Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Otto Warburg havaittu, että syöpäsolut ovat usein ominaista voimakas Glykolyysivaiheen läsnäollessa hapen ja samanaikainen lasku mitokondrioiden hengitykseen. Tutkimus on keskittynyt pääasiassa mahdollisesta yhteydestä lisääntynyt Glykolyysivaiheen ja kasvainten kehittymiseen taas laski hengitys on pitkälti jätetty vartioimatta. Siksi syy suhde laski hengitys ja kasvaimen kehittymisen ei ole osoitettu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tätä tarkoitusta varten pesäkkeet

Saccharomyces cerevisiae

, joka soveltuu manipulointi mitokondrion hengitystä ja osoittaa mitokondrioita-välitteisen solukuoleman, käytettiin mallina. Tukahduttaminen hengitys sekä ROS-puhdistusjärjestelmä kautta glutationin esti apoptoosin ja koitui selviytymisen etu aikana kylvö ja varhaista kehitystä tässä nopeasti lisääntyvien vankka solupopulaation. Sen sijaan parantaminen hengityksen laukaisi solukuoleman.

Päätelmä /merkitys

Näin Warburg vaikutus saattaa suoraan edistävät aloittamisen syövän muodostumisen – paitsi tehostetun Glykolyysivaiheen – mutta myös kautta väheni hengityksen hapen läsnäollessa, joka tukahduttaa apoptoosin.

Citation: Ruckenstuhl C, Büttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) Warburg vaikutus vaimentaa Oksidatiivinen stressi aiheutti apoptoosia Hiiva malli Cancer. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10,1371 /journal.pone.0004592

Editor: Julian Rutherford, Newcastle University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 26 elokuu 2008; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2009; Julkaistu: 25 helmikuu 2009

Copyright: © 2009 Ruckenstuhl et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan FWF-FSP S93 FM- ja myöntämään EU STREP 511983 (TransDeath) KU. F .. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

1920 Otto Warburg kuvattu yleisin biokemiallinen fenotyyppi kasvainsolujen: vaikka läsnä normaalin hapen taso, Glykolyysivaiheen on erittäin kohonnut ja liittyy korkea laktaattituotanto sekä rajusti mitokondrioiden hengitys [1] – [3]. Vaikka tämä fenotyyppi on perusta kasvaimen diagnostiikka seurantaa glukoosinkulutusta [4], haastavia kysymyksiä ovat edelleen vaikeasti: esimerkiksi miten kasvainsolut hyväksyttävä tämä fenotyyppi eri mekanismeilla [5], [6], ovatko molemmat ilmiöt (korkea Glykolyysivaiheen ja laski hengitys) ovat olekaan yhteydessä [7], [8], ja lopulta ne osallistuvat kasvaimien syntyyn [7], [9] – [11].

nopeasti lisääntyvissä hiivat osoittavat samanlaista käyminen arvot kasvainsoluissa [12], jolloin tutkia suhdetta energia-aineenvaihduntaa ja maksimaalisen proliferaation. Erityisesti ohjelmoidun solukuoleman, joka suojaa tumorigeneesin, se liittyy läheisesti mitokondrioiden prosesseihin nisäkässoluissa. Hiivasoluja voi myös läpikäydä ohjelmoidun solukuoleman [13], [14] on mitokondrioiden riippuvaisella tavalla [15], [16], mukaan lukien sytokromi c ja AIF julkaisu, kanavan aukko kun ihmisen Bax ilme [17] – [19], depolaroituessa mitokondrion kalvon potentiaalia [20], ja mitokondrioiden pirstoutuminen [21].

erityinen kyky Crabtree-positiiviset hiivat kuten

Saccharomyces cerevisiae

kytkeä päälle ja pois päältä hengitykseen vastauksena muutoksiin hiililähteen ja mahdollisuus tuottaa elinkelpoisia kantoja puuttuu mitokondriaalisen DNA (rho

0), jotta tiukat geneettisen merkityksen arviointi mitokondrioiden solukuoleman aikana [15], [22]. Täällä me arvioida mahdollista yhteyttä tukahdutetaan solukuoleman ja esti oksidatiivinen fosforylaatio, yhdyskunnissa kasvanut yhdestä ainoasta solusta, joka muistuttaa kasvaimen kasvua.

Tulokset ja keskustelu

In maksimaalinen lisääntyvissä kiinteä solupopulaation , hengitys parantaa ROS tuotanto ja apoptoosin

S. cervevisiae

solut perivät ainutlaatuinen glukoosirepression joka upon kasvu glukoosin rajusti tukahduttaa hengityksen riippumatta Hapen [23]. Modelling kasvaimen kasvua, testasimme jos tukahdutettu hengitystä vaikuttaa solujen eloonjäämiseen kasvun aikana solupopulaatioiden lähtien yhden solun glukoosin media. Kolme eri kantoja kykene hengityksen kanssa isogeenisistä villityypin

S. cerevisiae

käytettiin pesäke määrityksessä, jossa eristetyt pesäkkeet kasvatettiin yksittäisistä soluista. Solut poistettiin pesäkkeistä aikana varhaista kehitystä rho

0 -kannan pesäke on merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen verrattuna villityypin kantaan (Fig. 1A). Johdonmukaisesti, reaktiivisten hapen lajien (ROS), prosessi tiukasti kytketty ja usein aiheuttavan varten ohjelmoidun solukuoleman, on vähentynyt (Fig. 1 B).

(A) eristetty pesäkkeitä kasvatettiin yksittäisistä soluista, manipuloitu agarmaljoille. Klonogeeniset määrityksessä soluja poistetaan pesäkkeitä villikannan, rho

0 (ei mitokondrio-DNA) ja kaksi yhden geenin deleetio kantojen (

mgm1

ja

oxa1

), kasvatettiin on SCGlu. 3 päivän 500 solua kokonaisten pesäkkeitä, 5 päivän kuluttua 500 solua Keski pesäkkeitä alue analysoitiin (keskiarvo ± SEM,

n

= 2). Tilastollinen merkitys p 0,006 vertaa pesäkettä muodostavaa yksikköä (cfu) mutanttien kantojen villityypin kantaan vastaaviin ajankohtina. (B) Soluja koko pesäkkeen (3 päivää) samoin kuin keskialueella (5 päivää), värjättiin reaktiivisen hapen (ROS) ja dihydroethidium ja analysoitiin FACSAria virtaussytometrialla (keskiarvo ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna poisto kantoja vastaavissa aika-pistettä). (C) noin 50 (2 päivää) ja 10 (3 päivää), pesäkkeitä kasvatettiin SCGlu levyt pestiin pois ja klonogeenisten määritykset suoritettiin kerättyjen solujen (keskiarvo ± SEM,

n

= 5; ** p 0,001). (D) Noin 50 pesäkettä kasvatetaan SCGlu levyillä 2 päivää värjättiin fosfatidyyliseriini käsikirjassa (AnnV) ja DNA rikkoutuminen (TUNEL) ja analysoitiin FACSAria virtaussytometrialla (keskiarvo ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01, *** p 0,001). (E) Fluoresenssimikroskopia Keski- ja ulkoalueen 5 päivän ikäisiä villityypin pesäkettä soluihin, plasmidin dsRED-MLS.

Jos haluat jättää rho

0-kanta on erityisiä vaikutuksia ei osuus hengityksen puutteiden kaksi muuta hengityksen heikentynyt kantoja tutkittiin. Yhden geenin poisto kantoja molemmat,

MGM1

(homologi ihmisen

OPA1

) – GTPaasina sijaitsee mitokondrioiden intermembrane tilaan [24] – ja

OXA1

(an insertase sisemmän mitokondrion kalvon – erittäin säilyneitä prokaryooteista nisäkkäisiin [25], [26]) käyttäytyi kuten (villin tyypin) rho

0 rasitusta. Kun 3 ja 5 päivän

mgm1

sekä

oxa1

poistetut solut noudetaan koko siirtomaa (3 päivää) tai keskialueella (5 päivää), ja siten lähinnä vanhempia soluja, osoitti merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen (Fig. 1A) sekä esto ROS verrattuna näytteiden villikannan (Fig. 1 B). Huomattavaa on, että toisin kuin muut hengitys puutteellinen mutantti kantojen (kuten rho

0 ja Δ

mgm1

) Δ

oxa1

kanta osoitti sama kasvuvauhti kuin villikannan nesteviljelyissä ja aikana pesäkkeen kasvun, vastaavasti (Fig. 2A ja B).

(A) kasvukäyrät olevan

oxa1

deleetiokanta ja vastaavan villikannan. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Y-akselilla on skaalattu logaritmisesti. (B) koko eristetyt pesäkkeet on ilmoitettua kantoja kasvatettiin 3 ja 5 päivää SCGlu levyt, vastaavasti. Halkaisijat arvioitiin prosessoimalla valokuvia Metamorph Imaging (keskiarvo ± SEM,

n

= 2).

täydentävä lähestymistapa, kylvetään pesäkkeitä (10 ja 50 levyä kohti) ja villityypin ja Δ

oxa1

kannoista, vastaavasti, pestiin päässä SCGlu levyt jälkeen 2 ja 3 päivää, ja klonogeenisten eloonjäämistä arvioitiin. Jälleen kanta kykene hengityksen osoitti paremmin selviytymisen kuin respiring villikannan (Fig. 1 C). Lisäksi selviytymisen etu Δ

oxa1

kanta ilmeni jo 2 päivän jälkeen, joka on hyvässä mukaisesti aiempien tietojen villityypin pesäkettä kasvatettu tavallista glukoosisella jossa näkyy jättämään logaritminen kasvuvaiheen jälkeen noin 36 tuntia [27].

arvioimiseksi aiheuttama tyyppi solukuoleman me seulotaan apoptoottisia merkkiaineiden avulla anneksiiniV ja TUNEL määrityksissä. Apoptoosi oli merkittävästi vähentynyt hengitystaajuuden puutteellinen

oxa1

deleetiomutantin verrattuna villityypin ohjaus (Fig. 1 D). On huomattava, että soluseinän pilkkomalla villityypin soluja oli vähemmän tehokas. Näin ollen pienempiä määriä positiivisesti värjäytyneiden solujen saatiin verrattuna havaitun solun eloonjäämistä klonogeenisten määrityksissä jälkeen 2 päivää. Tämä tarkoittaa sitä, että havaittu tukahduttaminen apoptoottisten merkkiaineiden

oxa1

poistettu kanta on todennäköisesti jopa korkeampi kuin esitetty 1D. Tämän mukaisesti, kun on käsitelty 30% enemmän entsyymiä yhdistelmä parantaa soluseinän hajotus, noin 37% villin tyypin solujen muotoutuneet TUNEL positiivista värjäytymistä (data ei ole esitetty). Mitokondrioiden pirstoutuminen on edellytys apoptoosin hiivaa. Näin ollen, mitokondrioiden morfologia solujen villityypin pesäkettä (eikä rho

0-solut, koska niillä ei ole hengitystä) seurattiin käyttämällä dsRED kuljettaa mitokondrion lokalisoinnin sekvenssin. 5 päivän jälkeen solut keskialueelta (siis vanhemmat solut) osoittivat voimakkaasti lisääntynyt pirstoutuminen mitokondrioita ja lävistetyn rakenteita taas juuri ravittu nuorempia soluja ulkokehältä näkyy normaali putkimainen rakenne mitokondrioita (kuva 1 E).

Olemme päätellä, että kumoamisen hengityksen tukahduttaa apoptoosin ja ROS tuotanto on voimakkaasti lisääntyvissä solupopulaatio kiinteällä alustalla.

Pakko parantamiseksi hengityksen laukaisee solukuoleman aikana kylvö solupopulaation

Novel syöpä hoitomuodot perustuvat oletukseen, että saattamista tai pakotettu parantamiseksi hengityksen sisällä kiinteitä kasvaimia voi johtaa kasvun estymisen ja solukuoleman [10], [28], [29]. Voit testata, onko geneettinen täytäntöönpanoa hengityksen vaikutteita solukuoleman aikana kylvö solupopulaation (joka on kronologinen askel ennen siirtomaa perustetaan), media-shift kokeita käyttäen glukoosia (SCGlu), galaktoosia (SCGal), ja glyseroli (SCGly) mediaa vuorotellen ainoana hiilen lähteitä tehtiin. Siten hengitys on joko tukahdutetaan (SCGlu), yhteistoiminnallisesti aktiivinen käyminen (SCGal), tai se edustaa yksinomainen energialähde (SCGly). Kun paikallaan (ei lisääntyvien) nestemäisen populaatiot hiivan villityypin soluja kasvatetaan SCGlu oli siirtynyt kiinteän SCGal tai SCGly, vain 65%: n tai 44%: lla, kylvetään solut pystyivät muodostamaan pesäkkeitä (Fig. 3A). Käyttämällä erittäin proliferatiivinen viljelmiä villityypin BY4741 kanta (alkaen eksponentiaalinen kasvuvaihe) tämä vaikutus oli vieläkin suurempi, lähes ilman selviytyminen molemmin hengitysteiden media (Fig. 3A). Vertailukelpoisia tuloksia saatiin erittäin proliferatiivisen viljelmiä muiden villityypin kannat, kuten AH22, TB50 ja DBY746 (tietoja ei esitetty) alle meidän olosuhteissa. Jopa siirto samalla korkea hengitysteiden media (nestemäisestä SCGly kiinteään SCGly) johti vähentynyt pesäkkeiden muodostumista -70% (verrattuna siirtyminen neste SCGly kiinteään SCGlu) korostaen, että nimenomaan aloittamisen pesäkkeen kasvu on negatiivisesti vaikuttaa tehostettu hengitystä (Fig. 3B).

(A) klonogeeninen määritys kulttuurien valmiiksi kasvatettu nestemäisessä SCGlu. 500 solua maljattiin SCGlu, SCGal, ja SCGly-agarmaljoille, vastaavasti (keskiarvo ± SEM,

n

= 3; *** p 0,001). (B) klonogeeninen määritys kulttuurien ennalta kasvatettu nestemäisessä SCGly. 500 solua maljattiin SCGly ja SCGlu media levyt, vastaavasti (keskiarvo ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01). (C) Solut koko siirtomaa (3 päivää) samoin kuin keskialueella (5 päivää) värjättiin reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) kanssa dihydroethidium (DHE). Arvot suhteessa fluoresoivan (RFU) normalisoitiin villityypin kantaan arvot (keskiarvo ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001). (D) koko eristetty villityypin pesäkettä kasvatetaan SCGlu ja SCGal media levyt seurattiin ottamalla kuvia ilmoitetuilla ajankohtina. Halkaisijat arvioitiin prosessoimalla valokuvia Metamorph Imaging (valkoinen pylväs 1 cm) (keskiarvo ± SEM,

n

= 3; * p 0,05, ** p 0,01).

Pakko parantamiseksi hengityksen tukahduttaa kasvun ja lisää ROS tuotanto pesäkkeiden

havaitut vaikutukset tukahdutetaan pesäkkeen kylvö kun hengitys on korkea näkyivät myös lisäkasvun solupopulaation: Kahden päivän kasvun kiinteät SCGal yhdyskunnat näytetään vain puolet pienempiä kuin kasvatettu kiinteällä SCGlu, joskin edelleen koko lisäys (alkuvaiheen jälkeen viive) on verrattavissa (kuvio. 3D). Alkuperäinen viive voisi liittyä välittömästi ROS räjähtää, kun edelleen korostetaan voimakkaasti kohonneet ROS tasoilla pesäkkeitä kasvatetaan SCGal tai SCGly (Fig. 3C, myös katso alla ja kuva. 4C).

(A) noin 100 pesäkettä kasvatettiin 36 tuntia SCGlu levyjen kanssa tai ilman 5 mM GSH, pestään pois ja klonogeenisten määritykset suoritettiin kerättyjen solujen (keskiarvo ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01) . Lisäksi yhtä suuret määrät solut värjättiin reaktiivisen hapen (ROS) ja dihydroethidium (DHE) ja kvantitoitiin käyttäen fluoresenssin mikrolevylukijalla (Genios-Pro). Arvot suhteessa fluoresoivan (RFU) näytetään (keskiarvo ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01) (B). (C) klonogeeninen määritys kulttuurien valmiiksi kasvatettu nestemäisessä SCGlu. 500 solua maljattiin SCGlu, SCGal tai SCGly-agarmaljoilla, vastaavasti, tai ilman 1 mM GSH (keskiarvo ± SEM,

n

= 2; *** p 0,001).

siis perustaa voimakkaasti lisääntyvien vankka solupopulaation vaatii hengitystä voidaan tukahdutettu.

hengitys välittämän solukuoleman yhdyskunnissa ja vasta kylvetään solujen tehokkaasti suppressoida ROS puhdistusjärjestelmä

edelleen todistaa että hengitys ja mukana ROS tuotanto on suurin syy apoptoosin aikana pesäkkeen kehittämiseen käytimme pelkistettyä glutationia (GSH) kuin puhdistusjärjestelmä reagenssi: Colonies villityypin ja

oxa1

poisto kantoja kasvatettiin SCGlu agarmaljoilla tai ilman GSH ja solujen eloonjäänti määritettiin jälkeen 36 tuntia klonogeeniset määrityksessä. Kun taas

oxa1

deleetiokanta ei todettu muuttuneen selviytyminen lisättäessä GSH, selviytyminen villityypin solujen dramaattisesti parantunut (kuvio 4A). Tähän liittyi merkittävästi vähentynyt ROS tasoilla (kuvio 4B). Mielenkiintoista on, ulottuu fermen- kasvuvaiheessa kaksinkertaistamalla glukoosipitoisuuden median levyt johti hieman parantaa solujen selviytymistä (tietoja ei esitetty).

Lisäksi vaikutus glutationin, kuten ROS scavenger testattiin shift määrityksessä, jossa erittäin proliferatiivisen villityypin soluja esikasvatettiin nestemäisessä SCGlu media ympättiin SCGal ja SCGly levyjen kanssa tai ilman GSH. Silmiinpistävän, eloonjääminen on parantunut 50% ja 55%, vastaavasti, verrattuna 1% eloonjääminen levyillä ilman GSH (Fig. 4C). Samanlainen muutos paikallaan solujen tuotti lisääntynyt eloonjääminen 50% ja 60%: sta 75% ja 77%, vastaavasti, GSH sisältävillä levyillä (tietoa ei esitetä). Olemme päätellä, että puhdistusjärjestelmä ROS kautta glutationia parantaa solujen selviytymistä aikana pesäkkeen kehitystä sekä aikana kylvö korkeasti hengitysteiden media. Kiehtovan, on raportoitu äskettäin, että syöpäsoluissa ja neuronien (joka myös näyttää Warburg vaikutus), sytokromi

c

vähenee ja pidetään aktiivinen mennessä GSH [30].

Toistaiseksi , tutkimus Warburg vaikutus on keskittynyt pääasiassa korkean glykolyyttisissä vuo samalla oheisiin tukahduttaminen mitokondrion hengitystä oli usein jätetään yksin [8], [9]. Tuloksemme osoittavat, että hengitys laukaisee apoptoosin aikana kylvö ja kehittäminen solupopulaation, joka antaa suoraa kokeellista näyttöä, joka tukee Warburg hypoteesi aikana kasvaimien synnyn alkaminen. Voimakkaasti laski hengitysteiden kapasiteetti voi olla ratkaisevaa kasvaimen pahanlaatuisuuden [12] ja vastustuskykyä väistämättä vaihtelevan hapetus kasvaimissa [31], [32]. Mielenkiintoista, se on osoitettu, että hiiva rho

0 kannat osoittavat lisääntynyttä vastustusta tiettyjen ulkoisten apoptoottiset ärsykkeille, kuten etikkahappoa, joka laukaisee kuolema kautta mitokondrioiden reitin [15], [17]. Samanlainen vastustuskyky solukuolemaa voi myös olla merkitystä kasvainten solujen happamassa ympäristössä. Me spekuloida, että kyseeseen syöpäsolujen noudattaa ikivanha mekanismi läsnä

S. cerevisiae

villityypin pesäkettä: korkea Glykolyysivaiheen läsnä happea.

Materiaalit ja menetelmät

Kannat ja median

Kokeet suoritettiin BY4741 (MATa

his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

) ja vastaavat nolla mutantteja

mgm1

ja

oxa1

vastaavasti saatu Euroscarf. Strain BY4741 rho

0 rakennettiin useita kierroksia etidiumbromidin hoitoa kuten aikaisemmin on kuvattu [33]. Voit suorittaa fluoresenssimikroskopiaan mitokondrio-rakenteiden plasmidin dsRED-MLS (dsRED kuljettaa mitokondriaalisen lokalisointi järjestyksessä) [34] muunnettiin rasitusta BY4741. Hengissä pinnoitteet YEPD (1% hiivauutetta, 2% peptonia ja 2% glukoosia) media oli täydennetty 2% agaria. Kaikki määritykset, kantoja kasvatettiin SC-elatusaineessa, joka sisälsi 0,17% hiivan typpiemästä (Difco), 0,5% (NH

4)

2SO

4, ja 30 mg /l kaikkien aminohappojen (lukuun ottamatta 80 mg /l histidiiniä, 200 mg /l leusiinilla (ilman leusiinia, kun työskennellään plasmidi dsRED-MLS)), 30 mg /l adeniini, ja 320 mg /l urasiili mutta sisälsi 2% glukoosia (SCGlu), 2% galaktoosia (SCGal), ja 3% glyserolia (SCGly) vastaavasti täydennetty 2% agaria, missä tarvitaan. Pelkistettyä glutationia (GSH; Sigma-Aldrich) lisättiin pitoisuuksina 1 tai 5 mM, tarvittaessa.

eristetty monocolony määrityksessä

kuusi senttimetriä petrimaljoihin, mukana 13 ml kiinteää SC media ( leusiinin kanssa tai ilman) käytettiin. Yhden solut 16 ja 20 tunnin ajan yön yli Viljelmät asetettiin vankka SC media levyillä käyttäen mikromanipulaattoria (Series 200, Singer Instruments). Minimoida kuivumista kiinteiden levyjen, inkubointi suoritettiin 28 ° C: ssa suljetussa, kosteassa jalostus kammion (KBF115, Binder). Sillä halkaisija määritystä, kuvat otettiin ilmoitettuina ajankohtina (Microbiology-Colony-Counter, Lemnatec) ja käsitellään käyttäen Metamorph kuvantamisen.

Survival pinnoitus, media-shift kokeita, ja kasvukäyrät

määrittämiseksi eloonjäämistä solujen pesäkkeitä joko kokonaisina eristetyt pesäkkeet (kun kyseessä on 3 päivää) ja näytteitä keskiosissa eristetyt pesäkkeet (kun kyseessä on 5 päivää) poistettiin ilmoitetuilla aikapisteissä, tai SCGlu levyt noin 100 pesäkettä (36 tuntia), 50 pesäkettä (2 päivän kuluttua) tai 10 pesäkettä (3 päivän jälkeen) pestiin pois. Solulaskenta määritettiin CASY solun laskenta laite (Scharfe Systems) ja 500 solua maljattiin YEPD-agarmaljoille. Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (pmy) määritettiin sen jälkeen, kun 2 tai 3 päivää (jos kyseessä on hengityksen puutteellinen kantojen rho

0 ja Δ

mgm1

), jonka Microbiology-Colony-Counter (Lemnatec) ja prosessoidaan käyttäen SAWmicrobio version 3.1.

media-shift kokeissa kasvatettiin SCGlu ja SCGly nestettä median logaritminen (6 h) ja paikallaan (24 h) vaihe, vastaavasti, ja 500 solua maljattiin vastaaviin vankka media levyt sekä SCGlu levyillä missään tapauksessa.

arvioimiseksi kasvuvauhdin nestemäisissä, yli yön viljelmiä kasvatettiin SCGlu. Viljelmät siirrostettiin 5 x 10

5 solujen SCGlu ja solujen kasvua tarkkailtiin yli 12 tuntia käyttäen CASY solulaskuria laitteeseen.

Värjäys apoptoottisen markkereita ja fluoresenssimikroskopiaan

Värjäys reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja dihydroethidium (DHE), anneksiini V-värjäyksen ja TUNEL-värjäys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Kunkin näytteen 30,000 solut arvioitiin käyttäen virtaussytometrialla (FACS-Aria, BD) ja käsitellään käyttäen FACSDiva ohjelmistoa. Vaihtoehtoisesti yhtä suuret määrät DHE värjätyt solut mitattiin mikrolevyn fluoresenssin lukulaite (Genios-Pro, Tecan).

Mitokondrioiden morfologiaa tutkittiin fluoresenssimikroskopialla käyttäen dsRED suodatetaan Zeiss Axioskop mikroskoopilla. Solut keskushermoston sekä ulkoalueen eristettyjen monocolonies villin tyypin solujen plasmidin dsRED-MLS seurattiin 5 päivän jälkeen.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen opiskelijat T-Test (yksisuuntainen, parittomia), jossa * p 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001, vastaavasti.

Kiitokset

Kiitämme Ulrike Potocnik varten tekninen apu.