Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tiedot tukevat rooli SHARP1, perus helix-loop-helix transkription repressori, säätelyyn pahanlaatuisten solujen käyttäytymistä useissa ihmisen syövissä. Ilmaisulla ja roolia SHARP1 kehittämisen aikana kohdun limakalvon syövän (EY) jää epäselväksi. Tässä osoitamme, että säätelyä SHARP1 tukahdutti kasvaimen angiogeneesiä vähentämällä hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α), esti solujen elävyyden ja kasvaimen kasvua EY. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että ilmentyminen SHARP1 negatiivisesti korreloivat kasvaimen vaiheesta, histologinen luokka, myometrisia invaasio, imusolmuke etäpesäke, verisuonten läpäisevyyttä myometrium ja HIF-1α ilme. Mekaaniset tutkimukset osoittivat, että SHARP1 vuorovaikutuksessa HIF-1a fyysisesti, ja proteiini taso HIF-1α ja mRNA-tasolla sen kohdegeenien (

VEGFA, ANGPTL4

ja

CA9

) pieneni SHARP1 hypoksiaolosuhteissa. Säätelyä SHARP1 EY: n haittasi hypoksian indusoiman angiogeneesin vähentämällä VEGF eritystä. Immunohistokemiallista analyysiä todentaa korrelaatio laski SHARP1 ilmaisun ja nousi mikroverisuonitiheys EY: kudoksissa. Lisäksi SHARP1 esti solujen elinkelpoisuutta EY solulinjoissa. N yli-ilmentyminen SHARP1 in vivo esti kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä, ja laski HIF-1α ilme. Tässä tutkimuksessa perustimme SHARP1 uutena tuumorisuppressoriproteiinia EY ja valottaa mekanismeja, miten SHARP1 esti EY etenemistä. Siksi SHARP1 voi olla arvokas ennustetekijöitä biomarkkeri EY etenemistä ja näyttää lupaavat uutena potentiaalisimmaksi antiangiogeenisten lääkkeinä ihmisen EC.

Citation: Liao Y, Lu W, Che Q, Yang T, Qiu H, Zhang H, et al. (2014) SHARP1 Estää Angiogeneesi endometriumsyöpätapausta vähentämällä Hypoksia-indusoituva Factor-1α Level. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10,1371 /journal.pone.0099907

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2014; Julkaistu: 11 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Liao et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (81272885, 81172476, 81072139, 81072140), säätiö Project Shanghai Municipal Science and Technology komissio (nro 13JC1404500) ja Ph.D. Ohjelmat Foundation of opetusministeriön Kiina (nro 20120073110090). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä (EY) on merkittävä syy syöpään liittyvien sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen naisten keskuudessa. Se on neljänneksi yleisin maligniteetti naisten keskuudessa Yhdysvalloissa oli arviolta 49500 uutta tapausta ja 8200 kuolemantapausta vuonna 2013 [1]. Vaikka alkuvaiheen EY usein onnistuneesti hoidettu kirurgisia toimenpiteitä, edenneen EY voi olla vaikeaa ja sen ennuste on huono [2], [3], erityisesti kun otetaan metastaattisen tai uusiutuva sairaus, jossa on mediaanielossaolosta vain 7 -12 kuukautta [4]. Nykyinen hoitovaihtoehtoja, kuten kohdunpoisto, hormonihoito, ja yhdistelmät säteilyn ja kemoterapia, ovat tehokkaita alkuvaiheen EY; kuitenkin tehokas tavoite hoitojen metastasoituneen tai toistuvia EY ei ole saatavilla [5], koska etiologiaa ja biologiset mekanismit tämän heterogeeninen tauti ei täysin tunneta. Siksi edelleen selvittäminen molekyylitason mekanismeista EY eteneminen on kiireellinen.

Angiogeneesi, muodostuu uusia verisuonia ennestään niistä, on merkittävä rooli kasvaimen kasvun eteneminen, ja etäpesäkkeitä [6], [7 ]. Aluksi angiogeeninen aktiivisuus puuttuu alussa kasvaimet. Koska kasvaimet kasvavat yli nykyisen tarjonnan korko, happi tyhjenee sisällä ydin. Tuloksena hypoksinen ehto (PO

2 10 mmHg [~1.5% O

2]) estää hajoamisen hypoksian indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) kautta VHL kasvaimia estävä, mahdollistaa trans-aktivoitumisen pro- angiogeenisten tekijöiden, joista merkittävin on verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [8] – [11]. Viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että HIF-1α /VEGF signalointireitille on osallisena endoteelisolujen proliferaatiota, erilaistumista, muuttoliike, ja verisuonten läpäisevyyttä [12]. Lisäksi esto uudissuonittumisen suppressio HIF-1α /VEGF-signalointireitin voi viivästyttää taudin etenemiseen ja ehkä jopa nälkää kasvainsolujen kuolemaan [13] – [15]. Kuten muutkin kiinteät kasvaimet, kasvun ja etäpesäkkeiden EY solujen riippuu angiogeneesiin [16]. Mekanismi taustalla Angiogeneesin sääntely on laajasti kuvattu muiden syöpien, mutta vain hädin tuskin tutkittu EY [15].

SHARP1 (tunnetaan myös bHLHE41 tai DEC2), jäsen transkription repressori alaryhmään perus spiraali silmukkainen-helix (bHLH) transkriptiotekijöitä [17], [18], on ilmaistu eri alkion ja aikuisen kudoksissa [19], [20]. Laaja näyttö viittaa siihen, se on keskeinen säätelijä syövän etenemisen suun kautta ja rintasyöpä, jossa sen vaikutuksia syöpäsolujen apoptoosin lisääntymistä, ja etäpesäkkeiden on laajasti tutkittu [21] – [24]. Lisäksi SHARP1 säätelee negatiivisesti VEGF ilmaisun [25], ja hiljattain tehty tutkimus osoittaa, että SHARP1 estää rintasyövän metastaasi [23]. On kuitenkin vielä tiedetä, ja jos on, miten SHARP1 edistää kehittymistä ja etenemistä EY, erityisesti mitä tulee angiogeneesiä, jossa HIF-1α /VEGF-reitin on mukana.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että vähentynyt ilmentyminen SHARP1 korreloi merkitsevästi huono kliinistä tulosta EY. Lisäksi ensimmäistä kertaa, osoitimme, että SHARP1 on tukahduttava rooli aikana EY etenemisen; Erityisesti SHARP1 esti angiogeneesiä HIF-1α-riippuvaisella tavalla ja voi olla arvokas markkeri antiangiogeenisesti hoidon valinnassa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyttiin Human Investigation eettinen komitea kansainvälisen Peace Maternity Child Hospital sidoksissa Shanghai Jiao Tong University. Näytteet EY ja normaalin kohdun limakalvon kudokset kerättiin saatuaan kirjallinen lupa potilailta. Eläin Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia koskevat ohjeet Hoito ja käyttö Laboratory Animals Kiinassa. Menettelyt hyväksynyt Department of Laboratory Animal Science Shanghai Jiao Tong-yliopiston School of Medicine. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä.

Potilaat ja näytteet

parafinoidut kudosnäytteistä saatiin 110 potilaalla on kohdun limakalvon syöpä ja 52 potilasta, joilla oli normaali endometrium joille tehtiin kirurginen resektio hoitoon muille sairaudet kuten myoma tai adenomyoosi International Peace Maternity Child Health Hospital sidoksissa Shanghai Jiao Tong-yliopiston vuodesta 2009 vuoteen 2013. Keskimääräinen ikä potilaiden EY oli 56,9 ± 8,8 vuotta (keskiarvo ± SD, mediaani, 57 vuotta alueella, 33-78 vuotta). Keskimääräinen ikä potilaalla normaali endometrium oli 53,9 ± 8,6 vuotta (keskiarvo ± SD, mediaani, 53 vuotta alueella, 34-70 vuotta). Ei ollut merkittävää eroa koskien potilaan ikä, jolloin EY ja kontrollinäytteiden verrattiin (

P

= 0,054). Vuonna kontrolliryhmään, kaikki näytteet olivat kohdunpoisto yksilö, joista 16 tapausta olivat postmenopausaalisia naisia, 17 tapausta olivat perimenopausal naisia ​​ja muut olivat peräisin premenopausal naisia. Vaiheet (I-IV) ja histologisia laadut (G1-G3) näistä kasvaimista perustettiin kriteerien mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) kirurgisen pysähdyspaikan järjestelmä (2009) [26]. Kukaan potilaista oli tehty hormonihoito, sädehoito tai kemoterapia ennen leikkausta.

immunohistokemia (IHC) ja arvioinnit

Kudosleikkeet (4 pm paksu) valmistettiin parafinoidut kudosnäytteet. Leikkeet poistettiin vaha ksyleenillä seurasi rehydratoitu arvostellaan alkoholia. Antigeeni haku suoritettiin etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, pH 9,0) 20 minuutin ajan kuumentamalla mikroaaltouunissa. Sitten endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla kohdissa 3% vetyperoksidilla 10 min, ja ei-spesifinen värjäytyminen estettiin inkuboimalla 10% normaalia vuohen seerumia 30 min. Leikkeitä inkuboitiin kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​SHARP1 (laimennussuhde on 1:100 10 ug /ml; Novus, Littleton, CO), hiiren monoklonaalinen vasta-aine HIF-1α (laimennussuhde on 1:50 5 ug /ml ; BD Biosciences, Bedford, MA), kanin monoklonaalinen vasta-aine CD34 (laimennussuhde on 1:100 5 ug /ml; Abcam, Cambridge, UK), ja kanin polyklonaalinen vasta-aine Ki67 (laimennussuhde on 1:100 kohteeseen 5 ug /ml; Epitomics, Burlingame, CA), kosteutetussa kammiossa 4 ° C: ssa yön yli ja sitten inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (laimennussuhde on 1:1000 1 ug /ml; Beyotime, Nanjing, Kiina) 30 min, mitä seurasi streptavidiinin peroksidaasi 15 minuutin ajan. Fosfaattipuskuroitua liuosta (PBS) käytettiin laimentamaan vasta-aineita. Peroksidaasiaktiivisuuden havaittiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiiniä tetrachloride. Kukin inkubaatio vaihe suoritettiin 37 ° C: ssa, ja sitä seurasi kolme peräkkäistä pesua PBS: llä 5 minuutin ajan kutakin. Lopuksi leikkeet dehydratoitiin alkoholin ja kirkastettiin ksyleenissä.

Pisteytys suoritettiin kaksi riippumatonta patologia jotka sokaissut kliiniset ja patologiset tiedot. SHARP1 värjäytyminen arvioitiin ottaen huomioon sekä solujen määrä, joilla on positiivinen ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä ja voimakkuutta värjäytyminen kunkin positiivisen tumassa ja sytoplasmassa. Positiivisten solujen luokiteltiin seuraavasti: 0 (alle 5%); 1 (5-25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 ( 75%). Intensiteetti luokiteltiin seuraavasti: 0 (negatiivinen); 1 (heikko); 2 (kohtalainen); 3 (voimakas). Lopullinen pistemäärä laskettiin kertomalla kaksi tulokset edellä. Kymmeniä 0-2 määriteltiin ”” negatiivinen ilmaus ””; tulokset 3-8 kuten ”” heikosti positiivinen ilmaisu ”, ja tulokset 9-12 kuin ”” vahvasti positiivinen ilmaisu ” [27]. Sillä HIF-1α värjäys, vain prosenttiosuus tumma, homogeenisesti värjäytyneet ytimet arvioitiin, ja sytoplasminen värjäys ohitettiin. Sitä pidettiin positiivisena, kun 1% ydinten värjättiin [28]. Mikroverisuonitiheys (MVD) arvioitiin IHC värjäys CD34, jossa korostetaan kasvain /kudoksen verisuonitus. Mikroverisuonten laskettiin kolmella eri aloilla kohti § seuraavasti: Levyt ensin skannattu alle pienitehoisia (x 100) määrittää kolme ” kuormittajat ” tai alueita enimmäismäärä mikrosuonten, niin positiivinen-värjätään verisuonia valituilla alueilla analysoitiin × 400 suurennus [29].

Cell Culture, Hypoxic ehdot ja reagenssit

Ihmisen EY solulinjat (Ishikawa ja RL95-2) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolujen (HUVEC) saatiin Key-GEN Biotech (Nanjing, Kiina). Ishikawa ja RL95-2-soluja kasvatettiin DMEM /F12 (Gibco, Auckland, Uusi-Seelanti) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA). HUVEC-soluja viljeltiin RPMI1640 (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Soluja viljeltiin 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Sillä hypoksia kokeiluja, soluja kasvatettiin in vitro hypoksinen ( 0,1% O

2) säiliön järjestelmä (BD Diagnostics, Sparks, MD). Vakioitu alusta (CM), proteiinia ja RNA kerättiin välittömästi, kun solut poistettiin hypoksinen astiaan.

Transient ja vakaa Transfektiot varten SHARP1-yli-ilmentymisen

SHARP1 ekspressioplasmidin pez-M02-SHARP1 ja tyhjällä plasmidilla Preceiver-M02-NEG ostettiin GeneCopoeia (Guangzhou, Kiina). Ohimenevä transfektio suoritettiin 70% konfluentteja Ishikawa-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Stabiilia ekspressiota varten Ishikawa soluissa, ihmisen SHARP1 geeni kloonattiin lentivirusvektoreita kanssa Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP käyttämällä Gateway-tekniikalla (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaan käyttöoppaasta (http: //products.invitrogen. com /ivgn /tuote /12538120).

sirna (siRNA) B

siRNA: ita syntetisoitiin GenePharma Biotech (Shanghai, Kiina). Sekvenssit on esitetty taulukossa 1. siRNA transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia edellä kuvatulla tavalla.

RNA: n eristäminen ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ensimmäisen juosteen cDNA käänteiskopioitu 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen Prime Script RT reagenssipakkaus (TaKaRa, Dalian, Kiina), ja cDNA analysoitiin qPCR käyttämällä SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa). Sillä qPCR kokeissa arvot

y

akseli edustaa 2

(- ΔΔCt), jossa ACt on ero Ct varten mielenkiinnon kohteena olevan geenin, ja että koodaavan geenin β-aktiini ja ΔΔCt on erotus ACt kokeellisen ryhmän ja kontrolliryhmän tai ensimmäisen kaistan [30]. Alukesarjat on esitetty taulukossa 2. Tiedot saatiin kolmena kappaleena kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Western-blottaus

Solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (Beyotime, Nanjing, Kiina) ja proteaasinestäjä fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF; Beyotime). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit (Beyotime). Yhtä suuret määrät proteiinia panostettiin kuhunkin kaistan SDS-PAGE-geelillä proteiinien erottamiseen ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). Membraanit blokattiin ja inkuboitiin sitten kanin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​SHARP1 (laimennussuhde on 1:500 2 ug /ml; Novus), hiiren monoklonaalinen vasta-aine HIF-1α (laimennussuhde on 1:200 5 ug /ml; Abcam), ja kanin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan, β-aktiini (laimennussuhde on 1:5000 0,2 ug /ml; Epitomics) erikseen 4 ° C: ssa yön yli. Sitten peroksidaasi-kytketty toissijaisen anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineiden (laimennus suhteessa 1:5000 0,2 ug /ml; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) käytettiin havaitsemaan sitoutuneiden primaaristen vasta-aineiden.

Co-immunosaostus (Co-IP) Pitoisuus

tutkia endogeenisen SHARP1 /HIF-1α sitova, Ishikawa soluja inkuboitiin hypoksiaolosuhteissa 24 tuntia ennen korjuuta. Sitten kaksi konfluentteja 10 cm: n maljoihin ja solut hajotettiin, kuten yllä on kuvattu. Ennen immunosaostusta, kokosoluliuotteista inkuboitiin 1 ug hiiren IgG: tä ja 20 ui proteiini A + G-agaroosia helmilietettä (Beyotime) 4 ° C: ssa 2 h poistaa epäspesifisen sitoutumisen. Sentrifugointi suoritettiin sitten ja supernatantti otettiin talteen ja inkuboitiin hiiren anti-ihmis-HIF-1α (lopullinen konsentraatio: 10 ug /ml; Abcam) tai kontrolli hiiren IgG: tä (lopullinen konsentraatio: 10 ug /ml; Beyotime) yön yli. Seuraavana päivänä, 40 ui proteiini A + G-agaroosihelmille lietteeseen lisättiin reaktioseokseen seoksia ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Co-immunosaostettiin proteiinit analysoitiin western-blottauksella, kuten yllä on kuvattu.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) B

Quantikine ihmisen VEGF kit ostettiin R 5 mg /ml) reagenssia (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin elatusaineeseen. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä mikrolevylukijalla (malli 680, Bio-Rad, Hercules, CA). HUVECrlle elinkelpoisuus havaitsemiseksi, 2 x 10

4 HUVEC suspendoitiin 1 ml: lla laimennettua CM (laimennus 1:10) ja ympättiin 96-kuoppalevyille 2000 solua /kuoppa. 24 tunnin inkubaation, HUVEC elinkelpoisuus havaittiin MTT-menetelmää edellä kuvatulla tavalla. Kussakin kokeessa ja kunkin kunto, solujen elinkelpoisuus arvioitiin kolmena kappaleena, ja kokeet toistettiin kolmesti.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoversio 17,0 (Chicago, IL ). Arvot edustavat keskiarvoa ± SD. Tiedot analysoitiin parittomalla Studentin

t

-testi tai yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) monimuuttujille. Χ

2 testi taulukoita käytettiin vertaamaan kategorisen datan. Spearmanin korrelaatiokerrointa testiä käytettiin korrelaatioilmaisun.

P

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

SHARP1 on vaimentua EY: n ja korreloi kliinis Ominaisuudet

vaikutuksen määrittämiseksi SHARP1 ilmentymisen EY kehittymistä ja etenemistä, valitsimme 52 tapausta normaalin kohdun limakalvon kudos, 97 tapausta endomet- kohdun limakalvon syöpä (ETY) kudosten ja 13 tapausta papillaarisen serooseista EY tai kirkas solu EY kudosta edustajina tyyppi I ja tyyppi II EY, tässä järjestyksessä. Tyyppi I EY, esiintyy noin 85%: lla potilaista, usein näyttää ER positiivinen. Kasvaimet tämäntyyppisten yleensä hyvin eriytetty, ja huono laatu ja hyvää ennustetta. Sitä vastoin tyypin II, joka koostuu enimmäkseen vakavien ja selkeät cell carcinoma, tyypillisesti syntyy atrofinen endometrium mekanismilla liity estrogeenin altistumista. Tämä tyyppi on yleensä ER-negatiivisen, ja huonosti eriytetty, korkealuokkaisesta ja huonon ennusteen. Vaikka tyypin II hankittua osuus on noin 15% tapauksista, he ovat vastuussa noin 50% kaikista pahenemisvaiheiden [31]. Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että SHARP1 oli vahvasti ilmaistu sytoplasmassa ja tumassa useimpien solujen normaalissa endometrium mutta osoitti vähensi ilmentymistä EY (

P

= 0,00046, taulukko 3, kuvio 1A-C).

edustaja mikrovaloku- SHARP1 ja HIF-1α värjäytymisen kohdun limakalvon kudoksissa (alkuperäinen suurennos: 400 × palotiloissa, 200 × kaikille muille, asteikko bar, 100 m). Kentät A-C esittävät immunohistokemiallisella värjäyksellä SHARP1 normaalissa kohdun limakalvon (A), endomet- kohdun limakalvon syöpä (ETY) (B), ja papillaarinen vakavien EY (C). Paneelit D-F osoittavat immunohistokemiallisella värjäyksellä SHARP1 histologisissa grade 2 (G2) ETY (D), G3 ETY (E), ja selkeä solujen EY (F). Paneelit G-I osoittavat immunohistokemiallinen värjäytyminen HIF-1α G2 ETY (G), G3 ETY (H), ja selkeä solu EY (I) vastaavaan samoilla alueilla samaa tapauksissa SHARP1 värjäystä.

kliinis ominaisuudet 110 EY potilasta yhteenveto taulukossa 4. verrattuna ETY SHARP1 ilmentyminen väheni merkittävästi tai kadonnut papillaarisen serooseista EY tai kirkas solujen EY (

P

= 0,017), joka on eniten aggressiivinen tyyppisiä EY. Lisäksi SHARP1 ilmaisu väheni selvästi myöhäisvaiheen (vaihe III tai IV) tai korkea-asteen (G3) EY verrattuna varhaisvaiheen (vaihe I tai II) tai huonolaatuisen (G1, G2) EY (

P

= 0,017 ja

P

= 0,001, tässä järjestyksessä). Lisäksi meillä on myös havaittu vahva käänteinen korrelaatioita SHARP1 ilmaisun ja myometrisia invaasio (

P

= 0,002), imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,005), ja verisuonten läpäisevyyttä myometrium (

P

= 0,021). Emme kuitenkaan löytäneet merkittäviä korrelaatioita SHARP1 ja muut ennusteeseen viittaavia muuttujia, kuten ikä ja ilmentyminen estrogeenireseptori, progesteroni reseptorin, ja p53.

ilmentyminen SHARP1 korreloi käänteisesti HIF-1α EY: n

Voit selvittää alennetun SHARP1 ilmaisu korreloi HIF-1α ilmentyminen kasvaimen kudoksissa, immunohistokemiallisella värjäyksellä HIF-1α suoritettiin 104 110 EY kudosnäytteet (loput kuusi yksilöt puuttuvat tai vahingoittuneet ). Niistä 31 oli vahvasti positiivinen SHARP1 (29,8%), ja 77 104 näytteet olivat positiivisia HIF-1α (74,0%). Vain 16 tapausta olivat vahvasti positiivisia SHARP1 ja positiivisia HIF-1α (15,4%). Meidän kliiniset tiedot ovat ensimmäiset todisteet siitä, että on olemassa vahva käänteinen korrelaatio SHARP1 ja HIF-1α ilmentymisen EY (

P

= 0,003, taulukko 5, kuvio 1 D-I).

SHARP1 vaimentaa ilmentymisen HIF-1α proteiini ja sen Downstream Geenit EY Cell Lines

pohjalta meidän kliinisten löydösten ehdotimme potentiaalinen suhde SHARP1 ja HIF-1α. Käyttämällä qPCR ja Western blotting, huomasimme, että

SHARP1

taso kohosi kaksinkertaiseksi n solulinjassa RL95-2 verrattuna Ishikawa solulinjan, jotka molemmat peräisin adenokarsinooma kohdun limakalvoa (kuvio 2A) . Lisätutkimuksia SHARP1 toiminta sekä sen korrelointia HIF-1α, me upregulated SHARP1 käyttäen SHARP1 ekspressointiplasmideja Ishikawa soluissa ja pudotti SHARP1 käyttämällä siRNA RL95-2 soluissa. Transfektiotehokkuutta vahvistettiin 48 h ja 72 h transfektion jälkeen mRNA ja proteiini tasoilla, vastaavasti (kuva S1).

(A) ilmentyminen SHARP1 Ishikawa ja RL95-2 solujen määritettynä qPCR (vasen ) ja western-blottauksella (oikealla). (B) Western blot-analyysi ohjaus ja SHARP1 yli-ilmentäviä Ishikawa-soluja viljeltiin ilmoitetun happipitoisuus 24 tuntia. (C) Western blot analyysi vaikutuksista SHARP1 ehtyminen RL95-2 soluissa 24 tunnin kuluttua osoitetussa happipitoisuus. (D) qPCR analyysi

HIF-1α

mRNA: n ohjaus ja SHARP1 yli-ilmentäviä Ishikawa-soluja (vasemmalla) ja RL95-2-soluissa, jotka oli transfektoitu ohjaus- tai SHARP1 siRNA (oikealla) inkuboitiin ilmoitetuilla happipitoisuus 24 tuntia. (E) samanaikainen immunosaostus (Co-IP) endogeenisen HIF-1α endogeenisen SHARP1 uutteista Ishikawa soluja. Tähti osoittaa taustan bändi johtuvat rajat reaktio immunoglobuliinien (IgG: iden). (F) qPCR (vasemmalla) ja western-blottauksella (oikealla) analyysi

SHARP1

Ishikawa soluja inkuboitiin osoitetussa happipitoisuus 24 tuntia. (G) qPCR analyysi

VEGFA

,

ANGPTL4

, ja

CA9

valvonta- ja SHARP1 yli-ilmentäviä Ishikawa-soluja inkuboitiin osoitetussa happipitoisuus 24 tuntia. (H) qPCR analyysit

VEGFA

,

ANGPTL4

, ja

CA9

in RL95-2-soluissa, jotka oli transfektoitu valvontaa tai SHARP1 siRNA: t ja inkuboitiin osoitetulla hapen tasot 24 tuntia. Ohimeneviä transfektioita, plasmidi (1,6 ug /ml) ja siRNA (40 pmol /ml) käytettiin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kokeen yhdestä edustavasta kokeesta kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001; NS, ei merkitsevä). Kaikkien qPCR analyysit, ekspressiotasoja verrattiin p-aktiini, ja data normalisoitiin ilmaisu on esitetty ensimmäisessä sarakkeessa.

SHARP1 yli-ilmentyminen väheni merkittävästi HIF-1α-proteiinin tason Ishikawa soluja hypoksia (kuvio 2B). Sitten tutki endogeeninen SHARP1 oli merkityksellinen estäjä HIF-1α-proteiinin tasot. SHARP1 ehtyminen käyttämällä siRNA kasvoi HIF-1α-proteiinin tason RL95-2 soluissa hypoksiaolosuhteissa (kuvio 2C). Kuitenkin HIF-1α proteiini tuskin havaittiin molemmissa solulinjoissa viljeltynä normoksia. Samaan aikaan mitään merkittävää muutosta

HIF-1α

mRNA-tasolla havaittiin Ishikawa soluissa yliekspressoidaan SHARP1 tai RL95-2 soluja ehtyminen SHARP1 (kuvio 2D). Olemme myös havainneet fyysinen assosiaatio HIF-1α ja SHARP1 klo endogeenisten tasojen Ishikawa soluissa hypoksiaolosuhteissa käyttäen samanaikainen immunosaostus määritys (kuvio 2E). Kiehtovan,

SHARP1

ilmentymistä koholla Ishikawa soluissa kun ne viljeltiin hypoksiaolosuhteissa 24 h (kuvio 2F). Lisäksi HIF-1α pudotus käyttämällä siRNA laskenut SHARP1 ilmaisu hypoksiaolosuhteissa (kuvio S2A).

Voit testata, onko SHARP1 toiminnallisesti vaikuttaa HIF-1α aktiivisuutta, qPCR käytettiin havaitsemaan eroja tasojen valitun HIF-1α tavoite geenitranskriptien. Arvioimme koodaavat geenit verisuonten endoteelikasvutekijä A (

VEGFA

, isoformia VEGF on keskeisen tärkeä tuumoriangiogeneesissa ja sillä on keskeinen merkitys endoteelisolujen lisääntymistä, eloonjääntiä, ja läpäisevyys [7], [10 ], [12], [16], [32]), angiopoietiini kaltainen 4 (

ANGPTL4

), ja hiilihappoanhydraasi 9 (

CA9

). Erityisesti nämä geenit transkriptionaalisesti yliaktiivista hypoksiaolosuhteissa Ishikawa soluissa, kun taas SHARP1 ilmaisu kostutetulla nämä inductions (kuvio 2G). Toisaalta, SHARP1 pudotus stimuloi transkription näiden geenien RL95-2 soluja hypoksian (kuvio 2H). Ilmaisu Näiden geenien ei kuitenkaan merkittävästi vaikuta SHARP1 voimistumista tai downregulation alla normoksia. Lisäksi downregulation HIF-1α käyttämällä siRNA heikennettyjä mRNA ilmaus

VEGFA

,

ANGPTL4

ja

CA9

Ishikawa soluissa hypoksiaolosuhteissa (kuvio S2B).

SHARP1 estää angiogeneesin

HIF-1α on päällikön säätelijä tuumoriangiogeneesin [33], ja SHARP1 estivät

VEGFA

mRNA ilmaisun tutkimuksessamme (kuvio 2G, vasen paneeli). Lisäksi teimme ELISA havaitsemiseksi VEGF eritystä väliaine (CM) Ishikawa soluja. SHARP1 yli-ilmentyminen osittain vähensi VEGF: n eritystä aiheuttama hypoksia Ishikawa-soluja (kuvio 3A). Niinpä tutkittava impingement SHARP1 on HIF-1α /VEGF ilmaisu vaikuttaa hypoksia laukaisema angiogeneesin EY. Käytimme useita lähestymistapoja tutkia, onko ja miten SHARP1 voisi säädellä käyttäytymistä endoteelisoluissa. CM kerättiin Ishikawa-soluja, jotka on transfektoitu tyhjällä plasmidilla tai SHARP1 täyspitkän plasmidiin normoksia tai hypoksia 24 tuntia. Huomattavaa on, että elinkelpoisuus ja muuttoliike kyky HUVEC stimuloitiin CM alkaen hypoksisia Ishikawa soluista, kun taas CM alkaen hypoksinen Ishikawa soluista, jotka yli-ilmentynyt SHARP1 esti näitä vaikutuksia (kuvio 3B ja C). Koska mitään selvää vaikutusta SHARP1 VEGF eritykseen, HUVEC elinkelpoisuus ja muuttoliike havaittiin alle normoksia, käytimme CM alkaen Ishikawa transfektoitujen solujen SHARP1 tai tyhjiä plasmideja hypoksiaolosuhteissa varten seuraavissa kokeissa, ja CM alkaen Ishikawa transfektoitu tyhjällä plasmideilla viljellä normoksia kuin negatiivinen kontrolli. Sen määrittämiseksi, onko SHARP1 muutettu funktionaalinen käyttäytyminen endoteelisolujen, HUVEC asetettiin tyvikalvon matriisin aiheuttaa kapillaari-, kuten putken muodostumisen läsnä ollessa CMS edellä. -Putken muodostumiseen kvantitoitiin laskemalla keskiarvo kokonaispituus putkien kolmesta satunnaisesti valitusta alalla. Samoin CM mistä SHARP1 yliekspressoivia Ishikawa soluissa esti merkittävästi hypoksian stimuloi putken muodostumiseen ja haarautuvia (kuvio 3D).