Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on tällä hetkellä yleisimmin diagnosoitu maligniteetti länsimaissa. Se on yleisempää vanhemmilla miehillä 75% tapahtumasta tapauksissa yli 65 vuotias. Sen jälkeen eturauhasen, noin 30% miehistä kliinisiä toistumisen joilla on kohonnut seerumin eturauhasen-antigeenin tasoa. Näin ollen, on tärkeää selvittää molekyylitason mekanismit PCa etenemistä kehittää uusia diagnostisia /terapeuttisia lähestymistapoja. Tässä tutkimuksessa se on tarkoitus verrata microRNA (miRNA) profiilia toistuvien ja kertaluonteisten eturauhasen kasvain kudosten tutkia mahdollista osallistumista miRNA PCA etenemistä. Kokonais-RNA 41 toistuvia ja 41 kertaluonteisia PCa kudosnäytteet käytettiin tutkimaan miRNA allekirjoitus PCA yksilöitä. Ensinnäkin, 20 toistuvat ja 20 kertaluonteisia PCa näytteet profiloitu käyttäen miRNA mikrosirujen pelimerkkejä. Differentiaalisesti ilmaisi miRNA, miR-1, miR-133b ja miR-145 * valittiin edelleen validointi qRT-PCR eri joukko 21 toistuvien ja 21 kertaluonteisia PCa näytteitä. Data analysoitiin tilastollisesti käyttäen kaksipuolista Studentin t-testiä, Pearson korrelaatio testi, vastaanotin toimii ominaisuus analyysi. Tuloksemme osoittivat, että miR-1 ja mir-133b on merkittävästi vaimentua toistuviin PCa yksilöt verrattuna kertaluonteisia PCa näytteitä ja on riittävästi voimaa erottamaan toistuvat näytteet kertaluonteisia niitä itse. Täällä raportoimme että suhteellinen ilmentyminen miR-1 ja mir-133b ovat vähentyneet merkittävästi toistuvia PCa yksilöt verrattuna kertaluonteisia PCa näytteitä, jotka voivat toimia uusien biomarkkereiden ennustamiseen Eturauhassyövän eteneminen.

Citation: Karatas OF, Guzel E, Suer I, Ekici ID, Caskurlu T, Creighton CJ, et al. (2014) miR-1 ja miR-133b ilmentyvät eri potilailla, joilla Toistuva Eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (6): e98675. doi: 10,1371 /journal.pone.0098675

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2014; Julkaistu: 26 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Karatas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Array tiedot on talletettu osaksi Gene Expression Omnibus (GEO) hakunumerolla GSE55323.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Tieteen ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Turkin (TUBITAK) (lupanumeroon 108S051), samoin kuten osittain Yhdysvaltojen National Institute of Health (CJC ja MI, avustus P30 CA125123). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: CJC on PLoS One toimitusneuvosto jäsen ja tämä ei muuta kirjoittajien sitoutumista että PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on tällä hetkellä yleisimmin diagnosoitu maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista miehillä yli ikä 50 vuotta länsimaissa [1]. Eturauhassyövän on taipumus olla paljon yleisempiä vanhemmilla miehillä 75% tapahtumasta tapauksissa yli 65 vuotias [2]. Eturauhasen, radikaalin sädehoidon ja hormoniablaatioterapia ovat edullisesti käytetään tekniikoita alkuvaiheen kliinisesti lokalisoitu kasvaimia paranna sairautta, mutta nämä tekniikat eivät välttämättä parantuneisiin eloonjäämisluvut [3] ja lähes 30% miehistä kliinisiä toistumisen kanssa seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot [4]. Toisaalta, kokeneille ja etäpesäkkeitä, kemoterapiaa, joka on ainoa vaihtoehto, enimmäkseen ei anna positiivista kliiniseen tulokseen [5]. Siksi on erittäin tärkeää ymmärtää molekyylitason mekanismeista eturauhassyöpä etenemisen kehittää uusia diagnostisia ja hoitomenetelmiä.

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisesti syntetisoidun, sääntelyyn ei-koodaavat pieniä RNA: t koostuvat noin 20 nukleotidin ja harkita uutena luokan geenin säätävät. He tukahduttaa ilmentyminen tavoitteensa kautta mRNA: n hajoamisen tai translaation estäminen seurauksena epätäydellinen sitoutumalla 3’untranslated alueille (3’UTR) mRNA [6]. MiRNA on tarkoitus säädellä ilmentymistä lähes 60% ihmisen geenien [7]. Noin puolet selityksin ihmisen miRNA sijaitsevat hauras sivustoja genomin viittaa siihen, että nämä pienet molekyylit saattavat olla elintärkeä toiminto synnyssä useiden sairauksien kuten syövän [8], [9]. Ne on osoitettu pystyä erottamaan erilaistumista todetaan useiden maligniteettien, mukaan lukien rinta-, keuhko- ja paksusuolen syöpiä. Lisäksi on olemassa tutkimuksia viittaa miRNA ilmentymisen profilointi voi erottaa pahanlaatuinen ei-pahanlaatuisten eturauhaskudoksiin [10], [11]. On kuitenkin rajallinen määrä Kirjallisuudessa tutkittu miRNA eturauhassyövän etenemiseen.

Mirna profiloinnin kautta mikrosiruja on korvaamaton tekniikka määrittää miRNA allekirjoitus, joka on väistämättä merkittävä selvittää yleisiä ja erityisilmaus muutokset välillä eri tyyppiä kudosten [12], [13]. Tässä tutkimuksessa pyrittiin vertailemaan miRNA profiilia toistuvien ja kertaluonteisten eturauhasen kasvain kudosten valaista Olipa mahdollinen osallistuminen miRNA PCA etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

RNA: t eristettiin 41 toistuvia ja 41 kertaluonteisia syöpiä radikaalien prostatectomies, joka sisälsi vähintään 70% kasvain kudosta, joka saatiin Baylor College of Medicine Eturauhassyöpä ohjelmaa. Toistumisen määriteltiin kahtena peräkkäisenä seerumin PSA-suurempi kuin 0,2 ng /ml. Potilaita seurattiin kunnes PSA uusiutuminen tai vähintään 4 vuotta (ei-toistuvat tapaukset). Tämä tutkimus on hyväksynyt sisäistä Institutional Review Board of Baylor College of Medicine. Potilaat sisällytettiin tutkimuksessa ilmoittamalla tästä kirjallinen suostumus. Ominaisuudet toistuvat ja ei-toistuvat potilaita on koottu taulukkoon 1.

Yhteensä RNA: n eristäminen

Yhteensä RNA 41 toistuvia ja 41 kertaluonteisia kudosnäytteistä käyttämällä Trizol (Invitrogen , San Diego, CA) mukaisen reagenssin valmistajan ohjeiden mukaan. Puhtauksien ja pitoisuudet RNA-näytteet määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen NanoDrop ND-2000C (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE). RNA eheys testattiin geelielektroforeesia ja pistokokeen Nucleic Acid kvantitointi Kit (Sigma).

Mirna Microarray ja data-analyysin

100 ng kokonais-RNA: 20 toistuvia ja 20 ei-toistuvat näytteet ovat leimattu Cy3 käyttämällä Agilent miRNA -leimauskittiä seuraavat valmistajan protokollaa. Merkityt RNA: t ovat Lämpödenaturoitu ja hybridisoitiin Agilent 8 × 15 k miRNA microarray V2 koostuu 799 antureista kohdistaminen kattavan valikoiman 723 ihmisen ja 76 ihmisen virus- miRNA ohjaus- koettimilla Sanger miRBase (release 10,1) 55 ° C: ssa 20 tunnin ajan. Hybridisaation jälkeen ja hybridisaation jälkeisten pesujen, diat skannattiin välittömästi Agilent Microarray Scanner kanssa Surescan High Resolution Technology (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Feature Extraction v10.7.3.1 (Agilent Technologies, CA) ohjelmistoa käytettiin poimia kaikki ominaisuudet saatujen tietojen skannatut kuvat ja Bioconductor ohjelmistoa käytettiin analysoida raakadataa, joka normalisoitiin quantile normalisointi. P-arvot (by kaksipuolinen t-testi) ja kertamuutoksia välillä vertailu ryhmien laskettiin käyttäen log-muunnetun datan. Out of 15714 koettimien lukumäärä utaretulehdusmallia olisi huomattavasti suurempi 157 odotetun False Discovery Rate (FDR) voidaan pitää alhaisena (käyttäen menetelmää Storey et al. [14]). Nimellisesti merkittävä antureista ei ylittänyt tilanteen odotetaan useita testaus, joka edellytti ylimääräisen valitse miRNA. Array tiedot on talletettu osaksi Gene Expression Omnibus (GEO, hakunumero GSE55323).

cDNA Synthesis and Quantitative Real-Time PCR

validoimiseksi ero ilmentymistä miR-1, asennuspalveli- 133b ja miR-145 *, RNA näytteitä eri joukko 21 toistuvien ja 21 kertaluonteisia potilaat tutkittiin. Sillä miRNA qRT-PCR kokeissa yhtä suuret määrät kokonais-RNA (30 ng) kutakin näytettä käytettiin ensimmäisen juosteen DNA: ta (cDNA) synteesi käyttäen miRNA spesifisiä alukkeita hankkia Applied Biosystems ja ”TaqMan MicroRNA käänteistranskriptio Kit” mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA). TaqMan HSA-miR-1 (määritys ID: 002222), -133b (määritys ID: 002247) ja -145 * (määritys ID: 002149) vahvistus sarjat saatiin Applied Biosystems (Foster City, CA).

miRNA ilmentymisen analyysin kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen Roche LightCycler480-II reaaliaikainen lämpösyklilaite (Roche, Switzerland). TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin ja microRNA koettimia hankkia Applied Biosystems (Tanska). MiRNA ekspressiotietojen normalisoituivat RNU43. Kukin koe suoritettiin kahtena kappaleena. Suhteellisen määrän analyysi suoritettiin delta-delta-Ct menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [15].

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kaksipuolista Studentin t-testiä. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Pearson korrelaatio testiä käytettiin osoittamaan korrelaation miR-1 ja miR-133b ilmentymistä PCA yksilöitä. Vastaanotin toimii (ROC) käyrät piirrettiin SPSS 15.0 nähdä voiman PSA ja validoitu miRNA eriyttää toistuva PCa näytettä kertaluontoiset näytteitä. Sillä ROC-analyysi, logistinen regressio suoritettiin ja ennustetun todennäköisyydet laskettiin kullekin yksittäiselle miRNA tai miR-1 ja miR-133B yhteen. Sitten käyrän alla oleva ala lasketaan 95%: n luottamusväli. Alue käyrän alla hyväksytään poikkeavat merkittävästi 0,5, kun p-arvo on suurempi kuin 0,5 siten, että logistinen regressio luokittelee ryhmässä merkitsevästi parempi kuin sattumalta.

Tulokset

Yhteensä 41 toistuvat ja 41 ei-toistuva kasvaimia radikaali prostatectomies, jotka on saatu Baylor College of Medicine Eturauhassyöpä ohjelma, olivat mukana tässä tutkimuksessa suorittamiseen miRNA profilointi (taulukko 1). Keskimääräinen ikä leikkauksen aikana PCA sairastavien potilaiden uusiutumisen olivat 62,8 ± 6, kun taas ilman toistumisen oli keski-ikä on 61,7 ± 7,2 (ei merkitsevä, p = 0,54, Mann Whitney). Yli 80% potilaista molemmissa ryhmissä oli ei-latinalaisamerikkalainen valkoihoisten. Keskimäärin kuukautta operaation 1

st uusiutuminen tai viime tavanomaista arviointimenettelyä toistuvia ja kertaluonteisia PCa potilaista oli 22,63 ± 3,89 ja 76,59 ± 2,87, tässä järjestyksessä. PSA-pitoisuudet vaihtelee 4,2-100 ja 3,1-40,3 potilailla, joiden tauti uusiutui ja ei-toistuminen, vastaavasti. Kuten odotettua, keskiarvo ennen leikkausta PSA toistuvien potilaista oli lähes kaksi kertaa suurempi kuin toistuvia potilailla (22 vs. 11,3 ng /ml). Vuonna toistuva potilaille vain 3 näytteet olivat Gleason 6 (3 41), kun taas ei-toistuvia potilasta 14 41 näytteistä oli Gleason 5 tai 6. Vastaavasti 15 40 radikaalin prostatectomies toistuvista potilaista, joista tietoja oli saatavilla osoittivat rakkularauhanen invaasio mutta vain 4 41 kertaluonteisista syöpiä oli tämä ominaisuus. Niinpä, kun demografiset piirteet kaksi ryhmää ovat hyvin samankaltaisia, toistuvat syövät ovat paljon erittäin aggressiivinen perustuu kliinisiin ja patologisia piirteitä.

Jos haluat vertailla miRNA profiilit toistuvien ja kertaluonteisten PCa yksilöitä, teimme out mikrosiruanalyysi käyttämällä 20 näytettä kustakin ryhmästä. Mikrosiruanalyysi 20 toistuvien ja 20 ei-toistuvia näytteitä osoitti, että 93 antureista on ilmennetty eri joiden p-arvo alle 0,01. Niistä 93 nimellisesti merkittävästi antureista raportoitu, on 84 kartoitus ihmisen miRNA, jotka on esitetty taulukossa S1.

lämpöä kartta esitys ilmentyvät eri miRNA osoitetaan kuviossa 1A. Niistä merkittävästi vapautettu miRNA, mir-1, mir-133b, ja mir-145 * (kuvio 1 B) valittiin edelleen qRT-PCR vahvistusta erilainen joukko toistuvien ja kertaluonteisten PCa näytteitä.

(A) Heat-kartta esitys merkittävästi vapautettiin miRNA toistuviin PCa yksilöt vs. kertaluonteisia PCa yksilöitä. (B) Lämpö-kartta esitys miR-1, miR-133b ja miR-145 * toistuviin PCa yksilöt vs. kertaluonteisia PCa yksilöitä.

qRT-PCR tulokset osoittivat, että ilmaus taso miR-1 väheni merkittävästi toistuvia PCa yksilöitä kuin kertaluonteisten PCa kudosnäytteistä (kuvio 2A, p = 0,036). Downregulation mir-133b toistuviin PCa (kuvio 2B, p = 0,012) on vahvistanut myös. Päinvastoin, vaikka lievää laskua ilmentymistason miR 145 * toistuviin yksilöitä verrattuna ei-toistuvia niitä, ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 2C, p 0,05). Arvioidaan korrelaatio miR-1 ja miR-133b ilmaisua sekä toistuvia ja kertaluonteisia PCa yksilöitä, käytimme Pearsonin korrelaatio analyysi, joka osoitti, että miR-1-ilmentyminen korreloi voimakkaasti miR-133b ilmentymistä PCA kudosnäytteistä (kuva 3, korrelaatiokerroin (R) = 0,780).

suhteellinen ilmentymistaso (A) miR-1, (B) miR-133b, ja (C) miR-145 * 20 toistuvia PCa yksilöihin verrattuna 20 kertaluonteisia PCa yksilöitä. RNU43 käytettiin normalisointia miRNA ilmaisun analyysien.

testaamiseksi voima PSA, miR-1 ja miR-133b erottamaan toistuvia PCa yksilöt kertaluonteisia näytteitä, vastaanotin toiminta käyrät (ROC) piirrettiin, joka osoitti, että PSA, miR-1 ja miR-133b oli käyrän alapuolinen alue (AUC) arvot 0,950, 0,661 ja 0,692, vastaavasti, mikä osoittaa niiden riittävyyttä on valta erottaa toistuvat näytteet kertaluonteiset niitä itse. Lisäksi kun miR-1 ja miR-133b arvioitiin yhdessä ne ovat edustettuina paremmin teho (AUC; 0,719) kuin tapauksessa, jossa miRNA analysoitiin erikseen (kuva 4).

Käyrät yksittäisten miRNA ja osuuskunnan valta syrjiä kaksi potilasta koostuu 20 toistuvat ja 20 kertaluonteisia PCa yksilöitä.

keskustelu

PCA hyvin heterogeeninen sairaus, jolle nykyinen ennustetekijöiden indikaattoreita useimmiten onnistu määrittämään lopputulokseen ja lähes 30% PCA potilaat kokevat uusiutumisen jälkeen onnistuneen eturauhasen tai adjuvanttihoito [16], [17]. Tällä hetkellä ensisijainen kasvain vaiheessa seerumin PSA taso, ja koepala Gleason arvosana hyödynnetään aikana kliinistä arviointia ennustaa patologisen vaiheessa kasvain ja hoidon tehokkuus ei kuitenkaan mikään tai jopa näiden yhdistelmä indikaattorit ovat riittävät luotettavasti ennakoida tuloksia potilaissa [3], [4]. Yksimielisyys kriteerit määritelmästä biokemiallisten uusiutuminen perustuu PSA-arvot, ei ole vakiintunut, joka estää sellaisen standardin prognostista malli saaneilla miehillä eturauhasen [18]. Sitä paitsi, havaitseminen PSA seerumeista PCa potilaiden jälkeen eturauhasen voi johtua läsnäolosta jäljellä hyvänlaatuinen eturauhasen kudosta, joka harhaan harjoittajat keksiä väärän positiivisen diagnoosin [19]. Lisäksi samanlaisten potilaiden seerumin PSA, Gleason pisteet ja patologinen vaiheessa on osoitettu olevan selvä hoitotuloksia johtuen heterogeenisuus alatyyppejä molekyylitasolla [20], [21].

Koska se, että uusi prognostisia biomarkkereiden tarvitaan kiireesti kehittää tehokkaampia, optimoitu ja yksilöllisen hoidon strategioita, useita otaksuttu prognostisia biomarkkereita ehdotettiin viime vuosina, mikä saavutettiin vähän menestystä potilaalla kerrostumista [22]. Esimerkiksi erilaiset geenit, jotka on erityisesti havaittu eturauhanen, kuten ihmisen KLK2, pCA3, eturauhasen-erityinen kalvo antigeenin ja eturauhasen kantasoluantigeeni ehdotettiin hyödyllisinä ennustetekijöitä markkereita ennustamiseksi patologiset PCA potilailla [23]. Altered ilmauksia Bcl-2: n ja Bax liittyi myös myöhemmän kehityksen biokemiallisten uusiutuminen [18]. Kuitenkin joukossa geenit ehdotetaan ennustetekijöiden biomarkkerina riippuen laajamittainen geeniekspressioprofilointi tutkimuksissa vain muutaman geenejä voidaan validoitu useissa tutkimuksissa [24]. Lisäksi useat kliiniset riski ennustemallit kehitettiin ennustamaan biokemiallisten uusiutuminen riski tai kliinisten vika, vaikka nämä mallit myöskään luotettavasti ja tarkasti arvioida kliinisistä tuloksista johtuen heterogeenisuus taudin [25]. Kun otetaan huomioon rajoitukset nykyisen prognoosi- työkaluja ja malleja, on tärkeää sisällyttää uusien biomarkkereiden nykyisiin malleihin voittaa nämä rajoitukset kliinisissä päätöksentekoprosesseihin.

Siksi on tärkeä tavoite nykyisessä eturauhassyövän tutkimus selvittää tehokkaasti prognostisia molekyyli biomarkkerit, jotka auttaisivat tarkasti tunnistamaan potilaita, joilla aggressiivinen ja etäpesäkkeitä jotta voidaan ohjata terapeuttisia päätöksiin ja määrätä potilaille, jotka tarvitsee tiiviimpää seurantaa ja tehohoito. Lisäksi tunnistamisen biomarkkerit joilla potentiaalia ennustaa toistumisen jälkeen eturauhasen olisi ratkaisevan kliinistä merkitystä päättää adjuvanttihoito tarvitaan. Tällaiset biomarkkerit olisi erityisen arvokasta potilaille, joilla on erilliset seuraamukset vaikka niillä on samanlaiset kliinisiä tekijöitä.

Ensimmäinen seuraus miRNA syövän biologian on kuvattu kautta havaitseminen miR-15 ja miR-16 downregulation B-solujen krooninen lymfosyyttileukemioiden [26]. Sittemmin eri miRNA liittyi kasvaimen synnyssä leikin merkitys aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden syöpä [27], [28]. Lisäksi tutkitaan ero ilmentymistä miRNA syövässä, on tärkeää tutkia miRNA profiilit näytteitä selvittää yhdistyksen miRNA ilmaisun kliinisten tutkimusten tulosten kanssa.

miR-1 ja miR-133b, koodattu miR -1 /133a ja miR-206 /133b klustereita, jotka merkitään lihas-erityisiä miRNA [29] ja raportoitiin olevan usein vaimentua eri kasvaintyypeissä [30]. Lisäksi niiden ektooppinen yli-ilmentyminen on osoitettu estävän solujen kasvua, solujen vaeltaminen ja indusoida apoptoosia useita erilaisia ​​syöpiä [30]. miR-1 on hiljattain ehdotettu prognostinen markkeri PCa ennustaa toistumisen [31]. Sen downregulation saattaa olla mukana PCa uusiutumisen perusteellinen kohonnut tavoitteensa. Esimerkiksi yli-ilmentyminen CXCR4 ja SDF-1-alfa, koska validoitu kohteina miR-1 [32], liittyivät paikallisen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke PCA [33] ja huonon ennusteen II vaiheessa haiman adenokarsinooma [34], tässä järjestyksessä. Säätelyä NOTCH3, onkogeenisessä miR-1 tavoite, on myös osoittanut liittää PCA toistumisen [35]. Koska roolia miR-133b uusiutumiseen, se on liittynyt eloonjäämiseen ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä [36] ja ehdotetaan ennustetyövälineenä biomarkkeri PCA uusiutumisen erittäin tuoreessa tutkimuksessa [37]. Kohonneita validoitu miR-133b tavoitteita kuten CXCR4 [38], FGFR1 [39], FSCN1 [40] on liittynyt ennusteeseen eri syöpiä.

Johtopäätökset

nykyteknologialla do ei välttämättä parannetun eloonjäämisasteesta PCa potilaiden ja lähes 30% miehistä kliinisiä toistumisen joilla on kohonnut seerumin eturauhasen-antigeenin tasoa. Siksi on ensiarvoisen tärkeää selvittää molekyylitason mekanismeista PCa eteneminen kehittää uusia ja tehokkaita diagnostisia /hoitomenetelmien. Täällä me raportoimme että miR-1 ja mir-133b on merkittävästi vaimentua toistuviin PCa yksilöt verrattuna kertaluonteisia PCa näytteitä, jotka voivat toimia uusien biomarkkereiden ennustamiseen Eturauhassyövän eteneminen.

tukeminen tiedot

Taulukko S1.

luettelo ilmentyvät eri miRNA toistuviin vs. kertaluonteisia eturauhassyöpänäytteissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0098675.s001

(XLS) B

Kiitokset

Kiitämme Yiqun Zhang teknistä apua mikrosiruanalyysillä.