Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) pystyvät jatkuvaan lisääntymistä ja itseuudistumiseen ja ehdotetaan merkittävää osuutta oncogenesis, kasvaimen kasvu, etäpesäke ja syövän uusiutumiseen. CSCS katsotaan johdettu normaalista kantasoluista vaikuttaa kasvaimen mikroympäris- vaikka mekanismi kehitys ei ole vielä selvää. Vuonna 2007, Yamanaka ryhmä onnistui saamaan aikaan

Nanog

hiiri aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (mips) soluja, joissa vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) on työnnetty 5′-alueen tietokoneanalyysia

Nanog

geenin. Yleensä, iPS-soluja, kuten kantasoluja katsotaan indusoituvat progenitorisoluja, jotka erilaistuvat erilaisissa normaaleissa fenotyyppejä riippuen normaali kapealla. Oletimme, että CSCS voitaisiin johtaa

Nanog

mips solujen vakioitu kasvatusalustaa syöpäsolun linjat, joka on jäljittelee karsinooma microenvironment. Tämän seurauksena, Nanog MIPS käsiteltyjen solujen vakioitu väliaine hiiren Lewisin keuhkokarsinooma hankittu ominaisuudet CSCS, että ne muodostivat sferoidit ilmentävät GFP suspensioviljelmässä, ja oli korkea tuumorigeenisyyden Balb /c-nude-hiiriin, joilla angiogeneesiä in vivo. Lisäksi nämä iPS-johdettu CSCS tilavuus oli itseuudistumisen ja ilmaisi markkerigeenit,

Nanog

,

Rex1

,

Eras

,

Esg1

ja

Cripto

, liittyy kantasolujen ominaisuuksia ja eriyttämätön tila. Niinpä päädyimme siihen, että malli CSCS kehitettiin alun perin MIPS soluista ja ehdotti conditioned kasvatusalustaa syöpäsolulinjoissa saattaa toimia niin kapealla tuottamiseksi CSCS. Malli CSCS ja menettely niiden perustaminen auttavat selvittämään geneettisiä muutoksia ja erittyvän tekijät kasvaimen mikroympäristössä joka muuntaa MIPS solujen CSCS. Lisäksi tunnistaminen mahdollisesti bona fide merkkiaineita CSCS, joka auttaa kehittämään uusia syövän hoitokeinojen, voisi olla mahdollista, vaikka CSC malli.

Citation: Chen L, Kasai T, Li Y, Sugii Y, Jin G, Okada M, et al. (2012) malli Cancer saatavien kantasolujen Mouse aiheuttama pluripotenttien kantasolujen. PLoS ONE 7 (4): e33544. doi: 10,1371 /journal.pone.0033544

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2011; Hyväksytty: 10 helmikuu 2012; Julkaistu: 12 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (nro 21300179, https://www.waseda.jp/rps/en/manual/kakenhi_honbun.html), ja National Natural Science Foundation of China (Key Program, Grant nro 30930038, https://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useat tutkimukset ovat pyrkineet tunnistamaan mekanismien pahanlaatuisen kasvaimen kasvua ja etenemistä. Vaikka merkittävää edistystä, useimmat terapeuttiset lähestymistavat eivät poistamaan kaikki syöpäsoluja. Loput kasvainsolut usein johtaa uusiutumisen ja etäpesäkkeitä. Äskettäin hypoteesi syövän kantasoluja (CSCS) ehdotettiin selittää alkuperää syöpäsoluja. Määritelmän mukaan CSCS ovat pieni osa kasvainsolujen, joiden kapasiteetti sekä itseuudistumisen ja rajoittamaton hidasta lisääntymistä. Ne ovat usein resistenttejä kemoterapiaa ja säteily ja siten vastaavat jatkuvasti toimittaa uusia syöpäsolujen [1]. Nykyinen näkymä CSCS mallia pidetään, että aikuisten kantasoluja, progenitorisolujen tai erilaistuneita soluja voidaan hankkia useita geneettisiä ja epigeneettiset muutoksia tarvitaan tulla CSCS jotka ovat mukana edistää ja ylläpitää oncogenesis. Tämä syöpä-aloittamisen solu voi jakaa joitakin ominaisuuksia aikuisen kantasoluja asuvat elin, jossa ne syntyvät, joko siksi, elimiin ja kudoksiin peräisin asukas kantasoluista tai koska kantasolut ryhmittyivät ominaisuuksia oma paikkansa [2]. Tässä yhteydessä, kasvaimen solut voidaan epigeneettiseltä palasi kudoksen kantasolujen, kun istutetaan normaalin kantasolun kapealla [3] – [6].

On hyvin tunnettua, että mikroympäristö voidaan käyttää syvällisiä geneettisten tai epigeneettisten vaikutuksia kantasolujen avulla solujen välisiä vuorovaikutuksia, tai solusta peräisin oleva tekijät peräisin ympäröivien solujen sisällä markkinarako. Nämä vaikutukset voivat olla ohimeneviä, kuten nähdään aktivoinnin signalointipolkujen säännellä solujen proliferaatio ja migraatio, tai ne voivat liittyä vakaampi muutoksia, kuten solun kohtalon määrittämiseen ja erilaistuminen [7]. Koska kriittinen rooli microenvironment solun säätelyssä, useat tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet, että alkion kantasolujen mikroympäristölle voisi olla merkittävä vaikutus ilmiasun aggressiivinen syöpäsolujen [8] – [10]. Kuitenkin siitä kasvaimia microenvironment voi vaikuttaa kohtalosta kantasoluja ei ole riittävästi tutkittu.

Vuonna 2007 Yamanaka ryhmä [11] onnistunut synnyttämään

Nanog

MIPS soluja retroviruksen transduktion neljän transkriptiotekijöiden (

oktameeri 3/4

(

lokakuu 3/4

),

SRY laatikko sisältävä geeni 2

(

Sox2

),

Kruppel kaltainen tekijä 4

(

Klf4

) ja

C-myc

) osaksi hiiren alkion fibroblasteja (MEF). GFP ilmentyi stabiilisti näissä soluissa, mutta GFP-ilmentyminen lakkaa, kun nämä solut indusoitiin erilaistumaan. Tähän mennessä, MIPS solut on onnistuneesti erotellaan eri solutyyppejä, mukaan lukien hematopoieettisten ja endoteelisolujen [12], hermosolut [13], sydämen solut [14] ja haiman β-soluihin [15]. Huolimatta näistä onnistunut raportit in vitro erilaistuminen, iPS-solut eivät olleet täysin sopivia siirrettäväksi potilaille. Tärkein kysymys on turvallisuusongelmia että IPS solut pyrkivät muodostamaan teratomas ja on riski pahanlaatuisen muutoksen [16] – [18]. Joka perustuu CSCS teoriaan, me tutkittava CSCS voivat olla peräisin MIPS solujen altistuksen jälkeen kasvaimen mikroympäristön (Fig. 1).

MIPS-soluja olisi indusoitu joitakin erilaisia ​​kantasolujen, kuten hematopoieettisten solujen ja hermoston kantasoluja, erilaistumaan eri fenotyyppejä, kuten makrofagien, monosyyttien, hermosoluja, sydämen solut ja haiman β- solujen, kun se altistetaan normaaliin kapealla. Oletimme, että CSCS voivat myös olla peräisin MIPS soluista vain silloin altistuminen pahanlaatuinen markkinarako.

Tulokset

MIPS soluja viljeltiin elatusaine syöpäsolulinjois- osoitti kasvainten muodostumiseen ja angiogeneesin

in vivo

tässä tutkimuksessa, suunnittelimme kaksi menettelyä hoitoon MIPS soluihin. MIPS soluja viljeltiin ilman syöttösoluja seokseen MIPS keskipitkän ja kasvualusta saadaan seuraavan hiiren syöpäsolulinjassa: Lewisin keuhkokarsinooma (LLC), hiiren alkion karsinooma (P19), hiiren melanooma (B16) ja hiiren nisäkarsinooman (MC .E12) ja 4 viikkoa. MIPS soluja Näissä olosuhteissa viljellyt olivat kutsutaan MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm, ja MIPS-MC.E12 cm soluissa. MIPS solut myös viljellään kunkin syövän solulinja, joka oli aiemmin käsitelty mitomysiini C: llä, kuten feeder-solujen 4 viikkoa. Nämä MIPS solut kutsutaan MIPS-LLCc, MIPS-P19c, MIPS-B16c ja MIPS-MC.E12c soluissa. MIPS-soluja, jotka oli viljelty kanssa tai ilman feeder soluja eri edellytykset ja istutetaan sitten nude-hiiriin. 4 viikon jälkeen, MIPS solut muodostivat tyypillinen teratomas joka sisälsi eriytetty kudoksiin ilman etäpesäkkeitä (Fig. S1A). Sen sijaan hiiri allograftit MIPS soluja, jotka oli käsitelty elatusaineessa, MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm ja MIPS-MC.E12 cm solut muodostivat eriytymättömiä karsinoomat, joka hänellä soluja ydinvoiman sytoplasmiseksi suhde , ydin- pleomorfisimia, poikkeavasti korkea mitoosi hinnat, ja useita patologisia mitoottisia (Fig. 2A ja S1B). Toisaalta, vain MIPS-MC.E12c solujen yhteisviljelmä muodostaman ryhmän pahanlaatuisia kasvaimia (Fig. S1B). Tuumorigeenisyyden eri solujen on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. On huomattava, että ainoastaan ​​kasvaimia, jotka olivat peräisin MIPS-LLCcm solut osoittivat ominaisuuksia angiogeneesin ja mikrometastaasien (Fig. 2A).

(A) Histologia MIPS -LLCcm saatujen solujen kasvain. Kasvain näytteillä pahanlaatuisten ilmiasuun rauhas epiteelin liikakasvu (tähti), ydinvoiman sytoplasmiseksi suhde, vakava ydin- atypia ja useita patologisia mitoottisia (nuolenpäät, upotus) (ylhäällä vasemmalla); micrometastases (nuoli, ylhäällä oikealla); ja hypervascularization ohjeellinen angiogeneesin (alhaalla vasemmalla) HE värjäys. Positiivinen of CD31 (Rat monoklonaalinen vasta-aine, ruskea) IHC värjäys osoitti useita verisuonten alukset kasvaimen (alhaalla oikealla). Mittaviivat: 100 um (ylhäällä vasemmalla ja alhaalla), 50 um (ylhäällä oikealla). (B) Ensisijainen kulttuuri johdettu MIPS-LLCcm kasvain. Ensisijainen viljelmällä oli kantasolujen kaltaisia ​​soluja (tähdellä ylhäällä vasemmalla) ilmentävät GFP (ylhäällä oikealla) ja fibroblastien kaltaisten solujen (nuoli ylhäällä vasemmalla) ilman GFP: n ilmentymisen (ylhäällä oikealla). Sferoidiviljelmiä soluja kasvanut primääriviljelmässä suspensiossa (keskellä vasemmalla) GFP: n ilmentymisen (keskellä oikealla). Rakeiden Solut laitettiin takaisin kiinni oleva kulttuuri säilyy kantasolujen kaltaisia ​​soluja (tähdellä alhaalla vasemmalla) GFP: n ilmentymisen (alhaalla oikealla) ja fibroblastien kaltaisten solujen (nuoli alhaalla vasemmalla) ilman GFP: n ilmentymisen (alhaalla oikealla). (C) immunofluoresenssivärjäystä Nanog ja lokakuu 3/4 pallomainen soluissa. Kryoleikkeet pallomaisten solut värjättiin primaaristen vasta-aineiden (Rabbit anti-Nanog tai hiiren anti-Oct-3/4) ja sen jälkeen anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineet on leimattu Alexa fluoroforeilla 555 (punainen) tai 488 (Green). Solut vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittaviivat: 20 pm. (D) ilmentyminen tasolla p53, MMP-2 ja MMP-9 analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. MIPS + LIF /-MEF, MIPS soluja viljeltiin LIF keskipitkällä ilman MEFfeeder soluja; MIPS-LLCcm sferoidi, Rakeiden solut johdettu muoto MIPS-LLCcm soluissa; MIPS-LLCcm LMT sferoidi, Rakeiden peräisin olevat solut MIPS-LLCcm solujen keuhkojen etäpesäkekasvainkudoksen; LLC, Lewisin keuhkokarsinooma soluja.

MIPS-LLCcm solujen kapasiteetti oli itseuudistumisen

Kolmekymmentä viittäkymmentä prosenttia soluista oli GFP positiivisia kasvaimia johdettu MIPS-LLCcm soluissa vain alle viisi prosenttia oli positiivisia eriytetty teratoma (Fig. S2). Koska GFP suunniteltiin alle

Nanog

promoottori vakaasti ilmentämään vain soluissa, jotka olivat erilaistumattoman ja olisi vaiennettu eriytetty kudoksissa [11], suurin osa MIPS solujen katsottiin eriyttää teratomas. Toisaalta, pahanlaatuisten kudosten hiljaista sisältävät erilaistumattomia kantasoluja kaltaisia ​​soluja. Primaariviljelmät kasvain pitäisi olla tehokas tapa mahdollisesti poistaa erilaisia ​​soluja saadakseen enemmän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat peräisin MIPS-LLCcm. Siten kasvainkudoksen peräisin MIPS-LLCcm solut saatettiin primäärisestä viljelmästä, josta kahdentyyppisiä solupopulaatioiden havaittiin. Yksi oli kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ilmensivät GFP: tä, kun taas toinen populaatio oli fibroblastin kaltaisia ​​soluja, jotka eivät ekspressoineet GFP: tä (kuvio. 2B). Koska pahanlaatuiset solut varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia voidaan lisätä in vitro tarttumaton aloilla [19], [20], solut siirrettiin tarttumattomat kulttuuri ruokia helpottamaan kasvua pallosia. Vuonna jousitus, GFP: n ilmentymisen (Fig. 2B) oli näillä kasvain aloilla, kun taas fibroblastien kaltaisten solujen eivät selviäisi ilman kiinnittyminen pohjaan lautasen ja oli GFP negatiivinen. Pallojen johdettu MIPS-LLCcm kasvain oli toistuvasti trypsinoitiin ja vahvistettu kyky muodostaa pallosia alle tarttumaton kunnossa. Indivisual solut dissosioituneista aloilla pystyivät muodostamaan uusia palloja aikana serial passage kudosviljelmässä, joka osoittaa, että solut voisivat itse uudistaa [21]. Kasvain pallot siirrettiin sitten kiinnittynyt viljelyastioihin (Fig. 2B), ja alistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä ja Nanog sekä MMA 3/4 (Fig. 2C). Positiivinen värjäytyminen Nanog ja lokakuu 3/4, jotka ovat kriittisiä tekijöitä ylläpitämään eriytymättömiä valtion ja itseuudistumisen kantasolujen [11], [21], vahvisti ilmaus kantasolujen merkkiaineita näissä pallosia. Piirteen syövän tilan MIPS-LLCcm sferoidiviljelmiä solujen oli osoitettu p53-geenin RT-qPCR. Tämän seurauksena, ilmaisu havaittiin vaimentua tasolle LLC syöpäsolujen (Fig. 2D). Downregulation voi osoittaa pahanlaatuisuuden soluihin. Arvioida tuumorigeenisyyden solujen sisällä kasvaimen aloilla, 1 x 10~4 x 10

6 nämä solut subkutaanisesti transplantoitiin nude-hiiriin (taulukko 2). 4 viikon jälkeen, kasvaimet muodostivat ja näytteillä laaja angiogeneesiä (Fig. 3A), joka oli samanlainen kuin MIPS-LLCcm johdettu kasvaimia. Nämä kasvaimet näyttivät aggressiivisempia koska suuri kasvu. Tutkia metastaattinen potentiaali, 1 x 10

5 sferoidiviljelmiä solua injektoitiin hiiren häntälaskimoon. Kuukautta myöhemmin useita etäpesäkenystyröiden ekspressoivat GFP havaittiin keuhkoissa osoittaa, että ne olivat peräisin pallomainen solut (Fig. 3B ja 3C). Ja ilmentymistaso MMP-2 havaittiin merkittävästi voimistunut siinä pallomainen peräisin olevia soluja MIPS-LLCcm solujen keuhkojen etäpesäkekasvainten (MIPS-LLCcm LMT sferoidiviljelmiä) (Fig. 2D), mikä merkitsi sitä, että MIPS-LLCcm solut hallussaan metastaattista potentiaalia aiheutti induktiolla MMP-2: n ilmentymisen, ja väestö erittäin metastaattinen soluja voitaisiin eristää MIPS-LLCcm soluihin in vivo vieritystoiminnolla.

(A) histologia kasvaimen peräisin pallomainen soluista. Kasvain osoitti jonkin verran rauhas rakenne (tähdellä), jossa on useita pathologic mitoottisia (nuolenpäät, upotus) (vasemmalla), korkea mitoosi hinnat (nuolenpäät keskellä), ja hypervascularization (oikealla) HE värjäys. Mittaviivat: 100 pm. (B) keuhkometastaaseja jälkeen häntälaskimoon injektion pallomainen soluja. Keuhkot hoitivat etäpesäkekasvainkudoksen kyhmyt. (C) etäpesäkkeet osoitti jonkin verran rauhas rakenne (tähdellä), jossa on useita pathologic mitoottisia (nuolenpäitä sisään ylhäällä vasemmalla); hypervascularization (ylhäällä oikealla); invaasion keuhkojen parenkyymikudokseen (alhaalla vasemmalla) HE värjäys. Ilmaisu GFP (Kanin polyklonaaliset vasta-aine, ruskea) havaittiin näissä etäpesäkenystyröiden IHC värjäytymistä (alhaalla oikealla). T, kasvain; L, keuhkokudoksen. Mittaviivat: 100 pm. (D) immunohistokemia CK ja GFP lokalisointi kasvaimissa peräisin MIPS, MIPS-LLCcm ja pallomainen soluja. Serial leikkeet värjättiin CK (hiiren monoklonaalinen vasta-aine, ruskea) ja GFP (Kanin polyklonaalista vasta-ainetta, ruskea) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Rauhas alueella olivat CK positiivisia mutta GFP negatiivinen kasvaimia. Mittaviivat: 100 pm.

Kasvain peräisin MIPS-LLCcm solut koostuvat adenokarsinoomista ja runsas eriytymättömiä kasvainsolujen

Sitten tutkittiin tyypin pahanlaatuinen kasvain IHC. Pan-sytokeratiinivasta (CK, joka on epiteelikasvainsolut markkeri), vimentiinistä (merkki mesenkymaalisten kasvain), α-aktiini (merkki myogenic kasvain), CD31 (merkkiaine vaskulo-), NF-M ja GFAP (merkkiaineiden neurologisesta kasvain) käytettiin värjäämään kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). CK havaittiin voimakkaasti värjätään kasvaimissa. Ilmaus CK ja GFP arvioitiin sitten useita leikesarjojen. Rauhas alueet olivat CK positiivisia mutta nämä solut olivat GFP negatiivisia kasvaimissa (Fig. 3d). Kolmekymmentä viisikymmentä prosenttia kasvaimen solut olivat GFP positiivisia kasvaimia, jotka olivat peräisin sekä MIPS-LLCcm parit ja sferoidiviljelmiä solut taas ei alueet olivat GFP positiivisia teratoma. Siksi nämä kasvaimet arvosteli adenokarsinoomat sekoitettiin runsas eriytymättömiä syöpäsoluja.

johdettu solut ilmaisivat alkion kantasoluilla merkkiaineiden

Alkion kantasolujen merkkiaineita ja neljä transkriptiotekijöiden jotka transdusoitiin sitten tarkistettu käänteisfaasi-PCR (RT-PCR) ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (RT-qPCR). MIPS-LLCcm solut ja sferoidiviljelmiä solut osoittivat ilmentymistä alkion kantasolujen merkkiaineita (Fig. 4A), mutta ekspressiotasot olivat hieman erilaiset näiden tuumorisolujen ja alkuperäinen MIPS solut (Fig. 4C). Erityisesti RT-qPCR

Nanog

ja

Rex1

merkittävästi koholla MIPS-LLCcm kasvainsoluja, primaariviljelmissä johdettu näistä kasvaimista tai sferoidiviljelmiä verrattuna MIPS soluihin kasvatettiin puuttuessa tai läsnä ollessa syöttösoluja. Sitä vastoin ilmaus neljän transkriptiotekijöiden havaittiin vähentynyt vaihtelevassa määrin sekä MIPS-LLCcm soluja ja pallomainen soluja verrattuna MIPS soluja, jotka kasvatettiin tukisoluja (Fig. 4B ja 4D).

(A) RT-PCR-analyysi kantasolujen markkerigeeni ilme. (B) RT-PCR-analyysi neljästä mips transkriptiotekijät. PCR-tuotteet olivat koodaavat alueet (yhteensä), endogeeninen selostukset vain (Endo.), Ja siirtogeenin transkriptien vain (tg). (C) Expression tasot alkion kantasoluilla markkerigeenin analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. (D) Expression tasot neljän MIPS solun transkriptiotekijöiden analysoitiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR.

Keskustelu

MIPS-LLCcm solut osoittivat sferoidiviljelmiä muodostumista suspensioviljelmässä, joka on korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa rajoitetulla laimennuksia ja korkea metastaattinen potentiaali, jotka olivat kaikki yhdenmukaisia ​​perusominaisuudet CSCS [19], [22], [23]. Rapid kasvaimen kasvu edellyttää de novo angiogeneesiä, jossa verisuonten kapealla tarjoaa kasvua edistäviä signaaleja. Kasvaimet johdettu MIPS-LLCcm solut mukaan lukien pallomainen solut osoittivat myös korkea angiogeneesiä, jota ei havaittu teratomas peräisin MIPS soluista. Tiivis osallistuminen CSCS ja verisuonten on aiemmin dokumentoitu hermostoon ja näiden verisuonten kapeampiin auttaa ylläpitoa CSCS [24]. IFNy, suuri negatiivinen säätelymolekyyli Angiogeneesin on osoitettu alas-säätelemään MMP, estävät endoteelisolujen migraatiota ja aiheuttaa angiostaattisista tekijä IP-10 kautta aktivoida JAK-STAT signaalireitin [25]. Microarray arviointi vertaamalla MIPS solut ja MIPS-LLCcm solut osoittivat alas-säätely IFNγR MIPS-LLCcm soluja (materiaalit ja menetelmät S1, taulukko S1), joka saattaa olla vastuussa angiogeneesiä MIPS-LLCcm solut peräisin kasvain. Korkeampi MMP-2 MIPS-LLCcm LMT solujen antaa metastaattista potentiaalia MIPS-LLCcm soluissa saattaa olla seurausta IFNγR vähentäminen, vaikka tarkempaa analyysiä tarvitaan. Ottaen downregulation MMP-9-geenin ilmentymistä sekä MIPS-LLCcm ja MIPS-LLCcm LMT soluja huomioon, MMP-2 näkyy vastuussa angiogeneesin ja metastaasin tässä tutkimuksessa.

Self-uusimista mainitaan usein ominaispiirre CSCS. On kuitenkin olemassa teknisiä rajoituksia tiukasti arvioida itseuudistumisen. Normaalille kudosta kantasoluista, standardi testi itseuudistumisen edellyttää klonaalisen in vivo osoitus itseuudistumisen ja monilinjainen eriyttämisen ensisijainen elinsiirtoja kantasoluja, jota seuraa osoitus samat ominaisuudet sarjaan elinsiirtoja saman soluja. Itseuudistumisen kasvaimia tuottavassa syöpäsoluissa on yleensä arvioinut osoitus sarja transplantability polyklonaalisten kasvaimia ja osoittaminen samanlaisen fenotyypin heterogeenisuus vanhempien ja jälkeläisten tuumoriksenografteissa [26]. Sekvenssi käyttävien kokeiden MIPS-LLCcm soluja, jotka olivat peräisin ensisijainen kasvaimia ja niiden toistuva alakulttuuri kun pallosia osoitti kapasiteetin itseuudistumisen MIPS-LLCcm solujen saamiseksi sekundaarikasvaimia esille samaa histologia ja fenotyypin ensisijaiseksi kasvaimia [21] .

Lisäksi

Nanog

, merkkiaine laajasti liittyy ”stemness” oli vielä ilmaistiin korkeammilla tasoilla MIPS-LLCcm solujen ja sferoidiviljelmiä soluja verrattuna MIPS soluihin.

solmukohtien

ja

Cripto1

ovat alkion morfogeeneille jotka ovat vastuussa maintaince pluripotenttisuuden /itseuudistumisen alkion kantasoluja ja suorittaa kriittinen rooli ylläpitää erilaistumattomat tilasta solujen [7]. MIPS-LLCcm soluja,

solmukohtien

ja

Cripto1

ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeampia verrattuna MIPS soluihin, jotka vahvistivat suhteellisen erilaistumattoman tilan MIPS-LLCcm soluissa. Väheneminen solmukohtien ilmentymisen 70% pallomainen soluissa luultavasti osoitti erilaistumisen pallomaisten solujen pluripotenttien kantasolujen ja unipotent kantasolujen CSCS. Merkittävä alassäätöä kantasolujen merkkiaineiden havaittiin teratomas jotka olivat peräisin MIPS solujen nämä kasvaimet sisältävät sekoitettu populaatioita eri eriytetty solutyyppejä. Sen sijaan kasvaimet, jotka ovat peräisin MIPS-LLCcm solujen ja sferoidi solujen ekspressiotasot näiden markkerien heikkeni, mutta oli paljon suurempi kuin teratomas. Nämä tulokset, jotka olivat yhtäpitäviä IHC, merkitse sitä, että oli tietty määrä CSCS että pahanlaatuisia kasvaimia, kun taas lähes kaikki solut olivat erillisiä teratomas.

kasvainsolujen kehitetty tässä tutkimuksessa alkaen MIPS soluista kasvoi rakeita suspensioviljelmässä, osoitti korkeaa tuumorigeeninen ja metastaattisen potentiaalin ja angiogeneesiä in vivo. Lisäksi kyky itseuudistumisen ja ylläpidosta sekä erilaistumattomaan valtion arvioituna ilmaus markkereita, jotka liittyvät alkion kantasolut mukaan nämä ensisijainen MIPS-LLCcm soluihin ja pallomainen soluja, jotka olivat peräisin MIPS-LLCcm solut sisältävät suuri osa CSCS. Scaffidi ja Misteli on viime aikoina raportoitu tuotannon CSC kaltaisten solujen fibroblasti, jotka voidaan jäljittää somaattisten kantasolujen [27]. Ne transdusoidut onkogeenisia geenejä hTERT, H-Ras V12 ja SV40 T antigeenejä tuottaa CSC kaltaisia ​​soluja uudelleenohjelmointi. Sen pitäisi olla huomionarvoista, että meidän CSC kehitettiin käyttämättä geenitransduktion. Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa kehittymistä CSCS väestön MIPS-soluja, jotka voidaan saavuttaa tekijöitä, jotka ovat kasvainsolujen erittämiä, vaikka identiteetti näiden liukoisen tekijän (t) on edelleen tuntematon. Eksogeenisesti

C-myc

MIPS solut voivat edistää muutosta, koska aktivoituminen

C-myc

kuljettaa retrovirus katsottiin liittyvän kasvainten muodostumista 20% kimeeristen hiirten [11]. Lisäksi vuotava ilmentyminen näiden siirtogeenien voi myös estää täydellisen MIPS solujen erilaistumista ja kypsymistä, mikä suurempi riski epäkypsä teratoma muodostumisen [28]. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että siirtogeenien, joita käytetään tuottamaan MIPS soluihin olivat lähes täysin äänetön MIPS-LLCcm solut ja sferoidiviljelmiä soluja verrattuna MIPS soluja kasvatetaan syöttösoluja ja että kaksi onkogeenien,

C-myc

ja

Klf4

, dramaattisesti vähentynyt MIPS-LLCcm solut ja pallomainen soluja. Tämä viittaa siihen, että siirtogeenien ei saa olla tärkein tekijöistä muutosta MIPS solujen tässä nykyisessä mallissa. Lisäksi, koska mitään kasvaimen muodostumisen havaittiin tapauksia mips-P19c, -B16c, ja mitään eloon jäänyt vähimmäistuontihintoja-LLCc, jotka olivat kaikki ”co-kulttuuri ryhmä”, olisi vähän mahdollisuuksia siirron tai osuus hiiren kasvain virusten tuumorigeenisyyteen MIPS solujen viljelty käsitelty alusta. Ottaen huomioon, ettei kasvaimien näissä soluissa yhteistyössä kulttuuri ryhmä, ei-optimaaliseksi iPS kulttuurin pitäisi olla vaikea selittää muuntaminen mips solun taas mahdollisuus virus transfektion edelleen asioissa MIPS-MC.E12 cm ja -MC.E12c [29]. Lisäksi neljä riippumatonta teokset raportoida genomista analyyseihin iPS ja paljastaa huolestuttava mutaatioiden läsnäolon näissä soluissa [30] – [33], jotka voivat olla vihje MIPS on helpompi vaikuttaa liukoisen tekijän (t) olemassa kasvaimen mikroympäristössä . Eksosomit ovat 40-100 nm bilipid membraanivesikkeleihin jotka erittävät useimmat solutyyppejä. Niiden oletetaan välittävän solu-solu viestintä ja helpottaa biologisten prosessien kuten solun kasvua ja pahanlaatuisiksi [34], [35]. Perustuvat viimeaikaiset raportit kasvaimen eksosomeiksi [36], [37], on syytä selkeyttää merkittävä rooli eksosomeiksi erittää LLC solujen muuntaminen MIPS solujen CSCS. Lisäksi meidän toteaminen downregluration p53-geenin ilmentymisen MIPS-LLCcm soluissa osoittaa, että häiriintynyt p53 verkosto on yksi niistä mekanismeista muuntamisen MIPS solujen CSCS. On raportoitu, että kasvaimen solut voivat inhiboida p53-induktion vieressä fibroblastien [38]. On syytä huomata, että mekanismi tämän suppression tulisi riippua tekijä erittyneen kasvainsolujen, mutta ei suoraa solu-solu-vuorovaikutusta. Määritelmä ja karakterisointi geneettisiä muutoksia ja erittyy tekijöistä kasvaimen mikroympäristössä, mikä muuntaa MIPS solut CSC tehokas kehittämiseksi uusien syöpälääkkeiden.

spesifisten solun pinnan markkereita on laajalti käytetty tunnistamaan CSCS. Jotkut näistä pinnan markkereita tiedetään olevan yhteisiä eri CSCS väestöstä. Kuitenkin, nämä merkit voidaan silti liittyvät normaalit kantasolujen [1]. Ilmentyvät eri pinta markkereita voidaan erottaa normaalit kantasolujen CSCS ovat suurelta osin tuntemattomia [19]. On välttämätöntä tunnistaa markkereita voidaan erottaa toisistaan ​​CSCS ja normaaleja kantasoluja. Tämä solu malli tässä asiakirjassa pitäisi olla käyttökelpoinen väline tunnistaa mahdollisesti bona fide markkereita CSCS. Tällaisia ​​merkkejä voivat olla potentiaalisia kohteita kehittämiseen Uusien hoitomuotojen vastaan ​​CSCS vaikuttamatta normaaliin kantasolujen toimintoja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Hiiri aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (MIPS, solun nimi: iPS-MEF-Ng-20D-17; erä nro 012) ostettiin riken Cell Bank (Japani) ja pidettiin (DMEM, joka sisälsi 15% FCS: ää, 0,1 mM NEAA, 2 mM L- glutamiinia, 0,1 mM 2-merkaptoetanolia, 1000 U /ml LIF: ia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 U /ml streptomysiiniä), on syöttölaite kerrokset mitomysiini-C-käsitellyn hiiren alkion fibroblasti (MEF-solut) (Reprocell, Japani). Hiiri Lewis keuhkosyöpä (LLC) solut hankittiin ATCC (USA) ja ylläpidettiin DMEM, joka sisälsi 10% FCS; hiiren alkion karsinoomasolut (P19) hankittiin Riken Cell Bank (Japani) ja ylläpidettiin aMEM, joka sisälsi 10% FCS; hiiren melanoomasoluja (B16 /BL6) (ATCC, USA) ja hiiren maitorauhasen kasvainsolut (BALB-MC.E12) (Riken Cell Bank, Japani) pidettiin MEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS: ää.

valmistamiseksi conditioned väliaine (CM) päässä eri hiiren syöpäsolun linjat, alusta kerättiin konfluenteis- ruokia ja suodatetaan 0,45 pm suodattimen (Millpore, Irlanti). Sitten 3 ml CM lisättiin osaksi 3,5 cm malja yössä vahvistamaan ei ollut elossa syöpäsoluja CM. Sillä väliainetta kokeissa, MIPS-solut (ilman MEF feeder-soluja) ylläpidettiin väliaineessa on kuvattu edellä, ilman LIF. Puolet väliaine vaihdettiin joka päivä CM 4 viikkoa. MIPS soluja ilman hoitoa CM käytettiin kontrollina. Sillä yhteisviljelmä kokeissa hiiren kasvainsolulinjat käsiteltiin 0,4 ug /ml mitomysiini C: llä (Sigma, USA) ja niitä käytettiin sitten feeder-soluja ja viljellään MIPS-solut (ilman MEF feeder-solujen) ja 4 viikkoa. MIPS solut jatkettiin 3 päivän välein ja solujen morfologia valokuvattiin käyttäen Olympus IX81 mikroskooppi varustettu valoa fluoresenssi laite (Olympus, Japani).

primääriviljelmässä, hiiren allograftit leikattiin pieniksi paloiksi (noin 1 mm

3) HBSS: ssä. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa, kudokset siirrettiin 15 ml: n putkeen, jossa 0,25% trypsiiniä ja 5-6-kertainen tilavuus 37 ° C: ssa 40 min. Viisi mikrolitraa DMEM, joka sisälsi 10% FCS: ää, lisättiin sitten lopettaa ruoansulatusta. Solujen suspensio pantiin sitten uuteen putkeen ja sentrifugoidaan 1000 rpm: ssä 10 min. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan HBSS: ää, ja sentrifugoitiin 1000 rpm 5 minuutin ajan. Solupelletti asetettiin sitten sopiva määrä MIPS alustaa ilman LIF ja solut ympättiin astiaan tiheydellä 5 x 10

5 /ml. Solut siirrostettiin 3 päivän välein ja solujen morfologia havaittiin ja valokuvattiin käyttäen Olympus IX81 mikroskooppia varustettu valoa fluoresenssi laite (Olympus, Japani).

Jousitus kulttuureissa tuottaa pallosia suoritettiin, kuten on kuvattu Dontu et al [39 ]. Lyhyesti, yksi solut maljattiin pinnoittamatonta astiat (bakteeri kulttuuri astia) tiheydellä 2 x 10

4 /ml primääriviljelmässä. Soluja kasvatettiin seerumivapaassa MIPS väliaineessa ilman LIF. Sferoidit solut kerättiin varovasti sentrifugoimalla (500 rpm) jälkeen 7-10 päivää ja hajotettiin entsymaattisesti (0,025% trypsiini /EDTA: lla).

Eläinkokeet

Nude-hiiret (Balb /c Slc

-nu /nu

, naispuolinen, 6~8 viikkoa) hankittiin Charlesriver, Japani. Suunnitelma Eläinkokeiden tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea eläinkokeiden Okayaman yliopiston alla tunnukset OKU-2008211, OKU-2009144, OKU-2010179 ja OKU-2011-305.

elinsiirrot tutkimuksia, -soluja (esitetty taulukossa 1 ja 2) suspendoitiin 100 ul: aan DMEM, joka sisälsi 10% FCS: ää, ja injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin. 4 viikon jälkeen kasvaimet leikattiin irti ja kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin puskuriliuosta (Wako, Japani).

micrometastases tutkimuksia, 1 x 10

5 MIPS-LLCcm sferoidiviljelmiä solut suspendoitiin 100 ul DMEM, joka sisälsi 10% FCS ja ruiskutettiin paljaiden hiirien häntälaskimoon (n = 6).

histologisen analyysin ja immunohistokemia (IHC) B

Kasvaimet vahvistettu 24 tuntia ja sitten käsitellään käyttäen rutiininomaisesti vahaa -embedding menettely histologista tutkimusta varten. Kolme mikrometriä paksu leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE).

IHC GFP, pan-sytokeratiinivasta, vimentiinin, α-Actin, CD31, NF-M, GFAP suoritettiin käyttäen formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotettu kudokseen kohdat ja standardimenetelmiä. Lyhyesti, 3 um kudosleikkeet parafiini ja niiden antigeenin noutaa suoritettiin käyttäen mikro altistus 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan sitraattipuskurissa (pH 6,0) tai inkuboitu proteinaasi K: n (40 ug /ml) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan.