Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Glutationi (GSH) on tärkeä tehtävä suojella solujen hapettumista vastaan. ABCC1 proteiinin kuljettaa GSH. Vaikka tämä proteiini on pitkälti tutkitaan syövän takia monilääkeresistenttisyyttä fenotyyppi, sen rooli tubulussoluihin munuainen on tuntematon. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko ABCC1 on tehtävä suojella soluja distaalisesta nephron vastaan ​​aiheuttamaa stressiä korkea medullaarinen osmolaliteetti.

Tärkeimmät menetelmät

MA104 soluja käsiteltiin korkealla pitoisuudet natriumkloridia, urea, tai molempien nostaa osmolaliteetti viljelyalustan. Solujen elinkelpoisuus käsiksi MTT ja trypansininen määrityksissä. ABCC1 ilmaisun ja ekstruusion carboxi-fluoreseiini (CF), joka on fluoresoiva ABCC1 substraatti, mitattiin virtaussytometrillä.

Keskeiset tulokset

inkubointi MA104 solujen korkea natriumpitoisuus väliaine johti muutoksiin solu- rakeisuus ja muuttunutta ilmaisua ja toimintaa ABCC1. Urea ei muuttanut ABCC1 ekspression tai aktiivisuuden, mutta käänteinen havaitusta NaCl vaikutuksia. Korkea natrium pitoisuuksia oli myös negatiivinen vaikutus solujen elävyyden ja urean myös suojattu soluja vastaan ​​tätä vaikutusta.

merkitys

havainnot osoittavat, että ABCC1 on merkittävä rooli suojelussa munuaisen epiteelisolujen vastaan stressin aiheuttama korkea natrium ympäristössä läsnä munuaisydinkalvonäyte.

Citation: Fonseca LM, Alvarez AB, Rodrigues RC, Santos DHF, Lopes AG, Capella MAM (2013) ABCC1 liittyy suojelu Distal Nephron vastaan ​​hyperosmolaliteetin ja korkea natrium Ympäristö: Possible Implications for Cancer Chemotherapy. PLoS ONE 8 (6): e68049. doi: 10,1371 /journal.pone.0068049

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, France

vastaanotettu: 07 tammikuu 2013; Hyväksytty: 23 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Fonseca et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa de Oncobiologia (FECD /FAF /Onco II), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nivel Superior (viitat) ja Programa de Apoio aos Núcleos de Excelencia (PRONEX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

moniresistenssin (MDR) on edelleen tärkein syy epäonnistumiseen syövän kemoterapiassa. Vaikka MDR on monitekijäinen, se on ensisijaisesti tunnusomaista ATP-riippuva väheneminen solunsisäisen lääkeaineen kertymistä, koska yli-ilmentymisen kolme proteiinia, jotka kuuluvat ABC kuljettajat superperheelle: P-glykoproteiinin (ABCB1), rintasyöpä proteiinia (BCRP tai ABCG2) tai monilääkeresistenssiin liittyvä proteiini 1 (MRP1 tai ABCC1). Vaikka alun perin havaittu tuumorisoluissa, nämä proteiinit ovat myös läsnä normaaleissa soluissa. Munuaisissa, sekä ABCB1 ja ABCG2 ilmaistaan ​​apikaalisella kalvo proksimaalitiehyeet, viitaten rooliin lääkeaineen eritystä [1], [2].

ABCC1, joka aiemmin tunnettiin nimellä MRP1, on transmembraaniproteiini alun perin kun kuljettaja liittyvät monilääkeresistenssiin fenotyyppi joissakin syöpäsoluissa [3] – [6], mutta myöhemmät tutkimukset osoittivat, että tämä proteiini ilmentyy kaikkialla lähes kaikissa elimissä nisäkkäillä, ihmiset mukaan lukien [7], [8]. Tällä kuljettimella on suuri merkitys tulehduksellisten prosessien ja oksidatiivisen vahinkoa, koska se kuljettaa sekä pienentää ja hapettunut glutationi, leukotrieeni C4 ja prostaglandiinien [7], [9]. Sen fysiologinen rooli on tutkittu useiden elinten ja järjestelmien ja yksi tärkeimmistä löytöjä on se, että sen läsnäolo on välttämätöntä hypertensiivinen angiotensiini II [10].

kuitenkin koskee fysiologinen rooli ABCC1 munuaisissa, ei ole todennäköistä, että tämä proteiini esittää minkäänlaista sekretorisen rooli, koska se on rajoitettu glomerulus ja basolateraalisessa kalvo sekä paksu nouseva osa Henle n silmukan ja medullaarinen kokoojakanavaan [11 ]. Tämä toteamus lopulta enää lykätä tutkimustuloksia siitä että tämä transporter munuaisissa, vaikka joitakin todisteita viitata rooliin ABCC1 virtsan yhteistoimintamekanismeista. Esimerkiksi paksu nouseva osa ja distaalinen tubulussolujen ovat erityisen herkkiä GSH ehtyminen edistää dietyylimaleaatti (DEM), joka muodostaa komplekseja GSH, vähentää solunsisäisiä tasoja tämän tripeptidin. Eläimet altistetaan hoidon DEM osoittivat vakavia virtsan pitoisuus puutteita [12], [13]. Lisäksi on osoitettu, että etoposidi indusoi polyuria in abcc1 (- /-) hiirillä, mikä viittaa siihen, että tämä proteiini on jotenkin liittyy veden uudelleen imeytymistä, [14].

Useat syöpälääkkeiden tiedetään indusoivan munuaistoksisuutta. Esimerkiksi nefrotoksisuutta aiheuttama sisplatiinin, yleisesti käytetty huume syöpähoitoa, rajoittaa sen käyttöä syövän hoidossa, ja useat tutkimus suoritetaan pienentämään tätä haitallista vaikutusta [15] – [17]. Lisäksi se on äskettäin osoitettu, että munuaistoksisuus liittyvät doksorubisiinille, huumeiden kovassa käytössä kemoterapiassa rinta- ja muiden syöpien, johtuu mitokondrioiden häiriöihin ja solukuolemaan säätelevät geenit [18].

Koska nefrotoksisuutta on liittyy useita syöpälääkkeiden [19], [20], ja koska rooli ABCC1 munuaisten ratkea, tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan mahdollisen roolin tämän proteiinin munuaissoluissa. Havaitsimme todisteita, jotka ABCC1 liittyy suojeluun distaalisen nephron vastaan ​​hyperosmolaliteetin johtuu suuresta natrium ympäristöön ja että GSH on tärkeää säilyttää elinkelpoisuuden distaalisen Nefroni soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki eläinkokeiden aiemmin tarkistanut ja hyväksynyt eläinten mukaan komitean Centro de Ciencias da Saúde – UFRJ protokollan numero IBCCF 082/2009.

Cell Culture

Monkey alkion solulinja MA104 , sian munuaisen epiteelisolujen LLC-PK1 ja koiran munuaisen epiteelisolujen MDCK olivat kaikki saatu Rio de Janeiro Cell Bank. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa Dulbeccon Modified Eagle Medium (Gibco, USA) kanssa penisilliiniä ja streptomysiiniä (Gibco, USA) ja jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA) ja L-glutamiinia (Gibco, USA).

hoito Osmolytes

nostamiseksi osmolaliteetti viljelyalustaa, 100 mM NaCl, 200 mM ureaa, 200 mM mannitolia, tai 50 mM NaCl +100 mM ureaa (lopulliset pitoisuudet) lisättiin keskipitkällä ja nosti osmolaliteetti noin 450 mOsm /kg H

2O. Liuokset lisättiin joko vähitellen, yli 72 tunnin ajan, tai yhden lisäksi, kuten on kuvattu kuvioissa ”kuvatekstit.

MTT-määritys

MTT kolorimetrisellä määrityksellä [21] on käytetty arvioida elinkelpoisuutta MA104 solulinjasta inkuboitiin hyperosmotic väliaineessa. Noin 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin 96 kuopan levyille. Seuraavana päivänä NaCl, urea, mannitoli tai NaCl + ureaa lisättiin väliaineeseen, kuten edellä on kuvattu. Joissakin kokeissa Buthionine-sulfoksimiini estäjä GSH synteesi (BSO-Fluka, USA), ja MK571, joka on ABCC1 inhibiittori, lisättiin myös. Inkuboinnin jälkeen jaksot 24, 48 tai 72 h, 20 ui 10 mg /ml tiatsolyyli Blue liumbromidi (Sigma, USA) lisättiin viljelmään ja soluja inkuboitiin edelleen 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Lopussa inkubaatioaika supernatantti heitettiin pois ja 100 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuoppaa kohti liuottamiseksi äskettäin muodostettu formatsaanin suolaa. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijaa (Benchmark, BioRad). Keskiarvot laskettiin 3 erilliselle kokeelle.

trypaanisineä Värjäys

Toinen menetelmä, jota käytetään pääsyn solujen elinkelpoisuus oli solujen laskenta Trypan-sinivärjäyksellä. Tässä tapauksessa, 1 x 10

5 solua /kuoppa ympättiin 24-kuoppalevyille ja inkuboinnin jälkeen osmolytes kuten edellä on kuvattu, solut laskettiin hemosytometrillä.

Glutathione

kaupallinen pakkaus käyttäen monochlorobimane substraattina (Millipore, USA) käytettiin mittaamaan glutationin (GSH) tasoja. Tässä määrityksessä 1 x 10

6-solut ympättiin kulttuuri pullot, käsiteltiin kuten edellä, ja talteen trypsiinillä. GSH-määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssi tasot luettiin käyttäen levyä lukijalle 380/460 nm suodatin sarja.

ABCC1 Activity

Solut ympättiin 24-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin osmolytes edellä kuvatulla tavalla. Karboksi-fluoreseiinidiasetaattia (CFDA – Molecular Probes, USA) on ei fluoresoiva molekyyli, joka muunnetaan fluoresoiva yhden, karboksi-fluoreseiini (CF) solunsisäisten esteraasien. Tämä molekyyli on substraatti ABCC1. Näin ollen sen määrittämiseksi, ABCC1 toimintaa, soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan 2 uM CFDA (jotta väriaine sisäänoton, esteraasin toiminta, ja kertyminen CF), huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), pestä pois väriaine ja inkuboitiin toinen 30 minuuttia CFDA DMEM CF puristamiseen. Sitten solut kerättiin trypsiinillä, pestään ja ressuspended suolaliuoksessa. Solunsisäistä fluoresenssia mitattiin Beckton-Dickinson-virtaussytometrillä (FACSCalibur). Tietojen analysointi suoritettiin ohjelmiston Summit (Dako Inc., USA).

Leimaaminen Anti-ABCC1 Vasta

Solut ympättiin 24-kuoppaisilla levyillä ja merkintöjä määritys suoritettiin kuten kuvattu edellinen teos ryhmämme [22]. Polyklonaalinen kaniinin vasta-aine A23 (Alexis Biochemicals, USA) ja Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) käytettiin vastaavasti ensi- ja fluoresoivia sekundaarisia vasta-aineita.

Western-blottaus Analyysi Tamms-Horsfall Protein (THP tai Uromodulin) ja akvaporiini 2 (AQP2) B

Expression THP ja AQP2 arvioitiin immunoblottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Solut maljattiin 6-kuoppaisille maljoille 5 x 10

5 solua /kuoppa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, elatusaineet aspiroitiin; Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä (pH 7,4) huoneen lämpötilassa, kaavittu ja sentrifugoitiin 14000

g

60 sekunnin ajan. Sitten solut suspendoitiin näytepuskuriin (Trisma emäs 0,76% m /v; glyseroli 12,56% m /v ja natriumdodekyylisulfaattia 2,3% m /v; pH 6,8). Homogenisoinnin jälkeen, pieni näyte käytettiin proteiinin mittaamiseen. Puskuri sitten täydennetty 0,6% ditio-L-treitolilla (DTT), 0,5% β-merkaptoetanolia, ja bromifenolisinistä (1 mg /ml). Sitten proteiinit SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraanit blokattiin Western Breeze blokkausliuosta (Invitrogen, USA) ja inkuboitiin spesifisiä vasta-aineita vastaan, THP tai AQP2. Fosfataasia emäksinen Länsi Breeze Kit (Invitrogen, USA), käytettiin visualisoimaan bändejä kalvoja. Aliklooni C7 MDCK-solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina AQP2, koska se koostuu pääasiallisen solujen keräämisen kanavan [23]. Muut kontrollit olivat otteita rotan munuaisen ydin ja kuori. Tämän, Whistar rotilla oli munuaisissa poistettiin, leikattiin irti ja säilytettiin -80 ° C: ssa käsittelyyn. Elimet homogenisoitiin sitten liuoksessa, joka koostuu PMSF (1 mM), sakkaroosi (250 mM), EDTA (1 mM) ja imidatsolia (20 mM), kunnes homogenaatti saatiin.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koe toistettiin kolmesta viiteen kertaa. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta keskiarvon ja analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA Dunnet tai Bonferroni postitse testejä vertailun eroja. Arvot P alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

karakterisointi MA104 Cells

Koska ei ole ihmisen solulinja distaalisesta nephron kaupallisesti saatavilla, yritimme testata, onko munuaisten apinan solulinja MA104 oli peräisin distaalisesta Nefroni. Ensimmäinen, vertasimme herkkyys kolme nisäkkään munuaisten solulinjat urea: MDCK, koiran munuaisen solulinjan ominaisuudet distaalisen nephron [24] – [26]; LLCPK1, sian munuaisen solulinjan ominaisuuksia proksimaalitiehyeet [27] ja MA104, ei vielä tunnettu. Soluja inkuboitiin 48 h erilaisilla urean pitoisuuksia ja solujen määrä ja solujen elinkelpoisuus mitattiin Trypan Blue-värjäyksellä. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 1, MA104-solut ovat resistenttejä urea MDCK-soluissa, kun taas LLC-PK1-solut ovat herkempiä.

-solut ympättiin 24-kuoppaisilla levyillä ja ureaa lisättiin 24 tuntia myöhemmin useissa pitoisuuksissa. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus mitattiin Trypan Blue-värjäyksellä (n = 4). a – eroaa 37,5 mM (p 0,01); b – eroaa 75 mM (p 0,001).

MDCK on koira munuaisen solulinjan ja on huomattavia eroja koira ja ihmisiin. Lisäksi useat vasta-aineita ihmisille ei merkitä koiran proteiineja. Toisaalta, MA104 on apinan munuaisen solulinjassa, ja se on hyvin vastaan, että kädellisiä jakaa lukuisia ominaisuuksia ihmisten kanssa. Olemme aiemmin osoittaneet, että vasta-aineita ihmisen ABCB1 ja ABCC1 myös merkitty tässä solulinjassa [28], [29]. Koska ABCC1 ilmentyy vain basolateraalisessa kalvot distaalisen suoraan tubulussolujen ja keräämällä kanavan epiteeli [11], ja ottaen huomioon vastus MA104 solujen urea, vaikuttaa todennäköiseltä, että nämä solut tulivat distaalisesta Nefroni. Siksi arvioimme joitakin ominaisuuksia distaalisen nephron segmenttien tässä solulinjassa. Tuloksemme osoittivat, että MA104-solut eivät osoittaneet merkittäviä merkintöjä PNA, markkeri intercalated solujen ja ei ilmaista uromodulin, on proteiini, joka ilmentyy vain distaalisessa suoraan tiehyessä, mutta ilmaista AQP2, proteiinia ominaisuus pääasiallinen solujen keräys kanavan (Fig. 2). Yhdessä Näiden tulokset viittaavat siihen, että MA104 solut peräisin kokoojakanavaan, joten ne hyvä malli tutkia mahdollista roolia ABCC1 in vastus -munuaissoluihin hyperosmolaliteetin.

. Expression of THP proteiinin rottamunuaisen aivokuoren (kaista 1) ja meldullary (kaista 2) tiivisteet ja MA104 (kaista 3) ylempään kalvoon ja β-aktiini alemmassa kalvo; B. Expression of akvaporiini 2 MDCK-C7 (kaista 1) ja MA104 (kaista 2); C ja D. PNA merkintöjä (100 uM) MDCK-C11 (C) ja MA104 (D).

herkkyys MA104 Solujen useisiin Osmolytes

Seuraava vaihe oli vaikutuksen määrittämiseksi eri osmolytes selviytymisen MA104 soluja. Medium osmolaalisuus nostettiin natriumkloridia, urean tai mannitolin yhdessä lisäksi (osmoottinen sokki) ja elinkelpoisuus mitattiin MTT: llä. NaCl: n konsentraatiota käytetty aiemmin määritettiin pienin NaCl-pitoisuus saavuttaa mahdollisimman vaikutus solujen eloonjäämistä (tietoja ei esitetty). Kuva. 3 osoittaa, että natriumkloridin lisäys vähentää huomattavasti solujen eloonjäämistä, kun taas ureaa ja mannitoli oli vain vähäinen vaikutus. Tämä tulos viittaa siihen, että alennettua Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin NaCl ei johdu hyperosmolaliteetin itse, koska mannitoli ei saatu samaa vaikutusta.

alkuvaiheen jälkeen inkubaatio 24 tuntia 37 ° C: ssa, osmolytes lisättiin elatusaineeseen ja soluja inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 3). a – eroaa ohjaus (p 0,05); b – eroaa NaCl (p 0,01).

Koska NaCl saattavat vaikuttaa useita toimintoja, kuten natriumkanavien kloridikanavia, natrium-kalium ATPaasi jne, ja koska ei ole tietoa tieteellisessä kirjallisuus viittaa siihen, onko Na

+ tai CI

– on tärkein syy laskuun solujen elinkelpoisuuden, päätimme tutkia tätä kohtaan. Vertailun vuoksi käytimme koliinikloridi, joka säilyttää saman ionisen voiman väliaineen whithout läsnä Na

+. Kuviossa. Kuviossa 4 on esitetty, että NaCl: a ja koliinikloridia yhtä vähentää solujen elinkelpoisuutta, mikä viittaa siihen, että kloridi-ionin kantaa vastuun tätä vaikutusta.

alkuvaiheen jälkeen inkubaatio 24 tuntia 37 ° C: ssa, osmolytes lisättiin viljelyalustaan ja soluja inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan; A. Soluja käsiteltiin NaCl tai NaCl + urea. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 3). a – eroaa ohjaus (p 0,05); b – eri NaCl 175 mM (p 0,001), ja B. Solut käsiteltiin koliinikloridia (esitetty koliini) tai koliinikloridi + urea (n = 3). a – eroaa ohjaus (p 0,001); b – eroaa koliini 175 mM (p 0,001).

vaikutus Urea herkkyydessä MA104-solujen NaCl ja koliini

Jotkut tekijät huomasivat, että urea suojattu soluja vastaan vamman aiheuttama natriumkloridia [30]. Kuten medullaarista hyperosmolaliteetin munuaisessa johtuu pääasiassa ureaa ja NaCl, seuraava vaihe oli tutkia mahdollisen suojaavan vaikutuksen urean solujen elinkelpoisuuden kovassa NaCl-pitoisuus. Sitten solut toimitettiin osmoottinen sokki NaCl: n läsnä ollessa tai ilman ureaa. Säilyttääkseen saman osmolaliteetti, eri määriä NaCl: a ja ureaa käytettiin (lopullinen osmolaliteetti 50 mM ureaa +150 mM NaCl oli samanlainen kuin väliaineen lisätty 175 mM NaCl: a yksin, noin 561 mOsm /kg H

2O mitattuna osmometrillä). Vertailun vuoksi käytettiin myös koliinikloridia. Se voidaan nähdä kuvassa. 4, että urea suojattu solut toimitetaan korkean NaCl, mutta vaikutus urean käsitellyissä soluissa koliinikloridia oli paljon pienempi kuin mitä havaittiin NaCl. Tämä viittaa siihen, että molemmat ionit (Na

+ ja Cl

-) osallistuu solukuoleman, mutta vaikutus urean korostuvat edelleen NaCl ympäristössä, joka on sopusoinnussa sen munuaisten medullaarinen ympäristöön. Koska koliinikloridista ei osmolyyttiä munuaisten ydinjatkeen emme käyttäneet tätä ainetta seuraavissa kokeissa.

Solunsisäiset GSH-tasot MA104 käsitellyissä soluissa Osmolytes

On olemassa useita todisteita siitä, että NaCl lyijy oksidatiivista vaurioita [31], [32]. Koska GSH on yksi tärkeimmistä solunsisäinen molekyylejä suojeluun liittyviä oksidatiivista stressiä vastaan ​​[33], tasojen solunsisäinen GSH arvioitiin MA104-soluissa sen jälkeen, kun hoidon osmolytes. Tämän määrityksessä osmolytes lisättiin asteittain, aikana 72 tuntia ja sisältö GSH mitattiin. Kuviossa. Kuviossa 5 on esitetty, että solujen käsittely NaCl aiheutti merkittävää kasvua (noin 50%) on solunsisäisiä tasoja alennetaan GSH MA104-soluja. Urea yksin ei muuttanut solunsisäisen sisällön GSH, mutta käänteinen GSH kasvu havaittiin soluissa, joita käsiteltiin NaCl. Voit testata, onko tämä nousu GSH tasoilla voisi liittyä solujen selviytymiseen, käytimme BSO, estäjä glutationin syntaasin, mikä heikentää tätä nousua GSH tasoilla. Soluja esi-inkuboida BSO ennen käsittelyä NaCl tai urea. Kuten odotettua, inhibitio GSH-synteesin BSO alennetaan 50% selviytymistä käsiteltyjen solujen NaCl, mutta ei muuta, että käsiteltyjen solujen ureaa tai urea + NaCl (Fig. 6), mikä viittaa siihen, että solukuoleman urean läsnä ollessa + NaCl tapahtuu eri tavalla kuin, että NaCl yksin ei ole riippuvainen GSH.

Soluja inkuboitiin kuten kuviossa 4 ja solunsisäisiä tasoja GSH mitattiin, kuten on esitetty kohdassa materiaalit ja menetelmät. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 8); p 0,05 (a – eri sekä ohjaus- ja urea).

alkuvaiheen jälkeen inkubaatio 24 tuntia 37 ° C: ssa, BSO (1 mM) lisättiin elatusaineeseen ja sen jälkeen 24 tunnin inkubaation osmolytes lisättiin viljelmään ja soluja inkuboitiin edelleen 48 tunnin ajan. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 3); p 0,05. (A – eroaa NaCl).

ilmentäminen ABCC1 vuonna MA104 käsitellyissä soluissa Osmolytes

Koska ylläpito solunsisäisten GSH tasoilla liittyy läheisesti ABCC1 liikenne [34], [ ,,,0],35] ja koska MA104 ja keräämällä tiehytsoluja ilmentävät ABCC1 [14], [22], seuraavassa kokeita yritimme tutkia mahdollista roolia ABCC1 vastaukseen MA104 solujen NaCl ja ureaa. Kuitenkin suoritettaessa virtaussytometria, havaitsimme, että NaCl johtavat muutoksiin solun rakeisuus (katsottuna muutoksilla puolella hajonta-SSC), ilman muutoksia solujen määrän (katsottuna muutoksilla eteenpäin sironta-FSC) kuten voidaan nähdä kuviosta . 7A. Siksi tutkimme ensin tällaisia ​​muutoksia. Tehdä tämän, solut erotettiin kaksi aluetta: alue R1, joka sisältää solut, joilla on normaali SSC alue R2, joka sisältää solut, joilla on korkea SSC (Fig. 8A).

Soluja inkuboitiin 96 tuntia 37 ° C kanssa osmolytes. A – pistekuvioita osoittaa eroa eteenpäin sironta (FSC) ja puoli sironta (SSC), jotka edustavat vastaavasti solujen määrän ja rakeisuus. B – Suhteellinen solujen näytteille normaalia rakeisuus kussakin testiryhmässä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 4); (A – eroaa valvonta; p 0,001 ja B- eroaa NaCl; p 0,01).

Soluja inkuboitiin osmolytes aikana 96 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten solut leimattiin anti-ABCC1 vasta-aineen ja tämän proteiinin ilmentymisen analysoitiin virtaussytometrialla. Jokainen hoitoryhmä oli jaettu kahteen alaryhmään mukaan SSC-arvot. A – histogrammit osoittavat kaksi alapopulaatiot (normaali ja korkea SSC) kunkin kunto ja B – Suhteellinen ABCC1-positiivisten solujen sekä normaali ja korkea SSC -alapopulaatioiksi. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (n = 5). a – eroaa ohjaus (p 0,01) ja B- eroaa NaCl; p 0,01).

Kuvassa. 7B osoitetaan, että 90%: n ohjaus solut ovat normaalit SSC ja että hoito 72 tunnin virtsa yksin ei muuttanut solu rakeisuus. Kuitenkin NaCl kasvanut huomattavasti tämän parametrin, jossa lähes puolet väestöstä, joilla on suurempi SSC. Lisäksi urea päinvastainen tämä muutos, koska 76% soluista toimitetaan NaCl + urea oli alueella normaalin SSC ja tämä ei ollut tilastollisesti erilainen ohjaus soluista. Vaikka tämä kasvu solussa rakeisuus voisi johtua alennettua solun tilavuus, koska pudottaa solujen vesipitoisuuden, emme voineet havaita tätä. FSC solujen toimitetaan kaikki hoidot olivat samanlaisia ​​kuin kontrolli soluja, mikä viittaa siihen, mitään muutosta solun tilavuuden pitkittyneen hoidon NaCl, urea tai NaCl + Urea (Fig. 7A).

Koska havaitut vaikutukset NaCl hoidon SSC, tutkimista varten ABCC1 ilmaisun ja toiminnan me erottaa solut kaksi aluetta, toinen liittyy solujen normaalin SSC ja muut asiaan liittyvät soluihin suurella SSC. Tulokset on kuvattu kuviossa. 8 osoittivat, että solut, joilla on normaali SSC, noin 85% ohjausyksikön soluista ekspressoi ABCC1. Tämä prosenttiosuus vähennetään noin 50% soluissa, joita käsiteltiin NaCl, ja urea ei kääntää. Soluille, joilla on korkea SSC, prosenttiosuus soluista, jotka ilmentävät ABCC1 on noin 50% kontrollisoluissa. NaCl kasvoi tämän, noin 92%, ja urean muuttaa tätä, palauttaa arvot ovat lähellä kontrollisoluihin (54%).

Seuraava vaihe oli tutkia ABCC1 aktiivisuus virtaussytometrialla. Kun teet tämän, havaitsimme, että ohjaus soluja kertyy paljon enemmän CF (yhteinen käytetty substraatti ABCC1) kuin soluja käsiteltiin osmolytes, luultavasti siksi hyperosmolaliteetin median NaCl, urean ja NaCl + urea haitannut ottoa solun sisään väriaineiden ( kuva 9). Vaikka tämä heikentynyt vertailua osmolyytin käsiteltyjen solujen säätökennoja, voisimme silti verrata solujen normaali tai korkea SSC sisällä saman kohtelun. Siksi kuvassa. 10 on esitetty kertymistä ja ulosvirtausta NaCl käsiteltyjen solujen normaalin (Fig. 10A ja 10B) ja korkea (Fig. 10C ja 10D) SSC. Voidaan nähdä, että ottoa solun sisään CFDA oli samanlainen riippumatta siitä, normaali tai korkea SSC (Fig. 10A ja 10C). Kuitenkin ulosvirtaus fluoresoivan väriaineen soluja korkea SSC oli lähes täydellinen (Fig. 10D), kun taas solujen normaalin SSC noin 50% soluista ei pumpata väriaine (Fig. 10B). Toisaalta, solut käsiteltiin NaCl + urea olivat yhtä osaa pumpata väriaine, riippumatta normaali tai korkea SSC (Fig. 11b ja 11d).

Yhteensä solupopulaatio inkuboitiin aikana 96 tunnin ajan 37 ° C kanssa osmolytes ja solujen fluoresenssi, joka osoittaa kertyminen CF 30 min inkubaation mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Paneeli A esittää kertyminen CF kontrollisoluissa, mistä on osoituksena suuri fluoresenssin. Paneelit B, C ja D esittävät kertymistä CF käsitellyissä soluissa vastaavasti NaCl, ureaa tai NaCl + urea. Histogrammit edustavat 3 eri kokeesta.

Soluja inkuboitiin NaCl aikana 96 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja aktiivisuus ABCC1 mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Analyysin jälkeen, solut jaettiin kahteen alaryhmään mukaan sivusironta-arvojen. Vasen paneeli: CF kerääntyminen solujen normaalin (A) ja korkea (C) SSC; Oikea paneelit: CF ulosvirtausta soluista normaalin (B) ja korkea (D) SSC. Histogrammit edustavat 3 eri kokeessa. Arvot kussakin paneelissa viittaavat prosenttiosuus solujen fluoresenssin, mikä tarkoittaa sitä, solut, jotka kertyvät CF (paneeleissa A ja C), ja solut, jotka eivät voineet pumpata väriaineen jälkeen 30 min väriaine-väliaineessa (paneeleissa B ja D).

Soluja inkuboitiin NaCl + urea aikana 96 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja aktiivisuus ABCC1 mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Analyysin jälkeen, solut jaettiin kahteen alaryhmään mukaan sivusironta-arvojen. Vasen paneeli: CF kerääntyminen solujen normaalin (A) ja korkea (C) SSC; Oikea paneelit: CF ulosvirtausta soluista normaalin (B) ja korkea (D) SSC. Histogrammit edustavat 3 eri kokeita.

Keskustelu

MA104 on solulinja on peräisin munuaisten Afrikkalainen Monkey alkioiden [36]. Se ilmaisee useita ominaisuuksia polarisoitunut epiteelisolujen, kuten muodostumista ”kupolit”, perustaminen transmonolayer sähkövastuksen ja polarisoitunut kypsymisen vaipallinen virus [37]. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä solulinja ilmentää ainakin kaksi proteiinia, jotka liittyvät monilääkeresistenssiin, ABCB1 ja ABCC1 [28], [29], [38]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme edelleen tunnettu siitä, näiden solujen, ja se vaikuttaa hyvin todennäköiseltä, että MA104 peräisin kokoojakanavaan, luultavasti pääasiallinen soluihin. Tällainen luonnehdinta on tärkeää vahvistaa tätä solulinjaa mallina tutkimuksen ABCC1 munuaisissa.

Kun ominaista, osoitimme nousu osmolaliteetti takia NaCl tai koliinikloridi (mutta ei urea) vähensi solujen kasvua. Lisäksi ureaa suojattu soluja kasvun estäminen tai indusoimaa solukuolemaa NaCl mutta ei koliinikloridi (Fig. 3-4). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa muiden tekijöille, jotka osoittivat, että urea voisi kääntää haitallinen vaikutus johtuu NaCl [30]. On myös osoitettu, että vaikka urea voi aiheuttaa oksidatiivista vahinkoa, se kykenee myös aktivoimaan suojamekanismeja näiltä oksidatiivisen vahingot, ja että NaCl aktivoidaan myös suojamekanismeja, mutta vain silloin, kun se lisättiin vähitellen keskipitkällä [39], [ ,,,0],40]. Kuitenkin mekanismit, joilla tällaisia ​​vaikutuksia esiintyy vielä ole ymmärretty. Tarkka prosessi, jonka avulla NaCl aiheuttaa väheneminen solujen elinkelpoisuus on vielä tuntematon. Jotkut kirjoittajat näyttävät olevan yhtä mieltä, että korkeat NaCl pitoisuudet aiheuttavat solusyklin pysähtymiseen. Sekä Michea ja Kultz väittävät, että mIMCD kärsivät solukierron pysähtymisen G2 inkubaation jälkeen suolalisä pitoisuuksia, mikä vähentää leviämisen [41], [42]. Dimitrieva lisää, että vaatimus, joka osoittaa, että p53 nousevat nopeasti mIMCD3 soluissa inkubaation jälkeen natriumkloridia, joka vähentää solujen lisääntymistä ensi hetkestä [43]. Myöhemmin tutkimus taas viittaa siihen, että NaCl indusoi vähentäminen leviämisen, nyt määrä kasvusta EGR-1 ilmentymisen, joka toimisi kannustimena eriyttäminen [44]. Kultz [45] väittää lisäksi NaCl suurina pitoisuuksina aiheuttaa kaksinkertaisen säikeen katkoksia DNA, joka voi johtua vapaita radikaaleja. Lisäksi Zhou ja Zhang sopivat, että korkean NaCl aiheuttaa lisää ROS ja näin hapettumista [46], [47]. Sellaisenaan, todisteita näyttää viittaavan tämän vähennyksen elinkelpoisuuden taipumus kohta kohti oksidatiivisen stressin lähtökohtana.

tarjoama suoja urea on yhtä kiistanalainen kuin on NaCl aiheuttama vahinko. Yksi tutkimus osoittaa, että urea itsessään johtaa nousta ROS, mutta myös kykenee indusoimaan ekspressiota hemioksigenaasi-1 (HO-1) munuaisen soluja, jotka voivat käsittää osan adaptiivisen tai suojajärjestelmän hyperosmolaarisuus [40]. Zhang et ai, osoittaa, että urean lisääminen NaCl käsitellyissä soluissa johtaa inhibitioon kaspaasi-3-aktiivisuus [30]. Lisäksi, Santos osoitti, että sisempi ydin munuaisen solut, joita käsiteltiin sekä NaCl ja urea osoitti kasvua HSP70, joka korreloi kasvu osmolaarisuuden. Kirjoittajat ehdottavat, että tällaiset havainnot, jotka liittyvät leviämisen väheneminen nähdään käsitellyistä soluista voisi olla osa suojamekanismi, joka mahdollistaa solujen hengissä munuaisten ydin [48]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka NaCl (ja joissain malleissa, urea) johtaa lisätä oksidatiivista ja tästä DNA-vaurioita, joka on samanaikainen hoito urean johtaa aktivoitumiseen torjuntamekanismeissa kuten kaperonina lauseke, joka johtaa DNA suojaa. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että suoja urean vasten aiheuttaman vaurion pääasiassa Na

+ ioni eikä välttämättä NaCl. Tämä viittaa siihen, että uudet tutkimukset ovat tarpeen, jotta voidaan ymmärtää niin tappava vaikutus NaCl ja urean ja vuorovaikutusta näiden kahden komponenttien munuaisydinkalvonäyte.

Koska GSH on tärkein ei-entsymaattinen antioksidantti molekyylin, olemme tutkineet solunsisäistä GSH tasoja käsiteltyjen solujen NaCl ja /tai urea. Havaittiin, että NaCl: a, mutta ei ureaa, lisääntynyt solunsisäinen GSH tasoilla, ja että urea käänteinen lisäys GSH tasoilla NaCl-käsitellyissä soluissa (Fig. 5). Kasvu GSH pitoisuus NaCl käsitellyissä soluissa voi johtua esto ABCC1 toiminnan tai ilmaisua, mutta se voi myös johtua kasvusta oksidatiivisen stressin. Lisäksi BSO alennetaan 50% selviytymistä käsiteltyjen solujen NaCl, mutta ei muuttanut solujen eloonjääntiä käsiteltiin ureaa tai urea + NaCl (Fig. 6).