Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvän kuoleman American men. Kehittymistä ja etenemistä kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä riippuu suuresti androgen signalointi. Etäpesäkkeitä ovat aluksi reagoivat antiandrogeeni terapia kuitenkin tullut vastustuskykyisiä tämän hoito kun etenemistä. Genominen ja proteomic tutkimukset ovat sekaantuneet rooli androgen säännellä aineenvaihduntaa eturauhassyövässä. Kuitenkin on ollut metabolomic profilointi tutkimuksissa tähän mennessä jotka ovat tarkastelleet androgeenisäädellyn biokemiallisten prosessien eturauhassyövässä. Tässä olemme käyttäneet puolueeton metabolomic profiloinnin yhdistettynä rikastamiseen perustuvia bioprosessi kartoitus saada oivalluksia biokemiallisia muutoksia välittävät androgen eturauhassyövän solulinjoissa. Tuloksemme osoittavat, että androgeenien altistuminen aiheuttaa korkeus aminohappo aineenvaihduntaa ja muuttaminen metylaation potentiaalia eturauhassyövän soluissa. Edelleen, metabolinen fenotyypitys tutkimukset vahvistavat suurempi vuon kautta väyliä liittyy aminohapon aineenvaihdunnan eturauhassyöpäsoluissa käsitelty androgen. Nämä havainnot tarjoavat käsityksen mahdollisten biokemiallisten prosessien säädellään androgen signalointi eturauhassyövässä. Kliinisesti, jos validoitu, nämä reitit voidaan hyödyntää kehittää hoitostrategioita jotka täydentävät nykyinen androgeenireseptorin ablatiivi hoitoja, kun havaittu androgeenisäädellyn metabolinen allekirjoituksia voitaisiin käyttää biomarkkereita että presage kehittäminen kastraatiotasolle vastustuskykyisten eturauhassyöpä.

lainaus: Putluri N, Shojaie A, Vasu VT, Nalluri S, Vareed SK, Putluri V, et ai. (2011) Metabolomic Profilointi paljastaa rooli androgen aktivointi Amino Acid Aineenvaihdunta ja Metylointi eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (7): e21417. doi: 10,1371 /journal.pone.0021417

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 10 joulukuu 2010; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2011; Julkaistu: 18 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Putluri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee osittain National Cancer Institute myöntää RO1CA133458-04 (AS), 1 R03 CA139489-01 (AS) ja RCA145444A (AS), Doris Duke Foundation ja Molecular Fenotyypitys Core ja DK089503 (kaikki SP). AS tukee Georgia Cancer Research Distinguished Scientist palkinnon. Hanke tukivat myös Agilent Technologies jotka tarjotaan opastusta menetelmistä. TS ja SF työskentelee Agilent Technologies. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin kiinteä urut maligniteetti diagnosoidaan miehillä Yhdysvalloissa ja on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman American men [1]. Androgeenien ja androgeenireseptorin (AR) on tärkeä rooli kehityksessä ja etenemisessä PCa, ja androgeeniablaatio on yksi tärkeimmistä hoitovaihtoehtoja hoitoon paikallisesti levinnyt tai metastaattinen PCa [2]. Lähes 90% kaikista Metastasoivassa eturauhassyöpä aluksi vastata kastraatio aiheuttama androgen peruuttamista; mutta tämä hoito on usein tehokas alle 2 vuotta ja sen jälkeen etenee kastraatiotasolle kestävä tila (castrate kestävä eturauhassyöpä, CRPC). CRPC on tappava tauti. [3]. Huolimatta sen kliinisen vastustuskyvyn androgeenideprivaatio hoidon CRPC ilmaisee AR [4] ja jolla aktiivinen androgen signalointi ei-perinteisten aktivointi androgeenireseptorin signalointi akselin [5]. Tämä on parhaiten esitetty havainto lisätä seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA), joka on androgen säätelemä proteiini, ja tällä hetkellä käyttää markkerina biokemiallisia kasvaimen uusiutuminen, kehittämisestä huolimatta CRPC [6]. Se on keskustellaan yhä siitä, onko tämä AR toiminta CRPC välittyy suuren affiniteetin reseptorit, jotka ovat herkkiä alhainen verenkierrossa androgeenien tai, onko reseptorin voitot kyky promiscuously vuorovaikutuksessa muiden steroidihormonien [4], [7], [8]. Viimeksi mainittu on tukea tutkimuksista, jotka ovat kuvanneet usein mutaatio (T877A) sisällä hormonia sitovan domeenin AR, joka tekee sen salliva sitovia muita steroidihormonien ja siten voittaa tietty vaatimus androgeenit [9], [10], [11 ]. Tärkeää on kuitenkin, ei ole olemassa markkereita tällä hetkellä saatavilla, ennustaa jos kasvain etenee osaksi kastraatiotason kestävä tilassa. Näin ollen, ymmärrystä molekyyli muutokset, jotka johtuvat androgeeni toimia eturauhasen syöpä on välttämätöntä. Useita ryhmät ovat kuulustelleet androgeenisäädellyn muutoksia, jotka transcriptome ja proteomiin tasolla PCA solulinjoissa, geenien ilmentyminen paneelit ja massaspektrometriaa [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Yksi tällainen uraauurtava tutkimus käyttäen Affymetrix oligonukleotidisirujen korosti yhdistys androgen signalointi PCA solujen aineenvaihduntaan liittyvät stressistä [19]. Lisäksi androgeenin-indusoituun PCa-solujen on osoitettu olevan osallisena aktivaatio nisäkkään rapamysiinin kohde (m-TOR) [20], [21], [22], [23], joka itsessään on herkkä aineenvaihdunnan häiriöihin kasvain [24], [25]. Tästä huolimatta yhdistys on rajallinen käsityksen biokemiallisia muutoksia aiheuttama androgen toiminta PCA soluissa. Käyttämällä integroiva analyysi Hyväksytty geenien ilmentyminen ja proteomiikka tiedot, aiemmin meillä oli ennustanut aktivointi aminohapon aineenvaihdunnan androgeeni saaneilla LNCaP (androgeeni herkkä) syöpäsolujen [26]. Tämä odotus vahvistettiin edelleen metabolomic profilointi PCa kudosten joka paljasti aminohappo aineenvaihdunnan olevan yksi tunnusmerkkejä varhaisen kasvainten kehittymiseen [27]. Täällä käytämme massaspektrometria-pohjainen profilointi Metabolomi androgeenin käsiteltyjen PCa soluissa, nimetä muuttunut aineenvaihduntatuotteita, tunnistaa ja vahvistaa biokemiallisia reittejä ja arvioida hormoni liittyy allekirjoituksen potilaasta johdettujen kudoksia. Tuloksemme ovat osoituksena androgeenin indusoiman korkeus aminohappo aineenvaihduntaa ja muuttaminen metylaation mahdollisten PCA soluissa, jotka molemmat tukevat aiemmissa havainnot käyttämällä potilaasta johdettujen paikallista ja metastasoituneen PCa kudoksissa [27].

Methods

solulinjat

Eturauhasen solulinjoissa (Immortalized hyvänlaatuinen – RWPE; androgen-ei-reagoivaa – PC3, DU145 ja androgeenin-reagoiva – VCAP, ja LNCaP) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, VA). RWPE soluja kasvatettiin keratinosyyttien-SFM media (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF) ja 50 ug /ml naudan pitutary uute (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Vcap soluja kasvatettiin DMEM-Glutamax media (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Hyclone Labs, Thermo Scientific , Rockford, IL). DU145 soluja kasvatettiin Minimum Essential Media (MEM) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) täydennettynä 10% FBS (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL), 1% penisilliini-streptomysiiniä (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford , IL) ja 1% HEPES (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). PC3 ja LNCaP-soluja, kasvatettiin RPMI-1640-media (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Hyclone Labs , Thermo Scientific, Rockford, IL) .. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Androgeenien (R1881) käsittely

Equal määrä VCAP soluja päällystetty ja kasvatettiin 60% konfluenssiin DMEM-Glutamax väliaineessa, kuten edellä on kuvattu. Sitten väliaine korvattiin kaksi päivää fenolipunattomalla RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% hiilellä erotettua FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). Yhdet solut käsiteltiin 10 nM synteettistä androgen, metyylitrienolonia (R1881; Perkin Elmer, Waltham, MA), joko 24 tai 48 tuntia, kun taas ajoneuvon käsiteltyjä soluja (käsiteltiin etanolilla) toimivat kontrolleina. Lopussa hoidon, solut, trypsinoitiin, pelletoitiin, pestiin 50 mM fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4) ja säilytettiin -140 ° C: ssa, kunnes sitä analyysit.

Näytteiden valmistus massan spectrometry- pohjainen tarkastelu Metabolomi solulinjoissa

Massaspektrometria-pohjainen metabolomiikan profilointi tehtiin jäädytetty eturauhasen solujen pelletit (~ 10 miljoonaa solua). Prosessi metaboliitin uutto mukana käyttöön ekvimolaarinen seos 11 standardin yhdisteet liuotettiin metanoliin (Epibrassinolide, [D

3] Testosteroni, [

15N] Antraniilihappo, Zeatine, Jasmonihappo, gibberelliinihappo, [D

4] estroni, [

15N] -Tryptophan, [D

4] tymiini, [

13C] Kreatiniiniarvo ja [

15N] arginiini), mitä seurasi homogenointi solujen. Sitten homogenaattia uuttoon peräkkäinen käyttö vesiliuosta (jäähdytettyä vettä) ja orgaanisia (jäähdytetyllä metanolilla ja kloroformilla) liuottimet seuraavassa suhteessa 1:4:3:1 (water:methanol:chloroform:water) [28]. Saatu uutteet de proteiinittomaksi käyttäen 3 kDa: n molekyyli- suodatin (Amicon Ultracel -3K Membrane, Millipore Corporation, Billerica, MA) ja suodos sisältävät metaboliitteja kuivattiin vakuumissa (Genevac EZ-2

plus, Gardiner, NY) . Ennen massaspektrometria-analyysi, kuivattu uute suspendoitiin uudelleen sama tilavuus injektion liuotinta, joka koostuu water:methanol (50:50), jossa oli 0,2% etikkahappoa ja suoritettiin nestekromatografia (LC) massaspektrometrialla. Lisäkontrolleina seurata profilointiprosessissa, ekvimolaarinen 11 standardin yhdisteiden (Epibrassinolide, [D

3] Testosteroni, [

15N] Antraniilihappo, Zeatine, Jasmonihappo, gibberelliinihappo, [D

4] Estroni, (

15N) tryptofaani, [D

4] Tymiiniä, [

13C] Kreatiniiniarvo, ja [

15N] arginiini) ja tunnettu altaan hiiren maksan (uutettu rinnalla solulinjoja) analysoitiin yhdessä solulinjan näytteitä. Kukin näistä valvonta, sisällytettiin useita kertoja osaksi satunnaistamiskaavion järjestelmään siten, että näytteiden valmistelu ja analyyttinen vaihtelu voitaisiin jatkuvasti seurata. Lisäksi analyysin kustakin solulinjasta seurasi ainakin kaksi tyhjää ajoa, estää siirto aineenvaihduntatuotteiden näytteiden välillä. Kuva S1 havainnollistaa toistettavuus profilointiprosessissa seurataan standardin seosta kuvatulla tavalla. Erityisesti CV koko profilointiprosessissa mitataan viittä riippumatonta rinnakkaista hiiren maksauute edellä mainittiin oli alle 5%.

nestekromatografia /massaspektrometria (LC /MS) B

LC /MS osa puolueeton profilointi alusta perustuu 1200 SL Rapid resoluutio LC ja 6520 Quadrapole Time of Flight (Q-TOF) massaspektrometriin (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Näytteet itsenäisesti tutkittu sekä positiivista että negatiivista ionisaatiota tilat käyttämällä kahta sähkösumutusionisaatiota (ESI) lähde. Reaaliaikainen massakorjauskertoimet aikana massaspektrometrian saavutettiin infuusiona standardin sekoitus viite ionien avulla itsenäinen 1200 SL Rapid resoluutio LC isokraattinen pumppu varustettu 100:1 jakaja tuotos virtausnopeudella 5 ul /min. Tämä viittaus seos niiden valmistajan sisältämien ionien

m /z

121.050873, 922.009798 ja 119,03632, 966,000725 massa korjauksen positiiviseen (+) ja negatiivinen (-) ionisointi tilat vastaavasti. Massa välillä 50-1000 m /z käytettiin koko puolueeton profilointiprosessissa. Tiedonhankintaa analyysin aikana kontrolloitiin käyttäen Mass Hunter työasema tiedonkeräysohjelmilla. Käytetyt parametrit aikana massaspektrometrialla sisältyvät seuraavat: 1) lähde edellytykset: kapillaari jännite, 4000 V (negatiivinen asetus 3500 V), 2) lähteen lämpötila oli 325 ° C, 3) kuivaus kaasua käytettiin 10 l /min 4) , sumutinta paine pidettiin 45 psig: n (viite-ioni sumutinta 10 psig), 5) fragmenttori jännite asetettiin 140, ja 6) skimmer jännite pidettiin 65 V. koko analyysi, ultra high puhdasta typpeä käytettiin sumutinta ja törmäys kaasu. Törmäyksen aiheuttama dissosiaatio (CID) kokeissa esiaste ioni valittiin käyttäen nelinavan analysaattori asetettu korkean resoluution tilassa, kun tuote ionit analysoitiin TOF-analysaattorin. Törmäys energioita kaikissa kokeissa asetettiin 10-40 eV ellei toisin mainita. Spektrit varten analysoidut näytteet tässä tutkimuksessa rekisteröitiin identtisissä koeolosuhteissa. LC liuottimia käytetään koko tutkimuksen ostettiin Burdick Jackson (Muskegon, MI), ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

käänteisfaasi (RP) kromatografisella erotuksella LC-QTOF käytetään gradienttia käyttäen vesi (liuotin A) ja metanolia (MeOH, liuotin B) ( molemmat liuottimet modifioitu lisäämällä 0,2% etikkahappoa). Binäärinen pumpun virtausnopeus oli 0,6 ml /min, joiden alkuperäinen liuotinkoostumuksen 2% B. Gradientti operoidaan 2% B: 98% B 13 minuutin aikana, jonka jälkeen 98% B 6 min ja 5 min post (näytteen analysointia) aikaa. Sarake, joka koostuu Suojakolonnia Zorbax SB-C8 (2,1 x 30 mm, 3,5 um) ja analyyttistä Zorbax SB-Aq (Agilent Technologies, CA) (2,1 x 50 mm, 1,8 um,) käytettiin suorittamiseen käänteisfaasi-erotus. Pylvään lämpötila pidettiin 60 ° C: ssa koko kromatografisen prosessin. Lisäksi kaikki näytteet pidettiin 4 ° C: ssa ennen niiden massaspektrometria-pohjainen metabolomic analyysi. Massaspektritiedot hankittiin sekä painopisteen ja profiilin välillä. Kuuntelua run ajaa vaihtelua, virtausnopeudet ja paine käyrät kullekin LC-liittyvä Pumput kerätään ja tallennetaan.

LC kytketty kolmoiskvadrupolisen spektrometria (QQQ Agilent Technologies, Santa Clara CA) käyttää kohdennettuihin arvioitaessa yhdisteiden avulla Single Reaction (SRM) strategia. Toiminnallinen parametrit tämän massaspektrometri sisältyvät 1) source olosuhteet kapillaarinen jännite 3000 V ja lähde 350 ° C, 2) kuivaus kaasu ylläpidetään 10 l /min, 3) sumutinta paine asetetaan 35 psig ja 4) fragmenttori jännite setti 70 V. törmäys energiat käytetty pirstoutuminen asetettiin 10-40 eV, ellei toisin mainita.

Käänteisfaasipolymerointi (RP) kromatografisella erotuksella LC-QQQ palveluksessa gradientilla, joka sisälsi vettä (liuotin A) ja asetonitriili (ACN, liuotin B) (molemmat liuottimet modifioitu lisäämällä 0,2% etikkahappoa ja 0,1% muurahaishappoa). Kromatografinen erotus suoritettiin Zorbax Eclipse XDB-C18-kolonniin (Agilent Technologies, CA) (50 x 4,6 mm i.d. .; 1,8 um), jota pidettiin 37 ° C: ssa ja virtausnopeudella 0,2 ml /min. Liuotin alussa gradientin oli 2% B, joka oli sitten vähitellen tehostettava 30% B 6,5 minuuttia, minkä jälkeen se kasvoi 90% B seuraavien 0,5 minuuttia, 95% B vielä 5 minuuttia ja astui alas 2% B: tä aikana 8 minuuttia. Tätä seurasi post-näyte tasapainotuksen vielä 5 minuuttia. Huomattavaa on, että kolonni pestiin ja kunnostetun välein 50 injektiota.

Vesipitoinen normaalin faasin (ANP) kromatografisella erotuksella LC-QQQ käytetään gradienttia, joka sisälsi Acetonitirle (ACN, liuotin A): Vesi (liuotin B) sekä liuottimien modifioitu lisäämällä 0,2% etikkahappoa ja 0,1% muurahaishappoa. Virtausnopeus asetettiin 0,4 ml /min. Ensimmäinen liuotin oli 95% A: ta, jossa on gradientti 95% A: 90% A: ta 3 minuutin aikana, 90% A-80% A 2 minuuttia, jota seurasi 80% A-75% A 1 min, 75% A: -55% A 2 min, 55% A-40% A 2 min, 40% A-30% A 2 min, 30% A-20% A 2 min, 20% A-95% A 1 min ja 95% A: ssa 5 min. Sitten pylväs kunnostettuja takaisin Aloitusehtojen. Timantti Hydride pylväs (MicroSolv Technology, Eatontown, NJ) (4 um, 100A 2,1 x 150 mm) pidettiin kylmä- kammiossa (37 ° C) ja käytettiin yhdisteen erottamiseen. Aikana puolueeton ja kohdennettuja metabolomic profilointiprosessissa muutamia yhdisteitä toisteellisesti visualisoidaan eri ympäristöissä. Ymmärtäen, että herkkyys ja lineaarisuus ovat hyvin erilaisia ​​käyttöliittymän käyttöliittymä, nämä irtisanomiset käytetään osana laadunvalvontaa prosessin. Lisäksi tiukka laadunvalvonta hyväksyttiin tässä tutkimuksessa mukana kromatografinen erottaminen, joka oli alle 0,1 minuutin vaihtelu retentioaika havaittujen yhdisteiden kokeiden välillä (kuva S1). Lisäksi olemme myös käyttää sisäisiä standardeja, jotka sisältävät ekvimolaariset sekoitus puhtaiden yhdisteiden sekä tunnettu altaan maksan näytteen ohjaamiseksi prosessin liittyvää vaihtelua. Molemmat kontrollit toistuvasti analysoitiin rinnalla solulinjan näytteitä. Myös yhtenäisyyden varmistamiseksi profilointiprosessissa, kaikki sarakkeet ja liuottimet hankittiin yksittäisen valmistajan erän alussa näissä kokeissa.

lisäksi puolueeton profiloinnin Edellä kuvattujen arviointi alaniini ja sarkosiini oli suoritetaan käyttäen isotooppia laimennus kaasukromatografia-kytkettyä massaspektrometriaa. Tässä Jäännösvesi poistettiin näytteistä muodostamalla atseotroopin 100 ui: aan dimetyyliformamidia (DMF), ja kuivaamalla suspensio vakuumissa. Kaikki näytteet ruiskutettiin käyttäen sarakkeen injektorin ja Agilent 6890N kaasukromatografi, jossa on 15-m DB-5 kapillaari-pylvääseen (sisähalkaisija 0,2 mm, kalvon paksuus, 0,33 mikronia, J W Scientific Folsom, CA) rajapinta Agilent 5975 MSD massan ilmaisin.

t

butyyli- dimetyylisilyyli johdannaisia ​​sarkosiinimetyylieste- kvantitoitiin valitun ionin monitorointi (SIM) käyttäen isotooppia laimennus elektroni-iskuionisaatiolle GC /MS. Tasot alaniini ja sarkosiini että eluoitui 3,8 ja 4,07 minuuttia vastaavasti kvantitoitiin käyttäen niiden suhde ioni

m Twitter /

z

232 johdettu natiivi metaboliitti ([MO-

t

butyyli-dimetyylisilyyli]

-) ja ionien

m Twitter /

z

233 ja 235 vastaavasti alaniini ja sarkosiini, johdettu isotooppileimatussa deuteriated sisäisen standardin [

2 H

3] sarkosiini. Toteamisrajan (signaali /kohina 10) oli -0,1 pikomooli varten sarkosiini käyttää isotooppia laimennus GC /MS.

Metabolomic Fenotyypitys mikrosirut

Metabolinen fenotyyppaus suoritettiin käyttämällä 96-kuoppalevyillä, jotka sisältävät eri aineenvaihduntatuotteita ainoana ravinnesubstraatit. Ravinteiden sisältävät levyt saatiin Biolog Inc (Hayward, CA), ja määritys suoritettiin kohti valmistajan ohjeiden. Yhteensä 88 sokereita, 5 nukleotidin ja 29 aminohappoa tutkittiin substraatteina kaksi 96-kuoppalevyille, jotka on merkitty M1 ja M2 valmistaja. Pohjimmiltaan, määritys mittaa käyttöä näiden metaboliittien kasvava solujen funktiona NADH flux, joka on puolestaan ​​mitataan, missä määrin vähentämiseksi tetratsolium. Viimeksi mainittu on määrällisesti spektrofotometrisesti 590 nm: ssä, kun taas mikä tahansa ei-spesifisen tausta-aktiivisuus arvioidaan 790 nm: ssä. Metabolisen fenotyyppaus tutkimuksissa Vcap solut ilman ravintoa 96 tuntia ja ympättiin kaivoihin 96-kuoppalevylle tiheydellä 20000 solua /kuoppa. Erityisesti, Vcap solut joko käsiteltiin 10 nM R1881: n tai vehikkelin (etanoli) aikaan kylvö. Sitten solut annettiin kasvaa 24 tuntia 37 C: ssa, 5% CO

2. Seuraavat 24 h inkubaation, NADH: n virtaus mitattiin seuraamalla optista tiheyttä 590 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Samanaikaisesti lukemat 790 nm otettiin myös arvioimiseksi taustasäteily. Ensimmäinen lukema mitattiin 24 tunnin kuluttua androgen lisäksi ja myöhemmät lukemat otettiin 1 tunnin välein korkeintaan 30

th tunti, jota seurasi kolme ylimääräistä lukemat 34

th, 42

nd ja 48

nnen tunnin jälkeinen androgen lisäksi. Aineisto taulukoitu excel ja analysoitiin kuten kohdassa tilastolliset menetelmät.

Metabolomic Kirjastot

Metlin kirjasto (Agilent, Santa Clara, CA) käytettiin etsimään massaspektritiedot. Kirjasto luotiin käyttämällä noin 1000 kaupallisesti saatavilla olevista yhdisteistä, joiden retentioaika on määritelty käyttäen RP ja ANP kromatografisia menetelmiä on kuvattu edellä. Lisäksi massa ja ioniosan tiedot kustakin näistä standardiyhdisteillä saatiin myös sekä positiivista että negatiivista ionisaatio tilat ja sisältyvät Metlin kirjastossa.

Tilastollinen analyysi

Metaboliitit yli 60 % puuttuvat arvot poistettiin analyysistä. Metabolinen data jätetään sensuroitu johtuen kynnystykseen massaspektrometrin tiedot. Jotta voidaan ottaa huomioon erot puuttuvien malleja eri luokkiin, jakelun osuus puuttuvien arvojen androgeeniresponsiivinen (ARD), androgeenien ei reagoi (ARI) ja hyvänlaatuisia (Ben) näytteet tutkittiin ja yhdisteet, joissa on yli 85% puuttuvat arvot kussakin ryhmä ja alle 60% puuttuvat arvot yleistä katsottiin olevan biologinen puuttuvien. Androgeenien käsiteltyjen ja kontrolli näytteitä käsiteltiin samalla tavalla. Puuttuva aineenvaihduntatuote mittaukset näiden aineenvaihduntatuotteita korvattiin (laskennallinen) kanssa toteamisraja (2000). Puuttuva toimenpiteet jäljellä aineenvaihduntatuotteiden imputoitiin käyttämällä lähimmän naapurin algoritmi k = 5 käyttäen R-paketin PAMR. Laskennallinen data Sitten log2 muuttunut. Normalisointi Q-TOF data tehtiin käyttäen quantile normalisointi per näytteitä käyttäen Limma R-paketti. QQQ näytteet normalisoitiin mediaani keskitys- ja IQR skaalausta.

Heatmaps, boxplots ja Venn kaaviot tehtiin käyttämällä R-paketteja gplot, tilastot ja Limma, vastaavasti. Saatuja tietoja eri alustoilla sitten skaalataan yhdistettä kohti ja verrata koko näytteitä. Näytteet monistaa yhdisteitä yhdistettiin keskiarvoistamalla yli näytteitä johtui useista esiintymiä samoja yhdisteitä. Hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen täydellinen sidonnaisuudet Pearsonin korrelaatio. Kaksipuolinen t-testiä käytettiin arvioimaan yhdistyksen kunkin metaboliitin kanssa androgen reagointikykyä tilaansa kahden otoksen testi. Tuloksena p-arvot säädettiin sitten useita testejä käyttäen FDR q * = 0,2, laskemalla q-arvoja R-paketti fdrtool [29].

Tiedot aineenvaihdunnan fenotyyppaus määritykset korjattiin varten tausta signaali, joka on saatu lukemat tyhjiä kaivoja. Tiedot säädettiin sitten vähentämällä keskiarvoja kolmesta Negatiivisena kontrollina kuoppia kaikista muista näytteistä kunakin ajankohtana. Vaikutus androgen hoidon eturauhassyövän kasvatettujen solujen aminohappo- ja sokerin levyt verrattuna kontrollisoluihin verrattiin käyttäen lämpökarttoja ja boxplots. Lisäksi geeniperimä analyysi (R-paketti GSA [30]) käytettiin arvioimaan yleistä rikastuminen aminohappoa ja sokeria polkuja, että vastaavat levyt, kunakin ajankohtana.

Tulokset

Metabolomic profilointi eturauhasen solulinjat

Kun pyritään profiili androgeenisäädellyn Metabolomi eturauhassyövässä, käytimme nestekromatografia yhdistettynä massaspektrometria kysellä suhteelliset tasot aineenvaihduntatuotteiden poikki eturauhasen peräisin oleva solu linjat (Immortalized hyvänlaatuinen – RWPE; androgen-ei-reagoiva – PC3 ja DU145 ja androgen-reagoiva – VCAP, ja LNCaP). Sen lisäksi, rajattu eturauhassyövän-spesifinen (PCa) metaboliaprofiilien, tutkimme myös metabolisia muutoksia androgeenien reagoiva (ARD) vs ei-reagoivien solujen (ARI), samoin kuin säädetään suoraan androgen Vcap soluissa. Kuten kuviossa 1, puolueeton metabolomic profiloinnin alustaa käytettiin tässä tutkimuksessa koostui sekä käänteisfaasi ja vesipitoinen normaalin faasin kromatografia yhdistettynä 1) sähkösumutusionisaatiota (ESI) positiivisessa ionimuodossa (+) ja 2) ESI, että negatiivisten ionien tilassa (-). Lisäksi, kohdennettua arviointi 57 yhdisteiden suoritettiin käyttäen Single Reaction (SRM) on kolmoiskvadrupoli massa- spektrometriä toiminut (+) ja (-) ioni-tilat (kuvio 1). Solulinjan johdettu massaspektrometrialla profiilit tehtiin ensijalostusasemien että mukana tietojen suodatus, syytöksensä logaritminen muunnos ja normalisointi kuten kuviossa 1. normalisoitu data sitten kuulusteltiin aineenvaihduntatuotteiden, jotka erottavat 1) hyvänlaatuista eturauhasen solulinja (Ben) eturauhasen syöpäsolulinjoissa (PCa) 2) androgeeniresponsiivinen syöpäsolujen (ARD) androgeenista riippumattoman solujen (ARI) ja 3) androgeenin käsitellyn eturauhasen syöpäsolujen käsittelemättömiä kontrolleja. Edelleen, aineenvaihduntatuotteet, jotka erottaa ARD ja ARI solulinjoja arvioitiin paikallinen ja metastaattisen kudoksiin käyttämällä kudos johdettua metabolomic profiilit, jotka aiemmin julkaisemat ryhmämme [27]. Luokan aineenvaihduntarajoituksista allekirjoitukset tehtiin rikastukseen pohjainen bioprosessi kartoitus seurasi validointi käyttäen in vitro aineenvaihdunnan fenotyyppaus kokeita.

kuva eri vaiheista metabolomic profiloinnissa eturauhasen solulinjoissa. Pääaskeleet mukana aineenvaihduntatuote louhinta ja erottaminen, massaspektrometria perustuva tunnistus, spektrianalyysi, data normalisointi, rajaaminen luokkakohtaisten aineenvaihduntatuotteiden ja muuttaa reittejä ja niiden toiminnallinen luonnehdinta. Vaihtelu näytteenottoa, erottaminen ja massaspektrometrialla kontrolloitiin käyttäen piikki standardeja ja arvioidaan erilaisia ​​laadunvalvontaparametrien (kuva S1).

Yhteensä 1553 yhdisteiden havaittiin poikki kuusi eturauhasen solulinjoissa käyttämällä eri massaspektrometrian menetelmiä käytettiin tässä tutkimuksessa (katso edellä, kuvio 2A). Näistä 40 yhdisteet havaittiin vain Ben taas 102 ja 55 yhdisteet vastaavasti nähtiin ARI ja ARD solulinjoissa (kuvio 2B). Erityisesti tämä kooste sisälsi 72 nimeltään aineenvaihduntatuotteiden (kuvio 2C). Hierarkkinen klusterointi profiili perustuu yhdisteitä, joilla on merkittäviä ero ilme täydellisesti linjattu eturauhasen solulinjoissa (kuvio 2D).

A) Heat kartta edustus hierarkkinen klusterointi 1553 aineenvaihduntatuotteiden 5 eri eturauhasen solulinjoissa. Näyte luokat on merkitty väripalkkien [hyvänlaatuinen = vihreä, androgeenireseptorin ei reagoi PCa (ARI): keltainen ja androgeeniresponsiivinen PCa (ARD): punainen palkki]. Pylväät edustavat yksittäisiä solulinjoja ja rivit viittaavat erillisiä aineenvaihduntatuotteita. Sävyjä keltainen edustavat korkeus aineenvaihduntatuote ja sinisen sävyjä edustavat laskua metaboliitin suhteen mediaani metaboliittitasoihin (ks väriskaala). B) Venn-kaavio edustaa jakautuminen 1553 aineenvaihduntatuotteiden mitattuna poikki hyvänlaatuinen (RWPE), ARI (DU145 ja PC3) ja ARD (LNCaP ja VCAP) solulinjoissa käyttämällä nestekromatografiaa kytkettyä massaspektrometriaa. C) sama kuin (A), mutta 72 nimetty yhdisteitä D) dendrogrammissa edustavat hierarkkinen klusterointi eturauhasen liittyvien solulinjojen kuvattu B, käyttäen yhdisteitä, joilla on huomattava ero ilme.

Erityisiä metaboliaprofiilien erottaa Ben PCA ja ARD Ari

hahmottelevat metabolomic muutokset välillä Ben ja PCa solulinjoja, käytimme 2-näyte

t

-testi. Kaikkiaan 674/1553 yhdisteet olivat ero poikki näiden kahden luokan jälkeen monivertailu oikaisun väärä löytö määrä (FDR) on 20%. Mukana tässä luettelossa oli 29 nimetty aineenvaihduntatuotteita, joiden suhteellinen tasot on esitetty kuvassa 3A. Tämä muuttunut metabolomic allekirjoituksen PCa solulinjat sisälsivät kohonneita aminohapot, kuten sarkosiini, treoniini, fenyylialaniini ja alaniini sekä korkeampi yhdisteitä, jotka liittyvät typen metaboliaan, kuten kreatiini, kreatiniini, sitrulliini ja N-asetyyli spermiinillä. Toisaalta, tasot aineenvaihduntatuotteiden kuuluvat tryptofaani aineenvaihdunta eli tryptofaania, 1-metyyli-tryptofaani ja kyneuric hapon vähenivät PCa verrattuna Ben. Vastaavasti, 913/1553 yhdisteet muutettiin välillä ARI ja ARD PCa solulinjoissa (kuvio 3B). Muuttunut luettelo sisältyy 52 nimetty metaboliittien joukossa, jotka tasot spermiiniä, N1-acetylspermine ja aminohappoja, kuten seriini, treoniini, lysiini, homokysteiini, asparagiini, alaniini, glutamiinihappo jne, kohosivat ARD (kuvio 3B). Päinvastoin, tasot S-adenosylmethione (SAM, metylaatio valuutta solun vastaan) väheni ARD solujen samanaikainen kasvu tasoilla sen hajoamisen tuote, homokysteiinin (kuvio 3B). Tämä on viittaavia lisääntynyt metylaation aktiivisuuden eturauhassyövässä ja hyväksyy aikaisemmassa havaintoja edenneen eturauhassyövän kudoksissa [27].

A) Heat kartan 29 nimetty ero aineenvaihduntatuotteiden eturauhassyövän soluissa suhteessa hyvänlaatuinen solujen rivi (

p

0,05, FDR = 20%), on johdettu käyttämällä

t

-testi yhdistettynä permutaatioista (

n

= 1,000) määritellä

p

-arvot vertailulle ryhmille. Lämpö kartta tuotettiin jälkeen loki skaalaus ja quantile normalisoitumista tietoja. Värimaailma on sama kuin kuvassa. 2A. B) sama kuin (A), mutta 52 nimetty ero aineenvaihduntatuotteiden välillä ARI (keltainen palkki) ja ARD (punainen palkki) syöpäsolujen. C) Verkon näkymä molekyylitason konseptin analyysi metabolomic profiilien meidän ”muuttunut PCA solulinjassa allekirjoitus” (harmaa solmu). Kukin solmu edustaa molekyyli- käsite tai joukko biologisesti liittyviä geenejä. Solmun koko on verrannollinen geenien käsite. Jokainen reuna osoittaa tilastollisesti merkittävää rikastus (FDR

q

-arvo 0,2). Rikastettu käsitteitä kuvataan ”aminohappo aineenvaihduntaa” on merkitty keltaisella siltoja.

Integratiiviset Molecular käsite Modeling Eturauhassyövän johdettujen Metabolomi

Kun rajattu metabolomic kaavoja Ben, ARD ja ARI eturauhasen solulinjat, me sitä jatkoi arviointi näiden muutosten yhteydessä biokemiallisia reittejä ja rajaaminen muuttuneen biokemiallisten prosessien aikana eturauhassyövän kehittymistä ja etenemistä pitäen yhteydessä vastauksessaan androgen. Rajata yleinen biologisia prosesseja, jotka ovat muuttuneet eturauhassyövän solulinjoissa, sekä androgeenille reagoivien eturauhasen syöpäsolujen, luokka-spesifinen koordinoitua ilmentymisen profiilit metaboliittien edellä kuvatut tutkittiin käyttäen Oncomine Concept Maps (OCM, www.oncomine. org) [31], [32]. Täällä ”molekyyli käsite” määritellään miksi tahansa joukko molekyylikomponentit jotka liittyvät jollakin biologisesti merkityksellisellä tavalla. Tätä analyysiä varten käytimme molekyyli- käsitteitä kaksi yleistä tyyppiä: (1) geeni ja proteiini merkinnät ulkoisista tietokannoista, ja (2) laskennallisesti johdettuja säätelyverkkojen. 2A.