Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

Investigation mikrobi-metaboliitin suhteet suolistossa tarvitaan ymmärtää ja mahdollisesti vähentää peräsuolen syöpä (CRC) riski.

Methods

Microbiota ja metabolomiikan profilointi tehtiin kylmäkuivattiin ulosteet 42 CRC tapauksista ja 89 verrokkiin. Monimuuttujalähettimet logistista regressiota käytettiin tunnistamaan tilastollisesti riippumattomien yhdistysten kanssa CRC. Ensimmäinen pääasiallinen koordinoida-komponentti pari (PCo1-PC1) ja väärien löytö korko (0,05) -corrected P-arvot laskettiin 116000 Pearson korrelaatiot 530 aineenvaihduntatuotteiden ja 220 mikrobien sukupuoli * tapaus /kontrolli meta-analyysi.

tulokset

Yleisesti mikrobi-metaboliitin PCo1-PC1 oli korreloivat voimakkaammin tapauksissa kuin verrokeilla (Rho 0,606 vs 0,201, P = 0,01). CRC oli itsenäisesti liittyy alhaisempi Clostridia, Lachnospiraceae,

p

aminobentsoehapon ja konjugoidut linoleaatti, ja korkeampi Fusobacterium, Porphyromonaksella

p

hydroksi-bentsaldehydiä, ja palmitoyyli-sfingomyeliinin . Kautta oletetut vaikutukset solujen irtoaminen (palmitoyyli-sfingomyeliiniä), tulehdus (konjugoitu linoleaatti), ja synnynnäisen immuniteetin (

p

aminobentsoehapon), aineenvaihduntatuotteiden välittämän CRC yhdessä Fusobacterium ja Porphyromonas 29% ja 34%, tässä järjestyksessä . Kaiken palmitoyyli-sfmgomyeliini korreloivat suoraan runsaus Enterobacteriaceae (Gammaproteobacteria), kolme Actinobacteria ja viisi firmicutes. Vain Parabacteroides korreloi käänteisesti palmitoyyli-sfingomyeliinin. Muut lipidejä korreloi käänteisesti Alcaligenaceae (betaproteobacteria). Kuusi Bonferroni-merkittäviä korrelaatioita havaittiin, kuten alhaiset indolepropionate ja threnoylvaline kanssa Actinobacteria ja korkea erythronate sekä karakterisoimattomat metaboliitin kanssa enterobakteerien.

Johtopäätökset

Ulosteet CRC tapauksista oli hyvin voimakas mikrobeja metaboliitti korrelaatiot, olivat vallitsevia by enterobakteerien ja Actinobacteria. Metaboliitit välittämä suora CRC yhdessä Fusobacterium ja Porphyromonaksella mutta ei käänteinen yhdessä klostridit ja Lachnospiraceae. Tässä tutkimuksessa määritetään monimutkainen mikrobi-metaboliitin verkkoja, jotka voivat tarjota oivalluksia neoplasian ja tavoitteet interventioon.

Citation: Sinha R, Ahn J, Sampson JN, Shi J, Yu G, Xiong X, et al. (2016) Ulosteen Microbiota, Ulosteen Metabolomi, ja peräsuolen syövän keskinäisten. PLoS ONE 11 (3): e0152126. doi: 10,1371 /journal.pone.0152126

Editor: Peh Yean Cheah, Singapore General Hospital, SINGAPORE

vastaanotettu: 15 syyskuu 2015; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2016 Julkaistu: 25 maaliskuu 2016

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Cancer Institute Intramural tutkimusohjelma ja avustuksia R03CA159414 ja R01CA159036. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : BMI, painoindeksi; CRC, peräsuolen syöpä; CI, luottamusväli; FDR, vääriä löytö korko; OR, odds ratio; PABA,

p

aminobentsoehapon; PC, pääkomponentti; PCO, pääasiallinen koordinoida; SD, keskihajonta

Johdanto

suoliston mikrobien väestö (mikrobiston) kuljettaa yli 100 kertaa enemmän geenejä kuin ihmisen genomi, jonka kautta se säätelee lukuisten prosessien kuten korjuu, aineenvaihdunnan ravinnon komponentteja, immuniteetti, ja toiminta isäntä tai mikrobien johdettu kemikaaleja. [1] muuttaminen tai frank toimintahäiriö näistä prosesseista on tiiviisti sidoksissa tulehduksellinen suolistosairaus, aliravitsemuksen ja metabolinen oireyhtymä, [2-4] ja se vaikuttaa riskinä monenlaisia ​​sairauksia kuten peräsuolen syöpä (CRC). [5-11] Whole-genomin haulikko sekvensointi on tarjonnut oivalluksia metabolisen potentiaalin suoliston mikrobiston, erityisesti tutkimuksissa, mukana transkriptomiikka. [1, 12-14] Kohdennettu oivalluksia on kotoisin tutkimuksissa mikrobien yhteenliittymien, ruokavalion interventiot, gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta hiiri malleja, ja siirto ulosteen mikrobiston sairaista tai terveitä ihmisiä. [3, 13, 15] edistymisestä huolimatta kattavan vertailun kaikista havaittavissa aineenvaihduntatuotteiden kaikki mikrobit distaalisessa ihmisen gut puuttuu.

Olemme aiemmin raportoitu CRC yhdistysten kanssa ulosteen mikrobiston, erityisesti vähentynyt suhteellinen runsaus Lachnospiraceae ja muiden Clostridia ja lisääntynyt kuljetukseen Fusobacterium, Atopobium, ja Porphyromonaksella. [16] samassa väestö, CRC liittyi erot verrokkiin tasojen kymmeniä ulosteen aineenvaihduntatuotteiden. [17] Tässä pyrimme paljastaa korrelaatioita ulosteen mikrobeja ja aineenvaihduntatuotteiden sekä tunnistamaan tilastollisesti riippumattomia eroja CRC ja verrokkeihin.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkittavat ja näytteet

tutkimus suunnittelu on kuvattu aiemmin. [18, 19] Lyhyesti, vasta diagnosoitu tapauksia adenokarsinooma paksusuolen tai peräsuolen rekrytoitiin ennen leikkausta ja hoitoa aikana 1985-1987. [18, 19] Kontrollit olivat odottavia potilaita leikkausta ei-syöpäpotilailla, ei-ruoansulatuskanavan olosuhteissa näissä sairaaloissa samana ajanjaksona. Mediaani 6 päivää (kvartiiliväli, 3-13 päivää) ennen sairaalahoitoa ja leikkausta, osallistujat valmistunut ruokavalion ja demografiset kyselyt ja edellyttäen kahden päivän ulostenäytteet jotka jäädytettiin kotona hiilihappojään ja myöhemmin kylmäkuivattiin. Kahden päivän lyophilates yhdistettiin, sekoitettiin ja säilytettiin -40 ° C: ssa. Osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Lupa prosessi ja tutkimus menettelyjä tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Review Board National Cancer Institute. [18, 19]

69 tapausta ja 114 ohjaa alkuperäisessä tutkimuksessa [18, 19] tapauksessa -Säätimet analyysi mukana 48 tapauksessa ja 102 ohjaa joille vähintään 100 mg lyofilisoitua ulostetta oli saatavilla. Kontrollit olivat taajuus sovitettu tapauksiin sukupuolen ja painoindeksi (BMI). Mikrobiston ja metabolomic analyysit tehtiin näillä lyofilisoitua ulostenäytteistä. Kuten aiemmin on kuvattu [16, 17] sekä määrityksissä järjestelmissä, data olivat laadultaan erinomaisia ​​ja hyvin toistettavissa. Jotta nykyinen analyysit oli 42 tapausta ja 89 valvonta, joka oli sekä metabolomiikan ja mikrobiston tiedot.

Microbiota analysoi

yksityiskohtia vahvistus, sekvensointi, luokittelu ja analysointi 16S rRNA geenejä in Ahn et ai. [16] Lyhyesti, DNA uutettiin käyttäen Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit (Carlsbad, CA). 16S rRNA amplikonit kattaa vaihtelevia alueita V3 V4 syntyi, ja amplikoneista sekvensoitiin kanssa 454 Rochen FLX Titanium pyrosekvensointi järjestelmään. Suodatettu sekvenssit binned operatiiviseen taxonomic yksiköihin 97% identiteetti ja tasataan täysin sekvensoitu mikrobigenomeja (IMG /GG Greengenes) käyttäen QIIME putki. [20] Nykyisen analyysi rajoitettiin 220 mikrobit (poikki taksonominen tasoilla, myös 91 firmicutes, 33 Bacteroidetes, 45 proteobacteria, 11 Actinobacteria, 5 Fusobacteria, ja 35 muissa phyla), jotka havaittiin vähintään 13 (10%) koehenkilöistä.

metabolomiikka analysoi

erilaisia ​​pieniä molekyylejä (useimmat 1000 daltonia) havaittiin lyofilisoitu ulostenäytteistä korkean erotuskyvyn nestefaasin ja kaasukromatografia yhdistettynä tandem-massaspektrometrialla (HPLC-GC /MS-MS, Metabolon, Inc., North Carolina, USA) kuten aikaisemmin on kuvattu. [21, 22], Lyhyesti, ei-kohdennettu yhdessä metanolin uuttaminen suoritettiin, minkä jälkeen proteiini saostamalla. Yksittäisten molekyylien ja niiden pitoisuudet tunnistettiin päässä massaspektridatan piikit verrattuna kemialliseen käsikirjasto tuotetaan 2500 standardeihin, jotka perustuvat massaspektridatan piikit, retentioajat, ja massan ja varauksen suhde. Molekyylit sisältävät, mutta eivät rajoitu näihin, aminohapot, hiilihydraatit, rasvahapot, androgeenit, ja ksenobioottien. Haihtuvat molekyylejä, kuten lyhytketjuisten rasvahappojen, voi kadota lyofilisoinnin aikana tai uuttamalla. Tällainen menetys on yleensä vastaava poikki yksilöitä, ja lyofilisointi on optimaalinen ulostenäytteistä vakuuttaa yhtä suuri lastaus kuivapainosta. Nykyinen analyysi rajoitettiin 530 aineenvaihduntatuotteet että havaittu vähintään 118 (90%) koehenkilöistä.

Tilastolliset analyysit

Yleisenä tavoitteena oli tunnistaa kovariaatiota ja mahdolliset vuorovaikutukset ulosteen aineenvaihduntatuotteet ja ulosteen mikrobeja, joko liittyy CRC vai ei. CRC yhdistys, käytimme ehdoton logistista regressiota laskea kertoimet suhde (OR) ja 95%: n luottamusväli (CI), jossa on tapauksen tila riippuva muuttuja ja jokaisen CRC-liittyvät mikrobi ensisijaisena riippumaton muuttuja; [16] ikä, sukupuoli, ja BMI olivat mukana empiiristä säätö mahdollisten sekoittavien. Muun muassa rodun malleissa ei ollut olennaista vaikutusta arvioihin. Kuhunkin mikrobi malli, aineenvaihduntatuotteet lisättiin eteenpäin vaiheittain logistinen regressio, ja aineenvaihduntatuotteiden liittyvät CRC at P≤0.15 olivat säilyneet. Muutos OR lisäämällä aineenvaihduntatuotteiden laskettiin (OR

no metabs-OR

metabs) /(OR

no metabs- 1). Standardoituja arvioiden suhteellinen runsaus mikrobien ja luonnon-loki tasot aineenvaihduntatuotteiden normalisoitiin tarkoittavan 0 ja keskivirhe 1. Raportoimme myös Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä aineenvaihduntatuotteiden ja mikrobeja, jotka liittyvät CRC.

Yleistilanteen tavoite riippumatta CRC, me katsotaan kaikki 530 aineenvaihduntatuotteiden ja 220 mikrobeja, ja käytetty lineaarinen regressio, ositettu sukupuolen ja tapauksen tila, tunnistaa assosiaatioita aineenvaihduntatuotteiden ja mikrobeja. Kunkin 530 x 220 Regressioissa me ikä-, rodun (valkoinen vs. muut), BMI, ja sairaala. Me kuvaavat yleistä laajuutta yhdistysten piirtämällä-log 10 (P-arvot) kullekin metaboliitille-mikrobi pariksi on ”Manhattan” juoni. Olemme myös laskea korrelaatiot alkuun tärkein ainesosa (PC1) ja pääasiallinen koordinoida (PCo1) Metaboliittien ja mikrobeja, vastaavasti. Pääasialliset komponentit ja pääasiallinen koordinaatit saatiin jäljellä matriisi lineaarisen regression malleja, ikä-, rotu, BMI, ja sairaala, kunkin metaboliitin tai mikrobin, vastaavasti. Vertaamaan korrelaatio ρ

1, välillä PC1 ja PCo1 tapauksissa vastaavuustaulukon ρ

2 kontrolleissa haimme Fisherin Z-muunnos Z (ρ) = 0.5ln ((1 + ρ /1-ρ) ) kuhunkin korrelaation ja sitten testataan, onko Z (ρ

1) -Z (ρ

2) oli merkittävästi erilainen kuin 0. Oletimme Z (ρ

1) -Z (ρ

2) oli normaalisti jakautunut keskiarvolla 0 ja varianssi 1 /(N

1-3) + 1 /(N

2-3) alla nollahypoteesi jossa N

1 ja N

2 ovat numero tapausten ja valvontaa, vastaavasti. 2-puolinen P-arvo on 2 * (1-P

norm [(Z (ρ

1) -Z (ρ

2)] /sqrt (var)). Tilastolliset analyysit tehtiin vuonna R version 3.1.0 (R Foundation for tilastollinen tietojenkäsittely, Wien, Itävalta, https://www.R-project.org/).

tulokset

Täydellinen ulosteen mikrobiston ja Metabolomi tiedot olivat analysoitiin 42 CRC tapauksissa ja 89 iän ja BMI-verrokkeihin. [2] Nämä 131 koehenkilöillä keskimääräinen ikä oli 60 vuotta (SD 13,2) ja keskimääräinen painoindeksi oli 25,6 (SD 4,2), ne olivat enimmäkseen valkoinen ja uros ( Taulukko 1). tapaukset eivät poikenneet valvontaa iästä, painoindeksi, tupakointi tai sairaalaan, mutta suurempi osa tapauksista oli Afrikkalainen Amerikan ja uros (taulukko 1).

yhteinen yhdistysten ulosteen mikrobiston ja ulosteen aineenvaihduntatuotteiden CRC

logistinen regressio malleja, jotka sisältyvät ikä, sukupuoli, ja BMI, neljä mikrobit liittyivät merkittävästi CRC erillisissä malleissa: Fusobacterium (OR 10.17, CI 2,95-35,0), Porphyromonaksella (OR 5,32, CI 1,76-16,05), Clostridiat (OR 0,57, CI 0,38-0,85), ja Lachnospiraceae (OR 0,61, CI 0,40-0,92). Taulukossa 2 esitetään nämä ja lisäämällä ulosteen aineenvaihduntatuotteiden liittyvän CRC on kriteerinä P≤0.15. Näissä malleissa OR CRC oli noin 2,8 palmi–sfingomyeliinin, 2.4 jossa

p

hydroksi-bentsaldehydin, 0.5

p

aminobentsoehapon (PABA), ja 0.5 conjugated- linoleaatti-18-2N7 (CLA). Alfatokoferoli (OR 0,6) vaikuttivat Fusobacterium ja Porphyromonas malleja, ja mandelaatti (OR 1,6) vaikuttivat Clostridiat ja Lachnospiraceae malleja. Kanssa aineenvaihduntatuotteiden mikrobi malleja, korkea tai CRC kanssa Fusobacterium väheni 29% (+10,17-+7,53), ja korkeita tai joissa Porphyromonas väheni 34% (5,32-3,83). Vaimennus alhainen syrjäisimpien alueiden kanssa Clostridiat ja Lachnospiraceae oli vähäisempää (3,9% ja 1,5%, tässä järjestyksessä).

Lisätietoja Insight mikrobien ja neljä aineenvaihduntatuotteiden, jotka vaikuttivat kaikki logistisen regression malleja, pareittain Pearsonin korrelaatiokertoimet laskettiin tapaus-verrokki tila. Tapauksissa, vahva korrelaatio (