Krooninen sairaus

tiivistelmä

G503 on antrakinonin yhdiste eristettiin sekundäärimetaboliitteja of Mangrove endofyyttisten sienten Etelä-Kiinan merellä. Tämä tutkimus valottaa antituumorivaikutuksen ja taustalla mekanismi G503. Solunelinkykyisyysmääritys suoritettiin yhdeksässä syöpäsolulinjoissa ja kaksi normaalia solulinjat osoittivat, että mahalaukun syövän solulinja SGC7901 on kaikkein G503-syöpäsoluja. G503 indusoi SGC7901 solukuolemaa apoptoosin kautta. G503 altistus aktivoitu caspases-3, -8 ja -9. Esikäsittely yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK ja kaspaasi-9-estäjä Z-LEHD-FMK, mutta ei kaspaasi-8 inbibitor Z-IETD-FMK, heikennetty vaikutus G503. Nämä tulokset viittaavat siihen, että luontainen mitokondrioiden apoptoosireittiä, eikä ulkoinen tie, oli mukana G503: n indusoiman apoptoosin. Lisäksi G503 lisääntynyt suhde Bax ja Bcl-2 mitokondrioissa ja laski suhde sytosoliin. G503-hoito johti mitokondrion Depolarisaatio, sytokromi c release ja myöhemmin pilkkominen kaspaasin -9 ja -3. Lisäksi on raportoitu, että endoplasmakalvostoon apoptoosireittiä voidaan myös aktivoida G503 indusoimalla capase-4 pilkkominen. Kun otetaan huomioon alemman 50% estävä pitoisuus mahalaukun syöpäsoluja, G503 voi toimia lupaava ehdokas mahalaukun syövän kemoterapiassa.

Citation: Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Antrakinonia G503 indusoi apoptoosia mahasyöpä Syöpäsolut läpi mitokondrioiden Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 19 elokuu 2014; Julkaistu: 30 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Nature Science Foundation of China, Grant Number: 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech Special Project Kiinan, Grant Number: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Ohjelma Jatko Station University, Grant numero: 20120171110053, 20130171110053; Key Project of Nature Science Foundation of Guangdong, Kiina, Grant Numero: 10251008901000009; Key Sci-Tech Research Project Guangdong, Kiina, Grant Numero: 2011B031200006; Guandong Natural Science Fund, Grant Number: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-Tech Research Project Guangzhou kunta, Kiina, Grant Number: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Ohjelma nuori opettaja yliopistossa, Grant Numero: 10YKPY28; Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University, lukumäärä: 985 projekti PCSIRT 0947. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kirurgia, sädehoito ja kemoterapia ovat ensisijainen kliininen kasvain hoitoja. Kuitenkin leikkaus ja sädehoito ovat tehottomia metastaattinen; jos kemoterapia käytetään oikein, etäpesäke voidaan estää [1]. Ottaa huomioon syövän lääkekehityksessä, antrasykliinit ovat tehokkain syöpälääkkeet [2]. Luonnontuotteet valtameret ovat tärkeitä lähteitä uusien syöpälääkkeiden [3]. Marine mikro-organismi aineenvaihduntatuotteiden ainutlaatuisia rakenteita ja farmakologisia toimintoja käytetään tyypillisesti johtava antitumor yhdisteet [4]. Antrakinoniyhdisteitä, kuten daunorubisiini, doksorubisiini, epirubisiini ja mitoksantroni, ovat tehokkain kliinisen syöpälääkkeet [2]. Meri- antrakinoni SZ-685C estää leviämisen ihmisen rintasyövän [5] – [6] ja ihmisen nenänielun karsinooma (NPC) solut [7]. Huang et al. osoittivat, että antrakinonien raparperin, kuten emodiini, aloe-emodiinia ja rhein, estää kasvun ja leviämisen eri syöpäsolujen, kuten keuhkojen adenokarsinooma, myelooinen leukemia, neuroblastooma, maksasyövän, virtsarakon syöpä ja muut [8].

mekanismia antituumorivaikutuksen antrakinonien osallistuu pääasiassa seuraavia näkökohtia [9] – [10]: DNA vuorovaikutuksia sitoutumalla, interkaloimiseksi ja häiritseviä erottaminen DNA kaksijuosteisen; suora kalvo vaikutukset; DNA-vaurioita vastauksena topoisomeraasin II inhibition tai tuottaa vapaita radikaaleja, kuten reaktiivisen hapen (ROS), ja apoptoosin induktio kautta topoisomeraasi II inhibition, on toimiva p53, tai ROS: n syntyminen. Lisäksi antrakinoneilla myös laukaista apoptoosin kautta JNK (c-Jun N-terminaalinen kinaasi) [11], Akt /PKB (proteiinikinaasi B) [5], [12] ja mitokondrioiden reittejä [13] – [14].

G503 on antrakinonin yhdiste eristettiin sekundäärimetaboliitteja on mangrove endofyyttisten sieni nro 1403 alkaen Etelä-Kiinan merellä [15] .Kuitenkin onko G503 hallussaan syövän vastainen potentiaali kuin antrakinoni yhdistettä ei ole tutkittu. Näin ollen, esillä oleva tutkimus suunniteltiin selvittämään anti-kasvain aktiivisuus G503 ja taustalla olevasta mekanismista.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-diphenylterazolium bromidia (MTT) ja ROS scavenger N-asetyyli-kysteiini (NAC) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, karboksi-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit ja MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) saatiin Invitrogen (USA). Anneksiini V-FITC (fluoreskeiini-isotiosyanaatti) /PI (propidiumjodidia) Apoptosis Detection Kit ostettiin Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kiina). RPMI1640 väliaineessa ja naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Hyclon (Logan, UT, USA

).

Kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-FMK, kaspaasi-9-estäjä Z-LEHD-FMK ja kaspaasi-perheen estäjä Z-VAD-FMK oli Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) ja Beyotime (Kiina). Vasta-aineita kaspaasi-3, kaspaasi-4, kaspaasi-8, kaspaasi-9 ja COXIV vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Vasta-aineet sytokromi

c

, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 ja anti-vuohi LGG-HRP oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Hiiren anti-β-aktiini ja anti-GAPDH ensisijainen antibodywere Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-kani-IgG: n-peroksidaasi ja anti-hiiri-IgG-peroksidaasi olivat Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria eristyspakkausta hankittiin Pierce (Pierce, IL, USA), proteiini iinianalyysikitissä ostettiin Bio-Rad (Hercules , CA, USA), ja ECL havaitseminen pakki olivat Applygen Technologies Inc (Peking, Kiina).

Käyminen, louhintaan ja eristäminen G503 peräisin

Nigrospora

sp. No. 1403

NO.1403 eristettiin lahopuuta on

Kandeliacandel

(L.) Druce ja reidentified kuten

Nigrospora

sp. (Genebankin hakunumero: HQ891110), kerätään Mai Po, Hong Kong, ja Salt Lake Bahamalla. G503 eristettiin ja puhdistettiin sekundäärimetaboliitteja NO. 1403 [15]. Starter viljelmiä pidettiin maissijauhoagarilla meriveden agar. Pistokkeet agar tukevat rihmaston kasvun leikattiin ja siirrettiin aseptisesti 250 ml: n Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 100 ml nestemäistä elatusainetta (glukoosia 10 g /l, peptoni 2 g /l, hiivauute 1 g /l, NaCl

2 g /L, pH D 7,0). Kolvia inkuboitiin 28 ° C: ssa. Ravistelun jälkeen pyörivässä ravistimessa 3-5 päivää, rihmasto siirrettiin aseptisesti 500 ml: n Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi viljelmän neste (200 ml). Kolvia inkuboitiin sitten 28 ° C: ssa 25 päivää.

Viljelmät (150 L) suodatettiin juustoliinan läpi. Suodos konsentroitiin 5 L alle 50 ° C: ssa ja uutettiin kolme kertaa ravistamalla yhtä suurella tilavuudella etyyliasetaattia. Yhdistetyt orgaaniset uutteet tehtiin silikageelipylväässä ja eluoitiin gradientilla petrolieetteristä etyyliasetaatista, jolloin saatiin yhdiste.

Yhdiste liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jonka varastossa pitoisuuteen 50 mmol /l ja laimennettiin keskittymistä ennen käyttöä.

Soluviljely

HUVEC eristettiin ihmisen napalaskimon johdot normaalin synnytykset ja viljeltiin seuraava protokolla on kuvattu aiemmin [16] – [ ,,,0],17]. Chang maksa- solut ja kasvainsolulinjoja Hone-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 ja SGC7901, AGS ylläpidettiin laboratoriossamme ja viljeltiin RPMI1640-elatusalustassa täydennettynä 10% FBS: ää, 100 U /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä (Gibco) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Tämä tutkimus noudattaa esitettyjä periaatteita Helsingin julistuksen hyväksymä Medical Ethics komitean Sun Yat-Senin yliopistossa, ja kirjallinen suostumus saatiin luovuttajalta.

solunelinkykyisyysmääritys

solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

4 solua /ml 24-kuoppaisille levyille (HUVEC ympättiin gelatiinilla päällystetyille 24-kuoppaisille levyille). Kun solut saavutettiin tiheys 60% -70%, niitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla G503: ssa 48 tuntia RPMI1640-elatusaineessa (1 ml /kuoppa) ilman FBS: ää; negatiivinen kontrolli ryhmiä käsiteltiin PBS: llä. Sen jälkeen, 100 ui MTT: tä (5 mg /ml) liuotettuna PBS: ään, lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja niitä inkuboitiin vielä 4 tuntia, jotta muodostumista formazancrystals. Kiteet liuotettiin 1 ml: aan DMSO kuhunkin kuoppaan. Optinen tiheys (OD) arvoista violetti liuos, joka edustaa solujen elinkelpoisuus mitattiin 570 nm: [18] – [19]. Sen jälkeen kolmen erillisen kokeen, solujen eloonjääminen laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: selviytyminen (%) = (keskimääräinen kokeellinen OD-arvo /keskiarvo kontrolli OD-arvo) x 100%. Arvot ilmaistiin 50% inhiboiva konsentraatio (IC

50), joka laskettiin regressiomenetelmä lineaarisella alueella.

Hoechst 33342 fluoresenssi

SGC7901 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 10

5 solua kuoppaa kohti ja käsitellään G503 pitoisuuksina 0 umol /L 40 umol /l: ssa 24 tuntia. Solut leimattiin 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Olympus X71-A12FL /PH).

anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen määrityksessä

SGC7901 solut kerättiin tiheydellä 5 x 10

5-5 x 10

6 /ml sen jälkeen, kun G503 hoidon pitoisuuksina välillä 0 umol /L 40 umol /l 24 h 6-kuoppaisille levyille; solut, joita käsiteltiin 25 umol /L kolkisiinia käytettiin positiivisena kontrollina. Sitten solut pestiin ja värjättiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (anneksiini V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit). Lyhyesti, solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1 x sitomispuskurissa. Seuraava, 5 ui anneksiiniV-FITC ja 5 ui 20 ug /ml PI lisättiin näytteeseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan pimeässä. Värjätyt näytteet arvioitiin sitten virtaussytometrillä (Becton Dickinson, NJ, USA) tunnistaa apoptoottiset solut.

määritys mitokondrion kalvon potentiaalia

SGC7901 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Saavuttamisesta tiheys on 60%, soluja käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 18 tuntia ja kerätään sitten arvioida mitokondrion kalvon potentiaalin mukaan valmistajan suositusten (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). Lyhyesti, 1 x 10

6 /ml solut suspendoitiin uudelleen 37 ° C: ssa PBS: ää. Positiivisen kontrollin ryhmät esikäsitelty 1 ui 50 mmol /L CCCP 37 ° C: ssa 5 min. Kaikki ryhmät käsiteltiin sitten 5 ui 10 pmol /l DiOC

2 (3), 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja arvioitiin virtaussytometrialla. Mitokondrion kalvon potentiaali laskettiin seuraavalla yhtälöllä: mitokondrion kalvon potentiaali = (punaisen fluoresenssin intensiteetti) /(vihreän fluoresenssin intensiteetti).

Detection avaaminen mitokondrioiden Läpäisevyys Transition Pore (MPTP) B

SGC7901 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Saavuttamisesta tiheys on 60%, soluja käsiteltiin 20μmol /l G503: ssa 18 tuntia ja kerättiin arvioida MPTP-aukon virtaussytometrialla (Becton Dickinson, NJ, USA) valmistajan protokollan (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). Lyhyesti, kukin näyte jaettiin 3 erään ja käsiteltiin seuraavasti: näyte 1 käsiteltiin 5 ui 2 umol /l Calcein AM pimeässä; alikvootti 2 käsiteltiin 5 ui Calcein AM ja 5 ui 80 mmol /l CoCl

2 pimeässä; ja näyte 3 käsiteltiin 5 ui Calcein AM, 5 ui CoCl

2 ja 5 ui 100 umol /l ionomysiinillä. Eriä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan pimeässä. Oltuaan pestiin HBSS /Ca

2+ ja suspendoitiin uudelleen 400 ul HBSS /Ca

2+, solut arvioitiin virtaussytometrialla 1 tunnin kuluessa. MPTP aukko ehto lasketaan seuraavasti: (fluoresenssi näyte 2- fluoresenssi näyte 3) /(fluoresenssi näyte 1- fluoresenssi näyte 3). Calcein AM tunkeutuu sytoplasmassa ja soluelimiin myös mitokondrioissa. CoCl

2 sammuttaa Calcein AM fluoresenssia sytoplasmassa, mutta ei mitokondrioissa. Calcein AM translokoituu sytoplasmaan päässä mitokondrioissa, kun MPTP avataan, ja fluoresenssi vaimennetaan CoCl

2.

eristäminen solujen mitokondrioita ja sytoplasmassa

SGC7901 solut maljattiin 100 mm: n maljoille; kukin ryhmä maljataan kaksi levyä. Saavuttamisen jälkeen 60% -70% konfluenssiin, solut käsiteltiin tai ei 20 umol /l G503: ssa 18 tuntia. Käsittelyn jälkeen, mitokondrioiden ja sytoplasman fraktiot saatiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (mitokondrioita eristyspakkausta).

Western blotting -analyysi

Kuten aiemmin on kuvattu, solut lyysattiin RIPA-puskurilla [21] . Proteiinikonsentraatiot mitokondrioita, sytoplasmaan ja koko solun havaittiin BCA-menetelmällä käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit. Kaikkiaan 60 ug proteiineja jokaisesta ryhmästä erotettiin 12% tai 15% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Proteiinien SDS-PAGE siirrettiin PVDF-membraanille. Jälkeen epäspesifinen sitoutuminen sivustoja kalvoja blokattiin 1-2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa TBST, joka sisälsi 10% rasvatonta maitoa, kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Toissijainen vasta-aineita tai ilman fluoresenssi konjugoitu asiaa primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Kalvot loiste toissijainen vasta arvioitiin käyttäen Odyssey järjestelmä (Li-COR, Nebraska, USA) skannata fluoresoiva nauhat [22], että kalvot, joilla on normaali sekundaariset vasta-aineet visualisoitiin käyttäen ECL havaitseminen pakki immunobloteista. Kalvot riisuttu ja uudelleen koetettiin β-aktiini tai COXIV vasta-aineita. β-aktiini käytettiin sisäisenä standardina kokosolulysaattia ja sytoplasminen uuttoa, kun taas COXIV käytettiin kontrollina mitokondrioiden uuttoja. Densitomet- analyysi bändejä suoritettiin käyttäen Määrä One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Tilastollinen

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvoina ± SD ainakin kolmen määrityksen . SPSS 13.0 ohjelmistoa käytettiin Studentin t-testiä ja yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA) kaikissa tilastoanalyysit.

P

arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa tapauksissa.

Tulokset

G503 estoa proliferaatioon on voimakkain in SGC7901 soluissa joukossa 11 solulinjoista tutkitaan

Käytimme MTT-määritystä onko antrakinoni yhdiste G503 on sytotoksinen seuraavissa solulinjoissa: kaksi normaalia solulinjojen (ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) ja Chang maksasolut ja yhdeksän kasvainsolulinjoja (hone -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 ja SGC7901). Kaikki solut inkuboitiin 0, 2,5, 5, 10, 20 tai 40 umol /l G503: ssa 48 tuntia. Cell elinkykyisyyksiä mitattiin käyttäen MTT-määritystä, kuten edellä, ja IC

50-arvo SGC7901 soluissa oli matalin, kun taas IC

50-arvot normaali solulinjat, HUVEC ja Chang maksa- solut, olivat merkittävästi suurempia kuin SGC7901 ( Taulukko 1).

G503 indusoi apoptoosin SGC7901 ja AGS mahalaukun syöpäsolujen

Koska SGC7901 solulinja oli herkin G503 yhdestätoista solulinjoista tutkitaan (taulukko 1 ), me tutkitaan edelleen tässä solulinjassa erikseen. SGC7901 solut värjättiin Hoechst 33342 onko estävä vaikutus liittyi apoptoosin. Tulokset osoittavat kasvua solujen määrän näyttämiseksi ydin- kutistuminen ja kromatiinin kondensaatiota lisäämällä G503 pitoisuuksilla (kuvio 1A). Lisäksi, tutkia G503 indusoi apoptoosia muiden mahasyövän solulinjat, AGS mahasyövän solut tutkittiin myös. Anneksiini V /PI-värjäys käytettiin analysoimaan vaikutuksia G503 vuonna SGC7901 ja AGS mahalaukun syöpäsolujen virtaussytometrialla. Näitä kokeita varten, 25 umol /l kolkisiinia käytettiin positiivisena kontrollina. Käsittelyn jälkeen 0 umol /l, 2,5 umol /l, 5 umol /l, 10 umol /l, 20 umol /l ja 40 umol /l G503 ja 25 umol /l colchicines 24 tuntia, prosenttiosuus apoptoottisten SGC7901 soluja 5.625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% ja 20,69% ± 1,91%, vastaavasti (kuvio 1 B); prosenttiosuus apoptoottisten AGS solut olivat 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47.51% ± 18,29% ja 31,49% ± 2,45%, tässä järjestyksessä (kuvio 1C). Havaitseminen apoptoosin AGS soluihin ja edellä esitetyt tulokset osoittivat, että G503 indusoi mahasyövän apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla.

(A) SGC7901 soluja käsiteltiin eri G503 pitoisuuksilla (0-40 umol /L ) 24 tunnin ajan ja värjättiin Hoechst 33342. Red nuolet osoittavat apoptoottisia soluja. (B), (C) SGC7901 soluja (B) ja AGS-solut (C) analysoitiin virtaussytometrialla käsittelyn jälkeen eri G503 concentrations- 24 tuntia. Sillä kvantitatiivinen analyysi G503 aiheuttaman SGC7901 ja AGS solujen apoptoosin, kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Ja ** edustavat

P

0,05 ja

P

0,01, vastaavasti.

G503 indusoi apoptoosin kaspaasiriippuvaisen tavalla

Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi, joka osallistuu G503: n indusoiman apoptoosin mahasyövän soluissa, olemme tutkineet SGC7901 soluja. Kaspaasi 3 on efektori kaspaasi jotka voivat tulla tumaan ja suoraan vuorovaikutuksessa sen alustaan, mikä edistää solujen apoptoosin [24]. Caspse-9 on aloittaja kaspaasi joka aktivoi caspse-3 [25]. Soluja käsiteltiin eri G503 pitoisuudet ilmoitetaan kertaa ja kerätyt arvioida kaspaasi-3 ja -9 Western-blottauksella. Ilmaisu kaspaasin 3 esiaste väheni annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, kun taas kaspaasi-3 pilkkominen fragmenttien kasvoi annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 2A, B). Ekspression kaspaasi-9 esiasteen myös vähentynyt ja pilkkominen fragmenttien lisääntynyt sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 24 h (kuvio 2C). Nämä vaikutukset poistetaan viimeistään yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK (kuvio 2C, D). Yhdenmukainen kaspaasi-9 ja -3, apoptoottinen solu hinnat indusoi indusoi 20 umol /l G503 sisään SGC7901 solut olivat merkittävästi pienentyneet esikäsittelyn jälkeen Z-VAD-FMK (kuvio 2E). Nämä tiedot osoittivat, että G503 indusoi apoptoosia SGC7901 solujen kaspaasi-riippuvaisella tavalla.

(A), (B) Soluja käsiteltiin eri G503 pitoisuudet 24 h (A), ja käsiteltiin 20 umol /l G503 eri aikaan (B). Kaikki celluar proteiinit uutettiin ja kaspaasi-3-proteiinin tasot analysoitiin Western-blottauksella. (C) – (E) Soluja esi-inkuboitiin Z-VAD-FMK 30 minuuttia, ennen kuin käsiteltiin 20μmol /l G503: ssa 24 tuntia. Kaikki celluar proteiinit uutettiin ja kaspaasi-9 (C), 3 (D) proteiini tasot analysoitiin Western-blottauksella. Solujen apoptoottista hinnat määritettiin virtaussytometrialla (E). Kaikki arvot näkyvät keskiarvona ± SD vähintään kolmen erillisen kokeen (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli).

G503-indusoitua apoptoosia ei ole riippuvainen kaspaasin 8

Sen tutkimiseksi, onko syöttämällä reseptorivälitteisen apoptoottisen reitin indusoi G503, olemme tutkineet kaspaasi-8, aloitteentekijä kaspaasi kuoleman reseptori välittämä apoptoottista polku [26]. SGC7901-soluja käsiteltiin eri annoksilla G503 varten osoitti kertaa. Solut kerättiin mitata kaspaasi-8 Western-blottauksella. Tulokset osoittivat, että kaspaasi-8 esiasteen väheni ja pilkottiin kaspaasi-8 kasvoi aika- ja annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A, B). Solut esikäsitellään 20 umol /L kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-FMK 30 minuutin ajan ja käsiteltiin sitten 20μmol /l G503: ssa 24 tuntia. Kaspaasin 8 proform lisääntyi soluissa yhteistyössä käsitelty kaspaasin 8 estäjä ja G503 verrattuna käsiteltyjen solujen G503 vain. Kuitenkin, kaspaasi-9 proform, pilkottiin kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 pidettiin samalla tasolla käsitellyissä soluissa kaspaasi-8-estäjä ja G503 tai G503 yksinään (kuvio 3C). Yhdenmukainen Kuva 3C, G503 aiheuttaman apoptoottisen solu- hintojamme SGC7901 soluja ei vähentynyt esikäsittelemällä Z-IETD-FMK (kuvio 3D). Nämä tiedot osoittivat, että huolimatta aktivaatiota G503, kaspaasi-8 ei ole mukana pro-apoptoottisen aktiivisuuden G503.

(A), (B) Soluja käsiteltiin 20μmol /l G503 eri aikoja (A ) ja käsiteltiin eri G503 pitoisuuksilla (0-40 umol /l) ja 24 h (B). Solun koko proteiinit uutettiin havaita kaspaasi-8 Western-blottauksella. (C), (D) soluja esi-inkuboitiin 20 umol /L Z-IETD-FMK 30 minuutin ajan ja sen jälkeen käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 24 tuntia. Solun proteiinit uutettiin havaita kaspaasi -8, -9 ja -3 Western blottauksella (C). Solujen apoptoottista hinnat määritettiin virtaussytometrialla (D). Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli).

G503: n indusoiman apoptoosin on riippuvainen kaspaasi-9

caspase-9, aloitteentekijä kaspaasi mitokondriaalisen apoptoottisen reitin, voidaan aktivoida yhdistämällä sytokromi

c

(Cyto

c

) ja apoptoottisten proteaasi-aktivoiva tekijä-1 (Rahastolla-1) [25] – [26]. Edelleen tutkia, onko mitokondrion reitti on mukana G503: n indusoiman apoptoosin, aktivointi kaspaasi-9 tutkittiin sen jälkeen, kun G503 hoidon eri pitoisuuksina ja ajat. Lisäksi apoptoottisten solujen nopeus mitattiin myös samanakaiseen hoidon G503 ja kaspaasi-9-estäjä Z-LEHD-FMK. Tulokset osoittivat, että kaspaasi-9 proform vähentynyt ja pilkkominen fragmenttien suureni ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A, B). Seuraavaksi soluja esikäsitellään 20 umol /L Z-LEHD-FMK 30 minuuttia, ja co-inkuboitiin 20 umol /l G503: ssa 24 tuntia. Määrällisesti apoptoottisten solujen, solut värjättiin anneksiiniV /PI ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat, että apoptoottinen solu laski, kun solut samanaikaisesti käsiteltiin Z-LEHD-FMK ja G503 (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että G503-indusoidun SGC7901 apoptoosin on riippuvainen kaspaasi-9 aktivaation.

(A), (B) Soluja käsiteltiin 20μmol /l G503 eri aikoja (A) ja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla G503 24 h (B). Soluproteiinit ectracted ja kaspaasi-9-proteiinin tasot analysoitiin Western-blottauksella. (C) Soluja esi-inkuboitiin Z-LEHD-FMK 30 min, jota seurasi 20 umol /l G503: ssa 24 tuntia. Solun apoptoottinen määrä havaittiin virtaussytometrialla. Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * Ja ** tarkoittavat

P

0,05 ja

P

0,01, vastaavasti.

G503 indusoi apoptoosin kautta mitokondrioiden apoptoottisen reitin

on hyvin tunnettua, että mitokondrion reitti on tärkeä apoptoottisen reitin. Sen tutkimiseksi, G503 indusoi apoptoosia kautta mitokondrioiden reitin, tutkimme apoptoosiin liittyviä proteiineja, mitokondrion kalvon potentiaali (MMP), ja avaaminen MPTP vahvistaa induktion mitokondrioiden apoptoottisen reitin. Seuraa by G503 hoito, mitokondrio fluoresenssi pieneni verrattuna verrokkiryhmään (kuvio 5A), mikä viittaa siihen, että MPTP avasi G503. Lisäksi, kuten kuviossa 5B on esitetty, huomattavasti punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetti havaittiin verrokkiryhmässä. Kuitenkin käsittelyn jälkeen 20 umol /l G503, punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetti väheni. Tämä tulos viittasi siihen, että G503 vähentää mitokondrion kalvon potentiaalia SGC7901 soluja. Lisäksi yhteensä Cyto

c

proteiinin tasot eivät erityisesti vaihtaa ohjaus- ja huumeiden ryhmä; kuitenkin, Cyto

c

oli relocalized sytoplasmaan alkaen mitokondrioita (kuva 5C). Bax ja Bcl-2 ovat ratkaisevia tekijöitä säätelyssä mitokondrioiden kanavat ja vapauttamaan eri apoptoosin-sukuiset proteiinit [27]. Siksi Tutkimme jakautumista Bax ja Bcl-2 eri solun osiin ja ei havainnut näkyvä muutos proteiinin kokonaismäärän tasoja Bax ja Bcl-2 välinen ohjaus ja huumeiden ryhmä; kuitenkin, G503 edistää translokaatiota Bax sytoplasmasta mitokondriot sekä translokaatio Bcl-2: mitokondriot sytoplasmaan (kuvio 5D). Yhdessä G503 indusoi apoptoosia SGC7901 soluihin mitokondrioiden reitin.

(A) Soluja käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 18 tuntia, ja MPTP aukko havaittiin käyttäen mitokondrion kalvon läpäisevyyden fluoresenssiväri Calcein AM ja virtaussytometria. (B) Soluja käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 18 tuntia, ja kalvojännite havaittiin käyttäen virtaussytometriaa. ”CCCP” on positiivinen kontrolli reagenssin määrityksessä kit. (C), (D) Soluja käsiteltiin G503: ssa 18 tuntia. Kokonaisproteiinia uutteet kerättiin Western blotting arvioida tasot Cyto

c

(C) ja Bax /Bcl-2 (D) kokonaisproteiinista, mitokondrioiden ja sytoplasman jakeet. Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli).

G503 indusoi apoptoosia SGC7901 soluissa osittain läpi kaspaasi-4 aktivointi

kaspaasi-4 voi suoraan aktivoida kaspaasi-9, mutta ei läpi mitokondrioiden reitin [28] – [29]. Sen tutkimiseksi, kaspaasi-4 aktivoidaan G503 ja onko aktivoitu kaspaasi-4 aktivoi kaspaasi-9, tutkimme pilkkominen fragmenttien kaspaasi-4 ja -9. Tulokset osoittivat, että kaspaasi-4 pilkkomisfragmentin kasvoi merkittävästi soluissa, joita käsiteltiin G503 verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 6A). Hoito kaspaasi-4-estäjä Z-LEVD-FMK lisäsi kaspaasi-9 proform, jota ei ole havaittu G503 hoitoryhmässä (kuvio 6B). Nämä tulokset osoittivat, että G503 indusoi SGC7901 mahasyövän apoptoosia osittain läpi kaspaasi-4.

(A) Soluja käsiteltiin 20 umol /l G503: ssa 24 tuntia, ja kokonaisproteiinin uutteet kerättiin Western blotting. (B) SGC7901 soluja esi-inkuboitiin 20 umol /L Z-LEVD-FMK 30 min, jota seurasi 20 umol /l G503: ssa 24 tuntia. Solu-proteiinia uutteet käytettiin tunnistamaan kaspaasi-9 tasoa Western-blottauksella.

Keskustelu

On todettu, että

p

-quinone osaan Kinonianalyysien sisältävien molekyyli- näyttelee erittäin tärkeä rooli syövän vastaista potentiaalia [30]. Perchellet et ai. totesi myös, että p-kinoni J4, o-kinoni J1 ja substituoimattomat malli p-kinoni J7 vähensi eniten L1210 kasvainsolun elinkelpoisuuden joukossa kahdeksan yhdisteet syntetisoitiin ja seulottiin niiden alustavassa tutkimuksessa [31]. Jotta ymmärtää suhde syövän potentiaalia altersolanol A ja rakenne-aktiivisuus, Teiten et ai. arvioitiin vaikutusta altersolanol A ja siihen liittyvät antraseeni johdannaiset: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B ja ampelanol. He havaitsivat, että vain altersolanol A ja sen asetyloitua johdannaista tetraacetylaltersolanol Läsnä olevan sytotoksinen vaikutus K562-solut, kun taas johdannaisia ​​vähentäminen yhden karbonyyli- ryhmien, kuten tetrahydroaltersolanol B ja ampelanol, ei ole vaikutusta [32].

p

-quinone rakenne G503 (kuva S1) voidaan myös osaltaan syöpäsolun apoptoosin, ja seuraavassa Tutkimuksessamme analysoi G503 ja sen johdannaisten tunnistamiseksi ennakkojärjestäminen-aktiivisuuden suhteen. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että mahalaukun syövän solulinja SGC7901 on kaikkein G503-herkkien syöpäsolujen solulinja tutkittiin käyttäen solunelinkykyisyysmääritys yhdeksän syöpäsolulinjoissa ja kaksi normaalia solulinjat. G503 indusoi SGC7901 mahasyövän solukuolemaa apoptoosin välityksellä annoksesta riippuvalla tavalla. Toinen mahalaukun syöpäsolut AGS tutkitaan myös, ja on herkkä G503 aiheuttama apoptoosin samoin. Tämän seurauksena, 20 umol /l G503 on optimaalinen konsentraatio, joka indusoi vakavaa apoptoosia.

Ihmisen genomi koodaa vähintään 10 eri kaspaasi-homologien. Seuraavat kaspaasi homologit osallistua apoptoosin: Caspase-2, -3, -8, -9 ja -10 [33]. Vaikka caspases osansa apoptoosin, on olemassa erilaisia ​​kaspaasi riippumattomia reittejä olemassa. Esimerkiksi, kun läsnä on kaspaasi-inhibiittorit, tuumorinekroositekijä (TNF) indusoi solujen nekroosi, jolla on ominaisuudet apoptoosin ja kuolion [34] – [36]. Lisäksi apoptoosin indusoiva tekijä (AIF) on DNA-entsyymi, joka suoraan hajottaa DNA. Kun mitokondrion kalvon potentiaali on muutettu, AIF vapautuu sytoplasmaan päässä mitokondrioita ja aktivoidaan sen vuorovaikutus cyclophilinA [37] – [38]. Endo G voi myös hajota DNA: ta suoraan kaspaasi-riippumattomalla tavalla [39].

Tutkimuksessamme G503 altistuminen aktivoi kaspaasi-3, -8 ja -9 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuva 2A, B, 3A, B, 4A, B). Onko G503 aiheuttama apoptoosin riippuvainen kaspaaseja? Kun soluja samanaikaisesti käsiteltiin Z-VAD-FMK ja G503, Z-VAD-FMK estää kaspaasi-9 ja -3 aktivaation (kuvio 2C, D), ja apoptoottisten solujen määrässä indusoitu G503 vähentynyt (kuvio 2E), mikä osoittaa, että G503-indusoidun SGC7901 apoptoosin on kaspaasiriippuvaisen. Erottaa onko G503: n indusoiman apoptoosin riippuu kaspaasin 8, -9 tai molemmat, SGC7901 solut esikäsiteltiin Z-IETD-FMK ja Z-LEHD-FMK ja sitten yhteistyössä käsiteltiin G503. Tulokset osoittavat, että Z-IETD-FMK eivät estä kaspaasi-9 ja -3 aktivaation (kuvio 3C) tai vähentää apoptoottisten solujen määrässä indusoitu G503 (kuvio 3D); kuitenkin, Z-LEHD-FMK vähensi apoptoottisten solujen (kuvio 4C). Näin ollen, G503-indusoidun SGC7901 apoptoosin ei ole riippuvainen kaspaasi-8, mutta on kaspaasi-9.

mitokondriot koostuvat ulomman kalvon, kalvon tilaa ja matriisi. Apoptosis liittyviä proteiineja, kuten kaspaasi proentsyymejä, Cyto

c

ja AIF olemassa kalvo tilaan.