Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut (CSCS) hypoteesi väittää, että vain pienessä määrässä solujen kasvain kykenee sekä kasvaimen aloittamista ja sustainment. Epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT) on alkion kehityshäiriöitä ohjelma, joka usein aktivoidaan syövän eteneminen ja metastaasit. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on valottaa suhdetta EMT ja CSCS käyttämällä LC31 keuhkosyövän ensisijainen solulinja.

Materiaalit ja menetelmät

A549 ja LC31 solulinjoja käsiteltiin 2 ng /ml TGF-1 30 päivää, ja 80 päivää, vastaavasti. Arvioida EMT, morfologiset muutokset arvioitiin valomikroskoopilla, immunofluoresenssimenetelmällä ja cytometry seuraaville markkereita: sytokeratiineja, e-kadheriinin, CD326 (epiteelin markkereita) ja CD90, ja vimentiinistä (mesenkymaalisten markkereita). Lisäksi RT-PCR Slug, Twist ja β-kateniinin geenien suoritettiin. On TGFp-1 käsitellyt ja käsittelemättömät LC31 solulinjoissa, suoritimme stemness testejä kuten pneumospheres kasvun ja varsi markkereita ilmaisu kuten Oct4, Nanog, Sox2, c-kit ja CD133. Western Blot for CD133 ja tuumorigeenisyystesti määrityksiä käyttäen NOD /SCID tehtiin.

Tulokset

TGFp-1 käsitellään LC31 solulinjaa menettänyt epiteelin morfologia olettaen fibroblasti-ulkonäkönsä. Samat tulokset saatiin A549-solulinja (kontrollina). Immunofluoresenssi ja cytometry osoitti säätely ylöspäin vimentiinista ja CD90 ja alas-säätely cytocheratin, e-kadheriinin ja CD326 in TGFp-1 käsitelty LC31 ja A549 solulinjoissa. Slug, Twist ja β-kateniinin m-RNA-transkriptien olivat säädellään ylöspäin TGF-1 käsitellään LC31 solulinjassa vahvistaa EMT. Tämä solulinja osoitti myös yli-ilmentyminen Oct4, Nanog, Sox2 ja CD133, kaikki geenit stemness. Lisäksi TGFp-1: llä käsitellyissä LC31-solulinja, lisääntynyt pneumosphere muodostavan kapasiteetin ja kasvaimia muodostavan kyky NOD /SCID-hiiriin oli havaittavissa.

Päätelmät

induktio EMT mukaan TGFp -1 altistumisen ensisijainen keuhkosyövän solulinjassa johtaa hankinnan mesenkymaalisten profiilin ja ilmaisussa kantasolujen merkkiaineita.

Citation: Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, Franco R, La Rocca A, Liguori E, et ai. (2011) epiteelikasvaimet jotta mesenkymaalitransitioon by TGFli-1 induktio Lisäykset Stemness Ominaisuudet Ensisijainen Non pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Line. PLoS ONE 6 (6): e21548. doi: 10,1371 /journal.pone.0021548

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2011; Julkaistu: 30 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Pirozzi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Current Research 2009/10 Italian terveysministeriön G. Pirozzi ja G. Rocco. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kaksi tärkeää hypoteesi on oletettu synnyssä, muodostuminen, kasvu ja etäpesäke epiteelin syövän: rooli syövän kantasoluja (CSCS) tai Kasvaimen Initiating Cells (-lämpökameroissa) ja osallistuminen ns epiteelikasvaimet -Mesenchymal Transition (EMT).

syöpä kantasolut on määritelty ”solun sisällä kasvain, joka on kapasiteettia itse uudistaa ja aiheuttaa heterogeeninen suvusta syöpäsolut muodostavat kasvain” [1 ]. Nämä kaksi lopullista biologiset ominaisuudet ovat mitä tehdä CSCS oivana aloittamisen uusiutumisen.

CSCS hypoteesi esittää, että vain pienessä määrässä solujen kasvain pystyy sekä kasvaimen aloittamista ja Omavaraisuuden [2], [ ,,,0],3]. Nämä solut ilmentävät stemness markkereita, voivat muodostaa kelluvan palloja seerumittomassa väliaineessa, ominaisuus, joka liittyy kantasolujen, ja voivat myös erilaistua poikkeava solun fenotyypin, jotka muodostavat tuumorin heterogeenisyys [4]. Kokeellisesti tämä väestö tunnistetaan sen kykyä muodostaa uusia kasvaimia kautta serial transplantations immuunivajaissa ei-lihavilla diabeettisen (NOD) /sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriä, palauttamisessa kasvain heterogeenisuus [5].

kahta perustyyppiä aiheita, jotka korostavat oletusta, että CSCS peräisin normaalista kudoksesta kantasoluista. Ensinnäkin on todettava, että CSCS on normaali kantasolujen ominaisuuksia, kuten itseuudistumisen, erilaistuminen, lääkeresistenssin ja muuttoliike kapasiteettia. Sitten pitkäikäisyys kantasolujen tekevät niistä alttiita kertyvät geneettiset ja epigeneettiset vahinkoja, jotta niistä hyviä ehdokkaita syntymistä neoplastisen transformaation [6], [7]. CSCS ovat vain soluja, jotka pystyvät tuottamaan kasvainten samanlainen kuin alkuperäinen potilasnäytteistä, kun istutetaan immuunipuolustus hiirissä, kuten NOD /SCID-hiirissä [8].

Olemassa hoitoja ovat lisänneet pituus selviytymisen jälkeen diagnoosin syöpä, mutta epäonnistui täysin Palautumisen kannalta. Syöpähoidon vikoja saattaa johtua tehoton vaikutuksista nykyisen hoidon yhteydessä mahdollisesti lepotilassa CSCS, jotka ovat edelleen elintärkeä ja pitää yllä kykyä uudistua kasvain [9]. Useimmissa tapauksissa, tämänhetkiset terapeuttiset strategiat on kehitetty kohdistaa suurimman osan syövän ja todennäköisesti ei poistamaan CSCS kokonaan. CSCS ovat vastustuskykyisempiä hoitoja, koska selviytymisen etu lisääntynyt antiapoptooppinen toimintaa ja lääkeresistenssin vuoksi kohonneeseen lääkkeen effluksipumppujen kuten BCRP (breast cancer resistance protein) ja MDR (monilääkeaineresistenssi) kompleksit [10], [11].

CSCS on tunnistettu erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien glioblastoomat [12], rintojen [13], ja keuhkosyöpä [14], [15]. On olemassa kolme erillistä tärkeimmät menetelmät eristää CSCS kiinteiden kasvaimien: i) eristämällä CSCS virtaussytometrialla mukaan CSC-spesifisten solun pinnan markkereita, kuten CD44 tai CD133; ii) havaitseminen puolella väestöstä fenotyyppi Hoechst33342 syrjäytyminen; iii) alalla muodostumista alla viljely määriteltyjen seerumia kasvutekijöiden joka säilyttää CSCS eriytymättömiä.

epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on alkion avain kehitykseen ohjelma, joka on usein aktivoidaan syövän invaasio ja etäpesäkkeiden [16], [17]. Se on prosessi, jolla solut läpikäyvät morfologista kytkimen epiteelin polarisoitunut fenotyypin mesenkymaaliset fibroblastit fenotyyppi. Seurauksena EMT, epiteelisolujen menettävät määritelty solu-solu /solu-kasvualusta yhteyksiä ja niiden rakenteelliset /toiminnalliset polariteetti, ja niistä tulee karan muotoinen ja morfologisesti samanlaisia ​​aktivoituneiden fibroblastien [18]. Molekyylitasolla, EMT määritellään menetys solu-solu adheesiomolekyylien (esim E-kadheriinin ja ZO-1), alas-säätely epiteelisolujen erilaistumisen markkereita mukaan lukien sytokeratiineja ja E-kadheriinin ja transkription induktio mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista, fibronektiini ja N-kadheriinin kanssa ydinvoiman lokalisoinnin beeta-kateniinin [19]. Nuclear beeta-kateniinin indusoi geeniekspressiomalli suosivat kasvaimen invaasio, ja asennus todisteet osoittavat useita vastavuoroisesti vuorovaikutuksia E-kadheriinin ja beeta-kateniinin kanssa EMT-asiakkuutta transkriptiorepresso- vakauttaa invasiivisen mesenkymaalisten fenotyyppi epiteelikasvainsolut [20], [21 ]. Muut liittyvien geenien EMT ovat Snail, Twist e SIP-1 /ZEB-2, kaikki repressors geenien CDH1 joka koodaa E-kadheriinin [16]. Useita erillisiä piirteitä on kuljetettava EMT, kuten solun liikkuvuus, invasiivisuus, resistenssin apoptoosia, ja jotkut ominaisuudet kantasoluja. Monet signaalinvälitysreittien ovat osallistuneet induktion EMT, kuten transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-1), Wnt, Hedgehog, Notch ja tumatekijä-kappa B (NFKB) [22]. Kyoung-Ok Hong et ai. [23] ovat osoittaneet, että aktivoituminen PI3K /Akt-akseli on yksi tärkeimmistä mekanismeista prosessissa EMT ja näyttää siltä, ​​että sen esto käsittelemällä fosfatidyyli eetterilipidinä analogit (PIA) voi säädellä käänteinen prosessi mesenkyymikasvaimia epiteelikasvaimet kääntää Transition (Mert ) johtaa uudelleen ilmentymistä sekä E-kadheriinin ja β-kateniinin, ja vähentää ilmentymistä vimentiinista, mesenkymaalisten merkki, suun levyepiteelikarsinooma linjat syöpä vakiintunut. Prosessin aikana tuumorimetastaasin, joka on usein käytössä EMTs, levitetään syöpäsolut näyttäisi edellyttävän itseuudistumisen kyky, samanlainen kuin näytteillä on kantasoluja, jotta levittää makroskooppiset etäpesäkkeitä [24]. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että EMT prosessi, joka mahdollistaa syöpäsolujen levittämiseen, voi myös levittää itseuudistumisen kyky levittää syöpäsoluja. Todellakin, metastaattisen prosessi on ainakin pintapuolisesti samanlainen prosesseja, jotka tapahtuvat aikana kudosten korjaamiseen ja elvyttämiseen ja mahdollistaa aikuisten kantasoluja poistua kudokseen säiliöitä kuten luuytimestä, kirjoita ja hengissä verenkierrossa, ja päästä toissijainen kudokseen sivustoja, joissa ne lisääntyä, erilaistuvat, ja osallistua kudosrekonstruktiossa [25]. Yhdessä nämä erilaiset tekijät osoittavat välistä mahdollista yhteyttä syövän kantasolut ja mesenkymaaliset-esiintyvät solujen tuottama EMTs ja käänteinen prosessi kutsutaan mesenkyymikasvaimia epiteelikasvaimet käänteinen Transition (Mert). Mani et kollegansa [26] olivat ensimmäiset osoittaa tällaista yhteyttä ikuisti ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen (HMLEs).

Tässä yhteydessä on tärkeää tunnistaa, mitkä tekijät voivat aiheuttaa EMT ja miten EMT soluja voisi tulla resurssi syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, kehittämällä uusia ja kohdennettuja hoitomuotojen keuhkosyöpään. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena on valottaa mahdollisia suhdetta EMT ja CSCS käyttämällä LC31 ensisijainen solulinja saatu kudosnäytteestä leikkauksen jälkeen potilaan vaikuttaa Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

tulokset

TGFli-1 hoito indusoi morfologisia muutoksia NSCLC solulinjoissa

jotta vaikutuksen tutkimiseksi TGFp-1 LC31 ja A549 solulinjoissa, käsittelimme ne 2 ng /ml TGF-1. Kuten jo ilmi myös Ju Hee Kim [27], A549-soluja käsiteltiin TGF-1 menettäneet epiteelin morfologian havaittavissa 48 tunnin kuluttua hoidon; he hajoitettiin ja oletettu fibroblasti ulkonäkönsä kanssa kaivattu muoto ja ydinajatus.

LC31 soluja käsiteltiin TGF-1 menettivät epiteelin morfologia ja hankittu mesenkymaalisten piirteet alkaen 21 päivän hoidon. Solut tuli himoitsi fibroblastien kuten Keski tuma ja alkoi kasvaa nippuina. Tämä morfologia säilyi koko ajan hoidon (Fig. 1A-D).

V: käsittelemätön A549, OM 200 x; B: käsitelty A549 kello 2 päivää TGFli-1 hoito, OM 400 x; C: käsittelemätön LC31, OM 400 x; D: käsitelty LC31, 30 päivän kohdalla TGFli-1 hoito, OM 400 x; E: kasvukäyrät käsittelemättömän ja käsitellyn A549; F: kasvukäyrät käsittelemättömän ja käsitellyn LC31.

TGFli-1 hoito indusoi kasvun estäminen in NSCLC solulinjoissa

Kaikissa testatuissa solulinjoissa, TGFp-1 aiheuttama kasvun esto. A549, kasvukäyrät analyysit osoittivat vahvan kasvun inhibitiota aikana kulttuuri aikaa DT 28 h käsiteltyjen A549 suhteen DT 18 h vastaavasta käsittelemättömän solulinjassa. Vuonna LC31 soluissa, DT oli 72 h käsitellyt solut taas DT oli 36 h käsittelemättömät solut (Fig. 1 E-F).

TGFli-1 hoito edistää siirtymistä epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppiin

morfologiset vaikutus TGFp-1 A549 ja LC31 solulinjoja ehdotti, että TGF-1 edistänyt EMT. Morfologiset muutokset ominaisuus solujen käynnissä EMT mukana on siirtyminen lausekkeen epiteelin on mesenkymaaliset ohjelmistoon. Sen määrittämiseksi, onko TGF-1 indusoi tällaisen muutoksen, käytimme taussytometrialla, immunofluoresenssi ja RT-PCR-ekspression tutkimiseksi ja jakelu CD90, CD326, vimentiinin, e-kadheriinin ja cytockeratins merkkejä ja β-kateniinin, Slug ja Twist geenejä.

mukaan sytometrinen analyysin käsittelemättömästä solulinjoissa, CD90 oli heikosti ilmaistaan ​​A549 (keskiarvo prosenttiosuus 10%) ja LC31 (keskimääräinen prosenttiosuus 4%). CD326 ja sytokeratiineja ekspressiotasot olivat matalia sekä A549 (keskiarvo prosentteina 10% ja 1,1% vastaavasti) ja LC31 (keskimääräinen prosentuaalinen 1% ja 18,6% vastaavasti). Vimentiinista oli heikosti positiivinen A549 (keskiarvo prosenttiosuus 22%) ja LC31 (keskimääräinen prosenttiosuus 17%). Sen jälkeen TGF-1 hoito, CD90 (keskiarvo prosenttiosuus 93%) ja vimentiinista (keskiarvo prosenttiosuus 91%) nousivat, kun taas CD326 ja sytokeratiineja laski A549 ja LC31 (Fig. 2A, B).

V: Sytometrisen analyysi CD90, CD326, vimentiinistä ja sytokeratiinivasta käsittelemättömissä (line red) ja TGFp-1 käsitellään [rivi vihreä] A549 solulinjassa 20 päivän kuluttua hoidon; B: Sytometrinen analyysi CD90, CD326, vimentiinistä ja sytokeratiinivasta hoitamattomien [line red] ja TGFp-1 käsitelty (rivi vihreä) in LC31 solulinjassa 30 päivän kuluttua hoidon. Isotyyppikontrolleja ovat mustat.

immunofluoresenssimäärityksellä, käsittelemättömän solulinjoissa, vimentiinistä ilmaistiin sekä A549- ja LC31 mutta se sisältyi perinuclear vescicles. Sytokeratiineja ja E-kadheriinin oli heikosti ilmaistu molemmissa solulinjoissa. Sen jälkeen TGF-1 hoitoa, vimentiinistä oli voimakkaasti ja tasaisesti kaikissa A549 ja LC31 soluja, kun taas sytokeratiineja ja E-kadheriinin pysyivät heikosti ilmaistu ja lokalisoida perinuclear alueilla solujen kunnes kumotaan 30 päivän kuluttua A549- ja 40 päivää LC31 (Fig. 3 A-L).

Immunofluoresenssitesti varten vimentiinista (A), sytokeratiini (B) ja e-kadheriinin (C) käsittelemättömien A549-solulinja; vimentiinista (D), sytokeratiini (E) ja e-kadheriinin (F) käsitellään A549 solulinjassa kuluttua 20 päivän TGFp-1 hoito; vimentiinista (G), sytokeratiini (H) ja e-kadheriinin (I) käsittelemättömien LC31 solulinjassa; vimentiinista (J), sytokeratiini (K) ja e-kadheriinin (L) on käsitelty LC31 solulinjassa jälkeen 30 päivän TGFp-1 hoito. Kaikki immunofluoresenssilla kuvat ovat OM 200 x; M: RT-PCR-analyysi ja tiheysmittaus arviointi Slug, Twist ja β-kateniinin käsittelemättömien ja TGFp-1 käsitellään LC31 solulinjassa jälkeen 0, 20, 50 ja 80 päivän hoidon jälkeen. *, P 0,001, **, p 0,0001 verrattuna emosolulinjassa (0 hoitopäivän).

RT-PCR tiedot osoittivat, että siellä oli valtava muutos geenin ilmentymisen kuvio ominaisuus epiteelisolujen, että mesenkymaaliset solut LC31-solulinja lisää huomattavasti ilmentymisen EMT indusoivan transkriptiotekijöiden, erityisesti beeta-kateniini (~1,5 kertainen), Twist (~1,5 kertainen), ja Slug (~2,7 kertainen), joka osoittaa niiden EMT fenotyyppi. Ylössäätöä näiden geenien edellä mainituista oli TGFli-1 riippuvainen aikaa lukuun ottamatta beeta-kateniinin joille lisääntyi 20 ja 80 vuorokauden hoidon suhteen käsittelemättömien solulinjaan ja heikko pieneneminen 50 päivää kunnioittaa 20 ja 80 päivän hoitoa, mutta aina kasvanut suhteessa käsittelemätön solulinja (kuvio. 3M).

geeniekspressioprofilointi of stemness merkkiaineiden EMT-LC31 solulinja

tutkimiseksi säätelevien geenien ja ylläpitää kantasolujen fenotyyppi of LC31 soluja, joilla on EMT allekirjoituksia (kutsutaan EMT-LC31 solulinja), suoritimme RT-PCR Oct4, Nanog ja Sox2. Mielenkiintoista, transkriptiotekijöiden Oct4, Nanog, Sox2, tiedetään olevan riittävä ohjelmoida hiiren tai ihmisen somaattisten solujen eriytymättömiä, pluripotenttien kantasolujen, havaittiin merkittävästi lisääntynyt EMT-LC31 solulinjan kasvua 3,5 kertaiseksi, 3 , 0-kertainen, ja 1,4 kertainen Oct4, Nanog ja Sox-2, vastaavasti yli emosolulinjassa osoittaa niiden stemness fenotyypin (Fig. 4A).

V: RT-PCR ja tiheysmittaus arviointi Oct4 , Sox2 ja Nanog geenejä LC31 ja EMT-LC31 solulinjojen jälkeen 0, 20, 50 ja 80 päivää hoidon jälkeen, B: RT-PCR ja tiheysmittaus arviointi CD133 ja c-kit-geenien LC31 ja EMT-LC31 solulinjojen jälkeen 0, 20, 50 ja 80 päivää hoidon jälkeen, C: Western blot ja CD133 LC31 ja EMT-LC31 solulinjojen jälkeen 0, 20, 50 ja 80 päivää hoidon jälkeen. *, P 0,001, **, p 0,0001 verrattuna LC31 solulinjaan (0 hoitopäivänä). α-tubuliinin käytetään latauskontrollina.

CD133 ja c-kit markkereita korotettiin EMT-LC31 solulinja

edelleen selvittää solut EMT fenotyyppi voisi näyttää syövän kantasoluja kuten solujen ominaisuudet, arvioimme ilmaus CD133, tärkein merkki tunnistamisessa syövän kantasoluja NSCLC [14], [15] ja c-kit [28], mesenkymaaliset kantasolut merkki.

Cytometry analyysit osoittivat, että LC31 emosolulinjassa, prosenttiosuus CD133 oli 3% koko solupopulaation. Jälkeen TGF-1 käsittely, tulokset osoittivat, että ei ole eroja CD133 ekspressiotasot emo ja EMT-solut olivat havaittavissa (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos on erilainen osalta, jotka on saatu RT-PCR: llä ja western-blottauksella ja CD133: a. Sekä RT-PCR ja western blotting osoitti kasvua CD133 (~2,3 kertaisesti RT-PCR) jälkeen eri aikoina TGFp-1 hoito. Mitä c-Kit-geeni, jälkimmäinen johti säädellään ylöspäin EMT-LC31 solujen kasvua ~2,3 kertaisesti yli emosolulinjassa (Fig. 4B, C).

Pneumospheres muodostumista kyky korotettiin EMT-LC31 solulinja

Liu et al. [29] ja muut [30] ovat osoittaneet, että kyky muodostaa mammospheres

in vitro

riippuu läsnä itseuudistuvien. Testasimme pneumophere muodostavaa kykyä EMT-LC31 solujen verrattuna emosolulinjassa.

Merkittävästi, kun olemme aiheuttama EMT in LC31 soluissa altistamalla heidät TGF-β1, huomasimme, että EMT-LC31 solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt kyky muodostaa pneumopheres verrattuna emosolulinjassa muodostaa ainakin 40-kertaisesti enemmän pneumospheres kuin vanhempien soluja. Suhde pneumospheres koon ja niiden kasvu oli merkittävästi suurempi kuin käsittelemättömien solujen. Lisäksi EMT pneumospheres oli yli 50 um, kun 5 päivää, kun taas vanhempien pneumospheres oli 20 um (Fig. 5A, B). Lisäksi kaikki EMT pneumospheres oli positiivinen CD133 (Fig. 5C). Tämän perusteella funktionaalisella testillä, päättelimme, että solut tuottamat EMT hankittu vielä toinen ominaisuus keuhkosyöpään kantasolujen.

V: LC31 pneumospheres; EMT-LC31 pneumospheres; C: CD133 ilme EMT-LC31 pneumospheres.

Colony tehokkuutta analysoi

Yksi menetelmistä analysoida Tuumorigeenisuustutkimuksissa on pehmeä agar menetelmällä, joka mittaa ankkurista riippumaton kasvu, joka on indikaattori solutransformaatio. Kuten taulukossa 1, arviointi kasvukinetiikat paljasti suuria siirtomaa tehokkuutta EMT-LC31 solulinjan verrattuna emosolulinjassa 18 ja 3-kertainen kasvu 1000 ja 10000, vastaavasti kylvetään EMT solujen suhteen emosolulinjassa (Fig. 6A-C).

V: valokuvia pesäkkeitä LC31 solulinjasta ja [B] EMT-LC31 solulinja; C: pesäkkeitä numero laskettiin ja tulokset esitettiin CFU (%) suhteessa solujen määrä ympätty.

EMT-LC31 tuottaa kasvaimia suurempi kuin vastaavat emosolulinjassa

Aiemmissa tutkimuksissa [15] osoitimme, että kasvainten LC31-soluja kasvatettiin, kuten pneumopsheres kasvoi paljon nopeammin verrattuna vastaavasta kasvatettujen solujen kiinnittynyt viljelyolosuhteissa. Sen testaamiseksi, onko TGF-1 käsittely onnistunut muuttamalla kasvaimen aloittamista taajuus transformoitujen solujen, me injektoidaan EMT-LC31-solut ja vastaavat solulinjasta immuunivajaisiin isännät. Kuten on esitetty taulukossa S1, huomasimme, että kasvaimen tilavuus aiheuttama EMT-LC31-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin vanhempien soluissa (kuvio. S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että solut EMT allekirjoitus edistetään tuumorigeenisyystesti

in vivo

.

Keskustelu

epiteelikasvaimet kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT) on olennainen fysiologinen prosessi, jossa epiteelisolujen menettävät napaisuus ja käyvät läpi siirtymistä mesenkymaaliset fenotyypin. Tunnusmerkkejä EMT kuuluu menetys solun soluadheesiota, uudelleen organisointi tukirankaproteiinin aktiini ja hankinta lisääntynyt muuttavien ominaisuuksien [31], [32].

EMT on ratkaiseva tapahtuma kasvaimen etenemiseen ja useita tutkimuksia tila että EMT aktivoituu monien syöpien [33] – [35]. Viimeaikaisesta kehityksestä huolimatta tarvitaan lisätutkimuksia selventämään roolia EMT on hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden kasvaimia. Prosessin aikana tuumorimetastaasin, syöpäsolut, että etäispesäkkeitä, hankkia taitoja itseuudistumisen, samanlainen kuin näytteillä kantasoluja, jotta levittää etäpesäkkeitä [24].

Yhdessä nämä todisteet viittaavat siihen, yhteys syövän kantasolut ja mesenkymaaliset-esiintyvät solujen tuottaman EMTs.

tässä yhteydessä tämän tutkimuksen tarkoituksena on osoittaa, että EMT hankinta liittyy lisäystä stemness allekirjoitusten ensisijainen solulinja saatua laboratoriossamme. A549 keuhkosyöpä on hyvin tunnettu solulinja, jota on käytetty mallina järjestelmän mekanismien selvittämiseen Karsinogeneesin apoptoosin ja syövän etenemistä keuhkosyövän [36], [37]. Koska EMT on keskeinen rooli syövän etenemiseen, me valitsimme A549-solulinja mallina järjestelmän EMT. Olemme keskittäneet huomiomme LC31 solulinja saatiin laboratoriossamme ja vaikutuksen tutkimiseksi TGFp-1 EMT ja stemness mekanismi tätä linjaa. Suostumuksella aikaisempien raporttien [38], [39], osoitimme, että TGF-1 indusoi EMT A549 soluissa hankinta mesenkymaalisten morfologia, lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista ja CD90 ja vähentynyt ilmentyminen epiteelin markkereita, kuten sytokeratiineja ja CD326. Kun on määritelty, että EMT tutkimus malli on käyttökelpoinen, testasimme vaikutus TGFp-1 LC31 solulinjassa. Käsittelimme LC31 solulinjan TGFli-1 2 ng /ml 80 päivän ajan. Vasta kun noin 20 päivää, huomaamme morfologiset muutokset, jotka ovat yhdenmukaisia ​​hankinta EMT fenotyypin kuin ominaista menetys ilmaisun epiteelisolujen markkereita, kuten sytokeratiineja, e-kadheriinin ja CD326 ja voitto tai lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista korvaa sytokeratiineja. 20 päivän kuluttua hoidon, LC31 solut tuli pitkänomainen, ydinajatus kanssa fibroblastien kaltainen muoto ja lisääntynyt stressi kuitu uudelleenjärjestely.

EMT kestää 48 tuntia A549 koska se on vahvempi mesenkymaalisten merkkiaineiden ilmentymisen kuin LC31 tarvitsee 20 päivää aikaa läpi EMT .

Siksi LC31 solulinja näyttää useita ominaisuuksia tyypillisiä EMT: väheneminen solu-soluadheesion madaltuminen ja sironta, ilmaus mesenkymaalisten markkereita. Slug, Twist ja β-kateniinin, tärkein transkription tekijöitä EMT, ovat säädellään ylöspäin käsiteltyjen solujen ja nämä tekijät lisäävät yhä TGFli-1 hoitoaika, vahvistetaan heidän EMT fenotyyppi.

Nämä tulokset avata tapa tarkistaa, jos LC31 ensisijainen keuhkosyövän solulinjaa, herkkä TGFp-1 hoito voisi lisätä kantasolujen ominaisuuksia. Mielenkiintoista, EMT-LC31 soluissa myös näyttää kantasolujen kaltaisia ​​solun fenotyyppi ominaista lisääntynyt pneumosphere muodostavien kapasiteetti verrattuna vanhempien LC31 solulinjan kanssa EMT pneumospheres yli vanhempien pneumopheres. Lisäksi EMT pneumospheres oli positiivinen CD133 merkki vahvistamaan stemness allekirjoitus. Mikä tärkeintä, se on hyvin tiedossa, että ilmentäminen rinnakkain Sox-2, Nanog ja Oct4 ihmisen tai hiiren somaattisten solujen voidaan ohjelmoida nämä solut pluripotenttien alkion kantasolujen kaltaisia ​​soluja [40], [41]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ilmaukset Sox-2, Nanog ja Oct4 dramaattisesti säädellään ylöspäin EMT-LC31 solulinjan verrattuna emosolulinjassa. Yhdessä nämä tiedot, LC31 solulinjan EMT allekirjoitus kasvoi kantasilmukan kuten solujen ominaisuudet liittyvät yli-ilmentyminen Sox-2, Nanog ja Oct4.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että c-kit ja sen ligandi ilmaistaan ​​keuhkosyöpä. Immunohistologisia tutkimuksia c-kit ilmaisu osoitti, että proteiini on poikkeuksellisesti ilmaista vain keuhkosyövän soluihin eikä penumosyy- tai normaali keuhkoputken epiteelisolujen [42]. Lisäksi, Levina et ai. [43], [44] ovat osoittaneet, että keuhko- kasvainsolujen doksorubisiini, sisplatiini tai etoposidi tuloksena valittiin lääkkeen elossa soluja, jotka ilmentävät CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, ja ydin- beeta-kateniinin alhainen ilmentyminen erilaistumisen merkkiaineiden sytokeratiineja 8/18. Tutkimuksessamme olemme osoittavat, että TGF-1 indusoi myös kasvua c-kit m-RNA ilme, toinen stemness merkki, vahvistaa olettamusta, että LC31 solulinjan EMT allekirjoitus kasvoi kantasolujen fenotyyppiä. Toinen mielenkiintoinen tulos on säätely ylöspäin CD133 in EMT-LC31 solulinja, tärkein markkerin CSCS tunnistamista keuhkosyöpä on raportoinut Eramo et al. [14] ja Tirino et ai. [15]. Tutkimuksessamme havaitsimme kasvua CD133 sekä RT-PCR ja Western blot, mutta ei taussytometrialla ja immunofluoresenssilla on kiinnittyneitä soluja. On monia teoksia, joissa epäilyksiä rajoitukset käyttöön vasta keskustellaan [45]. Vasta-aineita yleisemmin käytetty tunnistamaan AC133 ja AC141 erittäin glykosyloitunut epitoopit [46]. Siksi niiden käyttö liittyy riski aliarvioidaan ei glykosyloituja muotoja antigeenin. Lisäksi useat CD133 mRNA on tunnistettu, mikä puolestaan ​​aiheuttaa proteiinituote ei tunnistettavissa yhteisiä vasta; Lopuksi luontainen rajoitukset immunofluoresenssilla ja sytometriaa menetelmiä, mikä merkitsee vasta-herkkyys, epitooppia johtuvia vaurioita rutiini kiinnittäminen /osallisuuden menettelyt, antigeeni haku, entsymaattisen vaiheen solun valmiste on otettava huomioon [47]. Tässä yhteydessä voimme myös oletuksen, että TGF-1 hoito aiheuttaa konformaatiomuutos of CD133 epitooppien ja sen vasta-aine ei kykene tunnistamaan molekyylin cytometry ja immunofluoresenssimenetelmillä. Vuonna pneumospheres, todennäköisesti, kolmiulotteisen rakenteen avulla altistumista tunnistamat epitoopit yhteisiä aineita. Lisäksi ne eivät koske entsymaattisen vaiheen, joka voi vahingoittaa solurakenne.

Vaikka tämä näkökohta, RT-PCR ja Western blot vahvistaa sama kaikkialla stemness ominaisuus EMT-LC31 solulinjan käsittelyn jälkeen TGFp-1 ylössäätöä sekä CD133 m-RNA: n ja CD133-proteiinia.

Lopuksi arvioida TGFp-1 vaikutusta Tuumorigeenisuustutkimuksissa, suoritimme molemmat pehmeä agar määritys ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

. TGF-1, linjassa syövän kantasoluja käsite, indusoi kasvua pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa kokeiluja ja kasvainten tilavuuden oli merkittävästi suurempi kuin käsittelemättömän LC31 solulinjan vahvistetaan, että EMT fenotyyppi paitsi edistää stemness fenotyyppiä mutta myös tuumorigeenisyyteen . Lopuksi solut EMT fenotyyppi edistetään kasvainten muodostumiseen.

Näin ollen suurella todennäköisyydellä, että EMT luo solut monien ominaisuuksien itseuudistuvien kantasoluja todennetaan lisääntynyt ilmentymä Nanog, Oct4 ja Sox2, määräävä itseuudistumiseen tekijät ja CD133 ja c-Kit, tärkein stemness merkkiaineiden CSCS keuhkosyövässä.

Yhteenvetona raportoimme että induktio EMT by TGFp-1 hoidon ensisijainen keuhkosyövän solulinjaa tulosta hankinnassa mesenkymaalisten profiilin ja säätely ylöspäin ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita.

Tämä tutkimus korostaa mahdollisuutta puuttua uudenlainen farmakologinen lähestymistapa versus EMT-fenotyypin soluja tai syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja ehkäisyä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden muodostumista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kokeelliset protokollat ​​on arvioitu ja hyväksytty eettinen komitea eläinten käyttöä Biogem. Kokeelliset hanke on hyväksyntä ID 10.08 ja on ilmoitettu 26 toukokuu

, 2008 Italian terveysministeriö jälkeen kansalliset lait, jotka koskevat eläinten hyvinvoinnin. Potilas, tähän tutkimukseen rekisteröidyt, oli allekirjoittanut tietoista suostumusta, hyväksymässä sisäisen eettisen komitean (National Cancer Institute, Napoli).

Cell Culture

A549-solulinja hankittiin ATCC Cell Bank ja viljeltiin RPMI1640 (Lonza, Milano, Italia) 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. LC31 solulinja on saatu laboratoriossamme potilaan vaikuttaa keuhkojen levyepiteelikarsinooma adenokarsinooma kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, hyväksymässä sisäisen eettisen komitean (National Cancer Institute, Napoli) ja viljeltiin IMDM (Lonza) 10% FBS [14] . Kokeita varten solut kasvatettiin 90% konfluenssiin.

TGFli-1 hoito ja kasvukäyrät

Jotta aiheuttaa EMT prosessi, A549 ja LC31 solulinjoja käsiteltiin 2 ng /ml TGF -1 (Abcam, Milano, Italia) 30 ja 80 päivää, vastaavasti. TGF-1 on lisätty kahdesti viikossa väliaineessa. Testata mahdollista kasvun inhibitio johtuu TGF-1 hoitoa, 10000 solua maljattiin 24well levyjen kunkin solulinjan ja TGFp-1 käsittelemättömien ja käsiteltyjen solut irrotettiin 24 tunnin välein 10 päivän ajan. Solujen lukumäärä kunkin koetilalle laskettiin ja edustettuna lineaarisen kuvaajan. Kaksinkertaistumiseen (DT) määritettiin kasvukäyrät kaavalla: jossa t ja t

0 olivat ajat, jolloin solut laskettiin, ja N ja N

0 olivat solujen määrä ajankohtina t ja t

0, vastaavasti.

Pneumospheres määrityksessä

jotta voidaan arvioida vaikutuksen TGFp-1 pneumospheres kasvua ja muodostumista, LC31 solulinjaa maljattiin tiheydellä 60000 solua kuoppaa kohti kuuden hyvin ultra-low kiinnityslevyt (Corning Inc., Corning, NY, USA) BEBM solujen väliaineessa, jota oli täydennetty BEGM [valmiiksi pakattu SingleQuots retinoidihappoa sisältävät, naudan aivolisäkeuutetta, insuliini, hydrokortisoni, transferriini, triiodotyronine, adrenaliini, ihmisen epidermaalinen kasvutekijä, gentamisiini ja amfoterisiini B (kaikki Lonza Group Ltd., Basel, Sveitsi) plus ihmisen EGF (10 ng /ml; Sigma, Milano, Italia) ja ihmisen bFGF (10 ng /ml; Sigma, Milano , Italia). Soluja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa 5% CO

2. Tuore alikvootit TGFp-1, EGF: n ja bFGF, lisättiin kahdesti viikossa. Sen jälkeen 48-72 tunnin viljelyn, pallojen oli nähtävissä käänteinen faasikontrastimikroskopiaan.

virtaussytometria

Jotta voitaisiin arvioida vaikutusta TGFp-1 molemmilla stemness ja erilaistumista fenotyyppi A549 ja LC31 solulinjojen, 200000 solut värjättiin seuraavilla vasta-aineilla (2 ug /ml): hiiren anti-ihmisen CD90 FITC (Becton Dickinson, Buccinasco, Milano, Italia), mesenkymaaliset markkeri, hiiren anti-humaani CD133 PE ( Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Bologna, Italia), hiiren anti-ihmisen CD326 PerCP (EpCAM, Becton Dickinson), epiteelin merkki, hiiren anti-ihmisen vimentiinista (DAKO, Milano, Italia) ja hiiren anti-sytokeratiinivasta (klooni CK3 -6H5, Miltenyi Biotec). Vasta-aineet inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Inkuboinnin jälkeen näytteet pestiin PBS: llä ja analysoitiin FACSAriaII (Becton Dickinson).