Krooninen sairaus

tiivistelmä

RNA-polymeraasi II transkriptoi fyysisen päiden lineaarista eukaryoottisten kromosomien osaksi erilaisia ​​pitkän ei-koodaavan RNA-molekyylejä, mukaan lukien telomeerisesti toista sisältävät RNA (Terra). Koska TERRA löytö, on edistytty vuonna luonnehdinta Terra biogeneesiä ja sääntely; päinvastoin sen toimintoihin jäävät hämäräksi. Suurin osa biologisia rooleja tähän mennessä ehdotettu Terra todellakin perustuvat

in vitro

kokeet suoritettiin käyttäen lyhyitä TERRA kaltainen RNA oligonukleotidit. Erityisesti on ehdotettu, että Terra estää telomeraasiaktiivisuuden. Olemme hyödynnetään kahta vaihtoehtoista solukkojärjestelmissä testata onko Terra ja /tai telomeerivasta transkriptio vaikutus telomeraasia välittämää telomere pidentyminen ihmisen syöpäsoluja. Soluissa, joilta puuttuu kaksi DNA-metyylitransferaaseja DNMT1 ja DNMT3b, Terra transkriptio ja vakaan tilan pitoisuudet ovat huomattavasti lisääntynyt, kun telomeraasin pystyy pitkänomainen telomeres normaalisti. Vastaavasti telomeraasi voi tehokkaasti pitkänomaisen siirtogeenisiä indusoituvan telomeres joiden transkriptio on kokeellisesti täydennetty. Tuloksemme haastaa nykyisen hypoteesia, että Terra toimii yleisenä estäjä telomeraasi ja viittaavat siihen, että telomeeripituuden homeostaasin säilyy riippumatta Terra ja telomeerivasta transkriptio.

Citation: Farnung BO, Brun CM, Arora R, Lorenzi LE, Azzalin CM (2012) Telomerase tehokkaasti elongates Erittäin puhtaaksi Telomeres Human Cancer Cells. PLoS ONE 7 (4): e35714. doi: 10,1371 /journal.pone.0035714

Toimittaja: Arthur J. Lustig, Tulanen yliopiston Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 helmikuu 2012; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Farnung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Euroopan tutkimusneuvoston (BFTERRA), Swiss National Science Foundation (3100A0-120090 ja PP00P3-123356) ja Fondazione Cariplo (2008-2507). CMB sai apurahan Boehringer Ingelheim Fonds. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fyysinen päät lineaarisen eukaryoottisten kromosomien transkriboidaan erilaisia ​​ei-koodaavan RNA: ta (ncRNA) lajit, jotka muodostavat ”telomeerisesti transcriptome”. Näistä lajeista, pitkä ncRNA Terra (telomeerisesti repeat-RNA: ta sisältävät) havaittiin ensimmäisen nisäkässoluissa ja peräkkäin kuvattu kuin nisäkkäiden eukaryooteissa, mukaan lukien seeprakala,

Arabidopsis thaliana

, orastava hiiva

Saccharomyces cerevisiae

ja fissio hiiva

Schizosaccharomycespomben

[1] – [7]. Terra-molekyylit transkriboidaan alueet välittömästi edeltävän telomeerit -THE subtelomeres- loppua kohti kromosomien ensisijaisesti DNA-riippuvainen RNA-polymeraasi II (RNAPII), joka käyttää telomeerisesti C-rikas juostetta templaattina. Siksi yksittäiset Terra molekyylit käsittävät subtelomeric suolikanavan ja G-rikas telomeerisesti toisintoa (5′-UUAGGG-3 ’nisäkkäillä). Terra pysyy liittyy telomeres transkription jälkeen viittaa siihen, että Terra on perustava osa telomeerinen heterochromatin [1], [3], [4], [6]. Muita RNA-lajit transkriptoitu kromosomista päistä käsittää ARIA, C-rikas telomeerisesti RNA toistaiseksi tunnistettu vain fissio hiiva- ja kasveja, ja kaksi täydentävää subtelomeric selostukset vailla havaittavaa telomeerinen toistojen nimeltään ARRET, tunnistettu orastava ja fissio hiivat, ja αARRET, jonka tunnuksena ainoastaan ​​fission hiiva [1], [4], [5], [7].

Subtelomeric promoottorit ajavat transkriptiota Terra on tunnistettu ihmisen soluissa ja käsittävät CpG-rikas saaret koostuvat osuuksilla 29 ja 37 emäsparin peräkkäistoistot (29-37 toistoja). 29-37 toistoa edeltää peräkkäin toistuva 61 emäsparin yksiköitä, jotka ovat tarpeeton promoottorin aktiivisuutta ja toistaiseksi karakterisoimattomat toiminto [8], [9]. CpG dinukleotidissä Terra promoottorit ovat voimakkaasti metyloitavaa eri syövän ja ensiöparit [9]. Ihmisen kolorektaalisen HCT116-solut tyrmäsi kahden DNA metyylitransferaasi entsyymit DNMT1 ja DNMT3b (DKO solut), Terra promoottori metylaatio poistetaan kokonaan ja RNAPII sitoutuminen Terra promoottoreita ja TERRA vakaan tilan pitoisuudet ovat huomattavasti laajennettu [9]. Siten yhdenmukaistetut aktiivisuus DNMT1 ja 3b rajoitetaan Terra promoottorin transkription aktiivisuutta ainakin HCT116-soluissa. Samoin vähentynyt subtelomeric CpG metylaatio liittyy lisääntynyt TERRA solujen tasot soluissa, jotka ovat peräisin ihmisen kärsivien immuunipuutos, sentromeerista alueen epävakautta, kasvojen poikkeavuudet (ICF), väistyvä oireyhtymä peräisin ituradan mutaatioita DNMT3b geeni [10]. Outoa, Terra runsaus vähenee hiiren soluissa puutteellinen varten DNMT1 ja DNMT3a /b, vaikka maailmanlaajuinen metylaatio subtelomeres vaarantuu, mikä viittaa lajispesifiset Terra sääntelyn välittämän DNMTs [6], [11]. Todellakin, Terra promoottorit ovat vielä tunnettu hiiren soluissa ja se on edelleen mahdollista, että hiiren Terra promoottorit eivät säännellä CpG metylaatio.

Vaikka Terra biogeneesiä ja sääntelyä on tutkittu laajasti, puute toistettavissa kokeellisten työkaluja muuttaa Terra cellular tasolla tilit harvan tietoa TERRA liittyviä toimintoja. Useimmat oletetun roolit toistaiseksi katsoneet Terra oli johdettavissa

in vitro

kokeissa, joissa lyhyt TERRA kaltainen RNA oligonukleotidit palveluksessa. Tällaiset

in vitro

kokeet ovat ehdottaneet, että Terra voisi säädellä telomeeripituuden homeostaasiin, telomeerien replikointi ja telomeerisesti DNA tiivistyminen [6], [12] – [14]. Erityisesti TERRA kaltainen oligonukleotidit inhiboivat voimakkaasti telomeraasiaktiivisuus telomeerisesti toista vahvistusta protokolla (TRAP) ja telomeraasin suora määritykset [6], [14]. Siksi Yleisesti oletetaan, että Terra toimii yleisenä estäjä telomeraasi välittämän telomere venymä ja muutama epäsuora

in vivo

todisteita ilmeisesti tue tätä oletusta. Orastava hiiva telomere keinotekoisesti pakko puhtaaksi koki lyhentämistä, kun taas pituus jäljellä telomeres ei vaikuttanut [15]. Hiiva mutantteja, joilla on heikentynyt Rat1p RNA eksonukleaasiaktiivisuudella kantamaan suurempia määriä Terra molekyylien ja lyhyemmät telomeerit verrattuna villin tyypin kollegansa [16]. Lopuksi telomeres lyhyitä soluissa perustetaan ICF potilaista kuin soluja terveiltä luovuttajilta [10]. Siitä huolimatta se ei ole suoraan testattu onko telomere lyhentäminen havaittiin näissä eri solukkojärjestelmissä todella peräisin telomeraasia esto. Siten todellinen biologista merkitystä kykyä TERRA kaltaisia ​​oligonukleotidien estävän telomeraasiaktiivisuutta

in vitro

vielä arvioitava.

Sen määrittämiseksi, onko Terra ja telomeerivasta transkriptio vaikuttaa telomeraasiaktiivisuutta

in vivo

olemme hyödynnetään kahta vaihtoehtoista ihmisen solu- järjestelmissä, joissa Terra transkriptio on täydennetty. Osoitamme, että DKO solut infektoitu retrovirusten ilmaisemiseen katalyyttinen alayksikkö telomeraasi pitkänomaisen niiden telomeres niin tehokkaasti kuin vanhempien solujen ehjä DNMT toimintaan. Johdonmukaisesti, telomeraasin biokemialliset aktiivisuuden ei näytä vaikuttavan samassa soluissa. Olemme myös esittää kehitystä solukkojärjestelmän, jossa transkription ainutlaatuinen ”transkriptionaalisesti indusoituva telomeerit (tiTELs) voidaan säätää vapaasti. Transkriptio induktio tiTELs ei vaikuta niiden homeostatic pituus, eikä se estä telomeraasia välittämää uudelleen venymä upon lyheneminen aiheuttama telomeraasiestäjät. Kaikkiaan tuloksemme haastaa yleisesti käytetty käsite, joka Terra on soluestäjä telomeraasi ja kerjätä tutkia vaihtoehtoisia toimintoja aiheuttaman Terra ja telomeerivasta transkriptio. Lisäksi tuloksemme merkitse, että telomere lyhentäminen havaitaan järjestelmissä, joissa Terra oli poikkeavasti koholla [10], [15], [16] todennäköisesti peräisin vaarannu telomere eheyden sijaan telomerase eston.

Tulokset ja keskustelu

TERRA vakaan tilan tasoja ylläpidetään riippumatta telomeeripituuden ihmisen syöpäsoluissa

ehdotettu rooli Terra estossa telomeraasiaktiivisuutta ehdotti mallia, jossa pitkä telomeres kerääntyä tai tuottavat enemmän Terra estäen telomeraasin entisestään laajentaa ne [6], [14], [17]. Vastaavaa näyttöä käytetään muuta kuin isogeenisiin nisäkässoluille linjoja eri alkuperää näyttää tukevan tätä olettamusta [6]. Päinvastoin, viime aikoina työ orastava hiiva on osoittanut, että kokeellisesti aiheutettua yli-venymä tai lyhentäminen telomeres ei muuta Terra tasoja ja RNAPII käyttöaste kromosomissa päissä [18]. Siksi perustettu testata onko korrelaatio välillä Terra tasojen ja telomeeripituuden in isogeenisiin ihmisen solujen telomeres eripituisia.

vakaasti tartunnan kohdunkaulasyövän HeLa solujen retrovirusten ilmentävät katalyyttinen alayksikkö ihmisen telomeraasin (hTERT ). Kontrollina, me tartunnan samojen solujen tyhjällä vektorilla (EV) retroviruksia tai retrovirusten ilmentävät hTERT C-terminaalisesti fuusioitu Influenssahemagglutiniinitrimeerien epitooppimerkin (hTERT-HA). hTERT-HA näyttää normaali katalyyttinen aktiivisuus

in vitro

mutta ei venyttää telomeres

in vivo

, mikä johtuu todennäköisesti heikentynyt rekrytointi telomeres [19]. Pysyvästi tartunnan väestön keskuudessa ja pidettiin viljelmässä useita populaation kaksinkertaistumista (PD). Telomere restriktiofragmentti (TRF) analyysi genomisen DNA osoitti, että silloin, kun kokeet suoritettiin hTERT-infektio oli johtanut huomattavaan venymään bulk telomeres: TRFs oli välillä 2 ja 5 kb ev-infektoiduissa soluissa ja välillä 5 ja kuin 15 kb hTERT-infektoiduissa soluissa (kuvio 1A). Kuten odotettua, hTERT-HA ilmaisua ei muuttanut telomeeripituuden, vaikka se ilmentyi vastaavia määriä kuin hTERT (kuva 1A ja E). Sitten pilkottu genominen DNA

Msp

I tai sen CpG metylaatioherkän isoskitsomeeri

Hpa

II ja hybridisoitiin sen radioaktiivisella koettimia, jotka vastaavat 29-37 toistoja tavataan TERRA promoottorit. Yhdenmukainen mitä olemme aikaisemmin raportoitu [9], huomasimme, että 29-37 toistoja ovat suurelta osin metyloituja HeLa-soluissa. Restriktiomallista havaitaan 29-37 toista koettimien ei muuttunut hTERT-ekspressoivia soluja verrattuna ev ja hTERT-HA-ohjaus solujen, mikä osoittaa, että telomeerien venymä ei vaikuta metylaatiotilaa Terra promoottorit (kuvio 1 B). Northern blot-analyysi kokonais-RNA käyttäen telomeerisesti koettimia ei paljasta mitään merkittäviä muutoksia yhteensä Terra solun tasolla hTERT-infektoiduissa soluissa verrattuna ev- tai hTERT-HA-tartunnan ehkäiseminen (kuvio 1 C). Koon muutos Terra molekyylien kohti korkeampia molekyylipainoja näkyi solujen pitkänomainen telomeres, mikä viittaa siihen, että ainakin näissä solulinjoissa telomeeripituuden saattavat vaikuttaa pituuteen Terra molekyylejä (kuvio 1 C). Yhdenmukainen Northern blot analyysi, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) mittaukset Terra molekyylien puhtaaksi kromosomista aseita 10q, 15q ja XpYp eivät paljastaneet tilastollista merkitsevää muutosta TERRA vakaan tason upon telomere pidentymisen (kuvio 1 D). Olemme myös suorittaa vastaavia kokeita ensisijainen ihmisen keuhkojen fibroblasteja (HLF) ja, kuten HeLa-solut, telomere venymä ei muuttanut merkitsevästi metylaatiotilaa Terra promoottorien ja solujen Terra tasolla (kuva S1).

(A) TRF analyysi HeLa-solujen tartunnan tyhjän vektorin (ev), hTERT tai hTERT-HA retrovirusten. DNA pilkottiin

Rsa

I ja

Hinf

I restriktioentsyymeillä ja hybridisoitiin telomeerisesti koettimilla. (B) Sama DNA A pilkottiin

Hpa

II (metylaatioherkän) tai

Msp

I (metylaatio tunteeton) restriktioendonukleaaseilla ja hybridisoitiin koettimella havaitsemiseksi 29-37 emäsparin toistoa TERRA promoottorien. (C) Nuclear RNA hybridisoitiin käyttäen telomeerisesti koettimina yhteensä Terra ja peräkkäin 18S rRNA koettimet ohjata kuormausta. Alhaalla olevat numerot ovat suhdelukua Terra ja 18S-signaalin ilmaistiin kertainen kasvu yli ev-tartunnan näytteitä. Molekyylipainot ovat vasemmalla kiloemäksinä. (D) qRT-PCR-analyysi vakaan tilan tasot Terra transkriptien peräisin 10q, 15q ja Xp /Yp kromosomin päät. Baarit ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ilmaistuna kertainen kasvu yli ev-tartunnan näytteitä. Virhe palkit ja numerot ovat keskihajonnat ja P-arvot, vastaavasti. (E) Western blot -analyysi infektoitujen solujen käyttäen anti-hTERT (havaitsemaan kaikkia hTERT-molekyylit), anti-HA (havaitsemiseksi hTERT-HA) ja anti-PCNA (kuormituksen valvonta) vasta-aineita.

vuonna täydentävä lähestymistapa, me viljeltiin HeLa-solujen läsnä ollessa telomeraasiestäjä BIBR1532 [20] on noin 19 viikkoa. BIBR1532 käsittely johti huomattavaan lyhenemiseen bulk telomeres: telomeeripituuden oli enimmäkseen välillä 2 ja 5 kb käsittelemättömissä kontrollisoluissa ja välillä 1 ja 3 kb: n BIBR1532-käsitellyissä soluissa (kuvio 2A). Käsitellyt solut jaetaan samalla käsittelemättömiin soluihin viittaa siihen, että telomeerit olivat tarpeeksi pitkä ylläpitämään normaalin solujen kasvun (dataa ei näytetty). Telomere lyhentäminen ei aiheuttanut mitään merkittävää muutosta metylaatiotilaa 29-37 toistoja eikä kokonaan tai kromosomispesifisten TERRA vakaan tason (kuva 2B-D). Kaiken kaikkiaan nämä kokeet osoittavat, että, kuten viime aikoina osoittanut orastava hiiva [18], telomeeripituuden muutokset eivät vaikuta Terra promoottori metylaatio tai Terra solujen tasot ihmisen soluissa. Olemme päätellä, että Terra transkriptio ei ole säännelty telomeeripituuden, ainakin solutyypissä, olemme analysoineet.

(A-D) HeLa-soluja käsiteltiin telomeraasiestäjä BIBR1532 (+ BIBR) ja 19 viikkoa tai jätetään käsittelemättä (-BIBR). Telomeeripituuden, Terra promoottori metylaatio ja kokonaista tai kromosomispesifisten TERRA vakaan tilan tasot analysoitiin kuin kuviossa 1. Kokonais-RNA käytettiin kaikissa kokeissa. Northern blot-analyysi yhteensä Terra (C), beeta-aktiini (ACT) käytettiin normalisointi ohjaus. Molekyylipainot ovat vasemmalla kiloemäksinä.

DNA metyylitransferaasi-vajaiden solujen normaali telomeraasiaktiivisuutta

Kohonneet Terra tasojen läsnä DKO solut tekevät niistä sopivan solukkojärjestelmän testata vaikutukset kohdistamaa Terra on telomeraasiaktiivisuutta. Olemme vakaasti tartunnan DKO ja HCT116 vanhempien (par) solujen hTERT tai ev retrovirukset ja valittujen pysyviä populaatioita. Mahdollisesti johtuen eri transkription tilan kahden solulinjan, olemme toistuvasti todettu, että yli-ilmentynyt hTERT-proteiinin pitoisuudet olivat yli kaksi kertaa suurempi par kuin DKO soluissa (kuvio 3A). Kuten alla qRT-PCR ja Northern blot, vakaan tilan tasot Terra molekyylien transkriptoidun 61-29-37 toista sisältävästä 10Q ja 15q kromosomin päät dramaattisesti lisääntynyt DKO soluissa (kuviot 3B ja S2A) ja johdonmukaisesti tulokset edellä kuvattiin HeLa ja HLF soluja, hTERT vakaa ilmaisu ei muuttanut Terra määriä joko solulinjassa (kuvio 3B). Me valmistaa proteiinia tiivisteet ja analysoitiin telomeraasiaktiivisuuteen käyttämällä kvantitatiivista TRAP määrityksiä. Ei ole merkittävää eroa telomeraasiaktiivisuus mitattiin ev-tartunnan par ja DKO soluja, kun taas hTERT infektio johti huomattavaan kasvuun telomeraasiaktiivisuutta molemmissa solulinjoissa (kuvio 3C ja D). TRAP-aktiivisuus oli hieman suurempi hTERT-tartunnan par soluissa kuin hTERT-tartunnan DKO soluja, ja meidän syyksi ero pienempiä määriä yhteensä hTERT-proteiinin ilmaistuna DNMT-solulinjaan (kuvio 3A, C ja D). RNA eristettiin TRAP otteita sisälsivät 10q ja 15q Terra molekyylit, vaikka suuri osa heistä (noin 90 ja 80% par ja DKO solut, vastaavasti) jäi solupelletteihin vasemmalle louhinnan jälkeen (kuvio 3E), todennäköisesti koska suurin osa Terra on kromatiinin liittyy [1], [3], [6]. Silti, kun otetaan huomioon, että 10q ja 15q Terra molekyylit ovat -300 kertaa runsaampaa DKO kuin par soluissa (kuvio 3B), arvioimme, että DKO TRAP otteet sisälsi ~600 kertaa enemmän Terra molekyylejä kuin par otteita. Lopuksi me raportoimme että TRAP aktiivisuus on samanlainen solujen hyvinkin erilainen TERRA tasoilla. Tämä on jyrkässä ristiriidassa saatujen tulosten

in vitro

lyhyillä TERRA kaltaisia ​​oligonukleotidien [6], [14]. Uskomme, että lyhyet RNA oligonukleotidit

in vitro

eivät käyttäydy niin luonnollista, pitkä Terra molekyylejä, mahdollisesti johtuen niiden käyttö korkeisiin ei-fysiologiset pitoisuudet.

(A) Western blot analyysi hTERT-ilmentymisen HCT116 vanhempien (par) tai DNMT1 ja 3b kaksinkertainen KO (DKO) infektoiduissa soluissa. Alhaalla olevat numerot ovat suhdelukua hTERT ja PCNA (lastaus valvonta) signaaleja ilmaistuna kertainen lisäys yli hTERT-tartunnan vanhempien soluissa. (B) qRT-PCR-analyysi vakaan tilan tasot Terra transkriptien peräisin 10q ja 15q kromosomin päät ilmaistuna kertainen kasvu yli ev-tartunnan par soluissa. Baarit ja virhepalkkeja ovat keskiarvot ja keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) analyysi TRAP vahvistus tuotteiden osoitettu soluista linjat. Kolme eri määriä koko proteiineja käytetään kunkin solulinjan ja kontrolloida spesifisyyden yksi näyte on esikäsitelty RNaasi A. valvonta-alukkeita monistamaan sisäinen kontrolli (IC) on mukana kaikissa reaktioissa. (D) kvantifiointi telomeraasiaktiivisuuden merkitty näytteitä qRT-PCR-pohjainen TRAP määrityksissä. Baarit ja virhepalkkeja ovat keskiarvot ja keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta, kun normalisoituminen kautta ev-tartunnan saaneiden vanhempien solun näytteitä. Numerot osoittavat P-arvot (*: P 0,01). (E) qRT-PCR-pohjainen kvantifiointi 10q ja 15q Terra transkriptien TRAP otteita (ext) tai solupelletteihin vasemmalle uuttamalla (plt). Suhteelliset Terra määriä ilmaistaan ​​murto koko Terra molekyylien pelletti plus uutetta. Baarit ja virhepalkkeja ovat keskiarvot ja keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tehokas telomeraasia välittämää telomere pidentyminen DKO soluissa

Voit seurata telomerase elongates telomeres par ja DKO solujen me valmistettu genomi-DNA: ta tartunnan saaneiden solujen 2, 5 ja 9 päivää infektion jälkeen. Suoritimme sitten TRF analyysi käyttämällä koettimia nimenomaan havaitsemaan kromosomissa 10q subtelomeric sekvenssit tai telomeerisesti toista antureista havaita bulk telomeres. Vaikka 10q ja bulk TRFs olivat olennaisesti lyhyempi DKO kuin vanhempien soluissa, ne molemmat tehtiin progressiivinen pidentäminen koko valitun ajan kurssi infektoiduissa soluissa hTERT mutta ei ev ohjaus soluissa (kuvio 4A). Siten telomeraasia pystyy pitkänomainen telomeres sekä par ja DKO soluja kuten 10q telomeres, jotka ovat voimakkaasti transkriptoidaan DKO soluissa (kuviot 3B ja S2A). Saada enemmän kvantitatiivista tietoa, olemme käyttäneet yhden telomeeripituuden analyysi (STELA), PCR-lähestymistapaa, jonka avulla voidaan mitata tarkasti pituuden yksittäisten telomeres [21]. STELA of 15q telomeres vahvisti, että keskimääräinen telomeeripituuden in DKO soluissa on pienempi kuin vanhempien soluissa (5,9 kb ja 3,8 kb par ja DKO soluja, vastaavasti, kuvio 4B ja C). Kuitenkin, kuten jo ehdotti TRF analyysi, 15q telomeres oli tehokkaasti pitkänomainen molemmissa solulinjoissa infektoitu hTERT retrovirusten (kuvio 4D). Kvantitatiivisen analyysin avulla STELA tuotteiden ja normalisointi kautta väestö kaksinkertaistuu (PD) aika lasketaan kahdessa solulinjassa (17,7 h ja 29,6 h par hTERT ja DKO hTERT solut, vastaavasti) arvioimme telomeraasin elongaationopeutta olivat noin ~204 emäsparin /PD par soluissa ja ~186 bp /PD DKO soluissa (kuvio 4C ja D). Tämä pieni ero telome- elongaationopeutta ei korreloi suunnattoman kohonneeseen 15q Terra DKO soluissa (kuvio 3B) ja todennäköisesti katsoa johtuvan eri hTERT-proteiinin tasot Tartunnan saaneiden par ja DKO soluja (kuvio 3A). Trypaanisininen värjäys ja fluoresenssi-soluerottelijaa (FACS) anneksiini V ja propidiumjodidilla-värjättyjen solujen ei havaittu merkittäviä eroja osa kuolleista tai apoptoottisten solujen eri solulinjoissa eikä se näytä merkittäviä muutoksia jakeluun solujen joukossa eri vaiheissa solusyklin (kuvio S2B). Tämä osoittaa, että korkeampi PD aika mitattiin DKO solujen johtuu todennäköisesti pidemmän pyöräily aikaa näiden solujen, käsite tukee myös ilmeistä viivästyminen solusyklin etenemistä tarkkailtiin synkronoitu DKO soluja vapautuu nokodatsoli lohkon (kuvio S3A).

(A) TRF analyysi par ja DKO solut infektoitu tyhjällä vektorilla (EV) tai hTERT retroviruksia. Genomi-DNA otettiin talteen 2, 5 ja 9 päivää (d) infektion jälkeen, pilkottiin

Rsa

I ja siirrettiin nailonkalvolle. Sama kalvo ensin hybridisoitiin koettimella havaitsemiseksi 10q TRFs ja peräkkäin anturi havaitsee yhteensä telomeres. (B) STELA of 15q telomeeripituuden käyttämällä samaa DNA kuin A. Marker molekyylipainot ovat vasemmalla kiloemäksinä. (C) rasiakuvaaja edustus 15q telomere pituudet. Keskimääräiset telomere pituudet kiloemäksissä ja kokonaismäärän telomeres analysoitu (n) kullekin näytteelle. (D) 15q telomere elongaationopeutta ilmaistuna keskimäärin telomeeripituuden eri populaation kaksinkertaistumista. Huomaa, että par soluja, vain kolmena ajankohtana käytettiin, koska ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa keskimäärin telomeeripituuden mitattiin välillä 5. päivänä ja päivä 9.

Normal telomere pidentyminen hTERT tartunnan DKO soluja ei tue käsitystä, että Terra toimii telomeraasiestäjä

in vivo

. Silti me harkitsi mahdollisuutta, että Terra-transkriptien DKO solut eivät kykene estämään telomerase joko koska he eivät kunnolla paikallistaa sen telomeres tai koska ne ovat huomattavasti alassäädetty aikana S-vaiheessa, kun telomeraasi toimii [17], [22] . Yhdistimme epäsuoralla immunofluoresenssilla RNA fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (IF /RNA-FISH) samanaikaisesti havaita telomeerisesti tekijä TRF2 ja Terra molekyylejä. DKO solut sisälsivät enemmän ja kirkkaampi Terra pesäkkeitä kuin vanhempien soluja ja hTERT infektioita ei muuttanut yleisen mallin Terra hybridisaatio. Noin 20 ja 30% TRF2 pesäkkeitä yhteistyössä paikallistaa Terra pesäkkeitä par ja DKO soluja, tässä järjestyksessä (kuva S2C ja D), todennäköisesti osoitus siitä, että kohonneita Terra DKO soluissa helpottanut havaitsemista TERRA pesäkkeitä. Toisaalta, osa TERRA pesäkkeitä yhteistyössä paikallistamisen kanssa telomeres oli samankaltainen molemmissa solujen taustat, mikä osoittaa, että luontainen kyky Terra pysyä liittyy telomeerisesti heterochromatin ei edellytä ehjä DNMT toiminta (kuva S2C ja D). Tärkeää on, hTERT ilmaisu ei muuttanut kolokalisaation hinnat joko solulinjassa. Siten osa Terra liittyy telomeres on samanlainen par ja DKO soluja, ja telomeerivasta venymä ei havaittavasti vaikuta TERRA lokalisointi. Sitten tukossa par ja DKO solut G2 /M vaiheessa ja vapauttaa ne synkronoidusti soluun syklin riittävä aika edetä S-faasin (Kuva S3A). Valmistimme kokonais-RNA eri ajankohtina ja dot-blot hybridisoitiin sen Terra ja aktiini antureista. Terra pysyivät vakaina koko ajan kulku sekä solulinjoissa (kuvio S3B ja C). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot esittävät, että telomeraasia välittämä telomere venymä ei ole olennaisesti heikentynyt DKO soluissa, jossa Terra transkriptionopeuksien ja vakaan tilan pitoisuudet ovat kasvanut dramaattisesti [9]. Tämä puute vankan esto ei perustu mislocalization Terra tai sen alassäätö aikana S-vaiheen. Tämä on hyvin linjassa havaintojen telomeraasiaktiivisuus ei vaikuta samassa solulinjoissa.

Generation ihmisen syöpäsolujen linjat kuljettavat kopiointia indusoituva telomeres

DNMT1 /3b poisto johtaa maailmanlaajuiseen transkription muutosten in DKO soluissa [23]. Saada solukkojärjestelmän, jossa transkriptio ainutlaatuinen telomeres voitaisiin muuttaa, me syntyy stabiilien solulinjojen kuljettavat siirtogeenisiä telomeerit, joka voidaan transkriboida indusoituva tavalla ( ”transkriptionaalisesti indusoituva telomeerit” tiTELs). Yhdistimme telomere kylvöön ilmiötä indusoituva geeniekspression Tet-On Technology [24] – [26] ja kehitimme telomeerivasta kylvö vektori, joka käsittää hygromysiiniresitanssikasetin ja doksisykliini (DOX) indusoitavissa minimaalinen CMV-promoottori sijoitetaan ylävirtaan (TTAGGG ) n telomeerisen array (kuvio 5A). -1,6 Kb ainutlaatuinen sekvenssi, jota kutsutaan ”transkriptionaalisesti indusoituva subtelomere” (tiSUBTEL) erottaa telomeerisesti sekvenssin indusoituvan promoottorin (kuvio 5A). Kylvö plasmidi linearisoitiin

Apa

I digestiolla jotta paljastaa telomeerisesti suolikanavan sen 3’ja transfektoidaan Tet repressori-ilmentävä solulinja on johdettu HeLa-soluista (T-Rex-HeLa). Riippumaton hygromysiinille resistentit kloonit valittiin ja testattiin Otsikko kylvö Southern blot -analyysillä. Perimän DNA pilkottiin

Xho

I vapauttamiseksi Titel TRFs ja hybridisoitiin käyttäen radioleimattuja koettimia vastaava tiSUBTEL sekvenssit (SBP kuvassa 5A). Kaksi kloonia (CL12 ja CL17) osoitti tyypillisen tahroja hybridisaatiokuvio odotetaan vasta kylvetään tiTELs (kuvio 5B) ja valittiin lisäkarakterisointia. Molemmissa klooneja, Titel TRFs käytti enimmäkseen asettuu välille 3 ja 6 kb. Koska

Xho

I leikkauksia noin 2,4 kb ylävirtaan ensimmäisestä telomeerisesti toista annetun kylvö plasmidissa (kuvio 5A), tiTELs telomeerisesti kirjoitusten oli vakiintunut noin 0,6 ja 3,4 kb, koko alue verrattavissa irtotavarana telomeres vanhempien ja klonaalisia soluja (kuvio S4A). Olemme edelleen vahvistaneet Titel kylvö klooneissa 12 ja 17 käyttäen muita kokeellisia lähestymistapoja. Olemme vakaasti tartunnan molemmat kloonisolulinjojen linjoihin hTERT ilmentävien retroviruksia ja vahvisti, että molemmat tiTELs ja luonnon telomeres oli helppo pitkänomainen upon hTERT infektio (kuviot 5B ja S4A). STELA oligonukleotideillä, jotka vastaavat tiSUBTEL sekvenssit tuotetaan monistustuotteet hybridisoituu sekä SBP ja telomeerisesti antureista vasta kun käytimme genomista DNA: ta CL12 ja CL17 soluissa, mutta ei vanhempien soluista (kuvio S4b). DNA kala metafaasikromosomeissa valmistettu CL12 ja CL17 soluihin käyttäen fluoresoivasti leimattua kylvö plasmideja vailla telomeerinen toistoja paljasti, että vasta kylvetään tiTELs yhdistettiin yksi ja kaksi kromosomi päättyy klooni 17 ja klooni 12-soluissa, vastaavasti (kuvio 5C). Lopuksi, dot blot hybridisaatio genomi-DNA pilkottiin BAL31: llä eksonukleaasi paljasti häviää vähitellen Titel hybridisaatiosignaaleista ajan (kuvio S4C).

(A) Scheme Titel kylvö vektorin. iCMV: indusoituva CMV-promoottori; SBF ja SBR: oligonukleotidit käytetään RT-PCR kokeet; SBP: käytetyn anturin TRF, STELA ja Northern blot kokeissa. (B) Titel TRF analyysi genomisen DNA valmistettiin kloonin 12 (CL12), klooni 17 (CL17) ja vanhempien (par) solut infektoitu hTERT ilmentävien retrovirusten tai ev ohjaus retrovirukset. DNA hybridisoitiin käyttämällä SBP koettimia. Marker molekyylipainot ovat vasemmalla kiloemäksinä. (C) Osittainen metafaasien peräisin CL12 ja CL17 hybridisoitiin

in situ

havaita tiTELs (nuolenpäät). (D) Northern blot -analyysi RNA: n CL12 ja CL17 käsiteltiin 24 h yhdistelmiä doksisykliiniä (DOX) ja trikostatiini-A (TSA) tai jätettiin käsittelemättä. SBP koettimia käytetään havaitsemaan tiTERRA. Samat Kalvot riisuttu ja uudelleen koetettiin havaita beeta-aktiini transkriptien (ACT) ohjaamaan lastaus. (E) qRT-PCR-analyysi tiTERRA vakaan tason osoitettuun solulinjoissa käsitelty erilaisilla yhdistelmillä DOX ja TSA tai ne jätetään hoitamatta. Kunkin solulinjan, arvot ilmaistaan ​​kertainen kasvu yli käsittelemättömien näytteiden. Baarit ja virhepalkkeja ovat keskiarvot ja keskihajonta 3-7 kokeissa. P-arvot asianmukaiset näytteet on merkitty numeroita tai joita tähdellä (*: P 0,01; **: P 0,001).

transkriptio induktion tiTELs

Voit testata, onko tiTELs vastasi transkription induktio, me viljeltiin CL12 ja CL17 solujen läsnä ollessa tai ilman doksisykliiniä (DOX) 24 tuntia. Keräsimme kokonais-RNA ja sille sen Northern blot-analyysillä käyttämällä SBP-koettimia (Kuva 5A). DOX hoito johti ulkonäön RNA-lajien, kutsutaan ’kopiointia indusoituva Terra ”(tiTERRA), käsitti pituudeltaan välillä noin 0,5 ja 6 kb (kuvio 5D). Koska indusoituvan promoottorin sekvenssi on lisätty noin 1,6 kb ylävirtaan telomeerinen sekvenssi, voimme päätellä, että nimen mukaan transkriptio voi edetä useimmat telomeerinen ärsytystä. Sitten suoritetaan qRT-PCR-analyysi RNA: n käänteiskopioinnin satunnaisia ​​heksameerejä ja PCR-monistamalla saatu cDNA käyttäen SBF ja SBR-oligonukleotidit (kuvio 5A). Kuten odotettua, ei tiTERRA havaittu vanhempien soluissa, mikä vahvistaa spesifisyys RT-PCR lähestymistapa (kuvio 5E). Vaikka alhaisella tasolla, tiTERRA transkriptit jo havaittiin molemmissa indusoimattomassa klooneja, paljastaen pohjapinta transkription aktiivisuutta indusoituva CMV promoottorin puuttuessa induktion (kuvio 5E). Absoluuttinen kvantitatiivinen tiTERRA molekyylejä osoitti, että indusoimattomassa klooneja, tiTERRA pidettiin tasolla kuin ne, endogeenisen Terra molekyylien transkriboidaan 10q kromosomista päistä (kuvio S5a ja B). Tämä osoittaa, että tiTERRA pidetään fysiologisia tasoja sekä klonaalisia solulinjoja. Yhdenmukainen Northern blot tulokset, DOX hoito indusoi 10-to-20-kertainen tiTERRA tasoilla sekä klooneja (kuviot 5E ja S5B). TiTERRA molekyylejä havaittiin myös PCR kokeet suoritettiin cDNA käänteiskopioidusta käyttäen C-rikas oligonukleotidit (TELC) täydentävä telomeerisesti venyttää sisällä Terra-molekyylejä (kuvio S5a ja C). Niinpä, kuten luonnon Terra, yksittäiset tiTERRA selostukset sisältävät sekä telomeerisesti ja subtelomeric sekvenssit.

Terra ilme on epigeneettiseltä säännelty ja histonideasetylaasi estäjän trikostatiini A (TSA) edistää kertyminen Terra transkriptien ihmisen syöpäsoluja [27] . Käsittelimme CL12 ja CL17 solut TSA läsnä tai poissa DOX ja määrällisesti tiTERRA by qRT-PCR.