Krooninen sairaus

tiivistelmä

immuunivaste liittyviä geenejä on merkittävä rooli peräsuolen syövän synnyn välittämällä tulehdus tai immuuni-valvonnan kiertäminen. Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut tutkimaan oleva mekanismi, ymmärrystä monimutkainen syövän synnyn prosessia valtavasti haittaa laajamittainen kasvain heterogeenisyys. Kehitys ja syövän syntymistä osuus silmiinpistävää yhtäläisyyksiä niiden solujen käyttäytymistä ja taustalla molekyylitason mekanismeja. Yhdistyksen välinen alkionkehityksen ja syövän syntymistä tekee alkionkehityksen toteuttamiskelpoinen viitemalli tutkimiseen syövän siten kiertää potentiaalisesti harhaanjohtava monimutkaisuus kasvain heterogeenisyys. Täällä ehdotimme, että immuunijärjestelmän geenit, vastaa sisäistä immuuni yhteistoiminnalla sekavuus (määritelty tässä tutkimuksessa häiriöt kehityshäiriöitä ilmaisun korrelointimalleista aikana syövän synnyn), sisältää todennäköisesti hyödyntämätön ennustetekijöiden resurssi paksusuolisyövän. Tässä tutkimuksessa määritimme mRNA ilmaisun profiilia 137 ihmisen biopsianäytteissä, myös näytteet eri vaiheista ihmisen paksusuolen kehitys, peräsuolen syövän esiasteita etenemistä ja peräsuolen syövän näytteet, joista 60 käytettiin myös tuottamaan miRNA mentymisprofiili. Olemme alun perin perustettu Spearmanin korrelaatio siirtyminen malli määrällisesti yhteistoiminnalla sekavuus siirtymiseen liittyvät normaalista precancerous syövän kudoksen yhdessä miRNA-mRNA sääntelyverkon ja koneoppimisen algoritmia tunnistaa geenien ennusteen arvioinnissa. Lopuksi 12-geeni allekirjoitusta uutettiin, jonka ennusteen arvioinnissa arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier selviytymisen analyysin viiden itsenäisen aineistoja. Käyttämällä log-rank-testi, 12-geeni allekirjoitusta liittyi läheisesti yleiseen eloonjäämiseen neljästä tiedostosta (GSE17536, n = 177,

p

= 0,0054; GSE17537, n = 55,

p

= 0,0039; GSE39582, n = 562,

p

= 0,13; GSE39084, n = 70,

p

= 0,11), ja merkittävästi liittyvät tautivapaan elinajan neljässä aineistot (GSE17536 , n = 177,

p

= 0,0018; GSE17537, n = 55,

p

= 0,016; GSE39582, n = 557,

p

= 4.4e-05; GSE14333, n = 226,

p

= 0,032). Coxin regressioanalyysi vahvisti, että 12-geeni allekirjoitus oli itsenäinen tekijä ennustettaessa peräsuolen syöpä potilaan eloonjäämiseen (riskisuhde: 1,759; 95%: n luottamusväli: 1,126-2,746;

p

= 0,013], sekä tautivapaan elinajan (riskisuhde: 2,116; 95%: n luottamusväli: 1,324-3,380;

p

= 0,002).

Citation: n, Shi X, Zhang Y, Lv N, Feng L, Di X, et al. (2015) Discovery of Novel Immuunijärjestelmän Gene Signature syvästi Prognostiset Arvo peräsuolen syövän a Model of yhteistoiminnalla Disorientation Luotu prosessiteollisuudessa kehitysversiosta Cancer. PLoS ONE 10 (9): e0137171. doi: 10,1371 /journal.pone.0137171

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2015; Accepted: 13 elokuu 2015; Julkaistu : 1. syyskuuta 2015

Copyright: © 2015 An et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

data Saatavuus: raaka ja käsitellyt tiedot on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannan sarjassa hakunumerot GSE71187 (mRNA data ) ja GSE71130 (miRNA data).

Rahoitus: Tätä työtä tuki National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiinassa (SS2014AA020801, https://www.863.gov.cn/) ja Sci Tech Development Program of Beijing (D121100004712002, https://www.bjkw.gov.cn/n8785584/index.html) saamat KZ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä (746000 tapausta, 10,0% kaikista syövistä) ja toinen naisilla (614000 tapauksissa 9,2% kaikista syövistä) maailmassa [1]. Vaikka merkittävää edistystä ymmärtämään sen molekyylimekanismin, CRC edelleen merkittävä syy syövän kuolleisuus [2]. Edelliset tutkimukset ehdotti laajamittainen heterogeenisyys tapahtunut CRC [3-5], samoin kuin monia muita syöpää [6-8]. Kasvain heterogeenisyys kehittyy läpi tapahtumaketju, ohjaavat kloonivalinnalla, jossa perimän epävakaisuuden osaltaan tuottaa monipuolinen solupopulaation, joka edellyttää valintaa mikro-ympäristö- tai terapeuttisessa yhteydessä [9]. Siksi uusi malli, joka jakaa yhtäläisyyksiä syövän kannalta solun käyttäytymiseen ja molekyylien ominaisuuksia, mutta se on luonnostaan ​​enemmän ”järjestäytynyt” on pikaisesti.

Se on ollut yli 150 vuotta sitten Rudolf Virchow ehdotti ensimmäisenä että kasvaimet syntyvät ”noudattaen samaa lakia, joka säätelee alkionkehityksen” vuonna 1858. yhdistyksen välillä alkionkehityksen ja syövän syntymistä on laajasti raportoitu. Lisäksi tietyt keskeiset kehitykseen geenit ovat mukana myös syövän synnyn kautta mutaatiostatuksesta aktivointi [10]. Kautta kehityshäiriöitä eläinmalleissa, molekyylitason mekanismeja syövän on julkistettu ja erilaisia ​​uusia syöpään liittyvien molekyylien polkuja ja biomarkkerit tunnistettu [11-13]. Alkion kehitykseen syövän syntymistä myös jakaa monia muita yhtäläisyyksiä suhteen solujen käyttäytymistä, kuten epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [14], mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtyminen (MET) [15], ja immuuni-valvonnan kiertäminen [16] . Yhdessä nämä havainnot tarjoavat vakuuttavia todisteita siitä, että kasvain voidaan pitää poikkeava elin, joka on hankkinut kapasiteettia toistaiseksi leviämisen kautta kertynyt lakoista [17], ja että molekyylitason tapahtumia, jotka poikkeavat syöpäsolujen normaalin kehitykseen polku, ovat luultavasti vastuussa syövän taudin alkamisen ja etenemisen.

Pairwise geenin ilmentymistä korrelaatiot (käyttäen Pearsonin korrelaatio) käytetään usein määrittämään assosiaatioita geenien transcriptomic tutkimuksissa [18-20]. Pareittain geenien ilmentymisen korrelaatio kehitysvaiheessa ilmentämään fysiologisia lähellä tai kaukana yhteenliittymät geenin geenisäätelyn. Tutkimuksemme osoittaa, että väliset korrelaatiot geenien tietyn funktionaalisen ryhmän (immuunivaste) osoittavat hämmästyttävän kompakti ja synkronoitu malli geenien ilmentymisen, joka takaa tiukka sääntely paksusuolen kehitystä. Tietyn geenin paremmuusjärjestyksessä sen korrelaatio muiden jäsenten tämän geenin ryhmän, joka edustaa biologinen yhdistys topologia, oli todennäköisesti häiriintynyt aikana syövän synnyn (sääntely suhteet olivat vaiheittain siirtynyt fysiologinen patologisia tila). Oletimme, että jos näkee kasvain kuin poikkeava kehittää elin, syyllinen geenit vastaavat häiritsevät eheys koordinoidun geeniekspression korrelaatio malli ja erityisemmin häiritsevät arvojärjestyksen korrelaation malli tämän tietyn geenin ryhmään aikana Karsinogeneesin luultavasti pidä syvällistä ennustetekijöiden tietoa. Määrittelimme tämän käsitteen kuin ”yhteistoiminnalla sekavuus”, ja alun perin rakennettu Spearman siirtyminen malli määrällisesti yhteistoiminnalla sekavuus, joka syntyy aikana etenemistä paksusuolen kehityksen precancerous etenemisessä syöväksi, eikä vain keskittyä differentiaalisesti ilmentyvien geenien erityisiä fenotyyppejä.

MikroRNA (miRNA) ovat luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, ~ 22 nt, jotka säätelevät geenien ilmentymistä sitoutumalla 3′-transloimaton alue (3′-UTR) kohdegeenien johtaa hajoamista tai proteiiniin käännös esto kohdegeenien [21]. MiRNA ennustetaan säädellä yli 60% kaikista proteiinia koodaavan geenien nisäkkäillä [22], jolloin säädellään lähes jokainen solu prosessi [23, 24]. Oletimme, että miRNA keskeisessä asemassa CRC elossaololuku ja että loppupään tavoitteet Näiden miRNA voi olla ennusteen arvioinnissa; Strategian hyväksyi myös Yang et al. [25], jotka osoittivat, että ilmentyminen 219 miRNA liittyvien geenien liittyi mesenkymaalisten alatyypin vakavasta munasarjasyöpä liittyy huono yleistä (OS) [25].

Vaikka suhde yhteistoiminnalla sekavuus, alkion kehittäminen ja syövän synty on edelleen epäselvää, on todennäköistä, että tietyt miRNA geenien, joka tärkeitä rooleja kehitysvaiheessa ja edistää yhteistoiminnalla sekavuus aikana karsinogeneesin voisi olla huomattavia vaikutuksia syövän muutosta. Nämä geenit voidaan lupaavien ennustetekijöiden biomarkkereita.

Tässä tutkimuksessa keskityimme immuunivasteeseen liittyvien geenien. Immuunivastetta ja erityisesti, tulehdus, on syvällinen vaikutus karsinogeneesin, joka voi joko tappaa kasvainsoluja, tai, tietyissä olosuhteissa, voidaan ottaa käyttöön helpottamaan karsinogeneesi [26]. Tärkeys immuunivasteen karsinogeneesis- sai meidät määrittämään prognostisia biomarkkereita CRC. Meillä on ensimmäinen tutkimus tutkia erilaisia ​​näytteitä, ihmisen paksusuolen alkionkehityksen, peräsuolen precancerous eteneminen, CRC näytteitä, jotta simuloida kehityskaari ihmisen paksusuolen kehityksen ja syövän syntymistä. Spearman siirtyminen mallin ehdotimme täällä on ensimmäinen askel tunnistamisessa syyllinen geenit [ilmennetty eri geenit (DEGS) uuteen tulkintaan perusteella ilmaisun korrelaation malli] vastaa häiritä järjestetty korrelaation malli keskuudessa immuuni liittyviä geenejä aikana syövän synnyn. Käyttämällä microarray teknologian ja bioinformatiikan analyysit tunnistimme 12-geenin allekirjoitus merkittäviä ennusteen arvioinnissa, jotka voivat olla kliinisesti merkityksellisiä tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Kaavamainen tutkimusta varten on kuvattu kuvio 1.

CRC

peräsuolen syöpä,

DVIG

kehitystä vaihtelevassa immuuni geeni,

OS

kokonaiselinaika,

DFS

taudista elinaika.

Potilaat ja näytteet

periaatteiden mukaisesti ruuansulatuskanavan kehitysbiologian [27], paksusuolen näytettä otettiin 20 abortin tapauksissa emolle Child Health Care Hospital of Hai Dian vuosina 2007 ja 2009. näytteet ovat koko alkioiden (WE) at kolme-viisi postovulatory viikkoa (PWS), varhainen alkion kaksoispisteitä (ETY) kahdeksasta kymmeneen PWS ja keskimmäinen alkion kaksoispisteitä (MEC) 14 22 PWS. 10 minuutin kuluessa abortin, kudokset huuhdottiin normaalilla suolaliuoksella, ja koko alkioiden tai alkioiden kaksoispisteet huolellisesti erotettu sikiön kudoksiin opastuksella Nikon stereo mikroskooppi SMZ1500 (Japani). Alkiot /sikiöitä, joilla tiedetään tai epäillään olevan geneettisiä häiriöitä jätettiin.

Normaali peräsuolen limakalvon kerättiin potilailta peräpukamat, jotka saivat kirurginen osastolla Colon ja Peräsuolen Surgery of Beijing Shi Ji Tan sairaalan välillä 2009 ja 2010 . viisikymmentäkaksi CRC näytteiden käyttöjärjestelmän tiedot saatiin aikana poistettu kirurgisella alkaen Zhe Jiang University School of Medicine. Kolonoskopia biopsianäytteissä, mukaan lukien peräsuolen ja -adenokarsinoomien saatiin Department of Endoscopy, Cancer Hospital, Kiina Academy of Medical Sciences, vuodesta 2008 vuoteen 2011. Potilaat historiaan familiaalinen adenomatoottisen polypoosin, perinnöllinen ei-polypoosin CRC, tai tulehduksellinen suolistosairaus suljettiin pois. Adenooma määritellään dysplasia, karsinooma in situ, epäily invasiivisia karsinooma ja intramucosal karsinooma; adenokarsinooma määritellään limakalvon alaista hyökkäystä adenokarsinooma [28]. Neljästä kuuteen alueet leikattiin peräsuolen neoplasian näytteissä, mukaan lukien reunat ja keskustan leesion mukaan ASGE ohjeen [29]. Kudosnäytteet kaikki snap-jäädytettiin nestetypessä heti biopsia tai leikkauksen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Osa kaikkien näytteiden tehtiin patologinen analyysi suoritettiin kaksi riippumatonta, sokaisi ja kokenut patologian. Näytteitä tyytyväisiä diagnostiset kriteerit normaalin limakalvon ja neoplasia (neoplastiset solut 70%) oli mukana. Jos useampi kuin yksi biopsia otettiin näyte samasta potilaasta, nämä näytteet yhdistettiin. Kaikki avunantajat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen muotoja. Käyttää ihmisen kudosnäytteitä ja kokeellisia toimenpiteitä tätä tutkimusta varten tarkastettava ja hyväksyttävä eettisen komitean Cancer Institute ja sairaalan, Kiina Academy of Medical Sciences.

RNA: n eristys

Yhteensä-RNA uutettiin jäädytetty kudoksista käyttäen TRIzol RNA: n eristys reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA eheys arvioitiin käyttäen 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Jos RNA: n eheys määrä oli ≥ 5, kokonais-RNA puhdistettiin edelleen käyttäen RNeasy Mini Kit (Cat No.74106, Qiagen, Saksa). RNA-pitoisuudet määritettiin kanssa NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA).

Microarray ilmentymisen profiloinnin ja tietojen normalisointi

Kun histopatologisissa ja RNA eheys analyysi, kaikki näytteet olivat analysoitiin Agilent mikrosiruja. Biopsianäytteissä lukien 6 WE, 6 ETY 8 MEC, 12 normaali, 58 adenooma ja 47 adenokarsinooman näytteitä käytettiin mRNA mikrosiruanalyysillä; Näiden 60 näytettä (2 WE, 6 ETY 8 MEC, 11 normaali, 9 adenooma ja 24 adenokarsinooman näytettä) käytettiin myös miRNA mikrosiruanalyysillä. Puhdistettu kokonais-RNA-näytteet leimattiin ja hybridisoitiin Agilent 4 x 44K kaikkiaan Human Genome Oligo mikrosirut (G4112F) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä miRNA paneelit, kokonais-RNA analysoitiin Agilent 8 x 15K Human miRNA Microarray V3 (G4470C).

mRNA ja miRNA microarray raakadataa normalisoitiin käyttämällä GeneSpring GX-ohjelmiston, versio 11,5 (Silicon Genetics, Redwood City, CA, USA). Sillä mRNA ekspressiotietojen, yhteensä 41091 single-koettimet saatiin mukaan GeneSpring n oletusasetukset. Ilmaisu arvo tietyn geenin määritettiin mediaani kaikkien koettimien kartoitus tätä geeniä. Lopulta, ilmaisu arvot 18986 geenien saatiin. Mitattu miRNA katsottiin, jos niiden signaali voitiin havaita vähintään 50% näytteistä kunkin näytteen tyypistä. Ilmaisu profiilit hankittiin 96 miRNA. Raaka ja käsitellyt tiedot on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannan sarjassa hakunumerot GSE71187 (mRNA data) ja GSE71130 (miRNA data).

Affymetrix microarray tiedonkeruu, esikäsittely, ja normalisointi

raakadataa viisi paksu- ja peräsuolisyövän mRNA microarray tutkimuksia (taulukko 1) on ladattu GEO. Yhdistetty data setti sisälsi 1094 näytettä oli käsitelty Affymetrix HG-U133A Plus2 (GPL570) taulukot, jotka sisältävät 52475 antureista. Normalisoitu ilme arvot saatiin kautta vankka multi-array keskiarvo (RMA) algoritmin ja edelleen quantile normalisoidaan käyttäen ”affy” Bioconductor paketti. Combat algoritmia käytettiin poistaa mahdolliset erä vaikutusten kanssa Bioconductor paketti ”inSilicoMerging”. Ilmentymistasojen 20184 geenien saatiin mediaani kaikkien koettimien kartoituksen tietyn geenin. Kaikki kliiniset tiedot uutettiin alkuperäisestä julkaisuista. Näistä viisi aineistoja, GSE17536, GSE17537 ja GSE39582 sisältävät sekä OS ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS) tiedot. GSE39084 sisältää käyttöjärjestelmän tietoja vain, kun GSE14333 sisältää DFS tietoja vain.

tunnistaminen ”kehityksen vaihteleva immuuni liittyvät geenit” (DVIGs) B

WE, ETY, MEC ja normaali näytteitä edustettuina näytteitä eri vaiheissa ihmisen paksusuolen kehitystä; adenoomia pidettiin syövän esiasteita; ja adenokarsinoomat edusti syövän vaiheessa. Geenit joka putosi alle Gene ontologia (https://www.geneontology.org) termi GO: 0006955 pidettiin immuunivastetta liittyviä geenejä; Tämä johti 1028 geenejä, joista 972 oli läsnä meidän mRNA microarray data. ANOVA käytetään hakea 665 DVIGs jotka ilmentyvät eri aikana kehitysvaiheessa (FDR 0,0001).

perustaminen Spearman siirtymisen mallin

Yksityiskohtainen kuvaus Spearman siirtymisen mallia on esitetty S1 Methods.

rakentaminen miRNA-mRNA sääntelyverkon

miRNA-mRNA sääntelyverkon luotiin perustuen sekvenssiin algoritmeja (Miranda [30], TargetScan [31], PicTar [32] ) ja mikrosirujen tiedot (60 biopsianäytteissä sekä miRNA ja mRNA microarray data). MiRNA-mRNA sääntelyyn paria pidettiin kiinteitä vain, jos ne täyttivät vähintään kaksi sekvenssin algoritmeja ja jos niiden ekspressiotasot olivat merkittävästi ja käänteisesti verrannollisia (FDR 0,01).

perustaminen CRC geeni allekirjoituksen käyttäen koneoppimisen sovellettu mRNA ilmaisun profiileja ensisijainen kliinisistä näytteistä

Niistä 52 kirurgisesti poistettu CRC näytteitä, valitsimme 19 ja 22 silloin, kun potilaat elivät pidempään ( ”Good ryhmä”) tai lyhyemmän ( ”Poor ryhmä”) yli viiden vuoden kuluttua ( leikkauksen jälkeen) kouluttaa satunnainen metsien koneoppimista malli. Lyhyesti, geenit tilaamat keskimääräinen lasku Gini (MDG) kriteeri, jossa geenejä paremmuusjärjestykseen niiden taso vaikutusta suorituskykyyn satunnainen metsien luokittelua; lähteä ulos cross validointi (LOOCV) arvioida ”Poor äänestäminen” osuus koetinkivi, jota käsitellään edelleen ennustin vastaanotin toimii (ROC) testi. Geenit sitten rekursiivisesti eliminoitu perustuu alkuperäiseen geeni sijoitusta, kunnes pinta-ala ROC-käyrän (AUC) optimoitiin. Tämä algoritmi on selvästi kuvattu edellisessä tutkimuksen AUC-RF-algoritmi [33].

Kaplan-Meier selviytymisen analyysin ja Coxin regressioanalyysi

Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin käyttäen geenit mielenkiintoa kaikissa ladata Affymetrix aineisto. Ensimmäinen pääkomponentti (PC1) kaappaa suurimman määrän koko varianssi profiilit ja laskettiin kullekin potilaalle. Potilaat jaettiin sitten kahteen ryhmään samankokoiseen perustuu arvojärjestyksen PC1 koko niiden kasvain profiileja. Kaplan-Meier selviytymisen analyysin ja log-rank-testiä käytettiin arvioimaan ennustetekijöitä ero kahden PC1 sidota ryhmät [12]. Coxin suhteellisten riskien regressiomallia käytettiin arvioimaan riippumattomuutta ennustetekijöiden vaiheittain. Näytteet yhdistetyssä Affymetrix aineisto (1094 näytettä) täydelliset tiedot iän, sukupuolen, American sekakomitean Cancer (AJCC) (vaihe), patologinen laatu (laatu) ja selviytymisen tietoja käytettiin (213 näytettä OS Cox analyysiä ja 213 näytteitä DFS Cox analyysi), ja arvo

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Gene allekirjoituksen validointi käyttämällä satunnaisia ​​geeniä näytteenotto

Strategiamme oli valita pieni geeni allekirjoitus merkittäviä ennusteen arvioinnissa supistaen kiinnostavia geenejä vaiheittain. Sen todistamiseksi, että tämä menetelmä todella ennustaa selviytymisen lopputulokseen, n-geeni (jos lopullinen geeni allekirjoitus sisältää n geenejä) satunnaisia ​​näytteitä tehtiin 2000 kertaa molempiin geenipoolissa. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin satunnaisesti valittu n geenejä, ja monta kertaa satunnaisesti valitun geenit voivat samanaikaisesti erottamaan kaikki tavoite selviytymisen aineistot tallennettiin.

TILASTOANALYYSI

Kaikki tilastolliset analyysit toteutettiin käyttäen R projektin ohjelmisto (versio 2.15.1), ja Bioconductor (versio 2.11). R paketteja ”randomForest” (Version 4,6-7) [34] ja ”proc” (versio 1.7.1) [35] oli käytetty AUC-RF malli. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien saatiin käyttämällä R paketti ”alosporaani-”. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin käyttäen R paketti ”survival”. Bioconductor merkintä paketti ”org.Hs.eg.db” (versio 2.8.0) käytettiin hakemaan immuuni liittyviä geenejä [36]. Kartoitukset välillä Affymetrix antureista ja Entrez geenin tunnisteet tehtiin käyttämällä Bioconductor paketti ”hgu133plus2.db”. Meta-analyysi tehtiin R paketti ”meta”, ja metsien tontteja tehtiin käyttämällä R paketti ”rmeta”. Verkko visualisointi suoritettiin Cytoscape (versio 3.2.0) [37].

Tulokset

Genes ilmentyvät eri normaalin ja CRC kudos merkittävästi rikastettu varten Reactome termi ”signalointia immuunijärjestelmää”

Differentially ilmaistuna geenejä (DEGS) välillä normaalin ja CRC kudokset tunnistettiin käyttämällä SAM-algoritmia (FDR 1e-07). DEGS mukana 3226 ja 2538 merkittävästi ylä- ja vaimentua geenien CRC. Käyttämällä Reactome rikastamiseen analyysi, suoritettiin DAVID Bioinformatics Resources 6,7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/), huomasimme, että Reactome termi ”signalointia immuunijärjestelmää” oli merkittävästi rikastettu CRC (Bonferronin-oikaistu

p

arvo = 0,004), mikä viittaa merkitsevästi yhteydessä syövän synnyn ja immuuni liittyvien geenien (S1 taulukko).

Pearson korrelaatio Heatmaps

Pairwise Pearson korrelaatiot joukossa 665 DVIGs laskettiin ja muuttaa siten bias (oikaistu menetelmää kuvattiin S1 menetelmät). Pearsonin korrelaatio lämpökarttoja (665 x 665) rakennettiin paksusuolen näytteiden aikana paksusuolen kehitystä (kuvio 2A), eteneminen (kuvio 2B) ja syöpä (kuvio 2C) vaiheissa. Aikana kehitysvaiheessa, kolme erillistä klustereita saatiin. Selvät klusterit eivät kuitenkaan ole selvää etenemisen aikana ja syövän vaiheissa. Päällekkäin kolme Pearsonin korrelaatio tiheyden käyrät (kuvio 2D), selkeä bimodaalis- nähtiin kehitysvaiheessa, toisin kuin yksihuippuisia jakaumat etenemisen ja syövän vaiheissa. Lisäksi syövän vaihe oli korkeampi maksimi tiheys Pearsonin korrelaatio on nolla verrattuna etenemisen tai kehitysvaiheisiin.

Heatmaps oikaistun Pearson korrelaatioita 665 DVIGs (A) kehittäminen, (B) precancerous etenemistä ja (C) syöpä, vastaavasti. Geenit koottiin kolmeen klustereita (korostettu eri väriä) mukaan UCA. (D) tiheys tontti pairwise oikaistun Pearson korrelaatioita kaikissa kolmessa vaiheessa. Käyrän kehitysvaihe on bimodaalis-, mutta unimodaalisesta varten etenemisessä ja syövän vaiheissa. Jotta tehdä sisäisen immuuni vektorit vertailukelpoisia, geenit järjestetään uudelleen etenemisessä ja syövän vaiheessa lämpökarttoja vastaamaan järjestystä kehitysvaiheessa heatmap, tuottaa (E) järjestetty uudelleen etenemiseen heatmap ja (F) tilattava syöpä lämpökartta.

DVIG

, kehitys vaihtelee immuuni geeni;

UCA

, valvomattoman klusterointialgoritmi.

”Kuuliaisia ​​geenit” erotettiin suodattamalla käyttäen Spearman siirtymisen mallia

Pearsonin korrelaatio lämpökarttoja of DVIGs etenemisen aikana ja syövän vaiheissa olivat järjestetään uudelleen tehdä kaikki kolme vaihetta (kuvio 2E ja 2F, kuvattu S1 menetelmät). Kuten on esitetty kuviossa 3A, 665 DVIGs oli projisoitu Spearman siirtymisen koordinaatistossa, jossa Spearman siirtymistä kehittymistä ja etenemistä (STD-P, S1 menetelmät) välillä etenemistä ja syövän (STP-C, S1 menetelmät), kuten x- ja y-akseli koordinaatit, tässä järjestyksessä. Geenejä väritetty samalla tavalla kuin kehityshäiriöitä heatmap klusterointi kuvassa 2A. Niistä 665 DVIGs, 385 (kutsutaan ”kuuliaisia ​​geenit”) kuului neljänneksen ympyrän kaari ja loput 280 (kutsutaan ”muualle geenit”) ei kuulunut tämän kaaren ja käytettiin ehdokkaiksi loppupään valintamenettelyä.

(EN) 665 DVIGs oli projisoitu Spearmanin korrelaatio siirtyminen koordinaatisto perustuu niiden yhteistoiminnalla sekavuus välillä peräkkäistä vaihetta. Geenejä väritetty samalla tavalla kuin kehittämiseen lämpökartta. (B) AUC-RF-algoritmia käytettiin geenin allekirjoituksen optimointi. Geenejä rekursiivisesti poistettiin tärkeysluokitusta tilata geeni luettelossa, kunnes suurin AUC-arvo saavutettiin. (C) suurin AUC 0,904 (95%

CI

: 0,799 ~ 1,000) saatiin, kun joukko geenejä vähenivät 12, jossa on 81,8% herkkyys (95%

CI

: 0,636-0,955) ja 89,5% spesifisyys (95%

CI

: 0,737-1,000).

Dev

, kehittäminen;

Ohj

, etenemisen;

TPS

teoriassa vakaa kohta;

AUC

, pinta-ala käyrän;

DVIG

, kehitys vaihtelee immuuni geeni;

CI

, luottamusväli.

Siirto geenejä yhden tai useamman miRNA sääntelyviranomaiset jäi geenipooli

Käyttämällä pariksi mRNA ja miRNA tietoja, jotka olivat käytettävissä 60 CRC biopsianäytteissä rakensimme miRNA-mRNA sääntelyverkon valita kulkeutumisen geenejä, joilla oli ainakin yksi miRNA säädin (S1 Methods). Tämä johti 59 kulkeutumisen geenejä, jotka mahdollisesti säätelee 37 miRNA (kuvio 4, S2 taulukko).

Tummankeltainen solmut edustavat miRNA. Punainen ja safiiri solmut edustavat mRNA: ita, joista punaisia ​​ovat geenien 12-geenin allekirjoitus. Ohjaus kiinteät reunat edustavat miRNA-mRNA sääntelyä.

Gene allekirjoitus optimointia AUC-RF-algoritmi

59 ohjautumisesta geenit edelleen kaventunut nämä 59 geenien saamiseksi osajoukko geenien tarjota paras ennustetekijöiden suorituskykyä. Nämä geenit ensin määräsi niiden merkitys erotteleva tapauksissa OS (pidempi tai lyhyempi kuin 5 vuotta) käyttäen satunnainen metsä algoritmi; geenit sitten rekursiivisesti eliminoitu alareunassa tämän listan kunnes pinta-ala ROC-käyrän (AUC) optimoitiin (AUC = 0,904, 95%

CI

: 0,799-1,000, kuvio 3B). Tämä johti optimoitu 12-geenin allekirjoitus, joka oli 81,8% herkkyys (95%

CI

: 0,636-0,955) ja 89,5% spesifisyys (95%

CI

: 0,737-1,000) in erotteleva huono hyvästä OS 52 leikkaus näytteitä ”Poor” äänestäminen osuus 0,560 (kuvio 3C). Tämä 12-geeni allekirjoitus koostuu

AXL

,

Bcl3

,

COLEC12

,

ABR

,

PXDN

,

EP300

,

JAM3

,

MAP3K1

,

CASP8

,

RPS6KA1

,

Chuk

, ja

RPS6KA2

, ja säätelee 16 miRNA (kuvio 4).

Kaplan-Meier selviytymisen ja Coxin regressioanalyysi vahvisti 12-geenin allekirjoitus

Kaplan-Meier selviytymisen analyysi oli arvioitiin ennusteen arvioinnissa 12-geenin allekirjoitus viidessä Affymetrix aineistoja haetaan GEO tietokannasta. Log-rank testitulokset vahvistivat, että 12-geeni allekirjoitusta liittyi läheisesti OS neljästä tiedostosta (kuvio 5A, GSE17536, n = 177,

p

= 0,0054; GSE17537, n = 55,

p

= 0,0039; GSE39582, n = 562,

p

= 0,13; GSE39084, n = 70,

p

= 0,11). Lisäksi tämä 12-geenin allekirjoitusta merkitsevästi yhteydessä DFS neljästä tiedostosta (kuvio 5B, GSE17536, n = 177,

p

= 0,0018; GSE17537, n = 55,

p

= 0,016 ; GSE39582, n = 557,

p

= 4.4e-05; GSE14333, n = 226,

p

= 0,032). Coxin regressioanalyysi vahvisti myös, että 12-geeni allekirjoitus oli itsenäinen tekijä ennustettaessa CRC potilaan OS [Taulukko 2; riskisuhde (

HR

): 1,759; 95%

CI

: 1,126-2,746;

p

= 0,013], sekä DFS (taulukko 2;

HR

: 2.116; 95%

CI

: 1,324-3,380;

p

= 0,002). Meta-analyysi arvioitiin korrelaation jokaisen 12 geenien ja (OS: GSE17536, GSE17537, GSE39582 ja GSE39084 ja DFS: GSE17536, GSE17537, GSE39582 ja GSE14333) CRC potilailla, joilla kiinteän vaikutuksen mallia (kuvio 6A ) ja random-vaikutus mallin (kuvio 6B).

Kaplan-Meier selviytymisen analyysit ja log-rank kokeita arvioimaan ennusteen arvioinnissa 12-geenin allekirjoitus. (A) suorituskyky 12-geenin allekirjoituksen OS syrjintään. Aineistoja OS tiedot olivat GSE17536, GSE17537, GSE39582 ja GSE39084. (B) suorituskyky 12-geenin allekirjoituksen DFS syrjintään. Aineistoja DFS tiedot olivat GSE17536, GSE17537, GSE39582 ja GSE14333.

OS

, kokonaiseloonjääminen;

DFS

, tautivapaan elinajan.

(A) Forest juoni yhdistyksen yksittäisten geenien ja OS määräaikaisessa vaikutus malli aineistot, jotka sisältävät käyttöjärjestelmän tiedot (GSE17536, GSE17537 , GSE39582 ja GSE39084). Meta-analyysi näistä 12 geenien neljä itsenäistä aineistoja tehtiin, ja

HR

, 95%

CI

kunkin geenin ja vastaavan

p

arvo laskettiin ja piirrettiin metsä juoni. (B) Forest juoni yhdistyksen yksittäisten geenien ja DFS satunnainen vaikutus mallia neljästä tiedostosta, joka sisältää DFS tiedot (GSE17536, GSE17537, GSE39582 ja GSE14333).

CRC

, peräsuolen syöpä;

HR

, riskisuhde;

CI

; luottamusväli;

OS

, kokonaiseloonjääminen;

DFS

, tautivapaan elinajan.

Random geeni näytteenotto todentaa pätevyyttä menetelmämme

Vahvista pätevyyden meidän allekirjoitus valintaprosessin 12-geenin paneeli satunnaisesti näytteitä 2000 kertaa yli 972 immuuni liittyviä geenejä, 665 DVIGs, 280 kulkeutumisen geenejä ja 59 miRNA-geenien, vastaavasti. Niiden kertojen määrä, jotka satunnaisesti valitun 12-geenin paneeli voisi samanaikaisesti syrjiä selviytymisen aineistot (OS ja DFS GSE17536 ja GSE17537, DFS GSE39582 ja GSE14333), oli 0, 0, 9 ja 33 edellä mainittujen neljän geenin ryhmään, vastaavasti , joka tarjoaa vahvaa näyttöä pätevyyden hypoteesia ja geenin allekirjoituksen valinta putki (Kuva 7A).

(A) Bar käyrä, kuinka monta kertaa, että 12 satunnaisesti valittua geenit voivat samanaikaisesti erottamaan neljä eloonjäämisen aineistot (OS ja DFS GES17536 ja GSE17537, DFS GSE39582 ja GSE14333). (B) Heatmap 137 koepalojen perustettu mRNA ilmaisun profiilin 12-geenin allekirjoitus. MRNA raakadataa normalisoituivat ja sitten suodatetaan (katso ”Materiaalit ja menetelmät”). Rivit edustavat geenejä, ja pylväät edustavat biopsianäytteissä. Rivit, pikemminkin kuin pylväät, jotka järjestetään uudelleen käyttäen UCA, kun taas näytteet samaa tyyppiä pantiin yhteen.

DVIG

, kehitys vaihtelee immuuni geeni;

UCA

, valvomatta klusterointialgoritmi;

OS

, kokonaiseloonjääminen;

DFS

, tautivapaan elinajan.

Keskustelu

Läheinen välinen alkionkehityksen ja syövän syntymistä tekee alkionkehityksen toteuttamiskelpoinen viitemallina tutkia syöpään, kiertämiseksi mahdollisesti harhaanjohtava monimutkaisuus liittyy kasvaimen heterogeenisuus.