Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin (AR) signalointireitin edelleen tärkein tavoite uusien terapeuttisten kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) . Ilmaisulla konstitutiivisesti aktiivisen AR-variantit, joista puuttuu karboksipään alue CRPC voi johtaa hoidon tehottomuuteen. Nämä AR variantit on tarkoitus tukea PCa solujen kasvua androgeeni-tyhjentynyt ympäristössä, mutta niiden vaikutustapa on vielä ratkaisematta. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit ilmentyvät ensisijaisesti eturauhasen kasvaimia ja saattaa edistää syövän etenemiseen. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutusta konstitutiivisesti aktiivinen AR varianttien ilmenemistä syövän etenemisen markkereita. N-kadheriiniekspressiota analysoitiin LNCaP yliekspressoivat villityypin AR tai konstitutiivisesti aktiivinen AR variantti by qRT-PCR, Western blot ja immunofluoresenssimenetelmällä. Osoitimme täällä ensimmäistä kertaa, että N-kadheriinin ekspressio lisääntyi läsnäollessa konstitutiivisesti aktiivisen AR variantteja. Nämä tulokset vahvistettiin vuonna C4-2B yliekspressoiviin soluihin näiden AR variantteja. Vaikka N-kadheriinin ilmentyminen liittyy usein downregulation E-kadheriinin, tämä ilmiö ei havaittu mallimme. Kuitenkin, sen lisäksi, että lisääntyneen ekspression N-kadheriinin, säätelyyn ylöspäin muiden mesenkymaalisten merkkiaineiden ilmentymisen, kuten

vimentiinin, SNAIL

ja

ZEB1

havaittiin, kun läsnä oli konstitutiivisesti aktiiviset variantit. Lopuksi todettakoon, että havainnot korostavat uudenlaisia ​​seurauksia konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit sääntelystä mesenkymaalisten merkkiaineiden eturauhassyövän.

Citation: COTTARD F, Asmane I, Erdmann E, Bergerat JP, Kurtz JE, Céraline J (2013 ) aktiivisessa muodossa olevaa androgeenireseptorin vaihtoehdot upregulate ilmentäminen mesenkyymikasvaimia Markers eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (5): e63466. doi: 10,1371 /journal.pone.0063466

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2013 Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: 02 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 COTTARD et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Strasbourgin yliopiston; Ligue Contre le Cancer, Alsace Contre le Cancer; ja Association pour la Recherche sur les Tumeurs Prostatiques (ARTP). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä miehillä yli 50-vuotiailla ja toinen syy miesten kuolleisuus johtuu syövästä Euroopassa. Androgeenit signalointi on keskeinen rooli PCA soluissa leviämiseen tai säilymiseen [1], ja androgeenin peruuttaminen edelleen tärkein hoito paikallisen uusiutumisen ja androgeeniriippuvaisen metastasoitunut PCa. Kuitenkin hyötyä tästä hoito on ohimenevä ja kaikki kasvaimet lopulta toistu kuten kastraatio kestävä PCa (CRPC).

Genetic ja silmukointitapahtumilla vaikuttavat androgeenireseptorin (AR) geeni on yhdistetty CRPC. Konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit, joilta puuttuu karboksipään alue, joka käsittää ligandia sitovan domeenin ja aktivaatiofunktio 2, voi edistää etenemistä PCa osaksi kastraation vastus. Nämä konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja aiheutua ennenaikainen lopetuskodonia johtuen nonsensemutaatiota kuin raportoitu ARQ640X [2], [3], [4], [5] tai vaihtoehtoisen silmukoinnin säilyttämisen kanssa arvoituksellisen eksoni sekvenssi on kuvattu AR -V7 [4], [6], [7], [8],.

rooli konstitutiivisesti aktiivisen AR variantit CRPC on osoitettu monissa tutkimuksissa [7], [8], [11 ], [12]. Ilmaisu Näiden katkaistun AR variantteja korotetaan 20-kertaiseksi CRPC verrattuna paikallisia PCa [9], ja korreloi kapasiteetti PCa solut voivat kasvaa

in vitro

ja

in vivo

puuttuessa androgeenireseptorin [7]. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismit johtavat niiden aktivointia ja niiden toimintatapa PCA ja CRPC jäävät epäselviksi.

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit voisi olla rooli syövän etenemiseen. Todellakin, vaikka nämä konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit on jo ilmaistu ensisijainen eturauhaskasvaimissa, niiden ilme on sitäkin ilmaistaan ​​luumetastaasipotilailla [8]. Lisäksi niiden ilmentyminen liittyy lisäystä NFAT (Nuclear kerroin aktivoitujen T-solujen) ja AP-1 (Activator Protein-1) aktiivisuus, kaksi transkriptiotekijät liittyvät soluproliferaatioon, muuttoliike ja selviytyminen [13].

N-kadheriinin, joka kuuluu kadheriinin suurperheeseen, sijaitsee vyöliitos hermostunut, endoteeli- tai mesenkymaalisten solujen mukana kasvainprogression [14], [15]. Todellakin, N-kadheriinin ilmentyminen lisääntyy useimmissa syöpien ja edistää kasvainsolujen muuttoliike, invaasio ja selviytyminen [14]. Lisääntynyt N-kadheriiniekspressiota liittyy myös epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), ilmiö ominaista väheneminen epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja kasvua mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista tai N-kadheriinin [16], [17 ], [18], [19]. Nämä molekyyli- ja solutason muutoksia tärkeä rooli kasvainsoluissa levittämisestä toissijainen sivustoja [20], 21.

Viime aikoina tutkimukset ovat osoittaneet, että kastraatio kestävä PCa liittyy säätelyyn ylöspäin N-kadheriinin ilmentymisen solu malleja sekä PCa ksenografteissa ja kliiniset näytteet CRPC [22], [23], [24]. Lisäksi monoklonaalisia vasta-aineita N-kadheriinin on osoitettu hidastavan syntymistä kastraation kestävyys ja vähentää kasvua CRPC ksenograftien [23]. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että on olemassa korrelaatio N-kadheriiniekspressiota ja kestävyys kastraatio. Kuitenkin molekyylimekanismeja jolloin N-kadheriiniekspressiota lisääntyy CRPC ole tiedossa.

Tämän työn tarkoituksena oli näyttää mahdollisen yhteyden läsnäolo konstitutiivisesti aktiivisen AR varianttien ja ilmaisu syövän etenemisen markkereita. Erityisesti olemme keskittyneet vaikutuksista konstitutiivisesti aktiivinen AR varianttien ilmentymistä koskevat N-kadheriinin ja muut mesenkymaaliset markkereita. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että

N-kadheriinin

sekä

vimentiinista

,

SNAIL

ja

ZEB1

on voimistunut läsnä ollessa konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit PCA.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen prostatakarsinoomassa LNCaP-solulinjasta, klooni FGC ja 22Rv1 solulinja (ECACC, Salisbury, Iso-Britannia), pidettiin RPMI-1640 täydellistä alustaa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, Ranska) ja 1 mM natriumpyruvaattia (Invitrogen, Fisher Scientific, Ranska).

C4-2B solulinja (ViroMed Laboratories, Minnetonka, MN, USA), pidettiin DMEM-väliaineessa, jota oli täydennetty 20% Hamin F12, 10% FCS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 5 ug /ml insuliinia, 13,65 pg /ml trijodi-thyronine, 4,4 ug /ml apo-transferriini-ihmisen, 0,244 ug /ml d-biotiini ja 12,5 ug /ml adeniinia (Sigma- Aldrich, Ranska).

Plasmidit ja transfektio

immunofluoresenssilla kokeissa villityypin androgeenireseptorin (AR) (AR-WT) ja konstitutiivisesti aktiivinen AR Q640X ja AR Q670X [25] variantteja liittyivät EGFP kuten aikaisemmin on kuvattu [2], [3]. Geenien ilmentymisen analyysiä ja Western-blot, uE-ARWT, uE-ARQ640X ja pE-AR-V7 plasmidit rakennettiin insertoimalla vastaava AR cDNA välillä Nhel: llä ja BamHI-kohtien pEGFP-C3.

transfektioihin The JetPEI

TM transfektioreagenssia (Polyplus transfektio, Ozyme, Ranska) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. LNCaP-soluja siirrostettiin 10 cm ruokia 1 x 10

6 solua /malja tai 6-kuoppaiseen levyyn 2 x 10

5 /kuoppa. Kolme päivää myöhemmin väliaine vaihdettiin ja solut transfektoitiin 10 ug: lla osoitettua plasmidi käyttäen 20 ui JetPEI transfektioreagenssia 10 cm: n maljoilla tai 3 ug plasmidia käyttäen 6 ui JetPEI 6-kuoppaiseen levyyn. Alusta vaihdettiin 48 h kuluttua ja soluja inkuboitiin enimmillään 9 päivän mukaan kokeita. Elatusaine vaihdettiin joka toinen päivä ja inkubaatioissa yli 4 transfektion päivää, soluja inkuboitiin, kun läsnä oli 400 ug /ml genetisiiniä (Invitrogen, Ranska).

vaikutus androgeenien on N-kadheriinin ilmentymisen

LNCaP-solut ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn täydelliseen kasvualustaan ​​ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin, väliaine vaihdettiin fenolipunaista RPMI-1640, johon oli lisätty 5% dekstraanipäällysteisellä hiilellä erotettua FCS (DCC-FCS) ja ilmoitetun pitoisuuden dihydrotestosteroni (DHT) (Sigma-Aldrich, Ranska) tai ajoneuvon (etanoli).

koe MDV3100, transfektoidut LNCaP-soluja inkuboitiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 5%: DCC-FCS, joka sisälsi osoitetut DHT annos ja 100 nM MDV3100 (Enzalutamide, Selleck Chemicals, Euromedex, Ranska) tai vehikkeliä (dimetyylisulfoksidi, DMSO). Vaikutusten vahvistamiseksi androgeenien on N-kadheriinin ilmentymisen, 22Rv1 soluja kasvatettiin RPMI-1640 100 nM tai 1 uM MDV3100, tai DMSO: ssa.

Cell Sorting

LNCaP-soluja siirrostettiin 10cm ruokia 1 x 10

6 solua /malja ja transfektoitiin pEGFP-ARWT tai pEGFP-ARQ640X. Neljä päivää transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja lajitellaan ansiosta vihreän fluoresenssin (EGFP) BD FACSAria-II solulajitteluanalyysi (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska). Kokonais-RNA uutettiin EGFP negatiivinen (ei-transfektoiduista) ja EGFP positiivinen (transfektoidut solut), ja sitä käytettiin analysoimaan geeniekspressiota qRT-PCR: llä.

Quantitative real-time PCR

Yhteensä cellular RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä NucleoSpin® RNA II määritys (Macherey-Nagel, Ranska) mukaan valmistajan menettelyä. RNA pitoisuudet ja puhtaus kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä ja 280 nm: ssä (GeneQuant pro, GE Healthcare, Ranska). Käänteinen transkriptio suoritettiin 400 ng tai 1 ug RNA: ta käyttäen RT Omniscript määritystä (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska). RNA laimennettiin 13 ui ja denaturoidaan 65 ° C: ssa 5 minuutin aikana. A 7 ui reaktioseosta, joka sisälsi 1 x RT malli, 0,5 mM kutakin dNTP: tä, 1 uM oligo-dT, 10 U RNaasi-inhibiittoria ja 4U Omniscript käänteistranskriptaasia lisättiin ja reaktiota inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 93 ° C: ssa 5 minuutin ajan.

N-kadheriinin

,

E-kadheriinin

,

vimentiinista

,

SNAIL

,

TWIST1

, ja

ZEB1

mRNA kvantitoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR LightCycler 480 (Roche Applied Science, Meylan, Ranska). PCR-reaktioihin, 5 ui LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Molecular Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja 1 ui spesifisiä alukkeita (taulukko 1) (Qiagen, QuantiTect pohjamaalit Courtaboeuf, Ranska) sekoitettiin 4 ul: 1: 5. cDNA laimennus. Tulokset normalisoitiin käyttäen taloudenhoito geeni

β-ACTIN

tai

PBGD

(porfobilinogeeni deaminaasia) (Qiagen, QuantiTect Primer). Monistaminen spesifisyys varmistettiin analysoimalla sulamiskäyrä- ja elektroforeesilla muuttoliike. Kaikki kokeet toteutettiin kolmena kappaleena ja toistettiin 3 kertaa. Suhteellinen kvantifiointiin käytettiin kartoitettiin kertainen muutos ilmaisun tasolla, jonka ΔΔCt menetelmällä. Kukin arvo on ilmaistu keskiarvona ΔΔCt ± SEM. Tulokset analysoitiin Student t-testiä ja

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Western Blot

Solut hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris HCl: lla pH 7, 140 mM NaCl, 3 mM MgCl2: a, 0,5 x Igepal, 5 mM DTT: tä, 1 x fosfataasin estäjä, ja 1 x proteaasi-inhibiittorin. Proteiinipitoisuus kullekin näytteelle kvantitoitiin käyttäen BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) valmistajan menettelyn. Tietty määrä 15 100 ug kokonais- proteiineista ladattiin 7,5% SDS-PAGE. Siirron jälkeen ja siirretään nitroselluloosakalvolle, kalvot kyllästettiin PBS /0,1% Tween /2% ECL ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 0,1 ug /ml hiiren monoklonaalista anti-N-kadheriinin (luettelonro. 610920, BD Biosciences, Ranska) tai 1 ug /ml hiiren monoklonaalista anti-AR (luettelonro. 554225, BD Biosciences, Ranska) vasta-aine. β-aktiinin (0,2 ug /ml) (luettelonro. sc-47778, Tebu-bio, Ranska) käytettiin sisäisenä kontrollina. Pesujen jälkeen immunokompleksien havaittiin 0,2 ug /ml HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri (luettelonro. Sc-2005, Tebu-bio, Ranska), tai 0,5 ug /ml rotan anti-hiiri-IgG2a-vasta-aineita (luettelonro. 553391, BD Biosciences, Ranska), ja lopuksi paljasti kemiluminesenssin (Immobilon

TM Western, Millipore, Molsheim, Ranska).

Immunofluoresenssivärjäys

Lab-Tek II kammio diat (2 kaivot) olivat päällystetty LNCaP väliaineen kaksi tuntia ja 1 x 10

5 LNCaP solua /kuoppa siirrostettiin. LNCaP-solut transfektoitiin 2 ug pEGFP-WT, pEGFP-ARQ640X tai pEGFP-ARQ670X 3 päivää myöhemmin ja inkuboitiin 4 päivää. LNCaP-solut huuhdeltiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä. Soluja blokattiin ja läpäiseviksi 0,1% Triton /1% naudan seerumialbumiinia (BSA) /PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Viljelmiä inkuboitiin 2,5 ug /ml anti-N-kadheriinin hiiren monoklonaalinen vasta-aine (luettelonro. 610920, BD Biosciences, Ranska) tai isotyyppisiä vasta-ainetta (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska) 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen PBS: ssä, LNCaP-soluja inkuboitiin 2 ug /ml Alexa Fluor 568-konjugoitu vuohen anti-hiiri (Invitrogen, Fisher Scientific, Ranska) 1 h ja tumat värjättiin 0,1 ng /ml DAPI liuosta 20 minuutin ajan 30 ° C. Kuvat otettiin Leica LAS AF6000 fluoresenssimikroskooppiin käyttäen LAS AF ohjelmisto (Leica).

Tulokset

konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin variantit upregulate N-kadheriiniekspressiota eturauhassyöpäsoluissa

konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja on liittynyt CRPC. Lisäksi jotkut tutkimukset osoittivat, että CRPC liittyy myös säätelyyn ylöspäin N-kadheriinin ilmentyminen [22], [23]. Me tutkimme, konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit upregulate N-kadheriiniekspressiota PCA soluissa.

N-kadheriinin

mRNA-tasolla määritettiin qRT-PCR: LNCaP-solut yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR Q640X tai AR-V7, tai AR-WT kontrollina (kuvio 1).

N-kadheriinin

ilmentymisen pysyi ennallaan LNCaP yli-ilmentävät AR-WT kuin verrokeilla. Mielenkiintoista on, että

N-kadheriinin

ekspressio kasvoi 8000-kertainen, kun läsnä on ARQ640X ja AR-V7 (kuvio 1A-B). Nämä tiedot vahvistettiin C4-2B-soluissa (kuvio S1) ja proteiini tasolla LNCaP-soluissa (kuvio 1C). Lisäksi ajan myötä koe paljasti, että N-kadheriinin proteiinin tasot olivat johdonmukaisesti kasvanut päivä-3 jälkeen LNCaP-solujen transfektion ARQ640X (kuvio 1 D).

A). N-kadheriinin ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR: LNCaP-solut yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR Q640X tai AR-V7, tai AR-WT ja soluissa, jotka oli transfektoitu tyhjällä plasmidilla (C3). Soluja kasvatettiin täydellisessä alustassa 9 päivää transfektion jälkeen. Vanhempien LNCaP-soluja käytettiin kontrollina. y-akseli edustaa suhteellista kertaluokkamuutos verrattuna ohjaus (vanhempien LNCaP).

β-ACTIN

käytettiin endogeenisen normalisointia ohjaus. Suhteellinen ekspressio on esitetty keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kukin näyte verrataan yksi kerrallaan kaksi häntää parittomia t-testiä.

NS: Ei merkittävä * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001

. B). Western blot, joka osoittaa AR ilmentymistä transfektoiduissa ja muiden transfek- LNCaP. C). Immunoblot-analyysi N-kadheriinin ilmentymisen transfektoiduissa LNCaP-solujen 4 ja 9 päivää transfektion jälkeen. D). Kineettinen analyysi N-kadheriinin ilmentymisen Western Blot LNCaP-soluissa yli-ilmentävät AR Q640X 2-9 päivää transfektion jälkeen. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus.

vahvistaa nämä tiedot lyhytaikaisella transfektiolla, solun lajittelu analyysi suoritettiin sen jälkeen, kun LNCaP transfektion osoittaa, että N-kadheriinin ilmentyminen rajoittui soluihin, jotka ekspressoivat konstitutiivisesti aktiivinen AR.

N-kadheriinin

ilmentyminen analysoitiin EGFP negatiivinen (ei-transfektoidut solut) tai EGFP positiivinen (transfektoitujen solujen) fraktioista qRT-PCR. Yhdenmukainen edellä tuloksia,

N-kadheriinin

ilmentyminen oli havaittavissa sekä EGFP- negatiivisia ja positiivisia jakeet seuraava LNCaP transfektion pEGFP-ARWT. Kuitenkin, kun transfektio pEGFP-ARQ640X,

N-kadheriinin

ekspressio lisääntyi EGFP-positiivisten solujen yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR, mutta ei EGFP negatiivinen osa (kuviot 2A-B). Nämä tulokset vahvistettiin edelleen immunofluoresenssianalyysillä, joka esittää N-kadheriinin merkintöjä yksinomaan EGFP: ää ilmentävät positiiviset konstitutiivisesti aktiivinen AR variantti (kuvio 2C).

LNCaP-soluja transfektoitiin ohimenevästi pEGFP-ARWT tai pEGFP-ARQ640X plasmidin ja lajiteltiin 4 päivää sen jälkeen. A).

N-kadheriinin

ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR EGFP positiivinen (transfektoitu) ja EGFP negatiivinen (ei-transfek-) jakeet. B). Androgeenireseptorin (AR) taso analysoitiin Western Blot tarkistaa puhtauden kunkin fraktion jälkeen solulajittelulla. C). Immunofluoresenssianalyysi N-kadheriinin (punainen fluoresenssi) ilmentyminen LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu EGFP-merkityn (vihreä fluoresenssi) AR-WT, AR Q640X tai AR Q670X ekspressioplasmidin. Suurennus: × 20.

Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit upregulate N-kadheriiniekspressiota PCA soluissa.

Androgeenit säätelemään negatiivisesti N-kadheriiniekspressiota aiheuttama konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin variantit

Tuore tutkimus kertoi, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit saattavat vaatia täyspitkä AR (AR-FL) aktivoimaan endogeenisiä kohdegeenien. Tutkia vaikutusta endogeenisen AR-FL läsnä LNCaP kykyyn konstitutiivisesti aktiivisen AR varianttien aikaansaamiseksi N-kadheriiniekspressiota, LNCaP yli-ilmentävät AR-WT tai konstitutiivisesti androgeenien varianttia inkuboitiin, kun läsnä oli 100 nM DHT tai ajoneuvon ja N-kadheriinin ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä. Mukaisesti edellisessä tuloksia, ei ole N-kadheriinin ilmentyminen havaittiin soluissa, jotka yliekspressoivat AR-WT. On kiinnostavaa, että 1,4-kertainen pieneneminen N-kadheriinin ilmentymisen taso havaittiin, kun soluja, jotka yliekspressoivat AR Q640X tai AR-V7 viljeltiin, kun läsnä oli 100 nM DHT verrattuna vehikkeliin (kuvio 3A). Lisäksi tämä androgeeni-välitteinen N-kadheriinin repression oli annoksesta riippuvainen (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin vaihtoehdot eivät edellytä AR-FL jopa säännellä N-kadheriinin ilmentymisen. Kuitenkin DHT-aktivoitu AR-FL näyttää antagonisoida vaikutuksiin konstitutiivisesti aktiivisen androgeenireseptorin muunnoksia N-kadheriiniekspressiota (kuvio 3C). Voit tarkistaa tämän hypoteesin, romaani antiandrogeeni MDV3100 käytettiin estämään DHT-aktivoitu AR-FL transfektoiduissa LNCaP-soluissa. Kuten odotettua, edelleen merkittävää lisäystä N-kadheriinin ilmentyminen havaittiin LNCaP-soluissa, jotka yliekspressoivat AR variantit, kun läsnä oli 100 nM MDV3100 (kuvio 3D). Nämä tulokset vahvistettiin myös kastraatio kestävä 22Rv1 solujen, tiedetään ilmentävän sekä AR-FL ja konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja. 2-kertainen nousu N-kadheriinin mRNA-tasolla havaittiin, kun 22Rv1 soluja viljeltiin 4 päivää, kun läsnä 100 nM ja 1 uM antiandrogeeninen MDV3100 (kuvio S2).

A). LNCaP-soluja kasvatettiin RPMI-1640, joka sisälsi 5% DCC-FCS: ää ja 100 nM DHT tai ajoneuvon (EtOH). N-kadheriiniekspressiota analysoitiin qRT-PCR LNCaP-solujen 4 päivän kuluttua transfektion AR-WT tai konstitutiivisesti aktiivinen AR Q640X tai AR-V7 ekspressioplasmidin. B). N-kadheriinin ilmentymisen tason LNCaP-soluissa tutkittiin qRT-PCR: llä 4 päivää transfektion jälkeen AR Q640X ilmentämisplasmidin läsnä eri DHT pitoisuuksia (10 nM, 25 nM ja 50 nM) tai vehikkeliä. C). N-kadheriiniekspressiota aiheuttama konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit (AR vaihtoehtoja) negatiivisesti säännelty kun LNCaP-soluja kasvatettiin läsnäollessa DHT. Oletamme, että endogeenisen AR-FL läsnä LNCaP ja AR variantit voivat toimia eri tavalla. Tässä mallissa DHT-stimuloi endogeenisen AR-FL tukahduttaa N-kadheriiniekspressiota taas AR varianttien ylössäätävät sen ilme. D). LNCaP-solut yli-ilmentävät AR-WT, AR Q640X ja AR-V7 viljeltiin DCC-FCS-väliaineessa, jota oli täydennetty 100 nM DHT ja, kun läsnä on 100 nM MDV3100 tai DMSO: ta kontrollina aikana 3 päivää. N-kadheriinin ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä 4 päivää transfektion jälkeen, ja normalisoitiin

β-ACTIN

. ΔΔCt menetelmää käytettiin laskemaan suhteellinen ekspressio ja kukin arvo ilmoitetaan keskiarvona ΔΔCt ± SEM.

NS: Ei merkittävä * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001

.

Kaikki yhdessä, nämä tiedot viittaavat siihen, että DHT-aktivoitu AR-FL voisi kilpailla konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin säätelemiseksi N-kadheriiniekspressiota.

konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin variantteja liittyy ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden

on yleisesti tunnettua, että kasvainsoluissa, ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden liittyy alas-säätely epiteelin markkereita. Oletimme, että ylösajon N-kadheriinin ilmentymisen havaittiin, kun läsnä on konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja liittyy vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin. Tämän hypoteesin testaamiseksi, olemme analysoineet E-kadheriinin ilmentymisen LNCaP transfektoitu ARQ640X, AR-V7 tai villityypin AR-ekspressioplasmidin, tai tyhjällä plasmidilla kontrollina.

E-kadheriinin

mRNA tasot LNCaP upon transfektio ARQ640X tai AR-V7 ekspressioplasmidin ei osoittanut mitään merkittävää eroa verrattuna kontrolleihin (kuvio 4A). Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi Western blot-analyysi (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että ekspression konstitutiivisesti aktiivisen AR variantit PCa liittyy huomattavasti enemmän N-kadheriinin ilmentymisen, mutta ei korreloi down-regulation of E- kadheriinin.

LNCaP-solut transfektoitiin ARWT, ARQ640X tai AR-V7 ekspressioplasmidin tai tyhjällä plasmidilla (C3). A).

E-kadheriinin

, B).

vimentiinista

, C).

TWIST1

, D).

SNAIL

ja E).

ZEB1

ekspressiotasoja analysoitiin qRT-PCR päivänä-9 transfektion jälkeen. Kunkin näytteen, ekspressiotasot normalisoituivat

PBGD

tai

β-ACTIN

ja ilmoitetaan suhteellisena arvo LNCaP emosolulinjassa. Arvot esitetään keskiarvona ΔΔCt ± SEM.

NS: Ei merkittävä * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001

. F). Western blot, joka osoittaa kehittymistä ZEB1 ilmentymisen LNCaP yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja. Immunoblotti 100 ug kokonaisproteiinia otteita. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

tutki myös konstitutiivisesti aktiivinen AR ilmentymistä PCA soluissa liittyy muita mesenkymaalisten markkereita. Ekspressiotasot

vimentiinista

ja transkriptiotekijöiden

TWIST1, ZEB1

ja

SNAIL

määritettiin qRT-PCR päivänä-9 jälkeen LNCaP transfektio ARQ640X tai AR-V7 ilmentämisplasmidi, villityypin AR-plasmidin tai tyhjän vektorin kontrolleina (kuvio 4B-E).

vimentiinista

ilmentyminen suureni 2,5 ja 1,5-kertaisesti LNCaP yliekspressoivien ARQ640X ja AR-V7 verrattuna kontrolleihin (kuvio 4B).

Vaikka Twist1 tiedetään indusoivan

N-kadheriinin

ilmentymisen PCa, ei merkittävää eroa mRNA-tasojen on

TWIST1

havaittiin (kuvio 4C). Kuitenkin konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit johti tilastollisesti merkittävää lisäystä

SNAIL

ja

ZEB1

mRNA (kuva 4D, E). ZEB1 ylössäätely vahvistettiin myös proteiinitasolla (kuvio 4F).

Keskustelu

AR signalointi on erittäin tärkeää leviämisen ja selviytymistä eturauhasen syöpäsoluja. AR polku pysyy aktiivisena etenemisen aikana PCa kohti kastraatio-resistenttejä ja syntyminen konstitutiivisesti aktiivisen AR-variantit, joilta puuttuu ligandisitoutumisdomeenista pidetään nyt merkittävä tapahtuma CRPC. Huolimatta joistakin tutkimusten mukaan konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit vaikuttavat taudin etenemiseen, niiden toiminta pysyy toistaiseksi ratkaisematta.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että N-kadheriinin ylössäädellään LNCaP soluissa, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja, mutta ei LNCaP ilmentämään täyspitkän AR. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ensimmäistä kertaa, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit voivat aiheuttaa N-kadheriiniekspressiota. Tämä havainto on kytkettävä viimeaikaiset tutkimukset, jotka esittävät korrelaation CRPC ja N-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen [22], [23], [24]. Yhdenmukainen Näiden tutkimusten meidän tiedot viittaavat siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit signalointi voisi olla mekanismi, joka johtaa N-kadheriinin ilmentymisen CRPC.

Nämä havainnot kerran korostaa yhteys AR signalointireitin ja N-kadheriiniekspressiota. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että AR säätelee negatiivisesti N-kadheriiniekspressiota [22], [23]. Todellakin, N-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen liittyy vähentynyt ilmentyminen AR kastraatio kestävä PCa ksenografteissa [23]. Lisäksi säätelyä N-kadheriinin havaittiin kastraatio kestävä LNCaP-19-soluihin voidaan kääntää, kun läsnä on androgeenien [22], [26], [27]. Mukaisesti nämä tiedot, olemme osoittaneet, että androgeenit liittyy vähentynyt N-kadheriinin ilmentymisen mallissamme yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin variantti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että AR-FL ja konstitutiivisesti aktiivisen AR variantit voivat toimia eri tavalla (kuvio 3C). Esimerkiksi DHT-stimuloi AR-FL voisi rekrytoida co-repressors ja puolestaan ​​tukahduttaa

N-kadheriinin

ilme. Lisäksi konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja puuttuu of karboksipään alue, saattavat käyttäytyä eri tavalla ja aiheuttaa

N-kadheriinin

ilme. Lisäksi AR-FL ja konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit voivat kilpailla keskenään säätelemiseksi N-kadheriiniekspressiota. Tämän mukaisesti hypoteesin,

N-kadheriinin

geeni sisältää klusterin androgeenireseptorin vaste-elementtien (ARE) toistuu intronin 1 [28].

Kuitenkin konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit voivat myös välillisesti ohjata

N-kadheriinin

ilme. Esimerkiksi eturauhassyövän,

N-kadheriinin

ilmentyminen liittyi ydinaseiden translokaatio Twist1 [29]. Vaikka tiedot osoittivat merkittävää eroa

TWIST1

mRNA, konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja saattaa lisätä ydin- translokaation Twist1, mikä puolestaan ​​voisi aiheuttaa

N-kadheriinin

ilmaisun sitoutumisen jälkeen E- laatikko ensimmäisten intronin

N-kadheriinin

.

Nämä olettamukset syytä tutkittu lisätutkimuksia ymmärtää, miten konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit säädellä

N-kadheriinin

ilme.

tässä tutkimuksessa olemme myös osoittaneet, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja liittyy lisääntynyt ilmentymä mesenkymaalisten merkkiaineiden kuin

vimentiinista

,

SNAIL

ja ZEB1. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tuoreessa tutkimuksessa, joka osoitti kasvua mesenkymaalisten merkkiaineiden kasvainten saaneilta potilailta androgeenien puute hoidon [24]. Yhdessä meidän havainnot viittaavat, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja voisi liittyä EMT prosessiin. Näitä markkereita eivät johdonmukaisesti liittyy EMT. Esimerkiksi, SNAIL resistenssin apoptoosia kasvainsoluissa alttiina ionisoivan säteilyn ja genotoksisten lääkkeiden ja mahdollistaa rintojen solujen tulla kasvaimeen aloittamista soluihin [30], [31], [32], [33], [34].

ilmaisu mesenkymaalisten merkkiaineiden raportoitu täällä läsnä ollessa konstitutiivisesti aktiivisen AR variantteja ei ollut yhteydessä downregulation E-kadheriinin mallissamme. Käänteistä korrelaatiota N-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen ja E-kadheriinin downregulation keskustellaan yhä. Todellakin, McKeithen ja työtovereiden, ja viime aikoina Tiwari ja kollegat raportoivat koekspressoimalla sekä E- ja N-kadheriineja kasvainsoluissa [35], [36]. Näissä tutkimuksissa E-kadheriinin proteiini näyttää eri solunosasijaintia. Lisäksi ilmoitetaan N-kadheriinin säätelyyn ylöspäin jälkeen kastraation LNCaP-19-soluissa ei liity laskua E-kadheriinin ilmentymisen

in vitro

soluviljelmässä [22]. Kuitenkin odotettu E-kadheriinin downregulation tässä mallissa on havaittu vain potilaalle tehdä kasvainten jälkeen kastraation, mutta ei ihon alle LNCaP-19 kasvaimet, mikä viittaa tärkeä rooli ympäröivän eturauhasen ympäristön E-kadheriinin downregulation [22]. Sitä paitsi, käänteinen korrelaatio kastraatio aiheuttama N-kadheriiniekspressiota ja E-kadheriinin downregulation on dokumentoitu LAPC9 ja LuCaP35 ihonalainen ksenografteissa mallit [23], [24]. Kuitenkin tämä kadheriineja kytkin ei ole raportoitu kahdessa tutkimuksessa keskitytään kliinisissä eturauhasen kasvaimia, potilailta tai ilman androgeenien puute hoitoa [22], [24].

Lisätutkimuksia ovat perusteltuja ymmärtää toiminnallisia seurauksia N-kadheriinin ja muut mesenkymaaliset merkkiaineiden säätelyyn ylöspäin läsnäollessa konstitutiivisesti aktiivisen AR variantteja. N-kadheriiniekspressiota laajalti liittyy kasvaimen etenemistä etenkin koska sen rooli muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Todellakin, N-kadheriinin suosii migraatio syöpäsolujen kautta solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä ja lamellipodioihin muodostumisen [14]. Se edistää myös migraation syöpäsolujen luoda homofiilisiä vuorovaikutus naapurimaiden kudoksiin, kuten strooman kudoksen tai endoteelin [37], [38]. N-kadheriinin ilmentyminen liittyy myös selviytymisen eturauhassyövässä ja melanoomasoluja. Todellakin, N-kadheriinin ilmentyminen voidaan aktivoida fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /AKT-reitin inaktivoimaan pro-apoptoottisia proteiineja ja aiheuttaa kasvua anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 [39], [40]. Lopuksi, tuore tutkimus osoitti, että N-kadheriinin voisi välittää angiogeneesiä indusoimalla monosyyttien kemoatrak- proteiini-1 (MCP-1) ilmentymisen kautta PI3K /AKT-reitin [41].

On hetkellä suurta kiinnostusta tilassa vaikutusmekanismia konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit CRPC. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit aiheuttaa N-kadheriiniekspressiota ja muut mesenkymaaliset merkkiaineita PCA. Nämä havainnot tukevat hypoteesia, että nämä konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja voitaisiin edistää systeemisiä levittämistä Eturauhassyövän soluja, ja vahvistavat, että on tärkeää kohdistaa näihin AR variantteja PCA.

tukeminen Information

Kuva S1.

N-kadheriinin ilmentyminen säädeltiin vuonna C4-2B-soluissa, kun läsnä on konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja.