Krooninen sairaus

tiivistelmä

Berberiini (BBR), joka on isokinoliini johdannainen eristetty alkaloidi kiinalaiset yrtit, on pitkä historia käyttötarkoituksia hoitoon useiden sairauksien, kuten syöpien. Kuitenkin tarkka mekanismit toimien BBR ihmisen keuhkosyövän soluista on epäselvä. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet molekyylitason mekanismeja, joilla BBR estää solukasvua ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. Hoito BBR edistetään solujen morfologia muutos, esti solujen vaeltamiseen, lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista, ja indusoi apoptoosia. Edelleen molekyylimekanismiksi tutkimus osoitti, että BBR samanaikaisesti kohdistettuja useita soluviestitykseen väyliä estää NSCLC solujen kasvua. Hoito BBR esti AP-2α ja AP-2β ilmaisun ja kumottu niiden sitova hTERT promoottorit, mikä rajoitti hTERT ilme. Pudotus AP-2α ja AP-2β siRNA huomattavasti lisätyn BBR-välitteistä solujen kasvun esto. BBR tukahdutti myös tumaansiirtymiseen p50 /p65: n NF-KB-proteiinien ja niiden sitoutuminen COX-2-promoottori, jolloin COX-2. BBR myös vaimentua HIF-1α ja VEGF ilmaisun ja esti Akt ja ERK-fosforylaation. Pudotus HIF-1α siRNA huomattavasti lisätyn BBR-välitteistä solujen kasvun esto. Lisäksi BBR hoito laukaisi sytokromi-c vapautumisen mitokondrion välisen kalvon tilaa sytosoliin, edistänyt pilkkominen kaspaasin ja PARP, ja vaikutti ilmaus BAX ja Bcl-2, siten aktivoimaan apoptoottisen reitin. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että BBR inhiboi NSCLC solujen kasvua samanaikaisesti kohdentamalla AP-2 /hTERT, NF-KB /COX-2, HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT, Raf /MEK /ERK ja sytokromi-c /kaspaasi signalointireittejä. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uutta tietoa ymmärtämään syövän vastaisen mekanismeja BBR ihmisen keuhkosyövän hoidossa.

Citation: Fu L, Chen W, Guo W, Wang J, Tian Y, Shi D, et al. (2013) berberine tavoitteet AP-2 /hTERT, NF-KB /COX-2, HIF-1α /VEGF: n ja sytokromi-c /Caspase Signaling ohitettavat Human Cancer Cell Growth. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10,1371 /journal.pone.0069240

Editor: Gutian Xiao, University of Pittsburgh Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 6. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 15 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Fu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varat National Natural Science Foundation of China (81071687, 81272195), johon ”863-ohjelma” of China (SS2012AA020403), tohtoriohjelmat säätiö Opetusministeriö Kiina (20110171110077), ja valtion Key Laboratory Syöpätautien Etelä-Kiinassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julisti kuuluminen (t) ”Guangzhou Double Biopro- Inc” in kilpailevien etujen osa verkossa käsikirjoituksen muotoon. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä ykkösenä joukossa syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa [1]. Ilmaantuvuus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on tärkeä muoto keuhkosyöpään, on kasvanut merkittäviä kuolleisuutta ja sairastavuutta. Käsittely kuten kemoterapiaa ja säteily ovat tärkeimmät terapia strategioita keuhkosyöpään [2]. Viime vuosina, hoitojen selektiivisesti kohdesoluun signalointireittejä, kuten EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, MET, TITF-1, p53, LKB1 ja monet muut, paitsi jos parempaa ymmärtämistä NSCLC karsinogeneesin, mutta myös käytetään ennustavat tekijät tai tavoitteita yksilöllistämiseksi terapia [3]. Kuitenkin, selviytyminen on edelleen huono. Edistyminen keuhkosyövän ja genetiikan johti kehitystä pienimolekyylisiä phytochemicals, erityisesti fytokemikaaleista uutettu kiinalaiset yrtit, joilla on vaikutuksia syöpäsolujen lisääntymistä, angiogeneesin ja apoptoosin [4]. Siten optimointi tavanomaisten ja uusien terapeuttisten phytochemicals saattaa parantaa tulosten hoitoa keuhkosyöpään.

kiinalaiset yrttejä on käytetty laajalti ja menestyksekkäästi vuosisatojen hoidossa erilaisia ​​sairauksia [5]. Fytokemikaalit kiinalaiset yrtit ovat osoittaneet lupaus ehkäisyssä syövän turvallisuuden ja tehokkuuden [6]. Berberiini (BBR) on isokinoliini johdannainen eristetty alkaloidi juurakosta, juurista ja varsi kuori useiden kiinalaisten yrttien,

Berberis

lajeja, kuten

Hydrastis

canadensis

(goldenseal),

Cortex phellodendri

(Huangbai) ja

Rhizoma coptidis

(Huanglian) [7]. Berberiini on pitkä historia käytetään terapeuttisena aineena hoitamaan erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien syöpä. On raportoitu, että BBR mukaan esillä useita farmakologisia vaikutuksia, mukaan lukien anti-inflammatoriset [8], verenpainetta alentava [9], kolesterolia alentava [10], ripuli- [11,12], anti-mikrobi [13,14 ] toimintaa, ja kasvaimen vastainen vaikutus BBR oli yhä enemmän korostuu jo usean vuosikymmenen ajan [15,16]. BBR on osoitettu olevan anti-leviämisen vaikutuksia syöpäsoluja vastaan ​​eri alkuperää, kuten glioblastooma [17], melanooma [18], paksusuolen syöpä [19], rintasyöpä [20,21], eturauhassyöpä [22] ja niin edelleen . Ihmisen keuhkosyöpä, on osoitettu, että BBR parannettu cyto myrkyllisyys sekä säteilyn

in vivo

ja

in vitro

mallien kautta induktion autophagy [23], ja BBR näytteillä suojaava vaikutus säteilyn aiheuttamien keuhkovaurio läpi solujen välistä adheesiota molekyyli-1 ja transformoiva kasvutekijä-beeta-1 [24]. BBR myös tehokkaasti esti liikkuvuutta ja hyökkäys kyky keuhkosyöpään A549 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla ei-solumyrkyllisyyspitoisuutta kautta laski tuotantoja urokinaasi-plasminogeeniaktivaattorin ja matriksimetalloproteinaasi-2 [25]. Lisäksi BBR oli raportoitu estävän kasvua ja aiheuttaa apoptoosin ihmisen keuhko- syöpäsoluja, ja hallinnon BBR letkulla suun kautta esti kasvua tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa nude-hiirissä [26]. Vaikka todisteita antituumorivaikutukset BBR laajenee, epävarmuus mekanismien BBR NSCLC edelleen.

Human telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) on osoitettu olevan tärkeä osa ihmisen telomeraasin, joka syntetisoi telomeerisesti DNA, pidentää kromosomi päät ja ylläpitää kromosomi vakautta, lopulta johtaa solun kuolemattomaksi [27]. hTERT ei ilmenny useimmissa ihmisen somaattisten solujen, mutta se on yleisesti yli-ilmennetään monenlaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä [28]. Kohonnut ekspressio hTERT on tarpeen muuttaa normaalin ihmisen solujen syöpäsoluja. Transkription säätely hTERT-geenin on merkittävä mekanismi syöpä-spesifinen aktivaatio telomeraasin, ja useita tekijöitä on tunnistettu suoraan tai epäsuorasti säädellä hTERT-promootterin [29]. Aktivoiva tehostaja-sitova proteiini-2 (AP-2) on osoitettu transkriptionaalisesti ekspression säätelemiseksi hTERT. AP-2 transkriptiotekijän perhe sisältää joukon kehityksellisesti säännelty, retinoiinihappo indusoituvia geenejä koostuu neljästä liittyvät tekijät-AP2α, AP2β, AP2γ, ja AP2δ [30]. Sitoutumalla hTERT-promootterin, AP-2 tekijät saavat aikaan biologisia vaikutuksia aktivaation kautta useiden kasvaimeen liittyvien geenien ja signalointireittejä, kuten hTERT, PI3K /Akt ja Raf /MEK /ERK [31].

endoteelikasvutekijä (VEGF) on tunnustettu yhdeksi tärkeimmistä initiaattoreista kehittämiseen ja etenemistä vascularization järjestelmän [32]. Pigmenttiepiteelin-johdettu kasvutekijä (PEDF), joka on voimakas angiogeneesin estäjä sekä neuro-suojaava tekijä, tasapainottaa vaikutus VEGF [33]. VEGF ja PEDF molemmat hallussaan useita biologisia toimintoja ja tehtäviä ja niillä on käänteinen suhde toisiinsa erityisesti syöpään [34]. VEGF: n ilmentymistä ja PEDF säätelee kehon ulkoisten tekijöiden, joista hypoksia on paras tunnettu sovittelija. Hypoksia indusoituvat tekijä-1α (HIF-1α) on transkriptiotekijä, joka on keskeinen rooli syövän synnyssä. Aktiivisuus HIF-1α on voimistuvan erilaisia ​​ei-hypoksinen signaaleja, mukaan lukien aktivoituminen useita onkogeeninen reittejä, kuten Src, HER-2, Ha-Ras, ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) signalointia [35]. Sitoutumalla hypoksia-reagoiva elementit VEGF-promoottori, HIF-1 johtaa transkriptionaalisen aktivaation VEGF-geenin [36].

COX-2 on indusoituva entsyymi, joka muuntaa arakidonihappoa prostaglandiinit, ja se on yleisesti yli-ilmennetään monenlaisia ​​ihmisen syövissä [37]. Lisääntynyt ilmentyminen COX-2-proteiinin ja sequencial PGE2-tuotantoa on osoitettu merkittävästi parantaa karsinogeneesiin ja tulehdusreaktioita säätelemällä EGFR, PI3K, ja ERK1 /2 signalointi [38]. COX-2: n ilmentymisen on transkriptionaalisesti ohjataan sitovat useiden transaktivaattorista ja koaktivaattoreiden vastaavaan toimipaikkoja sen promoottori. Tunnettuja useita säätelyelementtejä jakelusta ytimessä promoottorialueen COX-2 transkription aloituskohdasta, NF-KB sitoutumiskohta on olennaista COX-2 promoottorin aktiivisuus [39,40].

PI3K /AKT ja raf /MEK /ERK kaksi klassista solu signalointipolkujen ja sillä on keskeinen rooli sääntelyn solujen geenien ilmentymisen, kasvua selviytymistä. Epänormaali PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointi voi johtaa lisääntyneeseen tai valvomattoman solujen lisääntymistä, vastustuskykyä apoptoosin ja kemoterapia, sädehoito, ja kohdentamalla hoitomuotojen kasvaimia. Aktivointi HIF-1-proteiinia voidaan helpottaa PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointi. Koska ylävirran molekyylejä HIF-1-proteiinia, ERK saattaa myös osansa välittämisessä vaikutus BBR inhibitioon solujen kasvun [41].

Apoptoosin induktio pidetään yhtenä mahdollisena mekanismeja inhibitio syövän kehittymisen. Kaspaasin aktivaatio on keskeinen rooli suorittaessaan apoptoosin. Aktivoitu kaspaasien katkaisevat erilaisia ​​kohdeproteiinien, estäen tärkeisiin solun prosesseja ja hajottaa rakenneosat solun. Vapautuminen Sytokromi-c päässä mitokondrion välisen kalvon tilaa sytosoliin on edellytyksenä kaspaasiriippuvaisen apoptoosireitin. Sytokromi c sitoutuu Rahastolla-1 ilman dATP, ja kompleksi sitoo pro-kaspaasi-9 muodostamiseksi apoptosome, joka pilkkoo pro-kaspaasi on kaspaasi 9, ja vuorostaan ​​aktivoi efektori kaspaasi-3 [42].

tässä tutkimuksessa tutkimme yksityiskohtaisesti taustalla olevien mekanismien BBR estämisessä NSCLC solujen kasvua NSCLC

in vitro

. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uutta tietoa selvittää mahdollisuudet hoitostrategioita ja uusia tavoitteita ihmisen keuhkosyöpä.

Tulokset

BBR muuttuneet solun muotoon ja esti solumigraatio

Ensin analysoitiin vaikutus BBR solumorfologiaan A549 ja H1299 soluja. Käsittely BBR 100 uM BBR vähentää tehokkaasti solu-solu yhteyttä ja johti alempaan levitys vähemmän muodostumista fi lopodia verrattuna DMSO kontrolliryhmiin (kuvio 1A). Testasimme myös vaikutusta BBR solujen muuttoliikettä käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. Kuten kuviossa 1B, osa haavoittumisen väli solukerroksissa tehtyään naarmu oli miehitetty kokonaan kulkeutuva solut 48 tunnin kuluttua kontrolliryhmässä. Kuitenkin tyhjä tila solujen ei miehitetty kulkeutuva solut käsiteltiin 20 uM BBR. Nämä tulokset osoittivat potentiaalit BBR muuttuvissa solujen morfologia ja estämällä soluvaelluksen keuhkosyöpäsoluissa

(A) muutokset solu- morfologian ja leviää A549 ja H1299 soluja käsiteltiin 100 uM BBR 48 tuntia havaittiin ja solut valokuvattiin mikroskoopilla varustettu digitaalikamera. (B) solumigraation analysoitiin haavan paranemista määrityksessä. Soluja kasvatettiin täyteen konfluenssiin. Yksisolukerrokset haavoittuneen steriilillä pipetillä kärjestä, ja pestiin väliaineen poistamiseksi irrottaa soluja levyt. Solut jätettiin joko hoitamatta tai käsiteltiin 20 uM BBR. 48 h jälkeen haava ero havaittiin ja solut valokuvattiin.

BBR tukahdutetaan solujen proliferaatiota ja pesäkkeiden muodostuminen

berberine on osoitettu aiheuttavan kasvun estäminen ja apoptoosin ei-pienisoluisen solu ihmisen keuhkosyövän soluihin p53 signalointireitin [43]. Seuraavaksi me analysoitiin kvantitatiivisesti vaikutuksen BBR soluproliferaatioon keuhkosyövässä A549 ja H1299 solujen MTT: llä. Hoidon BBR annoksella 10 uM 200 uM inhiboi solujen elävyys annoksesta riippuvalla tavalla. IC

50-arvot BBR A549- ja H1299 solut ovat 67,1 uM ja 59,2 uM (kuvio 2A). Testasimme myös vaikutukset BBR kasvainsolujen kyky muodostaa klooneja A549-soluissa (kuvio 2B). Hoito BBR selvästi esti pesäkkeiden muodostumista, jolloin merkittävä lasku molemmissa pesäkkeiden muodostumisen suhteen (kuvio 2C) ja pesäkkeen koko (kuvio 2D).

(A-C) Ihmisen A549 ja H1299 soluja käsiteltiin BBR osoitetussa annoksilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elävyys määritettiin MTT-määrityksellä. IC50-arvot BBR A549- ja H1299-solut laskettiin (A). Kasvainsolun A549 aiheuttama pesäkkeiden muodostumisen analysoitiin myös (B), ja pesäkkeiden muodostumisen määrä (C) ja pesäkkeen koko (D) laskettiin. Solut, joita käsiteltiin DMSO: tä käytettiin vertaisverkko ryhmä solun elinkelpoisuuden asetettu 100%. Prosentuaalinen solujen elävyys kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa soluihin käsitelty DMSO ajoneuvon hallinnan. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolme testiä. *, P 0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja DMSO kontrolliryhmiin.

BBR esti AP-2 /hTERT signalointi

hTERT on pidetty tunnusmerkki syövän synnyn ja ilmaus hTERT on tiukasti hallinnassa transkriptiotekijä AP-2. Sen määrittämiseksi, ovatko BBR suunnattu AP-2 /hTERT signalointi, käsittelimme A549 soluja BBR (20 uM tai 100 uM) ja tutki ilmaus AP-2α, AP-2β ja hTERT proteiineja ja mRNA: iden Western blot ja RT-PCR vastaavasti. Hoidon BBR johti huomattavan estymisen ilmentymisen AP-2α, AP-2β ja hTERT on proteiinia (kuvio 3A) ja mRNA-tasot (kuvio 3B).

(A-C) Ihmisen NSCLC A549-soluja hoidettiin BBR osoitetussa annoksilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, AP-2 ja hTERT-proteiinien (A) ja mRNA: n (B) analysoitiin Western-blottauksella ja RT-PCR: llä, vastaavasti. GAPDH käytettiin verrokkeina näytteen lastaus. Sitoutumisen AP-2 hTERT-promootterin koetin (C) analysoitiin streptavidiini-agaroosia avattavan määrityksessä. (D) A549-solut transfektoitiin AP-2 siRNA tai AP-2-ilmentävällä vektorilla 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten BBR (100 uM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen, proteiinin ilmentymisen ja solujen elinkelpoisuus määritettiin Western blot ja MTT-määrityksellä, vastaavasti. Prosentuaalinen solujen elävyys kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *, P 0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja DMSO kontrolliryhmiin.

Koska hTERT ilmentyminen on tiukasti ohjataan sitovaa aktiivisuutta AP-2 perheen hTERT-promootterin, me seuraavaksi suoritetaan streptavidiini-agaroosia avattavan määritys tutkia vaikutusta BBR AP-2α ja AP-2β sitovia toimintaa hTERT promoottori. Kuten kuviossa 3C on esitetty, BBR hoitoon tehokkaasti kumottu AP-2α ja AP-2β sitoutumisen biotiini-leimattu hTERT-promootterin DNA-koetinta (kuvio 3C).

Vahvista rooli AP-2 signalointi BBR- välitteisen soluproliferaation inhibition, transfektoimme A549-soluja AP-2α tai AP-2β siRNA (100 nM), ja käsiteltiin sitten ne BBR (100 uM) 48 tuntia. Tulokset osoittivat, että transfektio AP-2α tai AP-2β siRNA tehokkaasti alassäädetty ilmentymistä AP-2α tai AP-2β proteiinia ja huomattavasti esti solujen elinkelpoisuuden (kuvio 3D). Pudotus AP-2α tai AP-2β siRNA myös lisäsi selvästi BBR-estoa solujen elinkelpoisuuden verrattuna transfektio ohjaus siRNA (si-NC) (kuva 3D). Nämä tulokset vahvistavat, että vaikutus BBR soluproliferaatioon inhibitio välittyy ainakin osittain läpi AP-2 /hTERT: n signalointireitin keuhkosyöpään soluissa.

BBR inhiboi NF-KB /COX-2-signalointi

korkea ilmentyminen COX-2 on osallisena syöpäsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja angiogeneesiä. Määrittämään vaikutukset BBR COX-2 signalointi keuhko- syöpäsoluja, seuraavan kerran analysoitiin ekspressiota COX-2-proteiinin in A549-soluja käsiteltiin BBR Western blotilla. Hoidon BBR annoksella 20 uM ei merkittävästi inhiboi COX-2-proteiinin ekspressiota, kun taas annoksella 100 uM merkittävästi vähentynyt COX-2-proteiinin ilmentymisen A549-soluja (kuvio 4A).

(A) ihmisen A549-soluja käsiteltiin BBR osoitetussa annoksilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, COX-2-proteiinia analysoitiin Western-blottauksella. GAPDH käytettiin verrokkeina näytteen lastaus. (B) A549-soluja esikäsiteltiin COX-2-selektiivinen estäjä selekoksibi (CB, 20 uM) 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten BBR (20 uM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysillä. Prosentuaalinen solujen elävyys kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus. (C) A549-soluja käsiteltiin BBR osoitetussa annoksilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, sitoutumisen p50 ja p65 COX-2-promoottori koetin analysoitiin streptavidiini-agaroosia avattavan määrityksessä. (D) A549-soluja käsiteltiin BBR (100 nM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen, vaikutus BBR NF-KB: n p65 ja p50 translokaation analysoitiin immunofluoresenssimäärityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *, P 0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja DMSO-kontrollin kanssa.

ilmentyminen COX-2 on tiukasti säädeltyä, että sitovaa aktiivisuutta p50 /p65: n NF-KB: n COX-2-promoottori rakenne. Me seuraavaksi määritetään, onko BBR-indusoitua tuumorin solujen proliferaatiota ja COX-2: n ilmentymisen välittää sitoutumisen inhibition NF-KB: n ja COX-2 promoottorin A549-soluja. Streptavidiini-agaroosi-pull-down-määritys osoitti, että BBR annoksella 100 uM inhiboi merkittävästi NF-KB: n p50 ja p65 sitoutumista COX-2-promoottori koetin verrattuna verrokkiryhmään (kuvio 4B). Sen sijaan, BBR annoksella 20 ja 100 uM ei vaikuttanut p50 ja p65-proteiinin tasot kokosolulysaateista (kuvio 4A).

translokaatio NF-KB: n p65 ja p50 solutumissa ja sytoplasmaan näytelmiä avainasemassa säännellä COX-2-geenin ilmentymisen. Me seuraavaksi suoritetaan immunofluoresenssimäärityksellä arvioida vaikutusta BBR NF-KB: n p65 ja p50 translokaatio in A549-soluja. Konstitutiivinen translokaatio NF-KB: n p65 ja p50 solun tumia havaittu (kuvio 4C). Käsittely BBR (100 uM) tehokkaasti edistää translokaatiota NF-KB: n p65 ja p50 solusta ytimet sytoplasmaan. Tulokset viittaavat siihen, että tuumorin solujen kasvua BBR voidaan myös välittämä moduloimalla NF-KB /COX-2: n signalointireitin keuhkosyöpään soluissa.

BBR inhiboi HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT , Raf /MEK /ERK signalointi

HIF-1α /VEGF /PEDF signaloinnin liittyy läheisesti syöpäsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja angiogeneesiä. Me seuraavaksi määritetään vaikutus BBR ekspressioon HIF-1α, VEGF: n ja PEDF on proteiini- ja mRNA-tasot keuhkosyöpää solujen RT-PCR: llä ja Western blot, vastaavasti. Hoito A549-solujen BBR estivät merkittävästi ekspressiota HIF-1α: n ja VEGF, mutta eivät PEDF, on proteiinia (kuvio 5A) ja mRNA-tasot (kuvio 5B).

A549-soluja käsiteltiin BBR ilmoitettuina annoksia. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, ilmaus HIF-1α, VEGF: n ja PEDF on proteiini (A) tai mRNA-tasot (B), samoin kuin koko ja fosforyloidun Akt ja ERK1 /2-proteiineja (D), määritettiin. A549-soluja käsiteltiin HIF-1α-spesifisten siRNA (si-HIF) (C) tai Akt-estäjä LY294002 (LY, 30 uM) tai ERK-estäjä U0126 (U, 50 uM) (E) 24 tuntia, vastaavasti, ja käsiteltiin sitten BBR. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysillä. Prosentuaalinen solujen elävyys kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *, P 0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja DMSO kontrolliryhmiin.

vahvistaa vaikutuksia BBR on HIF-1α /VEGF /PEDF signaloinnin, transfektoimme A549 soluja HIF-1α siRNA (100 nM) ja käsiteltiin sitten ne BBR (100 uM) 48 tuntia. Kuten kuviossa 5C esitetään, pudotus HIF-1α siRNA lisäsi huomattavasti BBR-välitteisen soluproliferaation inhibointi verrattuna transfektio ohjaus siRNA. Nämä tulokset vahvistavat, että vaikutus BBR soluproliferaatioon esto välittävät myös osittain läpi HIF-1α /VEGF /PEDF signalointireitin keuhkojen syöpäsoluja.

PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointi näyttelee tärkeä rooli säätelyssä kasvainsoluproliferaation ja selviytymistä. Sen määrittämiseksi, oliko BBR välittämiä solun kasvun estäminen on myös läpi inaktivaatiota PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointireitin, analysoimme vaikutus BBR on fosforylaation Akt ja ERK A549-soluissa Western blot. Kuten on esitetty kuviossa 5D, hoito BBR merkittävästi vähentynyt tasot fosforyloitua Akt ja ERK1 /2-proteiineja, kun taas veren kokonaiskolesterolia Akt ja ERK1 /2-proteiinia ei muutu.

BBR aktivoitu kaspaasiriippuvaisen apoptoottisten pathway

määritetään myös, onko lisälaite solujen kasvun esto indusoi BBR liittyy kasvu apoptoosin keuhkosyövän soluja. Hoidon BBR annoksilla 20 uM ja 100 uM indusoidun 26% ja 50% apoptoottisia soluja A549 ja 28% ja 60% apoptoottisia soluja H1299-soluissa (kuvio 6A). Vahvistaa vaikutuksen BBR apoptoosiin, seuraavan kerran havaitaan kuvaamaan joitakin pro-apoptoottisen ja anti-apoptoottiset proteiinit, kaspaasi-3 /7/9, PARP, BAX: n ja Bcl-2 A549-soluissa Western blot-analyysi. BBR merkittävästi lisäsi ekspressiotasot pilkottiin kaspaasi-3 /7/9, pilkottiin PARP ja BAX-proteiineja, mutta laski Bcl-2-proteiinin tasot verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 6B).

A549 ja H1299-soluja käsiteltiin BBR (20 uM tai 100 uM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen, apoptoosi määritettiin FACS-analyysillä (A). Tasot pilkottiin kaspaasi-3, 7, 9, pilkottiin PARP, BAX: n ja Bcl-2-proteiinien A549-solut analysoitiin Western blot (B). Vapauttamista Cyt-c A549-soluissa analysoitiin immunofluoresenssilla kuvantaminen analyysi seurata Cyt-c vapautumisen välisen mitokondrioiden tilaa sytosoliin (C). Apoptoosi edustaa suhteellinen osuus apoptoottisia soluja verrattuna, että DMSO-käsitellyissä soluissa. *, P 0,05, merkittäviä eroja BBR-käsiteltyjen ryhmien ja DMSO-käsiteltyjen ryhmien.

Sytokromi-c (Cyto-c) vapautuminen on tärkeä tapahtuma kaspaasiriippuvaisen apoptoosireitin . Me seuraavaksi suoritetaan immunofluoresenssimenetelmällä kuvantaminen (IF) analyysi seurata muutoksia solunosasijaintia Cyto-c A549-soluissa onko BBR voisi aiheuttaa Cyto-c release. Käsittely BBR (20 uM tai 100 uM) selvästi laukaisi vapauttamaan Cyto-c inter-mitokondrioiden tila sytosoliin (kuvio 6C). Nämä tulokset osoittavat, että BBR voivat helpottaa loppupään Cyto-c-riippuvaisen apoptosome kokoonpano ja kaspaasin aktivaatio sytosoliin keuhkojen syöpäsoluja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioimme vaste ihmisen keuhkosyöpäsoluissa A549 ja H1299 BBR, joka on isokinoliini johdannainen eristetty alkaloidi kiinalaiset yrtit. Olemme havainneet, että BBR parantaa solujen kasvun esto ja apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas näitä vaikutuksia ei havaittu normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (tuloksia ei ole esitetty). Tulokset osoittavat, että kasvainten vastainen vaikutus BBR välittyy modulaatio AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, NF-KB /COX-2, PI3K /Akt, Raf /MEK /ERK, kaspaasi /sytokromi C ja BAX /Bcl-2-riippuvainen signalointi.

hTERT on pidetty maamerkkinä syövän. AP2 /hTERT signalointi osoitettu olevan tärkeitä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [44]. Estyminen hTERT ilmentymisen havaittiin edistää leviämisen estämiseksi ja angiogeneesiä ja apoptoosin indusoimiseksi syöpä- solujen [45]. Tutkimuksessamme olemme osoittaneet, että vaikutus BBR kasvaimen solujen lisääntymisen inhibition välittyy osittain läpi AP-2 /hTERT signalointia. Hoidon BBR tukahdutti ilmentymisen AP-2a ja AP-2b ja vähensi proteiinin runsaasti solutumissa, mikä vähentää sitoutumista AP-2a ja AP-2b hTERT-promootterin ja alas-ekspressiota sääteleviä hTERT on BBR- käsitellyt solut.

lisääntynyt suhde VEGF /PEDF tarvitaan angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua [46]. HIF-1α /VEGF /PEDF reitin olemassa kriittinen vaihe keuhkosyöpään angiogeneesiin ja kasvaimen etäpesäke [47]. Tutkimuksemme osoitti, että BBR esti HIF-1α ilmaisua, mikä esti VEGF /PEDF suhde keuhkojen syöpäsoluja. On mahdollista, että BBR inhiboi HIF-1α-proteiinin kertymistä keuhko- syöpäsoluja, ja vaimennetaan ilmentyminen liittyvät geenit, jotka osallistuvat kasvaimen solujen lisääntymisen. Täten tuloksemme osoittavat, että HIF-1α signalointi vaikuttaa omalta ainakin osittain BBR aiheuttama solujen kasvun estäminen.

COX2 avainasemassa alkuvaiheessa keuhkojen syövän synnyn [48]. Täällä, osoitimme, että BBR pelataan sen antiproliferatiivinen rooli osittain estämällä COX-2: n ilmentymisen. Huomasimme, että BBR esti COX-2: n ilmentymisen paitsi proteiinia tasolla vaan myös mRNA tasolla, mikä viittaa siihen, että BBR voisi käyttää antituumorivaikutus osittain läpi tukahduttaminen COX-2 signalointi. Olemme myös havainneet, että COX-2: n ilmentymisen käsittelemällä BBR on osittain välittyy stimuloimalla NF-KB translokaatio ydinenergiasta sytosoliin ja se inhiboi NF-KB: n ja COX-2-promoottori.

PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointi avainasemassa säätelyssä solun geenin ilmentymisen, kasvua selviytymistä. Suhde Raf /MEK /ERK ja PI3K /AKT keuhkosyöpään on edelleen voimakas tutkimusalueen nykyisin [49,50]. Tutkimuksemme osoitti merkittävää roolia PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointireitille in BBR välittämän solujen lisääntymisen inhibition. BBR toimisi kautta inaktivoimalla PI3K /AKT ja Raf /MEK /ERK signalointireitin, fosforylaation inhibitiota Akt ja ERK proteiineja, ja vähen- tämisessä HIF-1α signalointi estämään kasvainsolujen kasvua.

Apoptoosi on keskeinen rooli vaste syövän kemoterapiaa ja sädehoitoa. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että apoptoosin induktio ihmisen keuhkosyövän soluja BBR oli sytokromi-c ja kaspaasi-riippuvaista apoptoosia reittejä. Huomasimme, että BBR indusoi kaspaasi ja PARP-proteiinien, ja edistettävä vapauttamista sytokromi-c välillä mitokondrioita sytosoliin. Tuloksemme siis viittaavat siihen, antituumorivaikutusta ja BBR keuhkosyövän soluja liittyy lisääntynyt aktivointi sytokromi-c ja kaspaasiriippuvaisen apoptoottisen reitin.

Yhteenvetona osoitettiin, että BBR osoittivat anti-proliferatiivisia ja pro -apoptotic toiminta NSCLC soluihin samanaikaisesti modulaatio AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, NF-KB /COX-2, Raf /MEK /ERK, PI3K /AKT ja kaspaasi /sytokromi-c signalointireitteihin. Nämä havainnot tarjoavat uusia oivalluksia tutkia uusia mahdollisuuksia hoitostrategioita ja uusia tavoitteita keuhkosyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat A549 ja H1299 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja viljeltiin yksikerrosviljelminä RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin inkubaattorissa, jossa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

reagenssit ja vasta

Berberiini (BBR), U0126, LY294002 ja selekoksibi hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO) ja liuotetaan pieneen määrä DMSO ennen lisäämistä koko soluviljelyalustaan. Streptavidiini-agaroosia Sigma (St. Louis, MO). Vasta-aineet GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, p50, p65, COX-2 saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet AP-2α, AP-2β, hTERT, sytokromi-c, PARP, kaspaasi-3 /7/9, BAX, Bcl-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt tai ERK1 /2 ostettiin Cell Signaling ( Beverly, MA).

haavanparantumis- määritys

arpeutumisprosessit määritys suoritettiin havaitsemaan solujen vaeltamiseen. Soluja kasvatettiin täyteen konfluenssiin kuuden kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli nälkiinnityskasvatusaine. Yksisolukerrokset haavoittui steriiliin 100 ui pipettetip, pestään nälkiinnityskasvatusaine poistamiseksi irrottaa soluja levyistä. Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksilla BBR kokonaan keskipitkällä ja säilytetään CO

2-inkubaattorissa. 48 tunnin kuluttua väliaine korvattiin PBS: llä, haavan ero havaittiin ja solut valokuvattiin käyttäen Olympus mikroskooppi on varustettu digitaalikameralla.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys määritettiin käyttäen MTT-määritystä (Roche Diagnoosi, Indianapolis, IN). Lyhyesti, keuhkosyövän solulinjoja siirrostettiin 4 x 103 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Soluja viljeltiin yön yli, ja sitten solut vaihdetaan tuoreeseen väliaineeseen, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia BBR liuotettiin DMSO: hon (lopullinen konsentraatio, 0,1%). Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 48 h, solujen kasvu mitattiin. Vaikutus Solujen elinkelpoisuus arvioitiin prosentuaalisena solujen elinkelpoisuus verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluja, jotka annettiin mielivaltaisesti 100% elinkelpoisuuden. BBR pitoisuus, joka tarvitaan aiheuttamaan 50%: solujen kasvun esto (IC 50) määritettiin interpoloimalla annos-vaste-käyrät.

Anchorage riippumaton pesäkemuodostusta

A549-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille oli käsitelty BBR. 24 tunnin kuluttua solut pestiin PBS: llä ja trypsinoitiin. Sitten soluja (8 x 10

3 /ml) sekoitettiin 1,0 ml: aan 0,3%: McCoyn 5a-agar, joka sisälsi 10% FBS: ää. Viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 14 päivää. Väliaine poistettiin ja solut pestiin huolellisesti PBS: llä kahdesti.