Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

PI3K /AKT-signalointireitin on poikkeavasti aktiivinen ja sillä on kriittinen rooli solusyklin etenemiseen ihmisen pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma (MME) soluja.

AKT on yksi tärkeä matkapuhelinverkon tavoitteet perifosine, uusi biologisesti saatavilla alkylphospholipid joka on osoittanut merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta in vitro ja in vivo useissa ihmisen kasvaimen mallijärjestelmiin ja parhaillaan testattu kliinisissä kokeissa.

menetelmät

Testasimme Perifosine aktiivisuus ihmisen mesoteelisolujen ja eri mesoteliooma solulinjoja, jotta saadaan näyttöä sen tehosta monoterapialla ja yhdistetyn hoidon.

tulokset

osoitamme tässä, että perifosine, arvioidaan parhaillaan kuin solunsalpaajaksi vaiheen 1 ja 2 kliinisiä kokeita, aiheutti annoksesta riippuvaa vähentäminen AKT aktivoinnin pitoisuuksina aiheuttaa MME solujen kasvun pysähtymistä. Tässä tutkimuksessa ensinnäkin kuvataan, että MME ilmentävät syrjään AKT1 myös AKT3 ja että joko Myristoylated, konstitutiivisesti aktiivinen, muotoja kahden proteiinin, kumotaan perifosine-välitteistä solujen kasvun esto. Lisäksi kuvaamme tässä uutta mekanismia perifosine joka häiritsee, ylävirtaan AKT, vaikuttavat EGFR ja MET fosforylaatio. Lopuksi osoitamme merkittävä kasvu solussa myrkyllinen MME solut käsiteltiin perifosine yhdistelmänä sisplatiinin.

Johtopäätökset

Tutkimus tarjoaa uuden vaikutusmekanismi perifosine, suoraan estämällä EGFR /MET-AKT1 /3 akselia, joka tarjoaa perustelut uusi translaationäkökulmasta hoitoon MME.

Citation: Pinton G, MANENTE AG, Angeli G, Mutti L, Moro L (2012) Perifosine mahdollisena Novel syöpälääkkeen Estää EGFR /MET-AKT akseli pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma. PLoS ONE 7 (5): e36856. doi: 10,1371 /journal.pone.0036856

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 marraskuu 2011; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 10, 2012

Copyright: © 2012 Pinton et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work oli tukee mesoteliooma Applied Research Foundation (MARF myöntää 2009), Fondazione Buzzi Unicem ja vyyttä (Italian mesoteliooma korko Group). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma (MME) on nopeasti tappava syöpä liittyy asbestille altistumisen, joka kasvaa esiintyvyys maailmanlaajuisesti [1], [2]. Koska MME kestää perinteisiin hoitoihin, ennuste näiden potilaiden on huono, joiden eloonjäämismediaani 11-12 kuukauden kuluttua diagnoosista [3], [4] Siksi on olemassa kiireellinen tarve tehokasta terapiaa.

aktivointi useiden reseptorityrosiinikinaasien (RTK: t) on kriittinen solujen lisääntymisen ja /tai eloonjäämistä MME soluja. Joukossa RTK, MET ja EGFR arveltiin olevan kaksi eniten merkittävästi mukana MME lisääntymistä ja /tai eloonjääminen kautta PI3-K /AKT signalointiryöpyn aktivointia. Kuitenkin vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa erlotinibin hoito ei näytä vaikutusta MME, vaikka 96% näytteistä osoitti positiivisen pEGFR [5].

Puute EGFR-mutaatio MME voi olla yksi syy että reagoimattomuus [6]. MET on toinen RTK, joka välittää aktivoinnin useita signalointireittien, kuten fosfoinositidi-3-kinaasin (PI3-K) /AKT ja Ras /mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin laskeutuu [7]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että MET ilmaistiin ja aktivoitu useimmissa MME solulinjojen ja kliinisissä näytteissä [8], [9]. Kuitenkin MET esto aiheutti kasvun pysähtymistä vain pienessä määrässä MME solulinjojen riippumatta usein MET aktivointi [10]. Äskettäin julkaistussa paperi Kawaguchi ym. ehdotti, että esto useita RTK voi toimia kehittää tehokkaampia tavoite potilaille, joilla MME [11].

Kuten muiden syöpien joukossa RTK aktivoitu signaaleja, fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) /AKT-reitin , on keskeisessä asemassa, että solusyklin etenemisen ihmisen MME soluissa [12], [13]. On raportoitu, että esto PI3K johtanut merkittäviin solusyklin pysähtymiseen ja solujen proliferaatio eri MME solulinjojen [14]. PI3K aktivointi johtaa kertymistä fosfatidyyli 3,4,5-trisfosfaatti ja fosfatidyyli 3,4- bifosfaatin [15]. Sitten pleckstrin homologia (PH) domain sisältävät proteiinit kuten PDK1 ja AKT [16], [17], sitoutuvat 3′-OH fosforyloidun fosfatidyylinositoleja läpi tällä alalla. Sitoutuminen johtaa kohdentamista AKT solukalvoon ja tarjoaa suotuisan konformaatiota AKT Thr308 ja Ser473 fosforylaatio [18].

Ensimmäisen sukupolven PI3K inhibiittoreista ovat LY294002 ja wortmanniini, molemmat suunnattu katalyyttiseen keskukseen p110, joka on käytetty tutkimuksen työkaluja selvittää arvo PI3K terapeuttisina tavoite [19]. YK-myönteisen lääke- ominaisuuksien, myrkyllisyyden ja cross-over eston muun lipidejä ja proteiinikinaasien, niitä ei laajalti käytetty kliinisissä tutkimuksissa [20].

Perifosine [octadecyl- (1,1-dimetyyli -piperidinio-4-yyli) -fosfaatti] on synteettinen uusi alkylphospholipid (ALP), uusi kasvaimia torjuvien aineiden luokkana, joka kohdistuu solukalvon aktiivisen jakautuvat solut ja estää PH domain välittämän AKT kalvo rekrytoinnin ja aktivaation. Tärkeää on, perifosine ei koske suoraan aktiivisuuteen PI3K tai fosfoinositidi riippuva kinaasi 1 (PDK1) [21]. Perifosine on osoittanut merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta

in vitro

ja

in vivo

useita ihmisen kasvaimen mallijärjestelmiin ja on parhaillaan testattavana eri kliinisissä kokeissa [22], [23].

nykyinen tutkimus tutkii mahdollisen antituumorivaikutuksen perifosine käyttämällä

in vitro

MME solumalleja käyttäen perifosine joko yksin tai yhdessä perustettu kemoterapeuttisten lääkkeiden. Osoitamme, että perifosine estämällä sekä MET ja EGFR aktivaation jopa läsnäollessa HGF ja EGF vähenee AKT fosforylaatio ja estää solujen lisääntymistä aiheuttamatta apoptoosia MME solulinjoissa. Tässä tutkimuksessa ensinnäkin kuvataan, että MME ilmentävät syrjään AKT1 myös AKT3 ja että perifosine indusoi solujen kasvun esto oli palautettu transfektoimalla sekä Myristoylated-AKTs, konstitutiivisesti lokalisoitu solukalvoon. Lisäksi yhtäaikainen käsittely perifosine merkittävästi lisää sytotoksista vaikutusta sisplatiinin MME soluissa.

Tulokset

Perifosine kohdistuu AKT fosforylaatio ja vaikuttaa MME soluproliferaation indusoimiseksi G2 /M vaiheiden pidättämään

Perifosine on samanlainen rakenne kuin luonnossa esiintyvät fosfolipidit, jotka on kuvattu ensisijaisesti häiritä kalvoja lisääntyvien solujen, kuten kasvainsolujen, Tässä me osoitamme, että 50% Perifosine aiheuttama MME kasvun esto (IC50) 24 tuntia oli 23 uM, 14 uM ja 7,5 uM REN, MSTO211H, ja MMP vastaavasti, kun taas vähäinen toksisuus oli esillä HMC normaaleissa mesoteelisolujen (kuvio 1A). Nämä annokset olivat linjassa saavuttaa plasmassa

in vivo

(kuvattu olevan noin 16 pM). Akt reitti on tavoite anti-proliferatiivista vaikutusta perifosine, joten tutkimme vaikutus tämän lääkkeen fosforylaation asemasta AKT. Kuvio 1B osoittaa, että altistuminen MME solut perifosine 1 tunnin ajan aiheutti annoksesta riippuvainen menetys Ser473 fosforylaation AKT, vaikuttamatta kokonaismäärä proteiinia. Tämä menetys AKT fosforylaatio havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa niiden IC 50 pitoisuutena perifosine. Me valittiin REN soluja edustavan yleisempiä epithelioid kasvaimia, edelleen luonnehtia aikaisin signalointi tapahtumia vaikuttaa perifosine. Vuonna REN soluissa Olemme osoittaneet, että käsittely eri annoksilla perifosine 24 tuntia aiheutti solusyklin pysähtymisen progressiivisen merkittävää kerääntymistä G2 /M-vaihetta (kuvio 2A). Sekä sub-G1 poimia ja lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi ei selvää inkuboitaessa kasvavia annoksia perifosine 24 tuntia, joka osoittaa, että ei kaspaasi-riippuvaisen apoptoottisen solukuoleman tapahtunut (kuvio 2B). Lisäksi vaikutukset perifosine lisääntyi ajan kuluessa hoidon johtavien kaikki solut altistettiin 23 uM kuolemaan 72 tuntia (kuvio 2C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin MSTO211-H-soluja (kuvio S1).

, vaikutus perifosine elinkelpoisuudesta HMC ja kolme erilaista MME solulinjoissa (REN, MSTO211-H: n ja MMP) 24 tunnin kuluttua hoidosta ilmoitettuina pitoisuuksina.

Pisteitä

, keskiarvot ± SD kolmesta erillisestä mittauksia. B, REN, MSTO211-H: n ja MMP-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksia perifosine 1 tunnin ajan. Solut hajotettiin, ja yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, tutkittiin fosfospesifisiä AKT ja uudelleen tutkittiin panAKT vasta-aineita on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät”. Edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

A, REN-soluja käsiteltiin eri annoksilla perifosine 24 tuntia. Käsittelyjen jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla kuvatulla ”Materiaalit ja menetelmät” ja analysoitiin solujen DNA sisällön virtaussytometrialla. Tiedot, jotka ilmoitetaan taulukossa edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3) ja solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin, * p≤0.005, ** p≤0.001. B, REN, soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella perifosine 24 tuntia. Solut hajotettiin, ja yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, tutkittiin erityinen anti-PARP1 vasta-aineen ja tubuliinin samasta loading. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. C, vaikutus perifosine elinkelpoisuudesta REN soluja testattiin 24, 48 ja 72 tuntia hoidon ilmoitettuina pitoisuuksina.

Pisteitä

, keskiarvot ± SD kolmesta erillisestä mittauksia.

konstitutiivinen aktiivinen muoto AKT yli-mukana perifosine esto

AKT koostuu kolmesta läheisesti isoformia: AKT 1, AKT 2 ja AKT 3, joita koodaavat kolme eri geeniä [24]. Koska fosfo-vasta-aine ei eroa kolmen isoformia, tässä tutkimuksessa, AKT 1, AKT 2 ja AKT 3 ilmentymistä tutkittiin REN soluissa. Tiedot esitetään kuviossa 3A ja 3B osoittavat, että REN ​​ilmentävät AKT1 ja AKT3, vaikka AKT2 mRNA ei ole todennettu (samanlaisia ​​tuloksia MSTO211-H solut on esitetty kuvassa S1).

, AKT1, 2, 3 ja aktiini kontrollina mRNA ilmaisun A549 ja REN solut arvioitiin RT-PCR raportoitu in ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. B, AKT1 ja 3-proteiinin ekspressio arvioitiin Western blot analyysi REN solujen isoformin spesifisiä vasta-aineita, tubuliinin blot vahvisti yhtä suuri kuormitus. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. C, REN solut transfektoitiin 1 ug /levy plasmidin koodaavan konstitutiivisen aktivoidun muodon AKT, Myr-AKT1 tai 3. 24 tuntia transfektion jälkeen REN-soluja käsiteltiin 23 uM perifosine 1 tunnin ajan, sitten lyysattiin ja yhtä suuret määrät proteiinien suoritettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella, jossa spesifisiä vasta-aineita fosforyloidun AKT, HA vahvistaa transfektion ja tubuliinin samasta loading. D, vaikutus perifosine soluihin, jotka on transfektoitu Myr- AKT1 tai 3 arvioitiin myös soluproliferaatioon. REN solut transfektoitiin 1 ug /levy plasmidin koodaavan Myr-AKT1 tai 3 ja 24 tuntia transfektion jälkeen käsiteltiin 23 uM perifosine 24 tuntia. Lopussa hoidon elävien solujen määrä määritettiin.

Pisteitä

, keskiarvot ± SD kolmesta erillisestä mittauksia. Perifosine merkittävästi muuttaa AKT kalvo translokaatio, joten seuraavaksi kysytään pakotettu ilmentyminen eksogeenisen Myr-AKT1 tai Myr-AKT3 voisi kumota vaikutuksen perifosine on AKT aktivoimalla fosforylaatioita ja solujen kasvua. Ristiriitaiset tiedot ovat saatavilla kirjallisuudessa, pystytäänkö konstitutiivisesti aktiivisen AKT voittaa perifosine toimintaa. Vaikka eturauhassyövän soluissa estämällä AKT-fosforylaation oleellisesti vähene käyttöön Myr-AKT1, joka ohittaa vaatimus PH domain-välitteisen kalvo rekrytointi, Myelomasoluista se on kuvattu, että perifosine voittaa konstitutiivista erittäin aktiivinen AKT1 [25], [26]. Me transfektoitiin lyhytaikaisesti REN soluja joko HA-koodattu Myr-AKT1 tai Myr-AKT3 ja käsitellään niitä 24 tuntia IC50 annoksen perifosine. Western-blot-analyysi esitetään kuviossa 3C esittää, että transfektio sekä Myr-AKT1 ja Myr-AKT3 voittaa perifosine eston AKT fosforylaation REN soluissa; vain lievää laskua fosforylaation, mikä todennäköisesti johtuu lohkon endogeenisen proteiinien havaittiin. Solujen kasvun analyysi esitetään kuviossa 3D osoitetaan, että molemmat transfektoitu Myr-AKTs pelastettu perifosine indusoi lohko solujen lisääntymisen.

Perifosine vaikuttaa EGFR ja MET signalointi

Perifosine on samanlainen Fosfolipidianalyysia pääainesosat solukalvojen ja muokata kalvo liittyviä signaalitransduktion. Johdonmukaisesti eturauhassyöpäsoluissa perifosine kykeni määrittämään vähentämiseen AKT-vaikutusta, solujen lisääntymisen, ja apoptoosin stimulaation jälkeen 50 ng /ml EGF: ää, vaikka tiedot eivät ole EGFR aktivointi osoitettiin toistaiseksi [27]. Siksi olemme analysoineet jos perifosine voivat häiritä ligandin aktivaation EGFR ja MET immunosaostuksella ja Western-blot kokeissa. Kuten kuviossa 4A ja 4C REN soluissa nälkään, käsiteltiin 1 tunti perifosine (23 uM) ja stimuloitiin sitten 10 minuutin ajan 5 ng /ml EGF tai HGF sekä EGFR ja edellytys eivät fosforyloitiin vaikka läsnä niiden ligandien. Myös EGFR ja MET signalointi merkittävästi vaarantunut; itse asiassa myös kasvutekijän aiheuttamaa AKT fosforylaatio voimakkaasti estyy. Kuten on kuvattu muissa solumalleissa [26], analoginen pitoisuudet perifosine itse aiheuttanut pientä nousua pohjapinta ERK1 /2 fosforylaation, kun taas torjua että aiheuttama kasvutekijöitä. Vaikutus perifosine arvioitiin myös kasvutekijän välittämää solujen lisääntymistä. Kuten kuviossa 4B ja 4D, 23 uM perifosine annetaan 24 tuntia REN solujen EGF: n läsnäollessa tai HGF kumottu kasvutekijän indusoima solujen lisääntymisen. Huomionarvoista samanlainen havaittiin MSTO-211H solulinjassa (kuva S1). Lisäksi perifosine oli tehokkaampi kuin yhden tai yhdistettynä käyttöä EGFR ja MET spesifisiä inhibiittoreita, joko mitattuna solujen elinkelpoisuus kuin AKT aktivoinnin (tuloksia ei ole esitetty).

Perifosine parantaa vastetta MME solujen kemoterapeuttisten aineiden

luonteen määrittämiseksi vuorovaikutukset perifosine ja kemoterapeuttisten aineiden käytetään nykyään MME terapiassa, tutkimme tietoja annos-vaste käyrät isobologram- analyysi. Päätimme arvioida antiproliferatiivisia vaikutuksia käyttäen IC50 yhden lääkkeen vaikutuksia, joiden on määritelty kokeellisesti, käyttämällä tietoja annos-vaste-kokeet lähtökohtana. Perifosine (5-20 uM) ja sisplatiinia (IC50: 100 uM) tai pemetreksedin (IC50: 22 uM) tai gemsitabiinia (IC50: 2 nM) annettiin samanaikaisesti 24 tuntia REN solujen colture. Lopussa inkuboinnin solut trypsinoitiin ja laskettiin. Edustavia isobologrammit kuvassa 5 osoittavat, että yhdistelmä perifosine ja sisplatiinin näkyy voimakas synergistinen sytotoksisuuden REN soluissa useilla eri annoksilla. Lisäksi perifosine osoitti summautuvia yhdessä gemsitabiinin vaikka se tuntui antagonisoinut pemetreksedin. Sinergy sisplatiinin kanssa on myös raportoitu MSTO-211H solulinjassa (kuva S1), vaikka eri herkkyys huumeita havaittiin.

Keskustelu

PI3-K /AKT signalointi on osoitettu olevan ratkaiseva biologinen vaikutus MME solusyklin sääntelyn, anti-apoptoosin ja chemo-vastus. Aktivointi AKT ilmoituksen mukaan Altomare et al., Havaittiin 65% MME yksilöt vaikka geneettisiä muutoksia tuntui olevan harvoin varten PI3-K /AKT aktivaation MME soluissa [12].

Lisäksi fosfo-RTK erilaisia ​​analyysi osoitti, että MME soluissa EGFR perhe, EGFR, ErbB2 tai ErbB3, oli usein yhteistyössä aktivoitu MET, joka ehdotti, että pyynnön ja EGFR perheen aktivaatio voi kompensoida toisiaan jatkuva loppupään signalointi aktivointi [28]. Itse asiassa, kuten on raportoitu useissa tutkimuksissa, vaikka EGFR ja MET olivat erittäin ilmaistaan ​​MME, yhden RTK-estäjien tuodaan vaiheessa II tutkimuksissa eivät olleet riittäviä estämään Mme solujen lisääntymistä, mikä viittaa siihen, että esto useita RTK voi toimia kehittää tehokkaampia kohdistaa potilaille, joilla MME tulevaisuudessa [28].

tarkastelu PI3K /PDK1 /AKT-signalointireitin, koska yhtymispiste kasvutekijän liittyviä vaikutuksia soluproliferaatiota mahdollisena uusi tavoite MME hoito johti siihen, että kokeissa on raportoitu tässä.

Perifosine [octadecyl- (1,1-dimetyyli-piperidinio-4-yyli) -fosfaatti] on synteettinen uusi alkylphospholipid, uuden luokan antituumoriaineita, jotka tavoitteet solukalvot, estää AKT aktivointi, ja indusoi apoptoosia erilaisissa masoluja.

A, B, Eksponentiaalisesti kasvavat REN-soluja esikäsiteltiin 23 uM perifosine 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin 10 minuutin ajan EGF: n (5 ng /ml) tai HGF: n (5 ng /ml). Lopussa kokeen, solulysaatteja valmistettiin tai immunosaostettiin ja ne analysoitiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. Tulokset edustavat kolmea eri kokeissa. B, D, vaikutus perifosine arvioitiin myös kasvutekijän välitteistä proliferaatiota. REN-soluja käsiteltiin 23 uM perifosine 24 tuntia poissa tai läsnä ollessa 5 ng /ml EGF: ää tai HGF. Lopussa hoidon elävien solujen määrä määritettiin.

Pisteitä

, keskiarvot ± SD kolmesta erillisestä mittauksia.

A, B, C, Isobologrammi tontit välistä vuorovaikutusta perifosine ja sisplatiinin tai gemsitabiinin tai pemetreksedin yhdisteitä REN ​​soluissa. Solut (5 x 10

4) maljattiin täydelliseen alustaan ​​ja annettiin tarttua pintaan yön yli. Pinnoituksen väliaine poistettiin ja korvattiin väliaineella, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia perifosine ja IC50 annokset muiden lääkkeiden kanssa. Luonteen määrittämiseksi vuorovaikutuksen perifosine ja cis-platinaa tai gemsitabiini tai pemetreksedin, laskimme eloonjääneiden solujen seuraavat 24 tuntia lääkkeen inkubaation. Diagonaalinen viiva isoeffect linja additiivisuuden. Jokainen piste on keskiarvo määritetään kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Kokeet esitetään tässä paperissa osoittavat, että perifosine, aiheutti eston MME solukasvun (IC

50 7,5 uM 23 pM 24 tuntia) ja solukierron pysähtymisen G2-M vaihe, joka liittyy väheni nopeasti AKT aktivointi, joka arvioidaan Ser473 fosforylaation kvantifiointiin. Koska ensisijaisesti vaikuttamalla membraanirakenne aktiivisten lisääntyvien solujen, perifosine johti vain lievästi myrkyllisiä normaali mesoteelisolujen.

AKT perhe on kolme hyvin homologisia isoformia: AKT 1, AKT 2 ja AKT 3, koodattu kolmen eri geenejä. Kaikki kolme AKT proteiinit sisältävät N-pään pleckstrin homologia (PH) domain, katalyyttinen kinaasidomeeni ja C-terminaali säätelydomaini.

Koska fosfospesifisiä ja anti AKT vasta käytimme ei syrji näiden kolmen isoformia, me syvemmin tutkittiin niiden ilmentyminen meidän soluissa. Olemme ensinnäkin kuvata että MME ilmentävät AKT1 ja AKT3 ja että perifosine häiritsee molempia. Ottaen huomioon kasvaimen kehittymisen mahdollisuuksia AKT-isoformien, lisätutkimuksia on tehtävä niistä MME tarvitaan. Esto AKT fosforylaation ja soluproliferaatiota olivat merkittävästi vähene käyttöön konstitutiivisen aktiivisen Myristoylated AKT1 tai 3, joka ohittaa vaatimus PH domain-välitteisen kalvo rekrytointi, tukee oletusta, että perifosine ei suoraan vaikuta aktiivisuuteen PI3-K tai phosphoinositide- riippuvaisen kinaasin 1 (PDK1). On raportoitu, että perifosine parantaa antituumorivaikutuksen setuksimabin PTEN-puutosta syöpäsoluja ja että yhdistelmähoito parantaa esto fosforylaation AKT: n, p44 /42MAPK ja p38MAPK, mutta offset fosforylaatiota SAPK /JNK, joka oli aktivoitu perifosine hoito yksinään [29]. Lisäksi on kuvattu, että perifosine osoitti synergiavaikutuksen erlotinibin palauttaa tehoa vastaan ​​EGFR: n estäjien PCA [28].

Mikä tärkeintä, kun analysoimme syvemmin vastetta MME solujen EGF ja HGF havaitsimme, että perifosine, luultavasti vaikuttamalla solukalvon rakenteessa tai vaikuttavat reseptorin vuorovaikutuksen tai rekrytointi co-aktivaattoreita, kumotaan vastavirtaan molekyylejä sekä EGFR ja MET-ligandi indusoi fosforylaatiota.

Lopuksi testasimme vaikutukset ja hoidon perifosine ja sisplatiinin tai pemetreksedin tai gemsitabiinin käyttäen isobologram- analyysiä. Osoituksena tuloksemme perifosine selvästi synergized kanssa sisplatiinihoitoon ja aiheutti lisäaineen vaikutus gemsitabiinin.

Yhteenvetona olemme korostaneet AKT, monitoiminen kinaasin, jonka aktivaatio liittyy vastustuskykyä solukuoleman ja kasvaimen kehittymisen, koska tärkeä tavoite perifosine. Olemme osoittaneet tässä, että perifosine estää joko AKT1 kuin AKT3 fosforylaation ja aktivaation soluissa kasvaa eksponentiaalisesti seerumin sisältävässä väliaineessa ja sen jälkeen kasvutekijää stimulaatiota. Tämä jälkimmäinen mekanismit aikaan uudenlainen perusteita harkita perifosine myös usean kohde estäjä, kun taas häiriöitä asianmukaista membraanilokalisaatiota Kohdeproteiinien niiden fosforylaatiota ja aktivaatiota (sijasta suora esto fosfotransferaasigeeni aktiivisuuden kinaasien tiedetään säätelevän AKT) , näyttää olevan vielä tuntematon mekanismi lääkkeen toiminnan paljastamme täällä. Vaikka tehoa yhdistetyn kohtelun sisplatiini ja perifosine on vahvistanut edelleen

in vivo

tutkimuksissa, meidän tulokset osoittavat perifosine niin monen tavoite hoitoa Mme. Enemmän kiinnostavaa, perifosine jo osoitettiin osittaisen vasteen ja stabiili tauti potilailla toisen linjan hoito (julkaisemattomia tuloksia ystävällisesti Keryx Biofarmasian).

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät hoitoja ja transfektio

epithelioid MME johdettu REN solulinjaa, jota käytetään pääasiallisena kokeellinen malli tässä tutkimuksessa oli ystävällisesti toimittanut Dr. SM Albelda (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA), MMP oli vakautunut Pleuraeffuusiot pahanlaatuisia mesoteliooma potilailla [30] ja ensisijainen HMC-tert viljelmiä saatiin potilailta, joilla sydämen vajaatoiminta ja kuolemattomiksi ilmaus ihmisen telomeraasin alayksikköä [31]. Bifaasinen johdettu MSTO-211H solulinja saatiin Istituto Scientifico Tumori (IST) Cell-pankki, Genova, Italia. Soluja viljeltiin vakio-olosuhteissa.

soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin kudosviljelymaljoilla transfektoitiin ohimenevästi pcDNA3 Myr-HA-AKT1 tai pBabe puroL Myr-HA-AKT3 plasmidi koodaa myristilated konstitutiivisesti aktiivisen muodon AKTs alkaen Addgene jonka LipofectAMINE-reagenssia, kuten valmistaja on kuvannut.

Reagenssit ja vasta-aineet

monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä fosfo tyrosiini, fosfo-ERK1 (pThr202 ja pTyr204) ja ERK2: n (pThr185 ja pTyr187) MAP-kinaasien ja fosfo-Akt (pSer473) AKT1 ja AKT3, olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet ovat spesifisiä α-tubuliinin, PARP1, ERK1 /2, panAKT, MET, EGFR ja HA oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-hiiri ja anti-kani-IgG-peroksidaasi konjugoitu vasta-aineet, kasvutekijät ja kemialliset reagenssit olivat yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL oli Amersham Pharmacia Biotech (Upsala, Ruotsi). Nitroselluloosakalvoille ja proteiinin määritys sarjat olivat Bio-Rad (Hercules, CA). Kasvatusaine, seerumit, antibiootteja ja Lipofectamine olivat Invitrogen (Carlsbad, CA). Perifosine markkinoidaan ja ystävällisesti tarjoaa Keryx Biopharmaceutical (New York, NY).

Solulyysis, immunosaostus ja immunoblot

Proteiinit uutettiin ja immunosaostettiin ja SDS-PAGE erottaa, kuten aikaisemmin on kuvattu [32] . SDS-PAGE, proteiinit siirrettiin nitroselluloosalle, saatetaan reagoimaan esitetty spesifisten vasta-aineiden ja sen jälkeen havaitaan piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja kemioluminesoiva ECL reagenssi. Densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen GS 250 Molecular Imager (Bio-Rad).

Solulisääntyminen määritettynä laskemalla suoraan

MME soluja kasvatettiin ja käsiteltiin täydellisessä elatusaineessa, kuten edellä on esitetty, niin oli trypsinoitiin ja värjättiin trypaanisini. Määrä elinkelpoisia soluja, laskettiin Burker-kammiossa.

Cell Cycle Analysis

Cell cycle /apoptoosin analyysit suoritettiin käyttäen propidiumjodidivärjäys myöhempien FACS-analyysi. 5 x 10

5 solua /kuoppa viljeltiin kudosviljelylevyiltä hoitoa tai 24 tuntia. Inkubaation jälkeen, kiinnittyneet solut irrotettiin trypsiinillä (0,5% trypsiiniä /0,1% EDTA: a PBS: ssä). Irrottaa ja keskeyttää solut kerättiin täydellisessä DMEM-alustassa ja sentrifugoitiin 500 g: ssä 10 minuutin ajan. Pelletit pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä 75% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa, käsiteltiin 100 ug /ml RNaasi A, ja sen jälkeen värjättiin 25 ug /ml propidiumjodidia. Sitten he analysoitiin käyttämällä virtaussytometriin FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ja Modfit ohjelmistot (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine).

RNA: n eristys ja RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin REN, MSTO-211H ja A549-solulinjoja jälkeen Trizol-reagenssia (Life Technologies, Inc.) -protokollaa. Laatu ja määrä RNA määritettiin mittaamalla absorbanssi kokonais-RNA: 260 ja 280 nm: ssä. Saadakseen cDNA: ta käytettiin RevertAid cDNA Synthesis Kit Fermentas. Alukkeet Akt isoformin ilmentyminen kuvannut Okano et al. [33] ja syntetisoitiin MWG. Alukkeet olivat: 5′-GCTGGACGATAGCTTGGA-3 ’(Akt1 merkityksessä); 5’-GATGACAGATAGCTGGTG-3 ’(Akt1 antisense); 5’-GGCCCCTGATCAGACTCTA-3 ’(Akt2 merkityksessä); 5’-TCCTCAGTCGTGGAGGAGT-3 ’(Akt2 antisense); 5’-GCAAGTGGACGAGAATAAGTCTC-3 ’(Akt3 merkityksessä); ja 5’-ACAATGGTGGGCTCATGACTTCC-3 ’(Akt3-antisense). p-Actin alukkeet olivat 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ’(sense) ja 5′-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3’ (antisense). RT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 2xPCR Master Mix Fermentakselta mukaan tavanomaisilla menetelmillä. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla. Akt-alukkeet suunniteltiin tuottamaan 383- (Akt1), 276- (Akt2), ja 329- (Akt3) bp tuotteita, vastaavasti.

Tilastollinen ja Isobologrammi analyysi

Tiedot ilmaistaan keskiarvo ± SEM. Erot arvojen saatu solupopulaatio käsiteltiin erilaisissa koeolosuhteissa määritettiin käyttämällä paritonta

t

-testi.

P

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Teoreettinen perusta isobologrammimenetelmällä on kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [34], [35].

Perustuu annosvastekäyriltä sisplatiinin, pemetreksedi ja gemsitabiinin, kolme isobologrammit rakennettiin piirtämällä IC50-arvot yhtenäisen huumeita

y

ja perifosine on

x

akselien suhteen, ja teoreettinen lisäaine annosyhdistelmän laskettiin.

tukeminen Information

Kuva S1 .

Analyysi perifosine vaikutuksia MSTO-211H-soluja. A, vaikutus perifosine elinkelpoisuudesta MSTO-211H-soluja 24, 48 ja 72 tuntia hoidon ilmoitettuina pitoisuuksina.

Pisteitä

, keskiarvot ± SD kolmesta erillisestä mittauksia. B, Eksponentiaalisesti kasvavat MSTO-211H-soluja esikäsiteltiin 20 uM perifosine 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin 10 minuutin ajan EGF: n (5 ng /ml) tai HGF: n (5 ng /ml). Lopussa kokeen, solulysaateista oli valmis ja analysoitiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. Tulokset edustavat kolmea eri kokeissa. C, AKT1, 2 ja 3 ja aktiinin, kontrollina, mRNA: n ekspression MSTO-211H-soluissa arvioitiin RT-PCR: llä, kuten on esitetty ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa. D, Isobologrammi juoni välistä vuorovaikutusta perifosine ja sisplatiini on MSTO-211H soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0036856.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Dott. Peter Sportelli alkaen Keryx Biofarmasian tarjota kliinistä tietoa perifosine saaneilla potilailla.