Krooninen sairaus

tiivistelmä

TMPRSS2 /ERG (T /E) fuusio geeni on läsnä suurimman osan kaikista eturauhasen syöpiä (PCA). Olemme osoittaneet aiemmin, että NF-kB signalointi on erittäin aktivoitu näiden T /E fuusiota ilmentävien solujen välityksellä fosforylaation NF-kB p65 Ser536 (P536). Siksi hypoteesina, että kohdistaminen NF-kB signalointi voi olla tehokas lähestymistapa alaryhmä kumppanuus- joka kuljettaa T /E fuusioita. Celastrol on tunnettu NF-kB-estäjä, ja voi siten inhiboida T /E fuusiota ilmentävien PCa solujen kasvua. Siksi arvioitiin Celastrol vaikutuksista

in vitro

ja

in vivo

in VCAP soluissa, jotka ilmentävät T /E fuusio geenin. Vcap-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Celastrol ja kasvun inhibition ja kohde-ilmentymisen arvioitiin. Testata sen kyky estää kasvua

in vivo

, 0,5 mg /kg Celastrol käytettiin hiirien hoitamiseksi, joissa ihonalainen Vcap ksenograftikasvaimissa. Tuloksemme osoittavat Celastrol voi merkittävästi estää kasvun T /E fuusiota ilmentävien PCa solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

kohdistamalla kolme kriittistä signalointireiteissä: AR, ERG ja NF-kB in nämä solut. Kun hiiret saivat 0,5 mg /kg Celastrol 4 kertaa /viikko, merkittävää kasvun inhibitio nähtiin mitään ilmeistä toksisuutta tai merkittäviä laihtuminen. Siksi Celastrol on lupaava ehdokas lääke T /E fuusio ilmentävien PCa. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusi strategia täsmähoitoihin jotka voivat hyötyä enemmän kuin puolet PCa potilailla, joilla on T /E fuusio ilmentävien kumppanuus-.

Citation: Shao L, Zhou Z, Cai Y, Castro P, Dakhov O, Shi P, et ai. (2013) Celastrol vaimentaa kasvainsolukasvun kautta Targeting AR-ERG-NF-KB Pathway in TMPRSS2 /ERG Fusion Gene ilmaiseminen eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (3): e58391. doi: 10,1371 /journal.pone.0058391

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 joulukuu 2012; Hyväksytty 4 helmikuuta 2013 Julkaistu: 06 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Shao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat puolustusministeriön Eturauhassyöpä Tutkimusohjelma (DOD W81XWH-08-1-0055, JW) ja NCI Dan L. Duncan Cancer Center Human Tissue ja patologia Core (NCI: P30CA125123). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on heterogeeninen sairaus, joka on edelleen huonosti. Polut muuttunut korkealla taajuudella tietyillä potilaalla kasvain tyypit on määriteltävä paremmin ennen suunnittelemalla yksilöllisesti täsmähoitoihin. On rohkaisevaa, viime muutaman vuoden merkittävää edistystä on tapahtunut alaluokkiin Eturauhassyövän, ja erityisesti päätelmä, että TMPRSS2 /ERG (T /E) fuusio geeni on läsnä useimmissa kumppanuus- ja on siten yleisin geneettisen vaurion löydettiin PCa [1], [2], [3]. Monet tutkimukset ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että T /E fuusio geeni voidaan edistää PCa invaasio ja vähäisemmässä määrin lisääntymistä ja vähentää erilaistumista [4], [5]. Tiheä tämä muutos ja sen tärkeä rooli PCa tuumoribiologiassa tekee siitä erinomaisen terapeuttinen kohde PCA. Olemme osoittaneet, että vakaa shRNA lauseke, joka kohdistuu erityisesti T /E fuusio selostukset merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

, mutta ne eivät poista sitä kokonaan [6], mikä osoittaa, että tarvitaan yhdistelmähoito, joka voi voittaa kestävyys ja /tai heikko vastaus yhden täsmähoitoa. Tutkimuksemme osoittavat, että NF-kB signalointi, erityisesti fosforylaatiota NF-kB p65 Ser536 (P536) on erittäin aktivoituu näissä T /E fuusiota ilmentävien solujen välityksellä ERG [7]. NF-kB signalointi on aiemmin osoitettu tärkeä rooli PCA kasvu, angiogeneesi, kasvaimen kehittymisen ja metastasointiin [8], [9], [10], [11], [12]. Koska dalmatialaistäpläisiä NF-kB kasvaimen etenemiseen oletamme, että kohdistaminen NF-kB signalointi voi olla tehokas lähestymistapa alaryhmä kumppanuus- tekevistä T /E-fuusioita.

Viime vuosina on kasvavaa kiinnostusta tunnistamisessa voimakas ja bioaktiivisten molekyylien luonnollisista lähteistä, kuten perinteisen kiinalaisen lääketieteen [13], [14]. Jotkut näistä molekyyleistä voivat tarjota potilaille turvallisempi pitkällä aikavälillä hoitovaihtoehtojen [15]. Celastrol, farmakologisesti aktiivinen yhdiste uutteesta Kiinan Thunder God Vine jota on käytetty Kiinassa satoja vuosia, on herättänyt suurta huomiota viime aikoina, koska sen merkittäviä tulehdusta ja syövän vastaisen toiminnan [16], [17] . Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Celastrol voi moduloida useita signalointireittien mukana tauti ja siksi niillä potentiaalista terapeuttista arvoa sellaisten erilaisten kroonisten sairauksien ja syöpien [16], [17]. Celastrol on osoitettu estävän kasvua monien syöpien soluja ja estää kasvaimen aloittamista, etenemisen ja etäpesäkkeiden useissa eläinmalleissa

in vivo

, mukaan lukien rintasyövän [18], keuhkosyöpä [19], haimasyöpä [20], gliooma [21], ja melanooma [19] sekä PCa [22], [23], [24], ja toistaiseksi ei ole merkittäviä haitallisia vaikutuksia ei ole raportoitu. Monet tärkeät molekyyli tavoitteita Celastrol on tunnistettu, mukaan lukien NF-kB, Hsp90, proteasomin, VEGFR, AKT /mTOR, c-Jun ja muut [16], [18], [22], [25], [26] , [27], mutta NF-kB reitti näyttää osuus paljon sen terapeuttisia vaikutuksia.

huolimatta tiheä T /E fuusio havaitaan PCA potilailla, vain yksi yleisesti käytetty PCa solulinja ( VCAP) endogeenisesti ilmentää T /E fuusio. Se on androgeenireseptorin riippuvaa solulinjaa ja ilmaisee korkeaa AR, joka voi ajaa ekspressiota ERG valvonnassa AR riippuvainen TMPRSS2-promoottori. Se osoittaa myös korkean tason P536 verrattuna lähes huomaamaton ilmentymisen muiden yleisesti käytettyjen PCa solulinjoja, mukaan lukien LNCaP, PC3 ja DU145 [7]. Siksi käytetään VCAP meidän tutkimuksissa. Tässä osoitamme, että Celastrol on voimakas P536-estäjä, joka voi merkittävästi estää VCAP solujen kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi meidän data paljasti uudenlaisen signalointiryöpyn AR-ERG-P536 kohteena Celastrol. Kohdentamista AR-ERG-NF-kB by Celastrol on uusi ja nähdään myös silloin, kun T /E fuusiota ilmentävät PCa solut altistuvat hyvin pieninä pitoisuuksina Celastrol. Tällaisissa olosuhteissa toinen raportoitu suurten väyliä säilyvät ennallaan. Perustuu kaikki todisteet ja sen voimakas biologisia vaikutuksia, Celastrol saattaa olla potentiaalia klinikan käyttää potilailla, jotka kantavat T /E fuusio niiden PCa kasvaimissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Vcap solut ylläpidettiin DMEM (korkea glukoosipitoisuus), 10% naudan sikiön seerumia (FBS). VCAP-Luc solut, jotka ilmentävät lusiferaasia käytetään elävien eläinten kuvantamisen pidettiin samassa DMEM mutta 2 ug /ml puromysiiniä [6]. LNCaP, PC3 ja DU145 viljeltiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää.

Western-blottaus

ERG anti-kani-vasta-aine (1:2000) saatiin Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA , kissa # 2805-1). AR-V7 (AR3) vasta-aine hankittiin A G Precision Vasta ™ (Columbia, MD, USA, cat # AG10008) ja käytettiin 1:1000 laimennus. Anti-p65, fosfo-p65 Ser536, AR, IKBα, HSP90, yhteensä-AKT ja fosfo-AKT Ser473 saatiin kaikki Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, USA) ja käytettiin 1:1000 laimennus Western blotting käyttämällä menetelmiä, on kuvattu aikaisemmin [28]. Anti-β-aktiini-ohjaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Blot signaaleja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Thermo Fisher Scientific, Inc) ja valotetaan ja kehitetään elokuvien tai Bio-Rad kuvantamisjärjestelmä ja kvantifioidaan käyttävä tiheysmittari Määrä Yksi (versio 4.5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA ).

Quantitative Reaaliaikainen PCR

T /E fuusio ja β-aktiini-alukkeet kuten aiemmin on kuvattu [3]. 5 ui templaatti-cDNA (1:20 laimennus) käytettiin lopullisessa reaktiotilavuudessa 15 ul. Master Mix reaaliaikaiseen PCR sisälsi 2 mM MgCl2, 0,4 uM kutakin eteen ja taakse alukkeita ja 7,5 ui DNA Master SYBR GREEN (2 x; Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen PCR tehtiin käyttämällä ABI välineen seuraa 3-vaihe PCR eri hehkutus lämpötila alla. Alukkeet AR, AR3, p65 ja CCL2 olivat: AR RTF: 5′-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 ’; AR RTR: 5’-GGGCTGACATTCATAGCCTTCAATGTGTGAC-3 ’; AR3 RTF: 5’-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 ’; AR3 RTR: 5’-TGCCAACCCGGAATTTTTCTCCC-3 ’; P65 RTF: 5’-CTGCAGTTTGATGATGAAGA-3 ’; P65 RTR: 5’-TAGGCGAGTTATAGCCTCAG-3 ’; CCL2 RTF: 5’TCTCAGTGCAGAGGCTCG -3 ’; CCL2 RTR: 5’GTTTGGGTTTGCTTGTCCAG -3 ’. Suhteellinen ilmentyminen ACt eri koeryhmien kerättiin ja normalisoidaan P-aktiini lausekkeita.

proliferaatiotestillä

1 x 10

5-solut ympättiin 24-kuoppalevyille kolmena kappaleena ja kiinnitetään solut laskettiin käyttäen solulaskuria kuten aiemmin on kuvattu [29]. Celastrol ostettiin Sigma-Aldrich Co. LLC. (Cat # C0869) ja liuotetaan DMSO suositusten. VCAP solut Celastrol hoito aloitettiin 48 tuntia ymppäyksen jälkeen. LNCaP, PC3 ja DU145 soluja käsiteltiin Celastrol 24 h kuluttua ensimmäisestä kylvö. Eri annoksia Celastrol sovellettaisiin kunkin koeryhmän. Koe toistettiin kolme kertaa.

Vcap-Luc Ihon alle Hiiret Malli

Kahdentoista viikon ikäisiä nude-hiiriä käytettiin. 4 x 10

6 Vcap soluissa, jotka ilmentävät lusiferaasia (VCaP- Luc solua) sekoitettiin 100 ul: n kanssa Matrigeliä (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) kokonaistilavuudessa 200 ui, ja injektoidaan subkutaanisesti. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain kuluessa ensimmäisen pistoksen avulla IVIS kuvantamisjärjestelmä (Xenogen, Alameda, CA, USA) [6]. Kuusitoista hiiret osoittivat 1 x 10

5 luminanssi lukemista viikon kuluttua injektion ja olivat mukana hoitoon kokeita. Ne jaettiin satunnaisesti 2 koeryhmään 8 hiirtä kussakin ryhmässä. Hiiret hoitoryhmässä ruiskutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 200 ui 0,5 mg /kg Celastrol liuotettiin 3% DMSO: ta ja PBS: llä, kun taas ohjaus eläimet saivat 200 ui vehikkeliä (3% DMSO: ta ja PBS: ää). Hoito tehtiin 4 kertaa viikossa 3 viikon ajan. Hiiren painoja tarkkailtiin kahdesti viikossa. Hiiret lopetettiin 24 tuntia viimeisen injektion jälkeen, ja ensisijainen tuumorit leikattiin, punnittiin, ja osa kasvaimen jäädytettiin nestetyppeen molekyylitason analyysia ja toinen osa kiinnitetyille ja parafiiniin upotettuja. Ruumiinavaus suoritettiin myös hiirille sulkea pois haittavaikutuksia hoidon. Erot keskimääräisen kasvaimen koon tutkitaan t-testiä. Proteiini ja RNA uutteet valmistettiin lisäanalyysiä. Kudos mikrosiru (TMA) valmistettiin IHC analyysiä. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt Baylor College of Medicine Institutional Animal käytön ja hoidon komitea (IACUC protokolla numero # AN-4542).

immunohistokemia

ja analysointi Apoptosis

Immunohistokemia (IHC) on VCAP ihonalainen kasvainten suoritettiin käyttäen anti-fosfo-p65-Ser536 ja ERG kuten aiemmin on kuvattu [7], [29]. Hiiren monoklonaalinen anti-AR päässä biocare Medical, Concord, CA, USA (Cat # CM109) käytettiin IHC arvioida AR ilmentymisen tuumorisektioiden käyttäen 1:50. Objektilasit valokuvattiin käyttäen Nikon Eclipse E400 mikroskooppi kytketty Nuance multispektrikuvaussensoreita System 40 × tai 200 × suurennuksilla 3,3 megapikselin resoluutio. Ki-67 ja CD31 IHC ja TUNEL, kuvat tallennettiin JPEG-tiedostojen kanssa 4-6 kuvat otettiin jokaisen dian, joka kattaa koko kasvaimen alueelle. Numeerinen arvo prosenttia värjätty (PS) määritetään käyttämällä Image J ohjelmisto (https://rsb.info.nih.gov/ij/) ja verrattiin käyttäen t-testejä.

Tulokset

Celastrol on voimakas P536 estäjä

Koska havainto, että NF-KB signalointi erittäin aktivoidaan T /E fuusiota ilmentävien solujen, pyrimme testaamaan hypoteesia, että kohdistaminen NF-KB signalointi voi olla kannattava terapeuttinen lähestymistapa T /E fuusio ilmentävien PCa. Siksi arvioimme useita ehdokas NF-KB-inhibiittorit mukaan lukien kaksi NF-KB-inhibiittorit (481407 yhdiste ja Celastrol) ja MG132, NF-KB-inhibiittori toimiva tasolla proteasomin esto [9], [30]. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, Celastrol voidaan merkittävästi poistaa P536 in Vcap soluissa, kun sitä käytetään pitoisuutena 2 uM 18 tuntia, kun taas kaksi muuta NF-KB: n estäjät 481407 (2 uM) ja MG132 (2,5 uM) [9] osoittivat, ei ole tällaista vaikutusta, samoin kuin PS1145 (tuloksia ei ole esitetty). Inhibition P536 ekspression Celastrol oli ilmeistä jopa 2 h hoito 0,05 uM Celastrol johtaa yli 60%: n vähennys P536 ilmentymisen (Fig. 1 B), mikä osoittaa, Celastrol on voimakas P536-estäjä.

(A) Vcap soluja käsiteltiin eri NF-KB: n estäjät 18 tuntia. Western blot osoittaa, että Celastrol 2 uM 18 tuntia hoitoa voidaan merkittävästi estää P536 ilme taas 481407 (2 uM) ja MG132 (2,5 uM) lähes ei ole vaikutusta P536 ilme. Lisäksi P536, dramaattisesti vähentynyt AR ja ERG ekspressiota proteiinin tasot nähdään Celastrol hoidetussa ryhmässä, mutta niitä ei ole vähentynyt kaksi muuta inhibiittorit. Rinnakkaiskuoppien on esitetty kullekin ryhmälle. β-aktiini käytettiin kontrollina. (B) Vcap soluja käsiteltiin eri pitoisuus Celastrol 2 tuntia. Merkittävät vähentynyt P536 ilmentymistä havaittiin kaikissa ryhmissä Western blot, myös alhaisin pitoisuus ryhmä 0,05 uM, mikä viittaa vahvasti siihen Celastrol on voimakas P536-estäjä. β-aktiini oli vertailu.

On raportoitu, että Celastrol voi estää AR ilmentymisen LNCaP-soluissa [22]. Jos se on suunnattu AR VCAP soluissa se voi aiheuttaa vaimentua ERG ilmaisu, joka puolestaan ​​voi johtaa vähentynyt P536 ilmaisun edellä kuvatulla ryhmämme [7]. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, Celastrol 2 uM 18 tuntia voi merkittävästi estää AR ja ERG ilmaisun lisäksi täysin poistaa P536 ilmentymistä Vcap soluissa, kun taas kaksi muuta inhibiittorit ei osoittanut tällaisia ​​vaikutuksia.

AR-ERG-P536, joka on Novel signalointiryöpyn kohteiksi Celastrol in vitro

oli monia muita tavoitteita Celastrol raportoitu eri järjestelmässä /soluja, mukaan lukien AKT-reitin aktivaation ja Hsp90. Jotta voidaan osoittaa inhibition AR-ERG-P536 on ainutlaatuinen T /E fuusiota ilmentävien solujen, käsittelimme VCAP solut Celastrol 2 h ja 24 h käyttämällä erilaisia ​​pitoisuuksia välillä 0,05 2 pm. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, Celastrol käsittely 2 tuntia voi estää P536 ekspressiota merkittävästi jopa erittäin pienenä pitoisuutena 0,05 uM, mutta tämä pitoisuus osoitti lähes mitään vaikutusta AR (mukaan lukien AR3, aktiivisen isomuodon AR) tai ERG ilmentymisen sekä muiden proteiinien, mukaan lukien yhteensä p65, IKBα, yhteensä-AKT, fosfo-AKT 473 ja Hsp90. Vuonna 24 h hoito kokeessa alhaisempi pitoisuus 0,5-1 uM, Celastrol voi merkittävästi estää AR, AR3andERG proteiinin ilmentymistä lisäksi P536 ilmaisua, kun taas p65, IKBα, fosfo-Akt473 yhteensä-Akt ja Hsp90 ei juuri vaikuta. Koska sen pleiotrooppisimpien biologisia vaikutuksia, tulee noudattaa varovaisuutta suhteen annoksen Celastrol käyttää

in vitro

tai

in vivo

. Suuremmilla pitoisuus, useita tärkeitä reittejä voi vaikuttaa koska 2 uM Celastrol alkaa alas säädellä fosfo-AKT473 (Fig. 2B). Olemme myös havainneet, että vain 0,75 uM Celastrol 24 tuntia on poistettava p-AKT473 yhteensä AKT ja yhteensä AR ilmentymisen LNCaP-soluissa (tuloksia ei ole esitetty), kun taas edellisessä tutkimuksessa käytettiin 5 uM osoittamaan AR tukahduttaminen ja muita biologisia vaikutuksia aiheuttamien Celastrol samassa solulinjassa [22]. Siksi määritellään pienin pitoisuus /annos on kriittinen välttää mahdolliset haittavaikutustutkimuksissa estämällä useita vaikuttaa reittejä. Meidän

in vitro

tiedot osoittavat, että Celastrol käytettynä 0,5 1 pm, voi kohdistaa AR-ERG-P536 signalointiryöpyn lähes yksinomaan vaikuttamatta muiden suurten väyliä. Testasimme lisäksi ERG, AR ja AR3 ilmentymistä RNA tasolla näissä Celastrol käsitellyissä soluissa kvantitatiivisen RT-PCR [3]. Kuten on esitetty kuviossa. 3, vahvistimme inhibitio T /E fuusio, AR ja AR3 geeniekspressiota Celastrol RNA-tasolla annoksesta riippuvalla tavalla.

(A) Western blot osoittaa, että Celastrol 2 h treament voi merkittävästi kohdistaa P536 ilmentymistä VCAP soluissa. Celastrol pitoisuudet näkyvät päällekkäin kaistaa. Lyhyt aika kohtelu Celastrol ei vaikuta AR, AR3, ERG ilme, ja yhteensä p65, IKBα sekä muut tunnetut Celastrol tavoitteita kuten koko AKT, fosforyloitu AKT-473 ja Hsp90. (B) Kun Celastrol hoidot kestävät 24 tuntia, P536 signalointi oli lähes poistettu kaikissa ryhmissä. Ryhmissä, joissa Celastrol pitoisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin 0,5 uM, merkittävät laski AR ja ERG sekä AR3 ilme nähtiin. Kun pitoisuus saavuttaa 2 uM, 24 h hoito voi vaikuttaa useita signalointi kuten fosfo-AKT. β-aktiini käytettiin kontrollina.

Kun Vcap soluja käsiteltiin eri pitoisuus Celastrol 24 tuntia, inhibitio kohdennettujen geenien arvioitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. β-aktiini käytettiin kontrollina geenin. T /E fuusio lauseke (A), AR (B) ja AR3 (C) lauseke on esitetty kussakin kuvassa. Inhibitio Näiden geenien RNA-tasoilla Celastrol ovat merkittäviä annos-depedent tavalla. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja Celastrol käsitellyn ryhmän ja kontrolli t-testillä.

Celastrol voi estää CCL2 Expression at Sekä RNA ja proteiini Level

Kuten aiemmin ilmoitettua yksi ehdokas geeni, CCL2 määrä lisääntyy T /E fuusiota ilmentävien PNT1a solujen [7]. Tämä säätelyä CCL2 voi aiheutua koholla NF-KB-signaalin näissä soluissa T /E fuusio. CCL2 (kutsutaan myös MCP-1) on kemokiini, joka on voimakas säätelijä PCa solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä [31], [32], [33]. CCL2 ilmaistaan ​​endoteelisolujen sisällä kasvaimen mikroympäristössä, mutta voidaan ilmaista myös kasvainsolujen suoraan [31], [32]. Tärkeintä on, kehittyvien todisteet viittaavat siihen CCL2 on suora transkription kohteena NF-KB [34]. Tämän perusteella näyttöä, me arveltu, että Celastrol voi olla suora vaikutus CCL2 ilme. Käsittelimme Vcap solujen eri pitoisuuksia Celastrol 2 h tai 24 h. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, Celastrol hoitoa vain 2 tuntia voidaan merkittävästi vähentää CCL2 mRNA ilmaisun VCAP soluissa arvioituna Q-RT-PCR ja tällainen estäminen on annosriippuvainen. Jos hoidot kestävät 24 h, jopa 0,05 uM Celastrol voidaan merkittävästi vähentää CCL2 mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4B). Huomattavaa on, että muut tutkimukset ovat osoittaneet CCL2 voidaan erittyä viljelyalustasta VCAP soluihin [31]. Siksi kerättiin viljelyalustasta kustakin Celastrol hoitoryhmässä ja testi CCL2 pitoisuuden avulla CCL2 Elisa pakki ebioscience.com. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, kaikki Celastrol hoitoryhmissä (24 h hoito) myös alhaisin pitoisuus hoitoryhmässä 0,05 uM osoitti merkittävästi vähentynyt CCL2 viljelyalustassa. Siksi meillä on lisätodisteita että Celastrol, koska voimakas NF-KB-inhibiittori, voi merkittävästi vaikuttaa loppupään tavoitteet NF-KB. Kuitenkin, onko fosforylaatiota ser536 on rooli säätelyssä CCL2 ilmentyminen ei tällä hetkellä tunneta.

(A) Vcap soluja käsiteltiin Celastrol 2 h, esto CCL2 on RNA taso on esitetty annos-depedent tavalla reaaliaikaisia ​​PCR; (B), kun Celastrol hoitoja tehtiin 24 tuntia, jopa 0,05 uM lyhentää merkittävästi CCL2 ilmaisu; (C), kun ne altistetaan Celastrol 24 tuntia, eritetty CCL2 proteiinia viljelyalustaan ​​Vcap solut merkittävästi vähentynyt. ELISA-tiedot esitetään. Jokainen konsentraatio testattiin kolmena kappaleena ja koe toistettiin kolme kertaa. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja Celastrol käsitellyn ryhmän ja kontrolli t-testillä.

Celastrol voi merkitsevästi estävän T /E Fusion ilmaiseminen VCAP Cell Growth in vitro

Celastrol voi merkittävästi estää Eturauhassyövän solujen kasvua

in vitro

myös yleisimmin käytetty PCa solulinjojen LNCaP, PC3 ja DU145 [22], [35]. Kuitenkin Celastrol ole koskaan testattu VCAP soluissa. Koska Celastrol voi kohdistaa AR-ERG-NF-KB, kolme suurta reittejä VCAP soluissa, päättelimme, että se todennäköisesti on voimakas esto VCAP solujen kasvua. Käsittelimme Vcap solujen eri pitoisuuksia Celastrol 24 tuntia ja solujen määrä laskettiin käyttämällä solun laskuri. Kuten odotettua, Vcap solujen kasvua voidaan merkittävästi estää Celastrol annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5A). Koska VCAP solut ilmentävät korkeaa P536 (verrattuna lähes huomaamaton signaalia muilta PCa soluista), ja AR oletamme, että T /E fuusiota ilmentävien VCAP solujen olisi herkin PCa solulinjan Celastrol kohtelustaan ​​LNCaP olisi haavoittumiselle AR ilmaisun ja AR negatiivinen PC3 ja DU145 solujen pitäisi olla suhteellisen tunteeton. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme 0,5pM Celastrol, pienintä tehokasta annosta, joka osoittaa merkittävää vaikutusta AR, ERG ja P536 lauseke (katso

in vitro

data kuvassa. 2B), hoitoon LNCaP, PC3, DU145 ja Vcap soluja 24 tuntia. Under meidän koeolosuhteissa, solu eloonjäämissuhteet ovat 55%, 72%, 83% ja 100% VCAP, LNCaP, PC3 ja DU145 vastaavasti (kuvio. 5B). Nämä tiedot jälleen vahvasti siihen Celastrol voi olla hyvä ehdokas lääke T /E fuusio ilmentävien PCa.

(A) Solut (1 x 10

5) maljattiin 35 mm: n annoksia täydellisessä alustassa ja käsitelty eri pitoisuus Celastrol 24 tuntia. Leviämisen 8 ryhmien Vcap soluja mitattiin käyttäen Coulter-laskimella. Solut trypsinoitiin ja laskettiin kolmena kappaleena. Solujen määrä kussakin ryhmässä on jaettu solujen kokonaismäärästä kontrolliryhmässä ilman Celastrol hoitoa. Koe toistettiin kolme kertaa. Mean +/- keskihajonta on esitetty. Asteriskit osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja Celastrol käsitellyn ryhmän ja valvontaa. (B) 1 x 10

5 VCAP, LNCaP, PC3 ja DU145 oli valottuu 0,5 uM Celastrol 24 tuntia, solujen lukumäärät laskettiin jokaiselle ryhmälle ja jaettuna solumäärät kontrolliryhmissä saamiseksi eloonjääntisuhdetta kantavassa koe toistettiin kolme kertaa. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja eri solulinjojen ja VCAP soluja.

Celastrol voivat estää T /E Fusion ilmaiseminen VCAP Cell Growth in vivo

Näiden

in vitro

tuloksia, muutimme eteenpäin

in vivo

kokeellisesti Celastrol hoitoon VCAP kasvaimia ihonalaisen kasvaimen malli. Viikon kuluttua ihonalaisen 4 x 10

6 lusiferaasia ilmentäviä VCAP soluja nude-hiiriin, Celastrol hoito aloitettiin. Kuusitoista hiiret osoittivat yli 1 x 10

5 luminanssi lukemista viikon kuluttua injektion ja sisällytettiin kokeita varten. Hiiret hoitoryhmässä injisoitiin 0,5 mg /kg Celastrol i.p. Hoito tehtiin 4 kertaa viikossa 3 viikon ajan. Hiiret punnittiin ja lusiferaasin perustuu kasvaimen kuvantamiseen tehtiin viikoittain. Hiiret lopetettiin 24 tuntia viimeisen injektion ja ensisijainen tuumorit leikattiin, punnittiin ja jäädytettiin varten molekyylitutkimukset tai toimitettu histopatologian ja täydellinen ruumiinavaus suoritetaan hiirillä. Ei merkittävästi vähentynyt kehon paino merkittiin (Fig. 6A). Yksi hiiri Celastrol hoitoryhmässä osoitti vatsakalvon tulehdus, mutta mitään merkittäviä toksisuutta havaittiin keuhkoissa, munuaisissa, maksassa, pernassa ja sydän. Havaitsimme, että jotkut kasvaimet alkoivat kutistuu 2 viikon kuluttua Celastrol hoidon ja loppuun mennessä kokeiden neljän hiiret osoittivat luminesenssi pienempi kuin 1 x 10

5. Lusiferaasiaktiivisuus ennen eutanasiaa on esitetty kuviossa. 6A. Oli selvästi tuumorin kasvun Celastrol hoidetussa ryhmässä ja hoidon päättyessä kasvaimen luminesenssin laski -70% (p = 0,048, t-testi) verrattuna kontrolliryhmään. Pystyimme kerätä 5 kasvainten Celastrol hoidetussa ryhmässä ja 7 kasvaimet verrokkiryhmässä. Lopullinen kasvaimen paino hoitoryhmässä oli laskenut vain ~ 10% siitä käsittelemättömissä ryhmässä (P = 0,0034, t-testi). Siten 0,5 mg /kg Celastrol hoito voi merkittävästi inhiboida Vcap kasvaimen kasvua

in vivo

.

(A) Nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti Vcap solut, jotka ilmentävät lusiferaasia. Yhden viikon kuluttua hiiriä hoidettiin 0,5 mg /kg Celastrol tai pelkkää vehikkeliä. Luciferase flux Kasvainten ennen eutanasiaa ja kasvaimen ja kehon painot hoidon lopettamisen näkyvät. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja käsiteltyyn ryhmään ja kontrolliryhmään. (B) esto AR, ERG ja P536 kvantitatiivisella Western blot normalisoidaan P-aktiini. Edustavia Immunoblot VCAP kasvainuutteiden kanssa vasta-aineita AR, ERG tai P536 näkyy. Kussakin western blot, kaistat 1-4 ovat ohjaus kasvaimia ja kaistat 5-8 ovat Celastrol käsitelty kasvaimia. β-aktiini on latauskontrollina. (C) Kudos mikrosiru (TMA) valmistettiin IHC-analyysi näiden hiirten kasvainten talteen. Edustavia näytteitä on esitetty. Kuvien jätti kaksi paneelit ovat kontrollina hiiren kasvain ja kuvien oikeaan kaksi paneelit ovat varten Celastrol käsitellyn hiiren kasvain. H 0,05, t-testi). Siten vähentynyt tuumorin kasvua voidaan katsoa johtuvan lisääntyneen solukuoleman, joka on yhdenmukainen aikaisempien raporttien kanssa [22], [36]. Olemme myös suorittaa anti-CD31 IHC arvioida mikroverisuonitiheys kuin angiogeneesin markkeri. Havaitsimme merkittävää eroa hoidettujen ja hoitamattomien kasvaimia.

Olemme osoittaneet

in vitro

että Celastrol voi kohdistaa AR, ERG ja P536. Siksi pyrittiin määrittämään, jos nämä samat tavoitteet vaikuttivat

in vivo

. Johtuen hyvin pieni kasvain massa kerätään Celastrol hoidetussa ryhmässä (keskimääräinen paino näiden 5 kasvaimet olivat 0,0345 g), meillä olisi vain 4 kasvain näytteiden western analyysiä. Siksi meidän satunnaisesti valitsi 4 kasvaimia kontrolliryhmän vertailla ilmaisua proteiinitasolla. Kuten kuviossa 6B on esitetty, merkittävästi vähentynyt AR, ERG ja P536 ilmentymistä havaittiin Celastrol hoidetussa ryhmässä verrattuna kontrolliin (p 0,05, t-testi). Havaitsimme myös hieman vähentynyt Hsp90 ekspressiota käsitellyt tuumorit, mutta ero ei ollut merkittävä (tietoja ei ole esitetty, p = 0,1, t-testi). Lisäksi olemme havainneet, että Celastrol ei ole vaikutusta koko AKT ilme. Johtuen hyvin rajallinen kasvain massa, emme pystyneet saamaan AR3 ja fosfo-AKT ilmentymistä näissä kasvain näytteissä.

Kaiken kaikkiaan tiedot osoittavat Celastrol voi merkittävästi estää VCAP solujen kasvua

in vivo

kohdistamalla AR-ERG-NF-KB-signaalin ja ehdottaa Celastrol voi olla terapeuttista potentiaalia T /E fuusio kuljettavat PCa.

keskustelu

Huomattavaa edistystä on tapahtunut viime vuosina osalta useampiin alaluokkiin PCa perustuu geneettisten muutosten kasvainsolujen, mukaan lukien kromosomaalisen uudelleenjärjestelyjä, joissa ETS perheen transkriptiotekijöiden tai yliekspressio SPINK1, geenin, joka koodaa eritettyä seriiniproteaasin inhibiittori. On rohkaisevaa, Ateeq et al. edellyttäen tukevat todisteet perustelut kohdistettu SPINK1 vuonna SPINK1

+ /ETS

– kumppanuus- ja osoittaneet, että yhdistetty monoklonaalinen vasta hoidon kohteena sekä SPINK1 ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori voi aiheuttaa enemmän merkittävä väheneminen kasvainmuodostusta kuin joko monoklonaalinen vasta-aine yksinään , joka tarjoaa vahvaa näyttöä täsmähoitoihin varten SPINK1

+ /ETS

– kumppanuus- [37]. Vaikutus Tämän havainnon rajoittaa havainto, että SPINK1 on vain ilmaistu pieni osa kumppanuus- (~ 10%) ja ei näy ETS-tekijä ilmentävien PCa. Suurin osa ETS-positiivisten kumppanuus- kuljettaa T /E fuusiot, jotka ovat läsnä yli puolet kumppanuus-. Niinpä on kiireesti löytää uusia hoitomahdollisuuksia tämän suuren alaryhmässä kumppanuus-. Olemme osoittaneet aiemmin, että kohdentaminen T /E fuusio selostukset käyttävät shRNA voidaan merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

[6], mutta ne eivät poista sitä kokonaan. Olemme myös osoittaneet, että NF-KB signaloinnin kautta fosforylaatio NF-KB p65 Ser536 on erittäin aktivoituu näissä T /E fuusiota ilmentävien PCa soluja ( 90% koko tapaus analysoidaan) ja puuttuminen P536 liittyy pienentynyt biokemiallisia toistuminen [7]. Koska dalmatialaistäpläisiä NF-KB on taudin etenemiseen, nämä havainnot viittaavat siihen, että NF-KB signalointi, erityisesti fosforylaatiota p65 Ser536, on ratkaiseva merkitys tuumorigeneesiä kumppanuus- laakeri T /E fuusioita. Siksi oletamme, että kaksivaiheista henkilökohtainen terapia strategian kohteena sekä T /E fuusio ja NF-KB: n signalointia, joka on samanlainen kuin lähestymistapaa SPINK1

+ /ETS

– kumppanuus- kuten aiemmin [38] , voi olla toteuttamiskelpoinen lähestymistapa tähän alaryhmään Eturauhassyövän, joka harjoittaa T /E fuusio.

tässä tutkimuksessa osoitamme, että Celastrol, tunnettu NF-KB-inhibiittori, voi olla erinomainen ehdokas lääke hoitoon T /E

+ /P536

+ PCa. Celastrol voivat muuntaa useita signalointireittien mukana syöpien ja siksi voi merkittävästi estää syöpäsolujen kasvua [16], [17]. Useita molekyyli tavoitteet Celastrol on tunnistettu myös AKT, Hsp90 ja muut [16], [18], [22], [25], [26], [27], [39]. Osoitamme ensin, että Celastrol on voimakas P536-estäjä sekä

in vitro

ja

in vivo

. Erittäin alhainen pitoisuus 0,05 uM Celastrol hoitoa 2 tuntia merkittävästi vähentynyt P536 ilmentymistä VCAP soluissa. Samoin 0,5 mg /kg Celastrol hoito 4 kertaa /viikko, pienin annos koskaan raportoitu kirjallisuudessa, voidaan merkittävästi pienentää P536 tasot VCAP ksenograftikasvaimissa. Fosforylaatiota p65 on osoitettu monien ryhmien lisäämiseksi p65 transkriptionaalista aktiivisuutta (katso arviot [40] ja [41]), mutta tarkka rooli P536 PCA soluissa erityisesti T /E fuusio ilmentävien solujen on tuntematon ja geenit säädetty erikseen by P536 ole koskaan tutkittu PCA. Tuloksemme osoittavat, että ilmaisua CCL2, tunnettu kohde NF-KB p65 ja voimakas säädin PCA solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä [31], [32], [33], voidaan dramaattisesti inhiboida Celastrol sekä mRNA ja