Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvain microenvironment, mukaan lukien stroomasolut, verisuonitauteja soluväliainekomponenteista, on on määritelty ratkaiseva tekijä, joka vaikuttaa leviämisen, lääkeresistenssideterminantit, invaasio ja etäpesäkkeiden pahanlaatuisten epiteelisolujen. Muun muassa viestinnän ja vuorovaikutuksen syöpäsolujen ja stroomasolujen on raportoitu pelata keskeisiä rooleja syövän edistämiseen ja etenemiseen. Tutkia näitä suhteita, on-chip-yhteisviljelmässä kehitettiin tutkia solujen välistä vuorovaikutusta A549-ihmisen keuhkokarsinooma solujen ja MRC-5-ihmisen keuhkojen epiteelisoluissa sekä normaali proliferaatio ja käsittelyolosuhteiden mukaan. Lyhyesti, co-kulttuuri, joka koostuu 2 yksittäisten fluidistorinen kammioiden rinnakkain, jotka erotettiin 100 um aidan käytettiin solujen kuviointi. Mikroelektrodeilla paneelit on asennettu kussakin kammiossa elektrodien eri etäisyyksillä vastakkainasettelua linja sähkökemialliseen impedimetric tunnistus arviointi solusta soluun vaikuttaa. Kun aita poistettiin ja solu-solu kosketuksiin tapahtui, arvioimalla impedanssi signaali vastaukset edustavat solun kunnossa ja käyttäytyminen, sekä suoria että epäsuoria solu-solu vuorovaikutuksia ottamalla elatusaineesta tutkittiin. Vaikutus erityisiä etäisyyksiä, jotka johtavat eri vaikutteet fibroblastisolujen syövän solut yhdessä viljelemisen ympäristön toiseksi määritelty.

Citation: Tran TB, Baek C, Min J (2016) Electric Cell-Alustan Impedanssi Sensing (ECIS) kanssa Mikroelektrodin Arrays varten tutkinta Cancer Cell – fibroblastit vuorovaikutus. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10,1371 /journal.pone.0153813

Editor: Jonghoon Choi, Chunag-Ang University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 12 helmikuu 2016; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2016; Julkaistu: 18 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Tran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee BioNano Health-Guard Research Center, rahoittama tiede, ICT Tulevaisuuden suunnittelu (MSIP) Korean Global Frontier Project (H-GUARD_2015M3A6B2063548) ja tukivat nanomateriaalin Technology Development Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama Korean hallitus (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on yhä enemmän näyttöä siitä, että kasvain microenvironment, mukaan lukien stroomasolut, tulehdussolujen, solunulkoinen matriisi (ECM), sytokiinien, alusten ja kasvutekijöitä, on tärkeä rooli aloittamista, etenemistä ja hyökkäys syövän [1-3]. Aikana kasvainten synnyssä, syöpäsolut vuorovaikutuksessa dynaamisesti ympäröivien stroomasolut, kuten fibroblastit, rasvasolujen ja asukas immuunijärjestelmän solujen. Näistä, fibroblastit muodostavat suurimman ryhmän stroomasolujen ja näyttävät toimivan näkyvästi syövän etenemisessä [4-5].

Ensimmäinen kuvattu lopulla 19

luvulla, fibroblastit ovat pitkänomainen, ei-verisuoni , ei-epiteelin ja ei-tulehdussolujen sidekudoksen laajennettu solujen prosesseja, jotka osoittavat fusiform tai kara kaltainen muoto profiililtaan. Fibroblastit suorittaa monia tärkeitä toimintoja, kuten laskeuma ECM, sääntelyn epiteelin erilaistumista ja sääntely tulehdus; ne ovat mukana myös haavan paranemista [5]. Normaalissa proliferaation terveiden elinten, fibroblastit syntetisoivat ja erittävät erilaisia ​​kollageeneja (eli tyypit I, III, ja V) sekä fibronektiiniin ja proteoglykaanien, jotka ovat olennaisia ​​aineosia ECM [6]. Fibroblastit erittävät myös tyypin IV kollageenin ja laminiinin, jotka auttavat muodostumista tyvikalvon [7]. Vuonna haavoittunut elimet, fibroblastit tärkeä rooli paranemista tunkeutuvat vauriot ja tuottaa ECM toimia tukirakenteena muut solut [8].

Varhaisessa vaiheessa tuumorigeneesiprosessin syöpäsolujen muodostavat kasvainleesioksi alueen rajojen sisäpuolella tyvikalvon mutta erottaa ympäröivästä kudoksesta [9]. Tyvikalvon, fibroblastit, immuunisolujen, kapillaarit ja ECM ympäröivästä syöpäsolut muodostavat alueen, jota kutsutaan kasvaimen mikroympäristössä. Koska periaate lähde ECM komponentteja, fibroblastit on määritelty, joka on keskeinen solun osa kasvaimia. Yhteistyössä syöpäsoluja, normaalien fibroblastien voi hankkia ikuisesti aktivoitu fenotyyppi suoralla solu-solu viestintä tai erilaisiin ärsykkeisiin, jotka syntyvät kun kudosvaurion tapahtuu [10]. Aktivoituneiden fibroblastien osoittavat ylös-asetusten ECM hajottavien metalloproteinaasien-2, 3 ja 9 (MMP-2, MMP-3 ja MMP-9) sekä monet kasvutekijät, jotka indusoivat proliferatiivisen signaaleja viereisten epiteelisolujen [11] . Tästä läheinen, herää kysymys siitä heterotyyppisten solujen vuorovaikutuksia kasvainsolujen ja fibroblastien kasvaimen mikroympäristössä. Viime vuosikymmenen aikana, useat tutkimukset ovat selvitetty vaikutusta fibroblasteissa eri puolista syöpäsolujen käyttäytymistä, kuten solujen lisääntymisen, angiogeneesi, invaasio, etäpesäke ja lääkeresistenssin; kuitenkin, syöpäsolut käyttäytyminen on vielä täysin selitetty. Näkyvästi, Stoker et al. (1966), Wadlow et ai. (2009) ja Flaberg et ai. (2011, 2012) ovat osoittaneet, että normaalien fibroblastien voi estää syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja ne kutsutaan tässä mielessä naapuri tukahduttaminen [12-15]. Flaberg et ai. (2012) on suunniteltu rinnakkaisviljelmätilanteessa määrityksessä H2A-MRFP-leimattujen tuumorisolujen on mono-kerroksen fibroblastien [15]. Aikana 62,5 h, kasvainsolujen proliferaation ja motiliteetin merkittävästi inhiboi fibroblastien suoraan solu-solu-vuorovaikutusta. Jotta täysin ymmärtää näitä vaikutuksia, me conjectured onko epäsuora naapuri vuorovaikutusta fibroblasteja ja syöpäsoluja, jota kutsutaan kuin etäisyyden vaikutus. Annettu hypoteesi on, että estävää vaikutusta fibroblastien syöpäsoluihin on etäisyyden funktio näiden 2 solutyyppejä yhteiseen strooman mikroympäristön.

Tässä tutkimuksessa ehdotimme yksinkertainen yhdessä viljelemisen malli, embedded suurikapasiteettisten microelectrode paneelit (MEA) käyttämällä sähköistä solu-alustan impedanssin tunnistava (ECIS) määritys (kuvio 1) seuraamaan tuumorisolujen olosuhteissa jatkuvasti kohdatessaan viljellään fibroblasteissa. Tämä sähköinen tunnistus menetelmää hyödynnettiin tässä tutkimuksessa, koska merkittävä etu; tämä menetelmä on ei-invasiivisia, yksinkertaisia ​​asentaa, helppo tehdä, erittäin herkkiä solun olosuhteissa ja kykenee reaaliaikainen seuranta [16,17]. MEA oli kuvioitu molemmin puolin soluviljelmän alueilla eri etäisyyksillä rajaviiva. Aikana soluinteraktiot, kunkin elektrodin tallentaa jatkuvasti impedanssi signaalin suurikapasiteettisten tiedonkeruujärjestelmä. Tämäntyyppinen impedimetric tietojen on tunnustettu heijastamaan soluadheesiota, levittää, leviämisen ja elinkelpoisuuden hoidossa olosuhteissa ympäristömyrkkyjä, huumeet, ja kemikaaleja, sekä muita aineita.

(A) Mikroelektrodin pakat (1: työelektrodin, 2: yhteinen vastaelektrodi) on valmistettu kokeellisiin objektilaseille (76mm x 52mm) yhteisellä valokuvalitografia prosesseja. SU-8 fotoresisti käytettiin passivointikerrokseen kattamaan johtavat jäljet. (B) Havainnointiväline alusta jaettiin 2 alueet, yksi syöpäsoluja ja yksi mikroympäristön aineita. Useita mirco kokoinen työ- elektrodit asennettiin kullekin alueelle eri etäisyyksillä: 100, 250, 650, 1450 ja 3050μm kaukana vastakkainasettelua linjan. (C) Yksi elektrodi oli 100 pm halkaisijaltaan. (D) Kuva todellinen siru jälkeen yhteistyössä viljely 2 eri solutyyppejä 2 puolin. (E) Yhteistyössä kulttuuri kuviointi menetelmä käyttäen kaksikammioisesta hometta. (E

1) Käsittelyn jälkeen pintaan soluviljelmässä, solun siru asetettiin suunniteltu telineeseen, ja kaksikammioinen muotti oli vahvistettu oikea sijainti ruuveilla. 2 kammiot erotettiin toisistaan ​​100 pm paksun seinän solujen kuviointi. (E

2) Sen jälkeen, kun solut sekä kammiossa oli kiinnitetty sirun pintaan, Kaksoiskammio muotti korvattiin hyvin tyyppinen avoin säiliö. PDMS sänky asennettiin myös estämään ratkaisu vuotaminen. Solu siru on kytketty mittausjärjestelmän, ja pidettiin inkubaattorissa mittausten aikana.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, inhiboiva vaikutus MRC-5 ihmisen keuhkojen fibroblastit normaalin leviämisen A549 ihmisen keuhkosyövän soluja. Impedanssi signaalin erot määritettiin epäsuorasti osoittaa etäisyyden vaikutus välinen MRC-5 ja A549-solut in co-kulttuuri ympäristössä. Erityisesti huumehoidon edellytyksin myös havaittu intensiivinen tukahduttaminen suorassa fibroblasti-syöpä vuorovaikutus, joka oli korkeampi kuin kohdistama epäsuora vuorovaikutus. Lisäksi inhiboiva vaikutus fibroblastien varmistettiin käyttämällä fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) -menetelmällä sekaviljelmässä malli. Tutkimuksemme tavoitteena oli matkia

in vivo

terapeuttinen tukikudosten vaikutusta kasvaimen etenemiseen romaani havaitseminen ja analyysi tekniikka reaaliaikaisen domain.

Materiaalit ja menetelmät

MEA valmistus

MEA kuvio valmistettiin lasi mikroskooppiobjektilaseille (52 mm x 76 mm) yhteisellä fotolitografian prosessien avulla AZ-5214E ​​(MicroChemicals GmbH, Saksa) negatiivisena fotoresistin varten lift-off prosessi. Kuviointiyksikkö seurasi laskeuman 250 Å /500 Ti /Au kaksikerroksinen käyttämällä e-beam haihtuminen järjestelmä, ja tarpeettomat osat olivat valikoivia poistettiin asetonilla. Sen jälkeen, kun elektrodit on muodostettu, teimme toisen valokuvalitografia vaiheessa soveltaa 2 um paksu SU-8 2002 (MicroChem, USA) kuin eristekerros kultaa jälkiä, jättäen vain elektrodit taulukot ja kosketustäplien expodes.

Soluviljely

MRC-5 ihmisen keuhkojen fibroblastit ja A549 ihmisen keuhko- syöpä-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja viljeltiin RPMI 1640 (Gibco ), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco) ja 1% antibiooteilla /antimykootteja (Gibco). Nämä solut pidettiin kunnossa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ja osa-viljeltiin hoitoon trypsiini-EDTA: a (Gibco) liuos. Solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä Cellometer (Cellometer Auto T4, USA).

Solun kuviointi monoetanoliamiinista chip

Tässä tutkimuksessa kenno kuvioitu käyttäen yhteistä fyysisen esteen tapa luoda solutonta alueiden kollektiivinen solujen vaeltamiseen [18]. Fyysinen este levitettiin ennen solun kylvö estää solujen sekoitus, ja poistamalla fyysisen esteen aloittaa solujen vaeltamiseen ja vastakkainasettelua prosessi. Akryyli kiinnikkeet solun siru ja kaksikammioinen muotti suunniteltiin AutoCAD ja kehitelty käyttäen CNC (kuvio 1 E). Ennen käytetään soluviljelmässä, kaikki laitteet steriloitiin alkoholissa kylpy ja kuivattiin uunissa UV-valolla. Sen jälkeen, kun kaksikammioinen muotin kiinnitetty soluun siru oikeassa asennossa ruuveilla, kuhunkin kammioon käsiteltiin kollageenin liuosta (10%) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotka edistävät solujen tarttumista. Sitten kammiot pestiin 1 x PBS, ja 2 eri solususpensiota (5 x 10

5 solua /kammio) injektoitiin 2 erillistä kammiota. 12 tunnin kuluttua, kun molemmat solutyypit olivat kiinnittyneet hyvin ja oli muodostunut yksikerroksisen siru pinnalla, kammiot on purettu ja ne korvattiin hyvin säiliöstä. Solun siru oli kytketty ECIS järjestelmään ja pidetään inkubaattorissa mittausten aikana.

CellTracker värjäystä maahanmuuton tarkkailun

MRC-5-fibroblasteja värjättiin CellTracker ennen yhdessä viljelemisen arvioida niiden kulkeutumista alue A549 syöpäsoluja. Lyhyesti, MRC-5-soluja kasvatettiin soluviljelmässä astia (SPL), ja kerättiin käyttämällä trypsiini-EDTA: a (Gibco). Solut sentrifugoitiin, supernatantti poistettiin, ja solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan viljelyalustaa (RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää, 1% PS, 25 mM HEPES, Gibco). Solun liuos sai 20 uM CellTracker

TM (Life Technologies, CellTracker

TM Green CMFDA) ja soluja viljeltiin sen jälkeen 30 min. Sitten solut sentrifugoitiin ja supernatantti poistettiin; Sitten solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan tuoretta elatusaineet. Värjätyt solut olivat sitten valmiita ruiskutetaan yhdessä viljelemisen kammiossa, kuten on kuvattu solun kuviointi osassa. Solun värjäytyminen varmistettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Eclipse 80i, Nikon).

Virtaussytometrianalyysi

A549 ja MRC-5-soluja (5 x 10

5 solua /ml) viljeltiin 6-kuoppalevyillä sekä mono-kulttuuri A549-solut ja yhdessä viljelemisen A549 ja MRC-5-solut). Kukin solutyyppi käsiteltiin 30 uM curcumin (Sigma-Aldrich) ja 3 päivää. Sitten solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä (Sigma-Aldrich) ja suspendoitiin sitovaa puskuria (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2, pH 7,4, Sigma-Aldrich). Kukin näyte sai 5 uM anneksiini V konjugoitu Alexa Fluor® 594 (Life Technologies, eksitaatio /emissio: 590/617 nm) ja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut analysoitiin käyttämällä Accuri C6 virtaussytometrillä (BD Bioscience), ja tiedot analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Treestar).

MTS-määritys

Curcumin (Sigma-Aldrich) valmistettiin DMSO: ssa ja laimennetaan haluttuun pitoisuuksiin soluviljelyalustoissa. Koetta varten soluja viljeltiin 1 x 10

4 solua /100 ui ensimmäisen kylvön määrän, joka on 96-soluviljelmässä levyn 24 tuntia. A549-solut ja MCR-5-fibroblasteja käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin (1, 10, 30, 50, 70, 100 ja 500 uM) 3 päivän ajan. Cell Counting Kit-8-liuosta (Dojindo Inc.) laimennettiin 1:10, keskipitkän ja lisättiin kuhunkin levyn kuoppaan, ja sitten soluja inkuboitiin 4 tuntia. Solujen lisääntyminen mitattiin 450 nm: ssä käyttäen Wallac 1420 VICTOR3 V mikrolevylukijaa.

Mittajärjestelmä

Agilent 4284A impedanssi Precision Meter (Agilent CA, USA) ja suunniteltu kytkentä relepiiri operoitiin samanaikaisesti mitata impedanssi elektrodien paneelit. Mittausolot olivat 10 mV ja 10 kHz 5 minuutin välein. LabVIEW (National Instrument, TX, USA) ohjelmistoa käytetään ohjaamaan mittari ja tallentaa numeerista dataa tietokoneeseen, ja sitten tiedot olivat automaattisesti piirretty reaaliaikainen kaavio.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin välineet (± SD) 3 toistoja. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntainen kertoma ANOVA, jonka jälkeen Tukeyn rehellisesti merkitsevä ero (HSD) testi ero. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä p-arvot alle 0,05.

Tulokset

MEA luonnehdinta kautta monokulttuurien kasvainsolujen ja fibroblastit

Ensimmäisessä kokeellinen vaiheessa MEA solu sirut validoitu kautta monokulttuurien A549 tuumorisoluissa ja MRC-5-fibroblasteja normaaleissa lisäävissä olosuhteissa. Ennen käyttöä solu mittausjärjestelmän, taulukot mukautettiin (by LabVIEW) normalisoida systemaattisia eroja, kuten johdot, juottaminen ja johtavien juovien. Normalisoitu soluvapaa vastus kunkin elektrodin vahvistettiin 2,6 kQ. Kuvio 2A esittää vastuksen vasteita, kun yksittäinen elektrodit altistettiin eri pitoisuuksia A549-solut. Saadut 16 tunnin tulokset sijoitettiin kukkulan algoritmi kasvua /sigmoidal malli (OriginPro 9). Alle 1,25 x 10

5 solua /kuoppa, vastus käyrät vastasivat hyvin istuva käyriä. Tällä suurempiin solutiheyksiin, viivevaihe ilmestyi 4 h 8 h, kun solut järjestämässä itse sitovan paikan päällä ennen muotoilua yksikerroksisen elektrodien. Helposti arvioida elinkelpoisuutta koko tämän tutkimuksen, dimensioton parametri kutsutaan solun indeksi (CI) määriteltiin suhteellista muutosta mitataan sähkövastus ja voidaan laskea käyttäen yhtälöä belowwhere R

i on vastus solun peittämän elektrodit ja R

solutonta on vastus tyhjä elektrodit (2,6 kQ). 16 tunnin kuluttua, kalibrointikäyrä piirrettiin, joka edusti korrelaatio Cl-arvo ja solujen istutustiheyteen (kuvio 2B).

(A) Resistance vastaukset MEA: n eri pitoisuuksille A549 kasvainsolujen monokulttuurin 16 h (at 10mV, 10kHz). (B) Tämä kalibrointikäyrän edustaa korrelaatio A549 solutiheys ja solujen indeksin arvo. (C) MTS tulokset monokulttuurien A549-solujen ja MRC-5-fibroblasteja 72 tunnin kuluttua altistumisen curcumin. IC50-arvot A549-soluja ja MRC-5-soluissa oli 50 uM ja 30 uM, vastaavasti. Tiedot esitetään keskiarvona (± SD) 3 toistoja.

Lisäksi, A549 tuumorisoluissa ja MRC-5-fibroblasteja käsiteltiin erikseen eri annoksilla curcumin määrittelemään asianmukaisen hoidon edellytys co-kulttuuri tutkimus. Curcumin on osoittautunut tehokkaaksi apoptoosin sekä proliferaation estossa keuhkojen adenokarsinoomasolulinjasta-A549 [19]. Tässä tutkimuksessa curcumin valittiin luomaan hoitoon ympäristön ehdotetun yhteistyön kulttuuri malli. MTS-määritys suoritettiin, ja solun elinkelpoisuutta käyrä piirrettiin kuluttua 72 h (kuvio 2C). Tulokset osoittivat, että kurkuma on merkittävä myrkyllinen vaikutus sekä kasvaimen ja fibroblastien 10 uM. IC50-arvot A549-soluja ja MRC-5-soluissa oli 50 uM ja 30 uM, vastaavasti. Hoidossa annos 30 uM valittiin myöhemmin yhteisviljelmässä kokeessa, jossa tuumorisolut samanaikaisesti altistuvat sekä toksisia vaikutuksia kurkumiinin ja inhiboiva vaikutus vierekkäisten fibroblasteissa.

Estovaikutus fibroblastien tuumorisoluihin in sekaviljelmässä

kasvainsoluproliferaation tämäntyyppisten yhdessä viljelemisen malli määritetään ominaisuudet sekä syöpäsolujen ja fibroblastit, jotka voivat käyttää vastakkaisia ​​proliferatiiviset vaikutukset

in vitro

. Esimerkiksi, AG09877 fibroblastit stimuloida T47D-soluja, kun taas AG04351 fibroblastit näytteille kasvun estymistä vaikutus samalla syövän solulinja [13]. Määrittää vuorovaikutukset välillä A549 ja MRC-5, FACS-analyysi suoritettiin sekaviljelmän mallia käyttäen nämä 2 solulinjoja. Havaitseminen järjestelmä perustuu eroihin fosfatidyyliseriini (PS) sijainti välillä terveiden solujen ja apoptoottisten solujen. Normaaleissa eläviä soluja, PS sijaitsee soluliman pinnalla solukalvon. Kun solut alkavat apoptoosiin, PS kulkeutua sisäpuolelta ulkopuolelle solukalvon ja altistetaan ulkoisen solun ympäristöön. Käyttämällä erityistä fosfolipidi-sitoutuva proteiini (anneksiini V-konjugoidun Alexa Fluor® 594) ja virtaussytometria lajittelu järjestelmä, varhaisen vaiheen apoptoottiset solut voidaan erottaa koko solupopulaatiosta.

Kuten kuviossa 3 , kurkumiini kohtelun monokulttuurien indusoi apoptoosia sekä A549-soluja ja MRC-5-solujen 9,87% ja 19,05% apoptoottisia soluja, vastaavasti. Tämä suhde oli vähäisempi kuin meidän MTS tulokset sekä tulokset Muiden aikaisempien tutkimusten [20]. Nämä erot selittyvät puute kuolleet solut, joita ei voida erotella FACS vain PS-värjäyksellä.

erilaiset prosenttimäärät Apoptoottisten solujen saatiin A549-kasvainsoluja ja MRC-5-fibroblasteja monokulttuurien ja seka kulttuuri näistä 2 solulinjoista. [Väriä lukua voidaan tarkastella online kysymys].

sekaviljelmät ilman naapurin vaikutus välillä kasvainsolujen ja fibroblastit, suhteessa taseen apoptoottisten solujen odotettiin 9,87%: sta 19,05% samoissa koeolosuhteissa. Mielenkiintoista on, että suhde apoptoottisten solujen sekaviljelmiä määritettiin olevan 33,71%. Tämä tulos viittaa siihen, että solu-solu-inhibitorinen vaikutus oli läsnä samanaikaisesti toksisia vaikutuksia curcumin molempien solutyyppien. Kuitenkin, on erityisiä vaikutuksia kustakin solulinjasta oli vaikea määrittää käyttämällä FACS: llä.

Estovaikutus fibroblastien normaaliin kasvainsolujen proliferaatio

erottamaan erityisesti osuus kunkin solulinjan koko estävä vaikutus, tutkimme solun olosuhteissa kautta impedanssi vasteita rinnakkaisviljelmätilanteessa malli. Raaka-vastus tiedot A549-solujen eri etäisyyksillä fibroblasteissa (0,1, 0,25, 0,65, 1,45, ja 3,05 mm) lineaarisesti asennettu ja normalisoitu, kuten on esitetty kuviossa 4A. Vastaava vastus tietoja 24 tunnin ja 48 tunnin muunnettu Cl-arvot käyttäen yhtälöä esitetty leikkauksessa 1 (kuvio 4B). Ensimmäisen 24 tunnin jälkeen solujen kontakti etäisyyden vaikutus oli epäselvä, ja CI-arvot eivät osoittaneet merkittäviä eroja 1

st elektrodi array (0,1 mm) ja 5

nnen elektrodin array (3,05 mm) .

(A) solujen resistenssin vasteita (at 10mV, 10kHz) A549 tuumorisoluissa funktiona ajan ja etäisyyden fibroblasteista yli 54 h yhdessä viljelemisen normaaleissa kasvuolosuhteissa. Raakadata olivat lineaarisesti-asennettu ja muunnetaan CI arvoa suhteessa soluttoman elektrodi vaste (2,6 kQ). (B) CI-arvot kasvainsolujen 5 eri etäisyyksillä viljellyistä fibroblasteista. 48 tunnin kuluttua yhteistyössä kulttuuri, Cl-arvot osoittivat, että syöpäsolujen kohtasivat fibroblasteja selvästi esti verrattuna kaukainen soluihin. (* P 0,02). (C) Kirkas-kentän kuvia vastakkainasettelu kasvainsolujen ja fibroblastien 0 h ja 48 h. Mittakaavapalkki edustaa 200 um.

merkittävän eron leviämisen A549-solujen havaittiin 48 tuntia. CI-arvot A549 solujen suoraan yhteyttä ja vierekkäin kosketuksiin fibroblasteja (eli kello 1

st ja 2

nd elektrodi array) hieman pieneni 6,12 ja 6,23-5,57 ja 5,77, kun taas edelleen A549 solut (eli 3

rd, 4

th ja 5

th elektrodi array) säilyy vakaana impedanssi vasteita konfluenttien solutiheyden (kuvio 4C). Nämä tulos osoitti selvästi, että fibroblastit kykenevät estämään lisääntymisnopeus kasvainsolujen kohtaavat kulttuureissa tehokkaammin kuin vaikutukset välittyvät mediaympäristön.

Sidekudosmuodostussolujen-kasvainsolujen vuorovaikutus altistusolosuhteet: ilmeinen naapuri vaikutus matkoilla

Tuottaa täyttä ymmärrystä naapurin vaikutuksen välillä fibroblasteja ja kasvainsolujen

in vitro

rakensimme yhdessä viljelemisen malli MRC-5-solut ja A549-solujen terapeuttista olosuhteissa. Curcumin johdettiin vastakkain kulttuurien aiemmin määritellyt pitoisuus, 30 uM; impedanssi sitten seurattiin seuraavat 84 h. Keskimääräinen vastaukset normalisoituivat ja epälineaarisesti asennetaan käyttäen annos-vaste-algoritmi (kuvio 5A). Mielenkiintoista on, että etäisyyden vaikutus osoitettiin selvästi varhaisessa aikoina sen jälkeen, kun lääkkeen altistumista (kuvio 5A ja 5B). 24 tunnin jälkeen keskimääräinen CI saadut arvot olivat 5,57, 5,77, 6,35, 6,34 ja 6,40 syöpäsolujen sijaitsivat 0,1, 0,25, 0,65, 1,45 ja 3,05 mm: n päässä fibroblastien vastakkainasettelua linja. 48 tunnin kuluttua ja 72 h, merkittävää laskua kaikista CI arvot ja ulkonäkö väliset raot paneelit selvästi heijastunut teho yhdistettynä apoptoottinen vaikutus sekä syövän huumeiden ja kasvun estäminen kautta fibroblastien vuorovaikutusta. Olemme myös suorittaa siirtymän määrityksen mukaisesti joutuu yhdessä viljelemisen olosuhteissa tutkimaan siirtyminen kyky fibroblastien kasvainsoluihin alueella ja siten pystyä erottamaan suoraa solu-solu-vuorovaikutuksen vaikutusta kokonaismäärästä estävää vaikutusta (kuvio 5C). 72 tunnin kuluttua, jäljellä fluoresenssin voimakkuus osoitti tehokasta apoptoottinen vaikutus kurkumiinista MRC-5-soluissa, mutta ei kulkeutuu merkittävästi havaittu. Nämä tulokset vastasivat hyvin muiden tutkimuksia vaikutuksista curcumin hoidon siirtyvien kinematiikka viljellyistä fibroblasteista.

(A) Solujen resistenssin vasteita (at 10mV, 10kHz) A549 tuumorisoluissa kuin ajan funktiona ja etäisyys fibroblasteista yli 84 h yhteistyön kulttuurin curcumin hoitoon kunnossa. Raakadatan sovitettiin ja muutettiin CI arvoihin nähden soluttoman elektrodi vasteet (2,6 kQ). (B) CI-arvot kasvainsolut 5 eri etäisyyksillä viljellyistä fibroblasteista. Inhiboivaa vaikutusta fibroblastien kasvainsoluihin selvemmin havaittu myrkyllisiä ympäristössä 24 h (* p 0,04). (C) Siirtymisen nopeus fibroblastien kasvaimeen solun alueella arvioitiin käyttäen solua tracker värjäys määrityksessä. Hoidettaessa kunnossa, mitään merkittävää muuttoliikettä havaittu. Harmaat pisteet osoittavat sijainnin elektrodien paneelit. Mittakaavapalkki edustaa 500 um.

Keskustelu

Impedimetric cell biosensoreissa on tunnustettu monipuolinen ja luotettava luonnehdinta alustan bio-analyyttisiä tutkimuksia johtuen niiden näkyvä etuja, kuten kuten korkea herkkyys, suurikapasiteettisten ja reaaliaikaisen tallennustoiminto. Erilaisilla geometrinen elektrodi malleja, ECIS alustat ovat laajasti hyödynnetty tutkimuksissa Solukiinnittymisen ja leviää [21,22], soluliikkuvuus [23], solujen kerros este toimintoja [24], sekä

in vitro

myrkyllisyystutkimukset ja lääkeaineiden seulonta [25,26]; Näiden alustojen myös integroida muihin bioanalyyttisista järjestelmiä [27]. Erinomainen elektrodi muotoilu on mikroelektrodilla joukko, joka koostuu monista yhtenäinen yhden mikroelektrodien yhtä jaettua alustalla. Koska ne ovat suuruusluokkaa mikrometrin kokoisia, yksi mikroelektrodien pystyvät käsittelemään heterogeeninen ominaisuudet soluja, jotka ovat piilossa sisällä keskimäärin solupopulaatioiden, sen sijaan, että kollektiivinen soluvastetta tietyn fysiologisen tilan. Kuitenkin käyttö yhden mikroelektrodien solujen mittaus on puuttua ylimääräinen herkkyyttä solun käyttäytymistä, kuten mikro-liikkeet, kiinnitys, leviämisen ja leviämisen. Tämä signaali vaihtelu on haaste määrittämiseksi todellisen solun käyttäytymistä elektrodin pinnalla. Tarjoama ratkaisu tässä tutkimuksessa käyttäen paneelit mittaus- toistoa, ja sitten soveltamalla asianmukaista sopiva menetelmiä saatuihin keskimääräisiin tietoihin. Käyttämällä tätä menetelmää, suhteelliset muutokset solun elinkelpoisuus voidaan osoittaa kautta CI numero ja voidaan helposti muuntaa prosentit verrattuna alkuperäiseen Cl-arvot.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli ehdottaa yksinkertaista, mutta tehokas tapa tutkia vuorovaikutuksia kasvainsolujen ja fibroblastien rinnakkaisviljelmätilanteessa malli, keskittyen erityisesti etäisyydestä vaikutus näiden 2 solulinjoista. Yleinen estävä ja myrkyllisiä vaikutuksia A549 syöpäsoluja on esitetty kuviossa 6. On huomattava, että muut aiemmat tutkimukset ovat tutkineet tuumorin solujen proliferaatiota ja liikkuvuus fibroblastit [28-31]; yhteinen johtopäätös oli, että esto vaikutus oli sekä lähi- ja liukoisen tekijän riippuvaista. Kuitenkin tehokas etäisyys kasvainsolujen ja fibroblastit ei ole vielä määritetty. Integroimalla MEA alustan osaksi rinnakkaisviljelmätilanteessa malli, onnistuneesti erot määritettiin A549 tuumorisolun käyttäytymisen eri etäisyyksillä MRC-5-fibroblasteja sekä normaali leviämisen ja käsittelyolosuhteet. Tulokset osoittavat, että vaikutukset kasvainsoluihin voidaan luokitella 3 eri vyöhykkeisiin elinkelpoisuuden syöpäsoluja. Ensimmäinen vyöhyke sijaitsi 0.25 mm poispäin fibroblasti vastakkainasettelua linja, jossa syöpäsolut voimakkaasti esti sekä normaali myrkyllisiä olosuhteissa. Tämä tulos voidaan selittää osallistuminen pinnan molekyylien fibroblastien sekä liukoisia tekijöitä, jotka erittyvät koska vastakkainasettelu fibroblastien ja kasvainsolujen [31]. Toinen vyöhyke sijaitsi enintään 3 mm poispäin ensimmäisestä vyöhyke, jossa vaikutus normaaleissa kasvuolosuhteissa oli epäselvä, mutta ilmeni selvästi hoitoon kunnossa. Tämä tulos voidaan selittää myös, että liukoiset tekijät erittyy fibroblasteista rajoitetun matkan. Kolmas vyöhyke sisältyvät jäljelle jäävällä alueella. Normaalissa yhteistyössä kulttuureissa A549 tuumorisoluissa tällä alueella säilyy CI-arvot 6,6 ja 6,5, mikä osoitti normaalia proliferaationopeus huolimatta rajat puhua kaukainen soluja. Hoidettaessa kunnossa, A549 solujen elinkykyisyys määritettiin olevan 75,6%, joka oli suunnilleen sama arvo määritetään mitokondrioiden perustuu MTS-määritys (72,1%). Tämä vastaavuus tietysti osoitti, että elatusainetta ei aiheuttanut estävää vaikutusta, kun syöpäsolut olivat yli 3 mm: n päässä fibroblasteista.

vaste pahanlaatuisten ihmisen solujen strooman microenvironment ja hoito-ohjelmia on perustavanlaatuinen aihe syöpätutkimuksessa, mutta täyttä ymmärrystä ei ole saavutettu johtuen liiallista päätepiste määrityksissä [32-34]. Tässä tutkimuksessa toimme vakiintunut määritys uuteen tunnistus alustan ensimmäistä kertaa helpottaa jatkuvan seurannan ja sijainti-riippuvainen arviointi soluinhibitio- vaikutuksia. Tuloksemme korosti, että tekijä kasvaimen koon voi vaikuttaa tehokkuuteen syövän kemoterapiaa ja olisi pidettävä vaikutusvaltainen parametri yhteistyössä kulttuuri järjestelmiä. Lisätutkimukset, jotka luonnehtivat molekyyli elementit erittävät solut sekä signalointipolkujen käyttämällä alustaa ja vastaavia 3D yhdessä viljelemisen järjestelmät kullakin syöpätyypin on huomattavan hyödyllistä syövän tutkimusyhteisöä.

Johtopäätös

parhaan tietomme mukaan tämä tutkimus on ensimmäinen yritys käsitellä tekijä etäisyyden ero esto kasvainsoluproliferaation ihmisen fibroblasteissa. Meidän impedimetric solupohjaiset tulokset osoittivat, että naapuri suppression vaikutusta normaalien fibroblastien riippuu paitsi solutyypistä ja siten vuorovaikutuksen, mutta myös välinen etäisyys 2 solulinjoja. A549-kasvainsoluja intensiivisesti inhiboida 0,25 mm MRC-5-fibroblasteja, kun taas mitään estoa havaittiin 3 mm ja edelleen. Jolla on mahdollisuus automaattisia mittauksia, meidän suuren suoritustehon määritys voidaan helpottaa alustavasti arvioida haluttu solu-solu-vuorovaikutuksia eri kasvua tai hoitoa olosuhteissa ennen käyttöä muita biologisia määrityksiä.