Krooninen sairaus

tiivistelmä

Uridine diphosphoglucuronosyltransferases (UGT) 1A6 on ainoa UGT1A isoformin ilmaistu keuhkokudoksessa. Se vastaa vieroitus karsinogeenejä kuten benezo [a] pyreenin tupakansavusta. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida yhdistyksen UGT1A6 polymorfismien ja haplotyyppien keuhkosyöpää riskejä ja arvioida toiminnallista merkitystä UGT1A6 polymorfismien. Genominen DNA eristettiin leukosyyteistä. Kahdeksan UGT1A6 polymorfismit sekvensoitiin testissä joukko 72 kiinalaisen keuhkosyöpäpotilaita ja 62 tervettä verrokkia. Mahdollista riskiä muuttamalla alleelien validoitu erillisessä joukko 95 kiinalaisen keuhkosyöpäpotilaita ja 100 tervettä verrokkia. UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C osoittivat merkittävää yhteyttä lisääntynyt keuhkosyövän riskiä, ​​kun taas UGT1A6 105C T ja IVS1 + 130G T merkittävästi yhteydessä alentuneeseen keuhkosyövän riskiä. Monimuuttuja regressioanalyysimme osoitti merkittävää yhteyttä keuhkosyöpää kanssa UGT1A6 541A G (OR: 3,582, 95% CI: 1,27-10,04, p = 0,015), 552A C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92-14,96, p = 0,001) ja IVS1 + 130G T (OR: 0,191, 95% CI: +0,09-+0,36, p 0,001). Toiminnallinen testi osoitti, että UGT1A6 105C T lisääntynyt mRNA vakautta, joka tarjoaa uskottavan selityksen sen yhdessä alentunut keuhkosyövän riskiä. Näin UGT1A6 polymorfismit voidaan tunnistaa ihmiset, joilla lisääntynyt riski sairastua keuhkosyöpään.

Citation: kua L-F, Ross S, Lee S-C, Mimura K, Kono K, Goh B-C, et al. (2012) UGT1A6 polymorfismit Moduloitu keuhkosyövän riski kiinalaisessa väestöstä. PLoS ONE 7 (8): e42873. doi: 10,1371 /journal.pone.0042873

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2012; Julkaistu: 17 elokuu 2012

Copyright: © KUA et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Healthcare Group (Singapore) pienet innovatiiviset avustus [NHG-SIG /06007]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on yli 85% ensisijaisen keuhkosyövässä ja noin kaksi kolmasosaa NSCLC potilaat diagnosoidaan edennyt pitkälle. Tupakointi on yhdistetty keuhkosyöpään [1] – [4], ja yli 60 karsinogeeneja ollut todettu tupakansavun [5] – [7]. Näiden, bentso [a] pyreeni (BaP) ja 4- (Methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NNK) ovat eniten tutkittu. Metabolinen aktivoituminen BaP ja NNK- P450-entsyymien tuloksena muodostuu enemmän reaktiivisia metaboliitteja, jotka voivat sitoutua kovalenttisesti DNA, tärkeä askel keuhkosyövän induktio [8] – [10].

uridiinia diphosphoglucuronosyltransferases ( UGT) kuuluvat superperheen metaboloivien entsyymien vastaavien myrkkyjä lukuisia endobiotics ja vierasperäiset aineet [11]. UGT vastaavat vieroitus BaP ja NNK- [12] – [15]. Alempi glukuronidaatio aktiivisuus oli osallisena keuhkosyövän herkkyys [16]. Lisäksi geneettinen polymorfia UGT ovat korreloivat riski ja esiintymistiheys eri syöpiä, kuten keuhkosyövän [12], [17] – [20]. Joukossa kaikki UGT1A isomuodot, UGT1A6 oli osoitettu olevan ainoa UGT1A isoformin ilmaistaan ​​keuhkokudoksessa [21].

Oletimme, että polymorfismit UGT1A6 voivat heikentää potilaan kykyä puhdistaa keuhkosyöpää karsinogeeneja ja moduloida keuhkosyövän riskiä . Tässä esitämme havainnot tapauskontrollitutkimuksessa käyttäen 2 eri ikäryhmien ja toiminnallisesti tunnusomaista UGT1A6 105C T polymorfismin

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta

yhteensä 167 kiinalaisten keuhkosyöpää ja 162 kiinalaisen terveillä verrokeilla 2 itsenäistä ikäluokat analysoitiin. Ensimmäinen kohortti koostuu 72 keuhkosyöpäpotilaita ja 62 terveen kontrollin päässä Cancer Center ja Verenluovutuskeskus National University Hospital, Singapore, vastaavasti. Toinen kohortti koostui 95 keuhkosyöpäpotilaita ja 100 ohjaa 4 kliinisissä tutkimuksissa, ja sitä käytettiin validointi asetettu. Koehenkilöt Tässä kohortissa oli keuhkosyöpäpotilaita kahdesta terapeuttisia faasin II tutkimuksissa (n = 44 ja 14 vastaavasti) ja ituradan biomarkkerit tutkimuksessa (n = 37) ja oikeutettu syöpää vapaa säätimet peräisin tapauskontrollitutkimuksessa familiaalinen kolorektaalisyövän Singapore. Tutkimuksen protokolla hyväksyi institutionaalisten ethnics Review Board National University Hospital, Singapore, ja kaikki tutkittavien kirjallisia tietoon perustuva suostumus.

Tiedonkeruun

Ensimmäisessä kohortin tutkimuksessa koehenkilöiden haastateltiin henkilökohtaisesti koulutettu lääketieteen ammattilaisia, jotka käytetään strukturoidun kyselylomakkeen. Demografiset tiedot kuten ikä, sukupuoli, tupakointi, pakkaus vuotta tupakoinnin ja histologinen solutyypin kerättiin kaikille kohteille. Samanlaisia ​​tietoja toisen kohortti noudetaan tapauksessa kirjaa, ja tietoa tupakoinnin tila tarkastuksia ei saatu. Tupakointi tila luokiteltiin koskaan tupakoi, ex-tupakoitsija ja nykyinen tupakoitsija. Histologinen solutyyppejä luokiteltiin kolmeen ryhmään, eli adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja huonosti eriytetty syöpä.

Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) genotyypityksen

kahdeksan SNP jotka olivat suhteellisen yleisiä Aasian väestöpohjainen aiempien kirjallisuudesta, valittiin tähän tutkimukseen. Neljästä varianttien eksonissa 1, kolme oli koodaus (cSNPs) johtaen aminohapon muutoksia, UGT1A6 19T G (S7A), 541A G (T181A) ja 552A C (R184S), kun taas UGT1A6 105C T oli synonyymi variantti. Loput kolme sekvenssivariantit 5 ’säätelyalue sisältyy 2-SNP: itä, UGT1A6 -556C T ja -427G C, ja yksi deleetio mutaatio -1310–1306 poistaa (aggag). UGT1A6 Introniset variantti IVS1 + 130G T tutkittiin myös.

genominen deoksiribonukleiinihappo (DNA) uutettiin buffy coat fraktioista käyttämällä Puregene-DNA-puhdistuspakkausta (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). Laatu ja määrä DNA arvioitiin NanoDrop (ND-1000 spektrofotometri). Kaikki DNA: lla on A

260 /A

280 suhde 1,7-1,9. Genotyypitys suoritettiin käyttäen pyrosekvensointi. Sillä pyrosekvensointi määrityksiä, yksi positiivinen ja yksi negatiivinen kontrolli sisällytettiin kuhunkin 96-kuoppalevylle. Lyhyesti, suunniteltiin alukkeet perustuen UGT1A6 sekvenssin. PCR-alukkeet ja sekvensointi alukkeet suunniteltiin käyttämällä pyrosekvensointi Assay Design Software (versio 1.0.6: Biotage AB, Uppsala, Ruotsi). BLAST-analyysi suoritettiin spesifisyyden varmistamiseksi alukkeiden kunkin eksonin. Yksityiskohdat alukesekvenssit ja PCR-olosuhteet on esitetty taulukossa S1. 250 ng genomista DNA: ta 50 ng /ul käytettiin kutakin PCR-reaktio ja PCR-tuotteet alistettiin sitten pyrosekvensointi kanssa PyroMark ™ ID laitteen (pyrosekvensointi, Uppsala, Ruotsi). Validation vaiheet suoritettiin suoralla sekvenointireaktioita käyttäen ABI PRISM® BigDye ™ Terminator v 3.1 syklisekvensointimenettelyllä kemia.

plasmidikonstrukteja

Funktionaaliset tutkimukset nonsynonymous polymorfismien (UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C) on tehty, kun taas IVS1 + 130G T on introni- SNP, siksi valitsimme UGT1A6 105C T, joka on synonyymi polymorfismin meidän toiminnallinen testaus. Sen arvioimiseksi, UGT1A6 105C T on vaikutusta UGT1A6 toimintaa, variantti 105TT luotiin. Lyhyesti, plasmidivektori koodaavan täyspitkän UGT1A6 * 1 sekvenssi ystävällisesti Dr. Michael H. Court (Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts). UGT1A6 koodaava alue subkloonattiin pcDNA 3.1 V5 /His Topo ekspressioplasmidivektoriin (Invitrogen). BLAST-analyysi suoritettiin vahvistaa UGT1A6 plasmidin sekvenssi. Plasmidia käytettiin sitten templaattina substituutio nukleotidin 105 käyttämällä GeneEditor

in vitro

kohdennettu mutageneesi (Promega), jossa on esitetty alukkeen 105CT (5′-5Phos /ccc tca GGA TGG AAG CCA c-3 ’) ja aluketta Bottom Strand (mukana). Kaikki DNA-rakenteet varmistettiin Sekvensointianalyysin. Lyhyesti, HEK293-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 50 U /ml penisilliiniä (Gibco), kostutetussa ilmakehässä 5% hiilidioksidia lämpötilassa 37 ° C. Vakaa transfektiot plasmidin HEK293-soluihin suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) kanssa reagenssin DNA suhde 03:01 Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco). Kaikki transfektio kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

RNA vakauden määritys

vieressä tarkasteltiin mahdollisesta vaikutuksesta variantin UGT1A6 105TT mRNA vakauteen. 10 ug /ml aktinomysiini D (Sigma) levitettiin soluviljelmiin kasvatettiin yön yli, ja solut kerättiin valituin välein jopa 24 tuntia. Rneasy Plus Mini Kit (Qiagen) käytettiin erottamaan kokonais-RNA: transfektoiduista soluista, ennen ja jälkeen inkubaation aktinomysiini D.

kvantifiointi transkriptien

RNA eristettiin 5 x 10

5-solut osoitetussa aikoina (0, 2, 4, 8 ja 24 tuntia) sen jälkeen, kun hoidon ActD ja ne käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen SuperScript III (Invitrogen). PCR-reaktio suoritettiin sitten käsittää seuraavat: 1 ui cDNA: ta, 10 uM kutakin alukkeista (UGT1A6: 5′-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 ’ja 5′-ccaatgaagaccatgttgggc-3′, GAPDH: 5’-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 ’ja 5 ”-catgtgggccatgaggtccaccac-3 ’) ja 2 x Virta SYBR Green Master Mix (jotka sisältävät SYBR Green väriaine, Taq Polymearse, ROX, ja dNTP) lopullisessa tilavuudessa 20 ui. Tyhjä vektori-transfektoiduissa soluissa käytettiin verrokkina, jossa data normalisoidaan GAPDH ilme. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blotting

lisäksi tutkittiin, mikä vaikutus variantin UGT1A6 105TT proteiinien vakauteen. Käsitellyt solut lyysattiin ja proteiini mitattiin. Proteiinit (7,5 ug /kuoppa) erotettiin 4-15% gradientti SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (Invitrogen) ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) mikrohuokoisen kalvon (Millipore, Billerica, MA, USA) estetty PBS: ssä 5% maito. Blokkauksen jälkeen kalvo tutkittiin käyttämällä kanin anti-humaani UGT1A6 primääristä vasta-ainetta laimennettuna 1:1000 (WB-UGT1A6; BD Gentest, Woburn, MA) ja vuohen anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:10,000 laimennettu) . Blotit kuvantaa ECL reagenssit (ECL Prime, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Ruotsi) ja filmin (Konica SRX 101). Tulokset ovat kahdesta itsenäisestä kokeesta.

Entsyymimääritys

Serotoniini käytettiin substraattina, kun se osoittaa, substraattispesifisyys ja UGT1A6 [22], [23], mutta eri alustalla menetelmää käytettiin Tämä tutkimus. 0,01 mg proteiineja tehtiin 384-kuoppaisen musta levy (Corning, NY), jossa Transcreener ® HTS fluoresenssin voimakkuus (FI) Pitoisuus kit (Bellbrook Labs, Madison, WI). Kukin entsyymi Reaktio suoritettiin käsittää seuraavat: 50 mM HEPES (pH 7,5), joka sisälsi NaCl: a (100 mM), MgCl

2 (4 mM), EGTA: ta (2 mM), 0,01% Brij-35, ditiotreitolia (DTT , 2 mM), DMSO (1%), UDPGA (5 mM) ja vaihtelevilla serotoniinin (Sigma) 0,5-30 mM: n lopullisessa tilavuudessa 25 ui. Levyä inkuboitiin RT: ssä 45 min ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 25 ui jääkylmää metanolia. Levy luettiin sitten Tecan Infinite M200 levy lukija. Kaikki entsyymi reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Alkuperäinen lukemat muunnettiin määrä UDP muodostettu käyttäen GraphPad Prism interpoloimaan nämä arvot UDPGA /UDP standardin käyriä. Michaelis-Menten käyrät muodostettiin käyttäen GraphPad Prism. Käyrän tiedot ovat kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja tulokset on esitetty keskiarvoina ± S.D. kolmen rinnakkaisen.

TILASTOANALYYSI

Case-ohjaus eroja lähtötilanteesta arvioitiin käyttäen t-testit (jatkuvien muuttujien) ja Chi-square testit (kategorisen muuttujat). Kertoimet suhde (OR) olivat peräisin Chi-square testi, ja 95% luottamusvälit (CI) OR annettiin. Yhdistys SNP: iden välillä iän, sukupuolen, tupakoinnista ja TNM vaihetta testattiin keuhkosyövän koehenkilöillä käyttäen chi-neliö testi. Kaikki tilastollinen analyysi mukaan lukien yhden ja usean regressioanalyysimme suoritettiin käyttäen SPSS versio 11.5 (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA). Hardy-Weineberg tasapaino testi, kytkentäepätasapaino- analyysi (merkitty D ’) ja tapaus-verrokki haplotyyppianalyysissä (permutaatio testi) laskettiin SNPAlyze ver.7.

Tulokset

Ominaisuudet potilaiden ja hallintalaitteet

lähtötilanteessa ominaisuudet keuhkosyöpäpotilaita ja hallintalaitteet molempien kohortteja on koottu taulukkoon 1. oli tilastollisesti merkitsevää eroa iän, sukupuolen ja tupakointi välillä keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla, enemmän male (s = 0,003) ja tupakoitsijoita (p 0,001) keuhkosyövän ryhmä. Verrattuna terveisiin kontrolleihin, potilailla, joilla on keuhkosyöpä, olivat yleensä vanhempia (p = 0,04). Adenokarsinooma oli yleisin histologinen alatyyppi, osuus 60% keuhkosyöpäpotilaita. Ei ollut mitään merkittävää eroa perustason ominaisuudet keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla välillä testaus ja validointi kohortteja (tuloksia ei ole esitetty).

genotyypin ja alleelifrekvenssien UGT1A6 polymorfismien (taulukko 2)

kahdeksasta genotyyppi SNP, viisi liittyivät merkittävästi keuhkosyövän riskiä, ​​kun niitä testattiin ensimmäisen kohortin koostuu 72 keuhkosyöpäpotilaita ja 62 valvontaa. UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C liittyvän kohonneeseen keuhkosyövän riskiä, ​​kun taas UGT1A6 105C T ja IVS1 + 130G T oli käänteisesti yhteydessä keuhkosyövän riskiä. UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C olivat yleisiä keuhkosyöpäpotilaita vähäisiä alleeli taajuuksilla 38%, 45% ja 48% vastaavasti.

Nämä 5 SNP arvioitiin edelleen toisessa kohortissa koostuu 95 Kiinan keuhkosyöpäpotilaita ja 100 kiinalaista verraton valvontaa. UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C pysyi liittyy lisääntynyt keuhkosyövän riskiä, ​​ja UGT1A6 105C T ja IVS1 + 130G T pysyivät merkitsevästi yhteydessä vähensi keuhkosyövän riskiä.

määritys liittyviä tekijöitä itsenäisesti keuhkosyöpä: yhden ja usean analyysit

Voit selvittää tekijöitä, jotka liittyvät keuhkosyövän riskiä, ​​ensin käyttää yhden muuttujan analyysiin ja toi esiin seuraavat tekijät: ikä, sukupuoli, tupakointi asema, ja viisi SNP (taulukko 3). Säätämisen jälkeen covariables tunnistaa yhden muuttujan analyysin monimuuttujamenetelmin löysimme vain tupakointi tila (OR: 3,385, 95% CI: 1,86-6,15, p 0,001), UGT1A6 541A G (OR: 3,582, 95% CI: 1,27-10,04 , p = 0,015), 552A C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92-14,96, p = 0,001) ja IVS1 + 130G T (OR: 0,191, 95% CI: ,09-+0,36, p 0,001) olivat itsenäinen ennustava tekijä keuhkosyövän riskiä.

Hardy-Weinberg Equilibrium, kytkentäepätasapaino- (LD) ja haplotyyppianalyysissä

tarkempi analyysi joukko DNA polymorfismien jotka periytyvät yhdessä, myös tunnetaan haplotypes suoritettiin seuraavien results.UGT1A6 19T G ja IVS1 + 130G T osoitti merkittävää poikkeamista Hardy-Weinberg tasapainon keskuudessa valvontaa. UGT1A6 552A C oli läheisessä LD UGT1A6 541A G (D ’= 0,9706, r

2 = 0,7795) keuhkosyöpäpotilaiden. UGT1A6 105C alleeli vahvasti sidoksissa UGT1A6 541G ja 552A-alleelin (taulukko 4). Taulukossa 5 on yhteenveto haplotyyppifrekvenssit on tapaus-verrokki vertailujen permutaatio testeissä. UGT1A6 541A G suljettiin pois tämän analyysin, koska se oli tiiviissä LD 552A C. Kymmenen ainutlaatuista haplotypes voitiin päätellä käyttäen 4 riski muokkaamista alleeleja, joissa data censored taajuudella 1%.

Näistä viisi haplotyyppien osoittivat merkittäviä p-arvo permutaation testissä, joista kolme liittyvän kohonneeseen keuhkosyövän riskiä. Haplotyypin # 2, joka sisältää kaksi riskiä alleelien UGT1A6 19G ja 552C oli suurempi OR 13,57 (95% CI: 6,15-29,93) verrattuna haplotyyppi # 4 (OR: 2,65, 95% CI: 1,26-5,59), joka sisältää yhden riskin alleelin UGT1A6 552A ja haplotyyppi # 6 (OR: 2,35, 95% CI: 1,23-4,48), joka sisältää kaksi riski alleelin UGT1A6 19G ja 552C, ja yksi ”suojaava” alleeli UGT1A6 intronin 1 + 130T. Kaksi haplotypes liittyi heikentynyt keuhkosyövän riskiä, ​​mukaan lukien haplotyyppi # 3 (OR: 0,23, 95% CI: 0,12-0,43) ja haplotyyppi # 7 (OR: 0,13, 95% CI: 0,04-,44).

In vitro toiminnallinen luonnehdinta variantin UGT1A6 105TT

In vitro

, mRNA stabiliteetti testattiin jälkeen estämällä transkriptio käsittelemällä soluja aktinomysiini D (ActD). Variant UGT1A6 105TT mRNA oli stabiilimpi kuin villityypin huomattavasti korkeampi mRNA-tasolla havaittiin 4 tuntia (p = 0,039), ja 8 tuntia (p = 0,004) sen jälkeen, kun hoidon ActD (kuvio 1A). Lisääntynyt stabiilisuus variantin UGT1A6 105TT mRNA johti korkeampiin proteiinin ilmentymisen ja entsyymin aktiivisuus verrattuna villityypin 48 tuntia käsittelyn jälkeen ActD (kuvio 1 B, C ja D).

UGT1A6 * 1 ja UGT1A6 105TT konstruktit olivat transfektoitu stabiilisti HEK293-soluihin. (A) Solut kerättiin käsittelemällä ActD eri ajankohtana jopa 24 tuntia. Tiedot piirretään ovat ajan myötä muutoksia jäljellä oleva määrä UGT1A6 mRNA jälkeen ActD hoidon. Siellä oli merkittävästi korkeampi mRNA tasolla UGT1A6 105TT kuin UGT1A6 * 1 transfektoidut solut 4 tuntia (p = 0,039) ja 8 tuntia (p = 0,004) hoidon jälkeen ActD. (B) Western blot-analyysi. Solulysaattia käytettiin 5 x 10

5-solut osoitetussa aikoina (0, 8, 24 ja 48 tuntia) sen jälkeen, kun hoidon ActD. Oli alassäätöä proteiiniekspressiossa in UGT1A6 * 1 verrattuna UGT1A6 variantti 48 tuntia hoidon jälkeen ActD. UGT1A6 aktiivisuus määritettiin arvioimalla serotoniinin glukuronidi käyttäen lysaatti variantti UGT1A6 (VT) ja UGT1A6 * 1 (WT) 0 tuntia (C) ja 48 tuntia (D) sen jälkeen, kun ActD hoidon, jossa substraatin pitoisuudet vaihtelivat 0,5-30 mM serotoniinin. Toiminta ilmaistaan ​​reaktionopeus (nanomoolia serotoniinin glukuronidi muodostivat per minuutti per milligramma proteiinia).

Keskustelu

Tämä on ensimmäinen tutkimus, kuvaamaan yhdistyksen välillä UGT1A6 polymorfismien ja keuhkojen syöpä. UGT1A6 geeni on vastuussa vieroitus karsinogeenejä kuten BaP tupakansavusta [13] – [15]. Tai kvalitatiivinen muutoksia UGT1A6 ilmentyminen voi vaikuttaa nopeus Glukuronidaation siten muuttamalla riski sairastua keuhkosyöpään.

Useita polymorfismien on raportoitu 5′-säätelyalueen, eksonin 1 ja intronit UGT1A6 [24 ], [25]. Näistä kolme ei-synonyymejä polymorfismien kodoneissa 7, 181 ja 184 (UGT1A6 19T G, 541A G ja 552A C, vastaavasti), joita yhteisesti kutsutaan UGT1A6 * 2, on yleisimmin tutkittu. Se on luokiteltu ”alhainen aktiivisuus” variantti useille fenoliyhdisteitä, mukaan lukien aspiriini [26] ja liittyy alentunut suolen kasvainten näiden lääkkeiden pitkäaikaisia ​​aspiriinia [27].

Tässä tutkimuksessa, meillä oli osoitti, että yksilöiden UGT1A6 * 2 (haplotyyppi # 2 ja 6) olivat kasvaneet keuhkosyövän riskiä. Meidän havainto oli yhdenmukainen raportti vähensi glukuronidaation toiminnan yksilöiden UGT1A6 * 2 alleeli verrattuna villin tyypin [26]. Krishnaswamy.

et al

osoitti myös 50% pienempi UGT1A6 mRNA (p = 0,026) in kantajia UGT1A6 19T G polymorfismi verrattuna noncarriers mutta ilman merkittävää vaikutusta UGT1A6 proteiinipitoisuus tai glukuronidaatiota toimintaa [24]. On huomattava, että on olemassa ristiriitaisia ​​raportteja vähintään 2 tutkimuksissa, mikä viittaa siihen, lisääntynyt entsyymiaktiivisuus UGT1A6 * 2 allozymes [28], [29]. Kuitenkin lisääntynyt aktiivisuus variantti UGT1A6 allozyme eivät johtaneet lisääntynyt alustaan ​​raivauksen variantti ihmisen maksan mikrosomeissa [29]. On todennäköistä, että lukuun ottamatta entsyymin aktiivisuutta, mRNA: n hajoamisen voi olla vastuussa vaihtelevuutta on UGT1A6 aktiivisuuden.

Kaksi polymorfismien UGT1A6 105C T ja IVS1 + 130G T havaittiin liittyvän keuhkojen syöpäriskiä . UGT1A6 105C T on synonyymi SNP, joka sijaitsee eksonissa 1 UGT1A6 geenin. Vaikka polymorfismi ei johda laadullisia muuttaminen UGT1A6, meidän

in vitro

tulokset ovat osoittaneet, että T-alleelin liittyy lisääntynyt mRNA vakautta ja korkea UGT1A6 aktiivisuus proteiinimuunnelmaa verrattuna villin tyypin. Tämä voi selittää suojaavaa vaikutusta UGT1A6 105 T-alleelin vähentää keuhkosyövän riskiä. Lisäksi suojaavaa vaikutusta UGT1A6 105C T saattaa johtua sen käänteinen sidonnaisuudet UGT1A6 * 2 (UGT1A6 541A G ja 552A C).

UGT1A6 IVS1 + 130G T todettiin olevan vain SNP liittyy pienentynyt riski sairastua keuhkosyöpään vuonna monimuuttujamenetelmin. On epäselvää, kuinka UGT1A6 IVS1 + 130G T moduloi keuhkosyövän riskiä, ​​koska se sijaitsee ensimmäisessä introni alueen UGT1A6 geenin. In silico analyysi käyttäen Human Jatkaminen Finder-ohjelma (https://www.umd.be/HSF/) ehdotti, että tämä SNP ei vaikuta konservoituneen nukleotidin sivuliikkeen sivuston introni alueella (tietoja ei esitetty) ja se olisi todennäköisesti vaikuta liittämiseen toimintaan.

Vaikka löysimme UGT1A6 IVS1 + 130G T olevan kohtalainen kytkentäepätasapainossa UGT1A6 541A G (merkitään UGT1A6 * 5), se ei voi selittää suojaava vaikutus havaittiin. Vaikka UGT1A6 on hallitseva UGT1A isoformi ilmaistu keuhkoissa, muiden UGT1A isoformit (UGT1A1 ja 1A9) ilmaisi maksassa voi silti vaikuttaa systeeminen puhdistuma karsinogeenien liittyvät tupakoinnin [30], [31].

On mahdollista, että IVS1 + 130G T voi olla kytkentäepätasapainossa kanssa polymorfismien muiden UGT1A isomuotoja, joilla on tärkeä ”suojaava” rooli keuhkosyövän riskiä. Esimerkiksi, Saeki.

et ai

[32] osoittivat, että UGT1A6 IVS1 + 130G T on tiiviissä LD UGT1A9- * 22, korkea entsyymiaktiivisuus alleeli, joka tiedetään lisäävän transkriptiota. Lisäksi, UGT1A6 on osoitettu olevan kytkentäepätasapainossa UGT1A1 ja UGT1A7 [33] – [36]. Vaikka ei ilmaistu keuhkoissa, nämä UGT-isoformit on osoitettu olevan tärkeitä puhdistumaan BaP [30], [31].

Suurin vahvuus Tämän tutkimuksen on, että havainto oli validoitu itsenäisessä kohortin. Analyysi rajoitettiin yhteen etniseen ryhmään minimoimaan väärien positiivisten tulosten takia väestön heterogeenisuus. On kuitenkin useita rajoituksia tutkimuksessamme että tunnustamme. Ensinnäkin keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla yhteydessä ei iän, sukupuolen ja tupakointi historiaa. Toiseksi kaksi SNP, UGT1A6 19T G ja IVS1 + 130G T poikkesi Hardy Weinberg yhtälöstä. Poikkeama Hardy Weinberg yhtälöstä voi johtua genotyypitys virheitä [37], [38]. Meillä oli ottanut toimenpiteen poissulkemiseksi genotyypitys virhe käyttämällä sekä pyrosekvensointi ja suoralla sekvensoinnilla menetelmä tunnistaa variantin SNP tutkimuksessamme koehenkilöillä.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että UGT1A6 polymorfismit voivat moduloida keuhkosyövän riskiä. UGT1A6 105C T osoitettiin lisätä mRNA vakautta, joka tarjoaa uskottavan selityksen sen yhdessä alentunut keuhkosyövän riskiä. Tutkimuksemme osoittaa, että UGT1A6 genotyypityksen voidaan integroida keuhkosyöpä seulontastrategia auttaa tunnistamaan alttiita populaatioiden.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Luettelo PCR ja sekvensointialukkeita. Luettelo kaikista monistamiseen käytetyt alukkeet ja sekvenssin jokaisen kahdeksan UGT1A6 SNP: iden on esitetty, tietoa SNP rsid ja niiden sijaintia säädetään. Koko PCR-tuotteiden ja hehkutus lämpötila kullekin PCR-reaktio on myös esitetty. Biotinyloitua alukkeet pyrosekvensointi määritys on merkitty §.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0042873.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Dr.Michael H. Court (Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts) josta saimme plasmidivektorin koodaavan täyspitkän UGT1A6 * 1-sekvenssin.