Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on aggressiivinen pahanlaatuisen rajoitettu hoitovaihtoehtoja. Olemme aikaisemmin havainneet, että PARP yliekspressoituu SCLC ja että kohdistaminen PARP vähentää solulinjan ja kasvaimen kasvua kokeellisissa malleissa. Kuitenkin SCLC solulinjoissa PI3K /mTOR-reitin aktivaatio oli suhteellisesti vähemmän herkkiä PARP eston. Tässä tutkimuksessa tutkimme proteomic muutoksia PI3K /mTOR ja muut polkuja, jotka seuraisivatkin PAPR eston ja /tai pudotus

in vitro

ja

in vivo

. Käyttämällä käänteisfaasin proteiinijärjestelmäksi, löysimme proteiinit merkittävimmin voimistunut hoidon jälkeen PARP-inhibiittorit olaparib ja rucaparib olivat PI3K /mTOR-reitin (p-mTOR, p-AKT, ja PS6) (p≤0.02). Lisäksi joukossa kaikkein selvästi alassäädetty proteiinit olivat LKB1 ja sen tavoitteet AMPK ja TSC, joka säädellä negatiivisesti PI3K koulutusjakso (p≤0.042). Sen jälkeen PARP pudotus solulinjoissa, fosforyloitu mTOR, AKT ja S6 kohotettiin ja LKB1 signalointi väheni. Global ATP pitoisuudet kasvoivat seuraavat PARP esto (p≤0.02) johtaa meidät oletuksen, että havaittu lisääntynyt PI3K /mTOR-reitin aktivaatio seuraavat PARP esto tuloksia väheni ATP käyttö ja myöhemmin lasku stressivaste signaloinnin kautta LKB1. Näiden tulosten perusteella, me olivatko yhteistyössä kohdistaminen kanssa PARP ja PI3K-estäjä (BKM-120) toimisi paremmin kuin kumpikaan yksittäinen aine yksinään. Suurin osa SCLC solulinjojen olivat herkkiä BKM-120 kliinisesti saavutettavissa annoksilla, ja cMYC ilme oli vahvin biomarkkereiden vasteen. Kliinisesti saavutettavissa annoksilla talazoparib (voimakkaimmista PARP estäjää SCLC kliinistä testausta) ja BKM-120, additiivinen vaikutus havaittiin

in vitro

. Kun testattiin kahdessa SCLC eläinmalleissa, additiivista suuremman vuorovaikutuksen nähtiin (p≤0.008). Tässä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että yhdistämällä PARP ja PI3K-estäjien tehostaa vaikutusta kummankaan aineen yksinään prekliinisissä malleissa SCLC, oikeuttaneet lisätutkimuksia näiden yhdistelmien SCLC potilailla.

Citation: Cardnell RJ, Feng Y, Mukherjee S , Diao L, Tong P, Stewart CA, et al. (2016) aktivointi PI3K /mTOR Pathway seuraavat PARP esto in pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10,1371 /journal.pone.0152584

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2015 Hyväksytty: 15 maaliskuu 2016; Julkaistu 7 huhtikuuta 2016

Copyright: © 2016 Cardnell et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat MD Anderson Cancer Center Support Grant (NIH P30 CA016672); University of Texas-Lounais ja MD Anderson Cancer Center Lung SPORE (5 P50 CA070907); kautta antelias avustukset, The University of Texas MD Anderson Keuhkosyöpä Moon Shot ohjelma; NIH 1R01 CA168484-01 (JVH); David Bruton, Jr., omistetun puheenjohtaja (JVH); Rexanna n säätiö Fighting Lung Cancer (https://www.rexannasfoundation.org/) (JVH); MD Anderson Cancer Center lääkäri tutkijan palkinto (LAB); Lee Clark Fellowship of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, tukee Jeane F. Shelby stipendirahastossa (LAB); NCI Syöpä Clinical tutkija Team Leadership Award (P30 CA016672) (LAB); Sheikh Khalifa Bin Zayed Al Nahyan instituutin Henkilökohtainen Cancer Therapy: n (IPCT n) Center for Professional Education and Training (LAB); National Lung Cancer Research Partnership, mahdollisti North Carolina Keuhkosyöpä Partnership (https://www.freetobreathe.org/) (LAB); Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB); LUNGevity Foundation (https://www.lungevity.org/) (LAB); ja Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research (https://kimmel.org/) (LAB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: YF ja YS ovat työntekijöitä BioMarin Pharmaceutical Inc. JVH palvelee neuvottelukunnissa ja AstraZenica, Abbvie, Novartis ja Genentech. Tämä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on kaikkein aggressiivinen muoto keuhkosyöpä, jossa on 5 vuoden eloonjäämisaste vain 6% [1]. On noin 30000 kuolemat SCLC vuosittain Yhdysvalloissa (joka muodostaa 13% keuhkosyövässä), mikä SCLC yksin 8

th johtava syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa vuonna 2011 [2, 3]. Useimmat SCLC vastata kemoterapiaa ja säteily aluksi. Kuitenkin uusiutuminen on lähes universaali ja suurin osa potilaista edelleen systeemisen hoidon ei tuota vastausta. Toisin kuin ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC), SCLC ei ole tällä hetkellä hyväksyttyjä hoitomuotoja kehitettäessä kanssa osoittivat hyötyä potilaille. Siksi uusien, aktiivinen, ja mahdollisesti kohdennettuja lääkkeitä hoitoon SCLC on suuri lääketieteellinen tarve.

aiemmin raportoitu, että poly-ADP riboosi-polymeraasi 1 (PARP1) yli-ilmennetään SCLC, tunnistaa PARP mahdollisena terapeuttisena kohteena tämä syöpä [4]. Lisätyötä ryhmämme on osoittanut, että PARP1 /2-estäjät talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281), ja rucaparib (CO-338, AG 014699) on yhden aineen aktiivisuus kokeellisissa malleissa [4, 5]. Vaikka PARP-inhibiittorit ovat myöhäisessä vaiheessa kehityksen munasarjojen syöpien (olaparib hyväksytty, rucaparib vaihe 3), perustuu tähän prekliiniset tiedot, useat kliiniset tutkimukset PARP estäjiä käydään SCLC vaikutuksen tutkimiseksi näiden lääkkeiden yksittäisinä aineina tai yhdessä kemoterapian (faasi I-talazoparib, vaiheen II olaparib ja veliparib) [6]. Faasin I tutkimuksessa yhden aineen talazoparib, havaitsimme osittaisia ​​vasteita potilasalaryhmässä, joilla oli uusiutunut SCLC [7]. Kuitenkin, kuten muita kohdennettuja lääkkeitä, tunnistamiseen liittyviä mekanismeja synnynnäisen ja hankitun lääkeresistenssin ja yhdistelmäkäyttö lisätä hoitovaste ja /tai kesto on kriittinen optimointiin kliininen käyttö näiden lääkkeiden [7, 8].

aiemmissa pre-kliinisessä työssä, käyttäen paneelia 8 SCLC solulinjojen me korreloivat solulinjan herkkyyttä PARP esto kunkin solulinjan n proteomic profile [5]. Solulinjat, joilla on suurimmat aktivoituminen PI3K /mTOR-reitin olivat vähiten herkkiä talazoparib; fosforyloituine (p) -AKT (T308) ja p-AKT (S473) kuin alkuun merkkiaineiden vastus [5]. Geneettisten muutosten PI3K /mTOR-reitin eivät ole epätavallisia SCLC [9, 10], jossa tyypillisesti toisiaan poissulkevia muutokset

PIK3CA

,

PTEN

,

AKT2

,

AKT3

,

RICTOR

tai

mTOR

löytyi 36%: lla potilaista [10]. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, PI3K-estäjien kuten PIK75 ja PF-4989216 olevan aktiivisuutta SCLC malleissa, joissa

PIK3CA

mutaatioita, mutta ei

PTEN

puute, mikä osoittaa mahdollisen tehtävän PI3K /mTOR kohdistetun hoidon SCLC [11, 12]. Tähän havaintoon liittyy, aiemmat raportit rintasyövän ovat osoittaneet, että hoito PI3K estäjän viivästynyt kasvaimen kasvua mutta kasvoi indikaattorit DNA vaurioita kuten poly-ADP riboosi (PAR) [13, 14]. Kun taas PARP-inhibitio yksin näiden rintasyövän mallit vain kohtalaisen heikennetty kasvu, yhdistelmä PARP ja PI3K inhibitio oli erityisen voimakas tukahduttaa kasvua [13, 14].

proteomiikka-analyysi paljasti käänteinen korrelaatio aktiivisuus PI3K /mTOR polku ja vastaus talazoparib

in vitro

[5], me arveltu, että lisäämällä PI3K /mTOR esto saattaa edelleen herkistää SCLC PARP-inhibiittorit. Ensin tutkittiin SCLC solulinjoissa solunsisäistä vastaus PARP eston, havainnoimalla lisääntynyt PI3K /mTOR signalointi seuraavat PARP eston.

Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että PI3K /mTOR signalointi lisääntyy seuraavien eston PARP SCLC ja että tämä voidaan ajaa alentamalla maksan kinaasi B1 (LKB1) signalointi-muutokset validoitu PARP1 knockdown. Näin ollen tutkimme antituumorivaikutukset yhdistämällä PARP estäjä, jolla on PI3K-spesifinen estäjä prekliinisissä malleissa SCLC. Yhdistelmä tutkimuksia kohdistaminen PARP ja PI3K

in vitro

paljasti lisäaineena vuorovaikutus näiden kahden estäjien lisääntymismäärityksissä. Eläinkokeet paljastivat, että tämä yhdistelmä on suurempi vaikutus kuin kumpikaan lääke yksinään vähentämään kasvaimen tilavuuden, luodaan vahva perusta erotukselle tämän yhdistelmän osaksi kliinisissä tutkimuksissa SCLC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

Ihmisen SCLC solulinjat COR-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , H1930, H196, H1963, H2081, H209, H211, H2141, H2171, H2195, H2227, H2330, H250, H345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, ja SHP-77 saatiin ATCC (Manassas, VA) tai Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); GEMM-solulinjat KP1, peruskurssi KP3, Kp11, ja KP12 [15] ja ihmisen potilaasta peräisin ksenografti (PDX) johdettu solulinja NJH29 olivat kaikki jalomielinen lahjoitus tohtori Julien Sage (Stanfordin yliopisto, Stanford CA). Kaikki solut kasvatettiin ehdotettu väliaineessa, jota oli täydennetty naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Soluja siirrostettiin vähemmän kuin 6 kuukauden kuluessa.

Proteiini analyysi

RPPA ja western blot-analyysi, soluja käsiteltiin kahtena kanssa 1 uM olaparib (Selleck Chemicals, Houston TX), rucaparib ( Selleck Chemicals, Houston TX), tai talazoparib (BioMarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western-blotit ja PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), AKT pT308 (cs9271), AKT (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα pT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signaling Technlogy, Danvers MA), ja aktiini (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX).

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmäksi

Protein lysaatit olivat kerättiin puskuriin, joka sisälsi 1% Triton X-100, 50 mmol /L HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L NaCl, 1,5 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /l EGTA: a, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /l Nappi, 10% glyserolia, 1 mmol /l PMSF, 1 mmol /l Na

3Vo

4, ja 10 mg /ml aprotiniinia. Näytteitä määrällisesti ja proteiinijärjestelmien painettiin lysaateista ja värjättiin kuten aikaisemmin on kuvattu [4, 16]. Lyhyesti, dia kuvat kvantifioitiin käyttäen MicroVigene 4,0 (VigeneTech, Carlisle, MA). Paikalla taso raakadataa käsitelty käyttämällä R paketti SuperCurve [17-19], joka palauttaa arvioitu proteiinipitoisuus (raaka pitoisuus) ja laadunvalvonta (QC) pisteet kunkin kuvan. Vain liukuu kanssa QC pisteet 0,8 käytettiin myötävirtaan analyysiä. Raaka pitoisuus data normalisoitiin mediaani-keskitys kunkin näytteen kaikkien proteiinien korjata lastaus bias.

Proliferaatiomääritykset

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 2000 solua kuoppaa kohti kolminkertaisena kunkin solulinjan. 24 tunnin jälkeen solut kussakin kuopassa käsiteltiin 24 tuntia PARP-inhibiittorin (talazoparib) ja /tai PI3K-estäjä (BKM-120, Selleck Chemicals, Houston TX) tai ajoneuvon hallinnan. Neljä päivää myöhemmin, lisäkasvua tutkittiin Cell Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). Yhden-lääkehoidot, mediaani estävä pitoisuus (IC

50) arvot arvioi drexplorer ohjelmisto [20]. Erityisesti kunkin lääkeyhdistelmä (kullakin annostasolla), havaitun (tai kokeellinen) yhdistämisen vaikutusta verrattiin ennustettu additiivinen vaikutus. Data myöhemmin esitetty prosentteina kokeellisen vaikutuksen suhteen ennustettu additiivinen vaikutus (1,1 = + 10%; 1 = 0%; 0,9 = -10%). Jos esimerkiksi lääkkeestä vähentää suhteessa leviämisen 0,8 ja huumeiden B 0,7, niin ennustettu additiivinen vaikutus olisi 1 – ((1-0,8) + (1-0,7)) = 0,5. Jos havaittu (kokeellinen) yhdistämisen vaikutusta suhteelliseen proliferaatio on sitten 0,3, sitten havaittu vaikutus on suurempi kuin ennustettu vaikutus yhdistelmän [(1-0,3) /(1-0,5) = 1,4]. Käyttäen 10% yli tai alle ennustetun lisäaine vaikutus kuin cut-off, me sitten annetaan seuraavat ryhmät: Havaittu /ennustettu 1,1 = suurempi kuin lisäaine; Havaittu /ennustettu 0,9 = alle lisäaine; Havaittu /ennusti ≤1.1 ja ≥0.9 = lisäainetta. Huumeiden yhdistelmissä MacSynergy II lähestymistapa [21], joka perustuu Bliss Independence malli [22] toteutettiin laskemiseen erilaisia ​​mittareita, kuten synergistisiä tilavuus, antagonististen tilavuus, kokonaismäärän, ja ylimääräinen tappaa prosenttiosuus [23].

Gene pudotus

vakaa proteiini knockdown lentivirusten hiukkasia, jotka koodaavat kahta erilaista lyhyen hiusneula-RNA: iden (shRNAs) kohdistaminen PARP1 ja ryntäily ohjaus shRNA (pGIPZ lentivirusvektorilla, Open Biosystems jako Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) valittiin ja nimettiin PARP1-shRNA-1, PARP1-shRNA2, ja SCR-shRNA, vastaavasti. PARP1 shRNA sekvenssit olivat seuraavat:

PARP1

-shRNA1: 5′-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 ’; PARP1-shRNA2: 5’-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 ’.

STK11

(LKB1) shRNA sekvenssit olivat seuraavat LKB1-shRNA1: 5′-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ’; LKB1-shRNA2: 5 ’ATTTATTGCCAAATTTGGG-3’. ShRNA lentivirus- partikkeleita inkuboitiin kohdesolujen 24 tunnin ajan, ja solut sitten valittiin sopivassa kasvualustassa, joka sisältää puromysiiniä (2 ug /ml) 3 viikon ajan. Resistentit pesäkkeet laajennettiin ja knockdown tehokkuus oli vahvistanut qRT-PCR ja western-blottauksella.

ATP kvantifiointiin

arvioimiseksi saatavuuden ATP, globaali ATP mitattiin soluissa käsitelty tai ei käsitelty PARP-inhibiittorin. ATP pitoisuudet määritettiin jonka ATPlite Luminenssi System kohti valmistajan ohjeiden (PerkinElmer, Inc., Waltham MA).

Poly ADP-riboosia (PAR) määritys

vaikutuksen arvioimiseksi PARP /PI3K estoa PARP1 aktiviteetti

in vivo

, lysaatit valmistettiin ksenografteista 2 tunnin kuluttua lääkeaineen päivänä 3 käsittelyn. Ksenografteja valmistettiin kuvatulla menetelmällä seuraavan momentti. PAR tasot määritettiin ELISAlla kohden valmistajan ohjeiden (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).

eläinmallit

Balb /c nude hiiret saatiin Shanghai Lingchang Bio Technology Co LTD (Shanghai, Kiina) tai Harlan Laboratories (Houston, TX). Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki liittyvät menettelyt eläinten käsittelyyn, hoito ja käsittely tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Shanghai Chempartner (protokolla numero A998HL0001) tai Teksasin yliopiston MD Anderson Cancer Center IACUC (protokolla numero RM00001191-RN01). Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä. Ihmisen NCI-H209 SCLC-soluja (5 x 10

6 solua) tai NCI-H1048 tuumorisoluja (3 x 10

6 solua) 0,2 ml: ssa 1: 1-seoksella keskipitkän ja matrigeeliä injektoitiin subkutaanisesti oikeaan kylkeen kunkin hiiren (36 eläintä per solulinja). Kun kasvaimet olivat saavuttaneet ~ 150 mm

3 keskimääräinen tilavuus, eläimet (6 ryhmää kohti) annettiin suun kautta ajoneuvo, talazoparib (0,25 mg /kg), tai BKM-120 (25 mg /kg) päivässä 28 päivän ajan. Kasvaimen tilavuus ja eläinten paino mitattiin joka 2-3 päivä. Lisäksi 3 eläintä kutakin ryhmää käsiteltiin 3 päivää; ksenograftikasvaimissa kerättiin ja jäädytettiin 2-3 tunnin kuluttua hoidon 3. päivänä tarkempaa analysointia varten. Hoidon tehokkuuden määritettiin vertaamalla kasvaimen tilavuuden huumeiden käsiteltyjen hiirten (AT) kanssa hiirille on ajoneuvo (ACk) käyttäen suhdetta (AT /ACk) päivänä 19 NCI-H1048 ja päivän 25 NCI-H209 [ ,,,0],24] (viimeinen mittaus ajoneuvon käsiteltyjen kasvainten).

tulokset

PARP esto

in vitro

kasvattaa PI3K signalointi SCLC

tunnistaa reittejä moduloidaan PARP esto, suoritimme käänteisfaasi- proteiinijärjestelmäksi (RPPA), joka mitataan muutoksia 137 yhteensä ja fosforyloituu proteiinien keskeisten kasvaimia synnyttävän reittejä kuten PI3K, MEK ja DNA: n korjautumista paneelia SCLC solulinjojen käsitelty joko ajoneuvon tai PARP-inhibiittorit olaparib ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014699), tai talazoparib (BMN 673) 24 tuntia. Analyysi solulysaateista kerätty esi- ja jälkikäsittely osoitti, että fosforylaatio (aktivointi) proteiinien PI3K /mTOR-reitin korotettiin käsitellyissä solulinjoissa. RPPA analyysi paljasti, että 137 koko ja fosforyloituu proteiinit mitattiin, kuusi kahdeksasta proteiineja, jotka olivat voimakkaimmin yläreguloituja vastauksena PARP eston (FDR ≤0.1) olivat PI3K /mTOR-reitin (myös p-mTOR, p-AKT, ja p-S6 [p≤0.02] (kuvio 1A ja 1B) kokonaisproteiinin tasot eivät muuttuneet RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, joka on noin 10 kertaa pienempi IC

50 SCLC kuin olaparib tai rucaparib, indusoi samanlaisen vasteen H69-soluissa, kuten näytteillä lisääntynyt p-AKT T673 ja p-S6 S240,244 hoidon (S1 Fig ).

(A) Hierarkkinen klusterointi proteiinien tunnistettiin lysaateista SCLC solulinjoista (H69, H82, H841) vehikkeliä tai olaparib 24 tuntia paljasti lisääntynyt aktiivisuus PI3K /mTOR-reitin seuraava PARP esto ( FDR≤0.1, joka vastaa p-value≤0.037). (B) Yksittäiset fosforyloidut proteiinit PI3K /mTOR-reitin (p-mTOR, p-AKT ja p-S6-kinaasi) ovat suurempia käsittelyn jälkeen joko olaparib tai rucaparib (p≤0.02). (C) Lysaatit solulinjoista käsitelty olaparib tai rucaparib vehikkeliä vastaan ​​24 tunnin osoittavat inaktivointi LKB1 koulutusjakson (LKB1, pAMPKα, ja pTSC2, p≤0.042).

PARP eston ajaa PI3K /mTOR aktivointi kautta ATP /LKB1

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että lisäksi PARP, SCLC solulinjoja myös yli-ilmentävät maksan kinaasi B1 (LKB1) [4]. LBK1 reitti on jännitys-vaste mekanismi, joka aktivoituu vasteena aineenvaihdunnan rasituksia, kuten ATP ehtyminen suojaamaan solujen [25]. Yksi seuraus LKB1 toiminta on tukahduttaminen mTOR-reitin [25]. RPPA analyysi SCLC käsiteltyjen solujen olaparib paljasti lasku aktiivisuus LKB1 reitin (kuvio 1A). Edelleen analyysi (kuvio 1 C) osoittivat, että hoito joko olaparib tai rucaparib vähensi merkitsevästi LKB1 lauseke (p 0,001). Fosforylaatiota LKB1 loppupään tavoitteet, pAMPKα ja pTSC2, vähensi merkitsevästi myös hoidon jälkeen PARP-inhibiittorit (p = 0.022 ja p = 0,042 kanssa olaparib; p = 0.013 ja p = 0,034, jossa rucaparib varten pAMPKα ja pTSC2, vastaavasti, yhteensä AMPK ja TSC proteiini pysyivät ennallaan mitattuna RPPA, p≥0.81).

PARP-inhibiittorit työn kautta sekä katalyyttinen eston PARP ja ilmiöitä kutsutaan PARP-DNA ansastusta jossa PARP on loukkuun paikalle kaksijuosteisen tauko (DSB) estää, että DSB peräisin korjataan ja aiheuttaa suora luuytimen [26]. Siksi tarkastella vaikutusta PARP katalyyttinen eston sanottuna olemme tippuu alas

PARP1

geenin lentiviraalinen shRNA transduktion paneelissa SCLC solulinjojen edustaja solulinjaan in vitro farmakokineettinen analyysi ja solulinjat käytetyt eläinkokeissa (kuvattu alla). PARP Knockdown antoi meille mahdollisuuden paitsi katsoa suoraan katalyyttinen esto PARP1, vaan myös välttää mahdolliset off-tavoite vaikutuksia farmakologisten estäjiä. Kuten on esitetty kuviossa 2A, tämä pudotus vähensi PARP1 ilmentyminen verrattuna sekoituskoodin shRNA (kontrolli). Edelleen western blot-analyysi

PARP1

shRNA Knockdown solulinjat osoittivat lisääntynyttä mTOR, AKT, ja S6 aktiivisuus suhteessa muokkaamaan shRNA valvontaa kaikissa testatuissa solulinjoissa huolimatta H69 ja H1048, joiden aktivoivia mutaatioita

PIK3CA

. Olemme vahvistaneet havainnot H69 pudotus soluissa käyttäen rajoitettua RPPA paneeli analysointi valittu proteiineista (S2 Kuva). Tässä analyysissä toinen ja kolmas Tärkeimmät erot scramble- ja

PARP1

shRNA Transdusoimattomia soluja vähentynyt PARP1 ja lisääntynyt p-S6 (35 osumia

PARP1

KD1 ja 52 Kd2 at FDR≤0.05). Havaittu kasvoi PI3K /mTOR signalointia lyhyen aikavälin farmakologinen ja pitkän aikavälin geneettinen menetys PARP1 toiminta vahvistaa käsitystä, että PI3K /mTOR aktivointi on vaikutus, joka liittyy katalyyttinen eston PARP sijaan PARP-DNA ansastusta. Romaani havainto, että PARP estoa tai Knockdown aktivoi PI3K /mTOR väylän SCLC (kuvio 1) on johdonmukainen aiemmin julkaistu raportti, että tämä reitti on vahvin merkki lähtötilanteen vastustuskykyä PARP eston [5].

(A) Lysaatit PARP1 pudotus mukaan shRNA vuonna SCLC solulinjoissa (H69, H1048, H209) johtaa toiminnan vahvistumisena PI3K /mTOR-reitin suhteen muokkaamaan (SCR) shRNA määritettynä western blot. (B)

PARP1

taintumisen shRNA soluja (KD1 ja Kd2) oli pienempi LKB1 ja pAMPKα ilmaisun kuin ryntäily shRNA soluja. (C) H69 ja H1048 soluja käsiteltiin olaparib osoittivat lisääntynyttä [ATP] mitattuna ATPlite määrityksessä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM; ** P 0,02, *** p 0,01. (D) Ehdotettu malli PI3K-reitin aktivaatio seuraavat PARP eston.

lisäanalyysi PARP1 toiminta on LKB1 väylän SCLC solulinjoissa ilmeni, että LKB1 ilmaisun ja fosforylaation AMPKα olivat molemmat pienempi

PARP1

pudotus soluissa kuin soluissa, joita käsiteltiin sekoituskoodin shRNA (kuvio 2B).

PARP katalysoi polymerointi ADP-riboosin siirtoa NAD + liittää poly ADP-riboosin (PAR) luovuttajan proteiineja prosessissa kutsutaan PARylation [27]. Kuten PARylation by PARP on ATP-intensiivinen tapahtuma, me arveltu, että PARP esto johtaa kasvua käytettävissä ATP, mikä puolestaan ​​johtaa vähentyneeseen LKB1 signalointia ja siten menetys PI3K /mTOR tukahduttaminen. Käyttämällä luminesenssi perustuva määritys, mittasimme maailmanlaajuisesti ATP-tasot on SCLC-soluja ennen ja jälkeen hoidon, joilla on PARP-inhibiittorin. Kuten on esitetty kuviossa 2C, ATP-pitoisuudet kasvoivat, hoidon jälkeen olaparib (1 uM, p 0,001 1 tunti). Ehdotettu mekanismi miten PARP eston voi stimuloida PI3K /mTOR-reitin kautta lisää ATP saatavuus ja tukahduttaminen LKB1 reitin näkyy kuvassa 2D. Nämä havainnot yhtyvät tuoreessa raportissa, joka PARP1 välittämää ionisoivan säteilyn aiheuttama autophagy tapahtuu aktivoimalla LKB1 /AMPK /mTOR-reitin [28] sekä raportit osoittavat, että aktivointi PARP1 seuraavista alkyloimalla DNA-vaurioita aktivoi LKB1 polku tukahduttaa PI3K signaloinnin väheneminen ATP-vaikutus, joka häviää seuraavan PARP1 esto [29, 30].

Talazoparib ja PI3K estäjän yhdistyvät additiivisesti vuonna SCLC

laajentaminen aiempien havaintojen 1 ) herkkyys PARP esto liittyy käänteisesti PI3K /mTOR-reitin aktiivisuus [5] ja 2) PARP eston lisääntynyt PI3K /mTOR signalointi, testasimme anti-leviämisen tehosta PI3Kα estäjän (BKM-120) meidän paneelissa 50 SCLC solulinjat. BKM-120 (pan-luokan 1 P110α /β /γ /δ estäjä) valittiin, koska sitä käytettiin tutkimuksessa PARP /PI3K estäjän yhdistelmä rinta /munasarjasyöpä (ClinicalTrial.gov Identifier: NCT01623349) ja koska toinen P110-spesifinen estäjä (PIK75) on osoitettu olevan yhden aineen aktiivisuuden joissakin SCLC solulinjoissa [12]. Kuten kuviossa 3A, IC

50 saavutettiin suurin osa testatuista solulinjoista (44/50), 35 niistä on kliinisesti saavutettavissa annosta pienempi kuin ilmoitettu päivä 1 C

max 2.3μM [31 ].

(A) Proliferaatiomääritykset osoitti erilaisia ​​herkkyys BKM-120 poikki SCLC solulinja paneelissa. Solulinjat, joilla

PTEN

mutaatiot /poistot punaisia ​​ja ne, joilla

PIK3CA

mutaatioiden vihreä; kliininen C

max on merkitty katkoviivalla vaakasuora viiva. # Osoittaa IC

50 ei saavutettu tutkituilla annoksilla. (B) Yhteenveto

PI3K /mTOR

mutaatio ja

MYC

vahvistusta tilan solulinjojen (katso S3 kuvio solulinjan nimiä). (C) solulinjat joko mutaatio PI3K /mTOR-reitin (MT) tai

MYC

vahvistus (AMP), olivat herkempiä BKM-120 kuin soluja ilman mutaation tai vahvistusta (WT ja EI- AMP; ** p 0,02.). (D) biomarkkereiden löytö käyttäen RPPA profiilit 47 SCLC solulinjojen korreloi proteiinin ilmentymisen kanssa BKM-120 IC

50 tunnistamaan merkkiaineita ennustavan vasteen. Leviämisen tiedot esitetään keskiarvona ± SEM.

Voit selvittää, millainen rooli PI3K /mTOR-reitin mutaatiot voivat olla herkkyyttä BKM-120, tunnistimme solulinjat tällaisia ​​mutaatioita. Solut, joissa

PIK3CA

mutaatioita (n = 3, merkitty vihreällä kuvassa 3A) liittyi pienempi IC

50-arvot, mikä osoittaa, kuten voisi odottaa, että solut, jotka ovat riippuvaisempia PI3K /mTOR signalointi hengissä ovat herkempiä PI3K estäjä. Havaitsimme myös

AKT2

,

RICTOR

, ja

mTOR

mutaatioita solulinjoja, jotka olivat herkkiä BKM-120. Solut, joissa

PTEN

muutoksia (n = 7, merkitty punaisella kuvassa 3A) jaettiin poikki välillä herkkyydet, mikä tarkoittaa, että

PTEN

muutokset eivät korreloi herkkyyttä. Taajuudet mutaatioiden näissä viidessä geeneistä (koottu kuvioon 3B ja S3 kuvassa) ovat samanlaisia ​​kuin on julkaistu tuoreessa tutkimuksessa SCLC koepalanäytteistä [10]. Kun ryhmitelty, solulinjoissa PI3K /mTOR-reitin mutaatioita oli huomattavasti pienempi IC

50 arvoja BKM-120 kuin ei-mutatoitunut soluja (kuvio 3C, p = 0,01).

tunnistamaan mahdollisia proteomic markkereita vasteen BKM-120, analysoimme korrelaation IC

50 BKM-120 ja pohjapinta ekspressiotasot 146 kokonaan tai fosforyloitua proteiinien RPPA. Kuten kuviossa 3D, Spearmanin korrelaatio tunnistettu cMyc proteiinin ilmentymisen kuin alkuun markkeri herkkyys BKM-120 (p 0,001); muita merkittäviä (p 0,05) merkkiaineiden herkkyys sisältyvät p-cMyc, p-AMPKα, ja p-ACC1. Edelleen analyysi BKM-120 arkaluonteisuuden data paljasti, että solulinjat, joiden tiedetään

MYC

vahvistus oli huomattavasti pienempi IC

50 (p = 0,01, kuvio 3C), validoida proteomic merkki. Vahvimpia markkereita vastustuskyvyn BKM-120 olivat proteiinien syyllistämättä MAPK /ERK-reitin (pERK1 /2 (T202, Y204) Rho = 0,358, p = 0,014; pGSK3α /β (S21,9) Rho = 0,318, p = 0,032 ; pMAPK (T202, Y204) Rho = 0,317, p = 0,032). Aktivointi MAPK /ERK-reitin eston PI3K on havaittu useissa syövistä [32], mukaan lukien NSCLC [33] ja rintasyövän [32, 34]; tämä vaikutus voi välittää menetyksen kautta AKT: n estävä vaikutus raf-[35]. Beyond MAPK /ERK-reitin, vahvin markkereita vastustuskyvyn BKM-120 olivat AKT ja p-BAD (p 0,001) Mielenkiintoista, BKM-120 IC

50-arvot eivät osoittaneet vahvaa korrelaatiota meidän aiemmin julkaistu PI3K pisteet [5] (Rho = 0,101, p = 0,51), joka on yhdenmukainen julkaistun havaintojen herkkyyttä pictilisib (GDC0941, joka on PI3Kα /δ estäjä) ei osoittanut mitään korrelaatiota PI3K pisteet paneeliin 60 pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjat [36]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että aktivoituminen MEK (tai muu korvaava /escape reitit) saattavat olla tärkeämpiä kuin pohjapinta PI3K signalointia määritettäessä herkkyyttä PI3K eston.

Yhdistelmä PARP ja PI3K-estäjien on raportoitu olevan erittäin aktiivinen kokeellisissa malleissa (potilaasta johdettujen ksenografteissa ja

BRCA1 /Trp53

tyrmäyksellä spontaani geenitekniikalla hiirimallissa) rintasyövän [13, 14]. Näiden tulosten perusteella, kliinisessä tutkimuksessa testaus yhdistelmä PARP estäjän olaparib ja PI3K-estäjä (pan-P110 BKM-120 tai P110α erityisiä BYL719) aloitettiin rintasyövän ja munasarjasyöpä (NCT01623349). Alustavat tiedot osoittavat, siedettävyyttä yhdistelmä [37] ja kliinistä hyötyä kaikilla annostasoilla ainakin olaparib + BKM-120 kohortti [38]. Siksi testattiin vaikutuksia yhdistelmän talazoparib (PARP-estäjä) ja BKM-120 (PI3K-estäjä) kliinisesti saavutettavissa annoksia paneelia SCLC solulinjojen joiden valikoima herkkyyksiä (herkkä, väli- ja kestävä) sekä BKM-120 ja talazoparib (herkkyys talazoparib esitetty S4 kuvassa). Kuusi annokset talazoparib (vaihteluväli 0,1-30 nM) ja kolme annosta BKM-120 (vaihteluväli 0,1-1 uM) testattiin kussakin solulinjassa. Kullakin annostasolla, vertasimme vaikutus leviämisen ennustetun additiivisen vaikutuksen. Proliferaationopeudet, jotka olivat 10% ennustetuista additiivinen vaikutus, jossa pidetään ”lisäaine”, kun taas jonka kanssa leviämisen hinnat yli 10% yli tai alle ennustetun additiivisen vaikutuksen katsottiin ”alle lisäaine” tai ”suurempi kuin lisäaine” (kuvio 4A ). Esimerkiksi kuvio 4A esittää edustavan solulinjat, jossa on ”lisäaine” vastaus (H211, DMS-79) tai ”suurempi kuin lisäaine” -vastaus (H1930). Tätä lähestymistapaa käyttäen olemme osoittaneet lisäaineen vuorovaikutuksen 49 50 SCLC testatuissa solulinjoissa.

(A) Proliferaatiomääritykset käyttäen kliinisesti saavutettavissa annoksia talazoparib (6 annosta, välillä 0,1-30 nM) ja BKM-120 (3 annosta, alue 0,1-1 pM) osoitti lisäaineena vuorovaikutuksen useimmissa 50 SCLC testatut solulinjat. Esimerkit osoittavat, lisäaineen vasteita (H211, DMS-79), ja suurempi-kuin-lisäaineen vasteen (H1930). (B) tutkinto (prosentteina) eston edellä (vihreä) tai alle (vaaleanpunainen) ennustettu additiivinen vaikutus (violetti) kutakin solulinjaa kaikissa kliinisesti saavutettavissa annoksilla. (C) Havaittu lisääntymistä suhteessa ennustettu additiivisen vaikutuksen yksittäisiä annoksia BKM-120.

Jos haluat ottaa yleiskuva vuorovaikutusta kahden lääkkeen jokaisen solulinjan kaikilla annoksilla, teimme tarkempaa analysointia, jossa yhdistyivät aste (prosentteina) inhibition ylä- tai alapuolella ennustettu additiivinen vaikutus kaikkia mahdollisia yhdistelmiä. Käyttämällä ala käyrän (tilavuus), vertasimme ja havaitun lisäainetta arvot (prosentteina suhteessa ennustettu) at kunkin yhdistelmän (jossa yksikkö uM

2%) positiiviset ja negatiiviset arvot sitten erikseen summataan kunkin solulinjan (kuvio 4B). Kaikkien mutta kolme solulinjoissa, kokonaisvaikutus on talazoparib + BKM120 yhdistelmä oli sisällä tilavuus ± 10%, mikä kuului ennustetun additiivisen vaikutuksen, mikä tukee päätelmää, että nämä lääkkeet ovat pääasiassa lisäaineen

in vitro

Drs.