saatavilla Euroopan Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena) (liittymisen numerot ERS700862, ERS700863, ERS700864, ​​ERS700858, ERS700859, ERS700860, ERS700861).

Rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

Kilpailevat edut: Chritopher Corless sai palkkiot ja tutkimuksen tuki Ion Torrent /ThermoFisher. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Vuonna 2014 oli yli 500.000 syöpään liittyvistä kuolemantapauksista Yhdysvalloissa; 90% näistä kuolemista etäpesäkkeitä. [1, 2] Kun syöpä on ominaista kloonivalinnalla etenemistä, etäpesäkeleesioita ja uusiutuva sairaus voivat poiketa huomattavasti primaarikasvaimen, kätkeminen ainutlaatuinen mutaatioiden kliinistä merkitystä. [3] tunnistaminen näitä eroja, koska ne syntyä vaatii sarja näytteitä kasvain genomin, [4] usein useista metastaasien, joka on saattanut rajoittaa toteutettavuuden vuoksi teknisiä haasteita tai taloudellista taakkaa. Sequencing veriplasmasta on kuitenkin mahdollista tunnistaa nämä muutokset ilman invasiivisuus liittyy kiinteiden kasvainbiopsioissa. [5-7]

jälkeen havaitsemista mutanttimuotoihin

KRAS

ja

sääntelyviranomaisten

plasmassa syöpäpotilaita, tutkijat ovat pyrkineet cfDNA muotona ”nestemäinen koepala” yksilön syöpä, käyttää sitä tunnistaa onkogeenisen muutoksiin eri syöpäsairauksia. [8-14] muutokset verenkierrossa kasvain DNA (ctDNA) aikana hoito voidaan mitata helposti kautta sarja näytteitä johtuen vähän invasiivisia luonteeltaan veren tasapeliä. [15-19] Aikaisemmat tutkimukset ovat keskittyneet määrällisesti ctDNA tasoilla mitata sairauksien, [15, 19, 20] etsitään resistenssin mutaatioiden tiettyihin hoitoihin, [18, 21-23] tela kasvain evoluutio, [18] ja arvioi ennusteen [12, 24, 25] ja uusiutumisen riski. [16] havaitseminen ctDNA edellyttää erityisesti herkkiä menetelmiä johtuu sen laimennus DNA ei-syöpäsolujen, joissa variantti alleeli prosentit niinkin alhainen kuin 0,01% alussa tauti. [12, 26, 27] tutkimuksessa kasvaimia vaihdetta sekä vaiheissa on havainnut, että vaikka ctDNA tasot vaihtelevat huomattavasti näytteiden välillä, etäpesäkkeitä korreloi korkeamman cfDNA plasmassa ja suurempi osa ctDNA. [6, 28] suhteellinen runsaus cfDNA ja ctDNA tekee siitä hyvin sopii koko-exome sekvensointi [18], jossa toisin kuin paneelit keskittyen hotspot tai potilas-mutaatioita, on mahdollista tunnistaa uusia mutaatioita, antaa sille ainutlaatuista arvoa tutkimuksessa terapeuttisen vastuksen ja kasvaimen kehittymistä. Koko-exome sekvensointi plasmasta on osoittanut korkeita välistä yhdenmukaisuutta mutaatioita kasvainkudoksessa ja cfDNA in etäpesäkkeitä; kuitenkin aiemmin tämä on osoitettu ainoastaan ​​näytteissä on poikkeuksellisen korkea ja ctDNA tasolla (33-65% of cfDNA kasvain alkuperää), suuresti rajoittaa sen kliinistä hyötyä. [18]

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta koko-exome sekvensointi plasmasta kahden potilailla, joilla on metastaattinen sairaus. Huomasimme, että vain pienin muutoksin meidän kokeellisia ja analyysimenetelmät voisimme tarkasti kerrata kasvain genomin plasmasta, tunnistaa samat kliinisesti merkittäviä mutaatiot tunnistettiin sekvensoimalla kasvainbiopsioissa, ja saada uusia tietoja sairauden kehittymistä. Nämä menetelmät olivat herkkiä näytteessä, jonka keskimääräinen ctDNA variantti prosenttiosuus 3,7%, mikä osoittaa noin 7,4% cfDNA oli kasvaimen alkuperän (ctDNA), riittävän alhainen tunnistaa ctDNA huomattavaa osaa metastaattisen potilailla. [6, 12, 16 ] Olemme päätellä, että cfDNA sekvensointi Metastasoivassa syöpää lainaa arvokasta tietoa tutkimuksen ja sairauden hoitoon.

tulokset

Potilas # 1

52-vuotiaiden vuotias nainen oli diagnosoitu primaarinen sisäkalvon sarkooma keuhkovaltimon joka oli leikkaushoitoon klo esitys. Potilas oli aluksi saaneet sädehoitoa jälkeen kemoterapiaa (kuvio 1) ja tällöin hänen kasvain seulottiin onkogeenisten mutaatioiden avulla multipleksoidun massaspektroskopia perustuva määritys, joka paljasti, että läsnä on

PIK3CA

R88Q ja Q546R että primaarikasvaimen. [29] Tämän seurauksena hän tuli vaiheen I kliinisen tutkimuksen, joka PI3 estäjä ja oli osittainen vaste, joka kesti 12 kuukautta. Kaksikymmentä kuukautta diagnoosin jälkeen primaarikasvaimen DNA seulottiin uudelleen käyttämällä kohdennettua paneelia Ion Torrent PGM. Tämä vahvisti

PIK3CA

mutaatioita mutta myös paljasti

KRAS

G12R. Veren piirtää otettiin tähän aikaan, eristämällä 1 ml valkosolukerros ja 25mls plasman (taulukko 1). Tuolloin verinäytteen potilaan oli lukuisia vaurioita keuhkoissa, keuhkovaltimon, ja maksassa (taulukko 1). Koska korkea pitoisuus cfDNA plasmassa (63ng /ml), koko-exome sekvensointi suoritettiin. Perustuu

KRAS

mutaatio, potilas sitten ilmoittautunut vaiheen Ib kliinisestä tutkimuksesta Yhdistämällä MEK ja PI3 estäjät. Hoito lopetettiin kahdeksan kuukauden jälkeen johtuen aiheuttamien komplikaatioiden hoito, ja potilas kuoli 30 kuukauden kuluttua alustavan diagnoosin.

A) Potilaan diagnosoitu sisäkalvon kara lusarkooma keuhkovaltimon. Hoidot ja näytekokoelmatodistuksesta ilmoitetaan kuukausina.

tilavuus plasmaa kerätään yhden veren piirtää. cfDNA kvantifioitiin käyttäen Quan-IT HS pico green kit.

Koko-exome sekvensointi ensisijaisen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kasvaimen paljasti 48 somaattisten, eksonisekvenssit mutaatiot (kuvio 2A, taulukko 2. teimme koko-exome sekvensointi cfDNA (524X keskisyvyys) ja jonka kynnys on 1,5% variantin alleelin prosenttiosuus tunnistimme 47 48 somaattisten mutaatioiden läsnä ensisijainen. Noissa 48 sivustoja keskimääräinen sekvensointi syvyys cfDNA oli 561X (181-1,197X). keskimääräinen variantti alleeli prosenttiosuus kaikkiin näihin 47 mutaatiota oli 3,7%, mikä osoittaa, että noin 7,4% plasman DNA kasvaimen alkuperän. Mikä tärkeintä, tunnistimme plasmasta aktivoivan

KRAS

G12R mutaatio ja molemmat aktivoivat mutaatiot

PIK3CA

(R88Q ja Q546R). hallinta sekvensointia syvyys, määrä cfDNA mutantti lukee tai variantti alleeli prosenttiluku ensisijainen kudoksessa ei merkittävästi parantaa korrelaatiota.

A) käyttäen sulku 1,5% variantin alleelin prosenttiosuus, 46 47 mutaatioiden läsnä kasvain tunnistettiin cfDNA. Arvioimisen keskimääräinen variantin alleelin prosenttiosuus 3,8%, 7,5% cfDNA oli peräisin kasvaimeen. B) Viisitoista muita mutaatioita kutsuttiin siinä cfDNA joita ei kutsuttu kasvaimen näytteessä. Neljä näistä ovat läsnä kasvaimessa, mutta alle meidän jossa sulku 10% kasvaimen. Geenit korostettu punaisella onnistuneesti validoitu kautta sekvensointi on Ion Torrent PGM. Noin 4000 genomien cfDNA käytettiin syötteenä validoinnit, antaa meille pienempi herkkyys sidottu of +0,025-0,5% riippuen paikkasidonnainen tausta virheprosentti.

Yhteenveto sekvensointi tietoa kaikkien kymmenen sekvensointi suoritetaan. Kaikki lukee luetellaan miljoonia. Liittyminen numerot for.bam formaateissa Euroopan nukleotidi- Archive säädetty, sillä sarkooma potilaaseen 3 cfDNA kulkee yhdistettiin single.bam tiedosto erotettu lukea ryhmässä.

Viisitoista ylimääräistä mutaatiota tunnistettiin cfDNA . Näistä 11 oli ole läsnä ensisijainen numero ja neljä oli läsnä primaarikasvaimen (kuvio 2B), mutta alleelin taajuuksilla alle meidän 10% kynnyksen soittamalla heille primaarikasvaimen. Nämä mutaatiot valittiin validointi sekvensoinnilla Ion Torrent PGM, jossa kuusi heistä vahvisti, kahdeksan ei validoida, ja yksi ei-sekvenssin (kuvio 2B). Validointi osuus 43% korostetaan tarvetta käyttää ortologiset sekvensointia menetelmiä läsnäolon vahvistamiseksi matalataajuista mutaatioiden cfDNA. cfDNA variantti alleeli prosenttiosuus korreloi huonosti primaarikasvaimen (kuvio 3).

A) cfDNA variantti alleeli prosenttiosuus on huonosti korreloivat primaarikasvaimen variantti alleeli prosenttiyksikköä.

Potilas # 2

41-vuotias nainen oli diagnosoitu ER + HER2 + rintasyöpä, joka oli levinnyt imusolmukkeisiin. Potilas koki neoadjuvanttikemoterapian (TAC) ja sen jälkeen kahdenvälinen rinnan ja munasarjojen poisto (kuvio 4A). Leikkauksen jälkeen potilas koki sädehoito ja käsiteltiin Trastutsumabi yhden vuoden ja Anastrotsolia 33 kuukautta, kunnes löytö 4cm maksan vaurio ja etäpesäkkeitä luustossa klo 11

th rintakehä nikama (T11). Muita kemoterapiaa ja Herceptin annettiin mutta hoito lopetettiin seuraavien tunnistamista maksametastaaseja. Tällä hetkellä keräsimme veri vetää noin 30 minuuttia ennen maksabiopsia otettiin ja saanut arkistoituja FFPE näyte primaarikasvaimen. Veren piirtää tuotti 15mls plasman keskimääräinen cfDNA pitoisuus 98ng /ml (taulukko 1). Sen jälkeen ensimmäinen plasma näyte potilas koki hoito anti-Her2 huumeiden TDM1 mutta ajan aluksi osittainen vaste kuoli 62 kuukautta jälkeen alustavan diagnoosin.

A) Hoidot ja näytekokoelmatodistuksesta ilmoitetaan kuukausina. B) 48 yhteensä somaattiset mutaatiot kutsuttiin ensisijainen rinta kasvain ja /tai maksan etäpesäke. 38 mutaatiot kutsuttiin vuonna cfDNA muunnelman alleeli prosenttiosuuden sulku 1,5%. Geenit punaisella onnistuneesti validoitu Ion Torrent PGM, geenien sininen ei validoida, geenit olivat mustia oltu todennettu.

Koko-exome sekvensointi primaarikasvaimen ja maksan etäpesäke paljasti yhteensä 48 nonsynonymous somaattisista mutaatioista (kuvio 4B, taulukko 2). Sekvensointi cfDNA keskimäärin syvyys 309X tunnistettu 38 näistä mutaatioista, joiden keskimääräinen variantin alleelin osuus 14%, mikä osoittaa noin 28%: cfDNA oli kasvaimen alkuperän. cfDNA VAP korreloivat hyvin VAP maksan etäpesäkkeiden (kuvio 5A ja 5B), mutta korreloi huonosti primaarikasvaimen (tuloksia ei ole esitetty). Muita syvä sekvensointi vahvisti, että aktivoiva

PIK3CA

(H1047R) mutaatio oli läsnä vain primaarikasvaimen, ei maksassa etäpesäkkeitä tai cfDNA, mikä osoittaa, että joko mutaatio ilmennyt vasta etäpesäke tai ei ollut läsnä alaryhmässä että kylvetään etäpesäke. Seitsemäntoista ylimääräisiä somaattiset nonsynonymous mutaatioita kutsuttiin plasmasta näytteestä. Tarkemmassa tarkastelussa kävi ilmi, että kahdeksan näistä (47%) oli ainutlaatuinen plasma, mahdollisesti peräisin metastaasien ei näytteitä (Kuva 5C). Kaksi näistä mutaatioista valittiin validointi kautta Ion Torrent PGM, molemmat validoitu (kuvio 5C).

A) cfDNA variantti alleeli prosenttiosuus korreloi maksan etäpesäke variantti alleeli prosenttiosuus B) Suurin parsimony puu osoittaa sukulaisuuden näytteiden, haara pituus on määrä somaattisten, nonsynonymous mutaatiot C) Seitsemäntoista uusia mutaatioita tunnistettiin yksikäsitteisesti cfDNA, joista 9 on lukee tukea niitä ensisijaisen ja /tai täytetty, mutta jossa ei kutsuttu riittämättömän sekvensointi syvyyden tai variantin alleelin prosenttiosuus. Geenit punaisella onnistuneesti validoitu Ion Torrent PGM, geenien sininen ei validoida, geenit olivat mustia oltu todennettu.

sekvensoimalla cfDNA plasmasta voimme saada tilannekuvan kasvain , todennäköisesti useista metastaasien. Tässä yhteydessä suuren korrelaatio maksan etäpesäke ja cfDNA oli huomattavia tietoja nykyisestä kasvain genomin voisi voiteta ilman koepala. Mutaatio

ESR1

(D538G), joka on osoitettu antamaan resistenssin estrogeenideprivaatiohoidon, havaittiin sekä koepaloja etäpesäkkeitä ja cfDNA. [30, 31] Tämä mutaatio ei ollut läsnä alkuperäisen exome sekvenssi primaarikasvaimen ja sen puuttuminen varmistettiin myöhemmin validoivat sekvensoimalla

ESR1

syvyyteen 4,272X (kuvio 6A). On todennäköistä, että vastus kasvaimen aromataasi-inhibiittori anastrotsoli voidaan selittää mutantti

ESR1

. Tämä mutaatio varmistettiin CLIA laboratorio- ja anti-estrogeenireseptorin käsittelyt katsottiin välillä cfDNA sekvensointi ja potilaan kuoleman. Kaikkiaan 15 mutaatioiden valittiin validointi Ion Torrent PGM, joista 13 on validoitu (kuviot 4B ja 5C). Toinen plasma otettiin näyte aikana vaste TDM1 hoitoon (määritettynä TT) ja kahdeksan mutaatiot läsnä esikäsittelyssä cfDNA näytteen määrä määritettiin aikana hoitoa otetusta näytteestä (kuvio 6B). Esikäsittelyssä cfDNA näyte oli keskimääräinen variantti alleeli osuus 13% poikki näistä kahdeksasta sivustoja, kun hoidon aikaiset näyte oli keskimääräinen variantti alleeli osuus vain 0,04% neljässä sisältävien sivustojen mutantin lukee ja mitään havaittavaa mutantti lukee neljällä mutaatioista testattu.

)

ESR1

mutaatio sekvensoitiin syvällisemmin sen Ion Torrent PGM. B) vertailu alleelifrekvenssit välillä ennen ja sen aikana-TDM1 hoidon cfDNA näytteitä kahdeksan mutaatioiden läsnä esikäsittelyssä näyte.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että koko-exome sekvensointi cfDNA peräisin Metastasoivassa syöpä voidaan täsmällisesti tunnistaa kliinisen toiminnan mutaatioita, ja vaatii vain vähän muutoksia vakiintuneisiin sekvensointi protokollia. Pystyimme järjestyksessä ja saada arvokasta tietoa plasma näyte, jonka keskimääräinen variantti alleeli prosenttiosuus 3,7%, paljon alhaisempi kuin arvot osoittivat aiemmissa tutkimuksissa ja selvästi alle taajuudet huomattava osa metastaattisen syöpäpotilailla. [12, 15, 16, 18, 19] hyväksyminen tämän lähestymistavan avulla on mahdollista suuresti laajentaa hyödyllisyys sekvensointi verrattuna koepalan riippuvaiset lähestymistapoja, jotka ovat tällä hetkellä tavanomaista hoitoa. Mutaatiot läsnä cfDNA tiiviisti korreloi mutaatioita esiintyy synkronisessa etäpesäke näyte, joka osoittaa, että sekvensointi cfDNA voi tuottaa tarkemman kuvan potilaan etäpesäkekasvainten genomin kuin luottaa biopsia primaarikasvaimen. CfDNA tiiviisti korreloi kasvainkudoksen otettu aikaan plasman hankinta- ja siksi sitä voidaan käyttää ottamaan ”tilannekuvia” syövän genomin. Lisäksi mutaatiot ainutlaatuinen cfDNA havaittiin sekä potilaiden, mahdollisesti edustaa vaurioita ei näytteet koepala. Validation kautta ortologiset sekvensointimenetelmiin vahvisti, että nämä mutaatiot eivät normaalista kudoksesta tai tulos sekvensointivirheitä ja todennäköisesti sivustoja ei ole läsnä koepala. Kyvyttömyys näyte kaikki metastaasien sisällä syöpäpotilaan on vakava rajoitus nykyisten sekvensointitekniikoilla, ja voidaan ratkaista mahdollisimman vähän muutoksia standardin sekvensointimenetelmistä käyttäen cfDNA.

Kaksi potilasta tässä tutkimuksessa oli korkea cfDNA niiden plasman (taulukko 1), joka antoi meille mahdollisuuden käyttää yli 100 ng cfDNA rakentaa sekvensointialustamme kirjastoissa. Kuitenkin monet potilaat pitoisuutena 10 ng cfDNA millilitrassa plasmaa on tyypillistä, mikä osoittaa, että useita veren viennit tarpeen saada riittävästi materiaalia sekvensointi. Huomattuaan tämän, hyväksyimme menetelmiä hahmoteltu Capp-Seq paperi Diehn lab [19], jonka avulla kirjastot tehdään tehokkaammin, vaatii vähemmän alkupanos DNA. Näillä menetelmillä onnistuneesti valmistettu kompleksi kirjastot alle 40 ng of cfDNA ja onnistuneesti sekvensoitiin ~ 25% tulo DNA-molekyylien (toisin kuin ~ 1% hyötysuhde saavutetaan tutkimuksessamme). Tämä parannus on antanut meille mahdollisuuden sekvensoida riittävä cfDNA lähes kaikille aiheista.

Toinen etu sekvensointi cfDNA on kyky sekvensoida sarjatuotannossa kerätään ja vähän invasiivisia plasmanäytteistä, mikä mahdollistaa lähes reaaliaikaisen seurannan kasvain genomin hoidon aikana. Tunnistaminen kehittyvät mutaatiot voivat sallia hoitoja voidaan käynnistää tai pysäyttää heti, kun kasvain ympäristö tekee tästä edullinen. Kun kyseessä on potilaan # 2, on mahdollista, että sarja cfDNA sekvensointi olisi tunnistettu syntyminen

ESR1

mutaatio ja hoito on voitu säätää estrogeenideprivaatiohoidon (anastrotsolia) yhteen kohdistaminen estrogeenireseptorin itse (

e

.

g

. Fulvestrantin): tämä muutos, ja mahdollisesti muut, saattanut viivästyttää sairauden etenemisen. Sen lisäksi etsii tunnettujen resistenssimekanismien luonne koko-exome sekvensoinnin avulla pyritään tunnistamaan uusien toistuvien resistenssimekanismeja kohortin olevia potilaita saman kohtelun, jota ei saa sisällyttää kohdennetusti paneelissa. Erityisesti aikana vaste potilaan # 2 TDM1 oli dramaattinen väheneminen tason ctDNA, jolloin se lähes ei havaita sekvensointialustamme lähestymistapaa. Seuranta kautta exome järjestyksessä näinä aikoina vaatisi erittäin korkea sekvensointi syvyyttä, joka olisi kohtuuttoman kallista nykyisen sekvensoimalla kustannuksia.

Huomattava painopiste on saatettu sekvensointi primaarikasvainten ja massiivisia sekvensointi hankkeisiin (TCGA

et ai

.

) B ovat paljastaneet huomattava määrä tietoa kuljettajan mutaatioiden erilaisia ​​syöpiä. Kuitenkin metastaattinen kasvaimia, jotka ovat vastuussa suurimmasta potilaan kuolemaa, ovat huomattavasti vähemmän tutkittu ilmiö. Sekvensoimalla primaarikasvainten yhdessä sarjatuotantona kerätyt plasmanäytteet on mahdollista seurata metastasointiin at genomista tasolla. Potilaan # 2 havaitsimme aktivoiva

PIK3CA

mutaation primaarikasvaimen, että ei havaittu joko maksan etäpesäkkeiden tai cfDNA. On todennäköistä, että joko

PIK3CA

mutaatio tuli klonaalisen jälkeen metastaattista prosessin tai että mutaatio ei ollut läsnä metastaattisen klooni; riippumatta, hoito PI3K estäjän ehkä ovat olleet tehokkaita kutistuu ensisijainen vaurio, mutta olisi ollut tehoton jokin kaukainen etäpesäke. Sen sijaan, sekvensointi potilaan # 1 osoitti, että cfDNA jaettua sisälsi lähes kaikki mutaatiot tunnistettiin primaarikasvaimen. Vaikka emme voineet saada näyte etäpesäke, vähäinen lukumäärä mutaatioita ainutlaatuinen cfDNA tarkoittaa ei ole kohtuutonta päätellä, että oli olemassa suhteellisen vähän eroja etäpesäke ja primaarikasvaimen. Sekvensoinnin cfDNA suurempien kohortin potilaista saattaa auttaa meitä ymmärtämään, kuinka metastasointiin vaihtelee eri kasvaintyypeissä ja voi tunnistaa terapeuttisesti relevantti kuvioita. Kliininen hyöty tämän menetelmän riippuu suurelta osin järjestelmällistä tehtävän kohdennettujen hoitomuotojen tunnistettuihin cfDNA mutaatioita.

Erityisesti palveluja cfDNA sekvensointia ovat tulossa kaupallisesti saatavissa, mutta ne perustuvat paneelien ja siksi on rajallinen käyttökelpoisuus on Tutkimusasetelma. Osoitamme tässä, että on olemassa merkittävä arvo koko-exome sekvensoitiin cfDNA.

Materiaalit ja menetelmät

Patient ilmoittautuminen

Kirjallinen suostumus saatiin kaksi Metastasoivassa syöpään ilmoittautuminen tässä tutkimuksessa. Tutkimus ja lupamenettelyjen hyväksyttiin Oregon Health Science University Institutional Review Board ja noudattaen liittovaltion ja institutionaalisten ohjeiden. Jopa 40mls verta kerättiin EDTA-putkiin. Plasma eristettiin kuten aiemmin on kuvattu [16], ja sitä säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes cfDNA uutettiin käyttämällä QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). Buffy coat eristettiin samasta verinäytteestä, ja DNA uutettiin käyttämällä DNA veren Mini Kit (Qiagen). Osana edellä mainitun tutkimuksen ja -hyväksyntämenettelyä, FFPE kudosta potilaan primäärikasvaimissa hankittiin arkistoitu patologian näytteitä. Potilas # 1: n näyte hankittiin University of Washington patologian osaston Seattle, WA (https://www.pathology.washington.edu/clinical/dermpath/contactinfo). Potilas # 2: n näyte hankittiin Kompassi Oncology Vancouver, Washington (https://compassoncology.com). FFPE kudos uutettiin käyttäen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen). Sama Potilaan maksan etäpesäke otettiin jäädytetty ydin koepala ja uutetaan DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen).

Koko-exome sekvensointi

vähintään 100 ng cfDNA ja 0.3-2μg DNA buffy coat ja kasvainkudoksen käytettiin luomaan sekvensointi kirjastoja. Agilent SureSelect XT reagenssit ja protokolla valmistamiseen käytettiin sekvensointiin kirjastoihin. DNA buffy coat, ja kasvainkudoksen sonikoitiin keskimääräinen koko on 150bp käyttäen Covaris E220. Plasman DNA-näytteet eivät sonikoitiin, plasma DNA on jo erittäin hajanaiset. Hybrid capture suoritettiin käyttäen Agilent SureSelectXT Human Kaikki eksoni V4 + UTR. 100bp pariksi-end sekvensointi suoritettiin koskevasta Illumina HiSeq 2000. Koko kaista oli omistettu sekvensointi plasman DNA-näytteet ja kaikki muut kirjastot sekvensoitiin kaksi-to-a-kaistaa. Maksimoida sekvensointi syvyyttä ja välttää PCR kaksoiskappaleita, plasma näyte potilaasta metastasoitunutta sarkooma tehtiin kolmeen erilliseen kirjastoihin, kukin sekvensoitiin toisella täysi kaista kunkin eli keskimäärin sekvensointi syvyys 1,034X. Vain yksi kirjasto saavuttamiseksi tarvitaan riittävä kattavuus cfDNA potilaalle # 2.

bioinformatiikka- analyysi

Jotta voidaan havaita mutaatioita me kohdistettuina HiSeq pariksi lopussa lukee kanssa hg19 ihmisen viitaten genomin käyttäen BWA. [32] Käytimme bwa aln löytää koordinaatit tulo lukee ja sitten käytetään bwa mem luodakseen linjauksia on sam muodossa. Me muunnetaan sam muodossa bam (binary) muotoon Samtools tuonti. Lajittelun jälkeen ja indeksointia lukee bam muotoiltu tiedosto, käytämme Picard Tools [33] MarkDuplicates poistaa päällekkäisiä lukee syntyvä PCR vahvistusasteen: poisto tapahtuu löytää kaikki lukee, joissa on tarkasteltu 5 ’koordinaatit ja pitää vain luku- pari korkein pohjan laatu summia. Sen jälkeen kahtena poisto me uudelleenlinjattu lukee noin SNVs ja indeleitä käyttämällä GATK Ohjelmarekisteri. [34, 35] kolme kirjastoa on sarkooma potilaan yhdistettiin PCR: n jälkeen kahtena poisto: paikalliset kannat kohdistaa varten Uudelleensuuntauksen kutsuttiin käyttämällä RealignerTargetCreator ja lukee sopeutettiin käyttäen IndelRealigner. Lopuksi, laatu pistemäärät kalibroida. Tämä tehtiin käyttämällä GATK BaseRecalibrator ja PrintReads, joka binned lukee perustuu alkuperäisen laadun pisteet, dinukleotidi, ja asema lukea. Sekvensointi tilastot on esitetty yhteenvetona taulukossa 2, ja luotiin käyttäen Samtools flagstat, GAKT DepthOfCoverage, ja Bedtools pairToBed.

Soita mutaatiot vertasimme kasvainnäytteissä normaalin näytteitä muTect v1.1.4 käyttäen buffy coat kuin Hyväksytty normaali. [36] vaihtoehdot katsottiin somaattiset mutaatiot jos: (a) ne eivät olleet läsnä dbSNP tietokantaan (paitsi jos muunnos oli myös COSMIC tietokannassa esimerkiksi

KRAS

ja

PIK3CA

mutaatiot), (b) oli ≥30x sekvensointi syvyyden että sivusto kasvain /plasma näyte ja ≥10x sekvensointi syvyys sovitetussa normaalissa näytteessä, (c) se oli muunnelma alleeli prosenttiosuus ≥10% varten kasvainnäytteestä ja ≥1.5% plasman näytteitä, ja (d) oli ainakin kaksi lukee sisältävän variantin alleelin. Mutaatiot cfDNA sitten edelleen suodatetaan pois, jos vastaaviin normaaleihin oli 1 lukea tukevat mutaatio tai mutaatio oli läsnä vain yksi säie on cfDNA. Vaikutus varianttien tarkistettiin käyttäen Mutaatio arvioija v2 (www.mutationassessor.org).

Mutaatio validointi

Alukkeet suunniteltiin kattamaan valikoima mutaatioita tunnistettiin kunkin potilaan ja sitten käytetään monistamiseen PCR valkosolukerros, plasma, ja kasvaimen DNA-näytteet sekä potilaiden. Kunkin näytteen, amplikoneja yhdistettiin vuonna ekvimolaariset määrät ja 10-100 ng käytettiin kirjaston luomisen käyttäen Ion Xpress Plus Fragment Library Kit. Sekvensointitemplaatit luotiin käyttäen emulsio PCR Ion OneTouch 2 käyttäen Ion PGM Template OT2 200 kit. Jopa kuusi viivakoodilla näytteet multipleksoida Ion 316 v2 pelimerkkejä. Sekvensointi suoritettiin Personal Genome Machine (PGM) sekvensseri (Ion Torrent) käyttäen Ion PGM 200 v2 sekvensointireagenssipakkausta. Torrent Suite ohjelmistoversio 4.0.2 käytettiin yhdenmukaistaa lukee hg19. Lukee visualisoitiin käyttäen IGV v 2.2.32 (Broad Institute) ja variantti alleelifrekvenssit määritettiin sivustojen aiemmin tunnistettu kautta Illumina sekvensoinnilla.