Krooninen sairaus

tiivistelmä

Xanthatin, sesquiterpene laktoni puhdistettu karheasappiruoho L., hänellä näkyvä syövän vastaista aktiivisuutta. Huomasimme, että häiriöt GSK3p toiminta oli välttämätöntä xanthatin käyttämään sen syövän vastaisia ​​ominaisuuksia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), samanaikaisesti sen kanssa parempi tukahduttaminen konstitutiivisen aktivaation STAT3. Mielenkiintoista, inaktivointi kaksi signaalia ovat kahden toisensa poissulkevia tapahtumia xanthatin solukuolema. Lisäksi olemme yllättäen havainneet, että altistuminen xanthatin ei laukaista oletetun sivuvaikutus kanoninen Wnt /β-kateniinin seuraa GSK3p: n inaktivoituminen. Olemme lisäksi havaittu, että downregulation STAT3 vaadittiin xanthatin hienosäätää riskiä. Siten löytö xanthatin, joka on kyky samanaikaisesti ohjaamaan kahta itsenäistä signalointikaskadien, voi olla merkittäviä vaikutuksia seulomiseksi lupaavia lääkkeitä syövän hoitomuotoja.

Citation: Tao L, Tuuletin F, Liu Y, Li W, Zhang L, Ruan J, et al. (2013) Yhtenäinen tukahduttaminen STAT3 ja GSK3p osallistuu kasvun estäminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä mukaan Xanthatin. PLoS ONE 8 (11): e81945. doi: 10,1371 /journal.pone.0081945

Editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Iso-Britannia

vastaanotettu: 31 elokuu 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu: 28 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Tao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81173174 ja 81202655); Kansallinen Key Technology Research Development Program (nro 2008BAI51B02); Ph.D. Ohjelmat Säätiö Opetusministeriön Kiinassa (nro 20113237110008). Jiangsu Ylioppilas tutkimus- ja innovaatiohankkeiden (nro CXZZ13_0627). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK3p) on tullut yksi houkuttelevin terapeuttisia kohteita hoidettaessa hermostoa rappeuttavien sairauksien, ja GSK3p estäjien on sovellettu onnistuneesti kliininen käytäntö vuosikymmeniä [1,2]. Vaikka se on laajalti hyväksytty, että poikkeavaan GSK3p välittämää toiminnot liittyvät usein Karsinogeneesin hyödyntäminen GSK3p antagonistien syöpähoitojen edelleen arvoituksellinen ja ristiriitainen [3]. Merkittävä huolenaihe anti-GSK3p hoidon odotetaan aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointi ja vakauttaa oncogenes siten oletettavasti johtaa kasvaimien syntyyn. Vuonna sytosoliin, GSK3p fosforyloi β-kateniinin ja tavoitteet sen ubikinaation ja proteasomaalisten hajoamista. Siksi esto GSK3p tuloksia β-kateniinin kerääntyminen, myöhemmät translokaation tumaan ja rekrytointi imukudoksen tehostajana tekijän /T-solu tekijä (LEF /TCF) DNA-sitoutumisen välittämä onkogeenisiä proteiinien transkriptio [4].

Keuhkosyöpä on tunnettu huipulle johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti [5]. Nykyinen tieto suhteen GSK3p keuhkosyövässä eteneminen perustuu kliiniseen havaintoon, että fosforyloituu GSK3p (Ser 9, kinaasi kuollut) voisi olla hyvä prognostinen merkkiaine epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) yli-ilmentävät keuhkosyöpä [6]. Viimeaikaiset todisteet ovat osoittaneet, että inhibitio GSK3p parantaa kykyä chemopreventive lääkkeen selekoksibin ja säätelevät vaimentaen anti-apoptoottista proteiini c-FLIP [7] ja herkistää tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) aiheuttama apoptoosin ei-pienisoluisessa keuhkosyöpä (NSCLC) [8], mikä viittaa siihen, että häiriöt GSK3p toiminta voi olla valinnainen tapa estää keuhkosyöpää.

tunnistaakseen uusia lääkkeitä luonnollisista tuotteista on pitkä ja menestyksekäs historia. Tässä työssä esittelemme luonnollinen sesquiterpene laktoni xanthatin [9], joka on eristetty

karheasappiruoho

L. ja on merkittävä syövän vastaista aktiivisuutta, saattaa farmakologisesti häiritä GSK3p. On raportoitu, että metanoli uute

karheasappiruoho

L., joka tarjoaa merkittäviä xanthatin voi estää GSK3 # aktiivisuutta ja säätelevät vaimentaen mikroftalmia liittyvä transkriptiotekijä (MITF) -välitteisen melanogeneesi, kun MITF on pääkohde Wnt signalointireitin [10]. Nämä havainnot alustavasti viittaavat siihen, että ei voi olla syy-kytkös GSK3p esto ja Wnt aktivointi kasvi. Lisäksi jos Wnt signalointi aktivointi on väistämätön lopputulos mukana GSK3p esto, me arveltu, että voisi hyvin mahdollisesti olla joitakin ennaltaehkäiseviä korjaustoimenpiteitä varten riskiä xanthatin. Tässä tapauksessa monitaitoinen kinaasi terapeuttisena kohteena toteutuu ja hyödyllisyys xanthatin myös ymmärrettävä.

Aikaisemmin osoitimme, että xanthatin merkittävästi indusoi solusyklin pysähtymiseen ja kaspaasi-riippuvaista apoptoosia ihmisen keuhko- ja mahasyöpä, samoin kuin hiiren melanooma [9,11,12]. On kuitenkin edelleen suurelta osin epäselvää inhibitio GSK3p on olennaista syöpää torjuvaa vaikutusta xanthatin. Edelleen paljastaa mahdollisia mekanismeja asianmukainen koordinointi useita polkuja, jotka inaktivointi GSK3p mukaan xanthatin annos ei helposti ylläpitää β-kateniinin /Wnt, käsittelemme signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3 (STAT3), koska siellä on laaja todiste kirjallisuuden salakoodinavaus että STAT3 säätelee kourallinen alavirran onkogeenien yhteinen β-kateniinin. Parhaan tietämyksemme, 1250 päällekkäisiä otaksuttu kohdegeenien on tunnistettu, jotka olivat yhdessä säätelee β-kateniinin /TCF4 ja STAT3 [13]. Nämä hyvin tunnettu yhteiset tavoitteet ovat solusyklin kiihdyttimiä (c-Myc, CyclinD1, jne.), Anti-apoptoottiset proteiinit (Bcl-2, XIAP, jne.) Ja sääntelyviranomaisten kasvaimen etäpesäke (COX-2, VEGF, jne.) [ ,,,0],14,15]. Oikeastaan ​​STAT3 aktivaatio oli mukana ydinaseiden kertyminen β-kateniinin, mikä huonontaa potilaan eloonjäämiseen paksusuolen ja rintasyöpiä [16,17]. Näin ollen päätellään, että STST3 voisi toiminnallisesti yhteistyössä β-kateniinin. Siksi arveltu, että häiriöt STAT3 saattavat osittain vaimentaa kohonnut Wnt /β-kateniinin seuraavat GSK3p inaktivoituminen xanthatin.

Tässä tutkimuksessa tutkimme vaikutus xanthatin on STAT3 ja GSK3p toimintaa NSCLC ja tutkittu taustalla välinen ylikuuluminen STAT3 ja Wnt /β-kateniinin signaloinneista. Tulokset olisivat takavarikoida epäilystä kliinisen syövän vastaisen soveltamisen xanthatin tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja solulinjoissa

Ihmisen NSCLC linjat (A549, H1975 , H1650, HCC827) ja SV40-ikuisti ei-tuumorigeeniset ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B kontrollina käytetty saatiin Kiinan tiedeakatemia Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, Kiina). Keuhkosyöpä solulinjoja viljeltiin yksikerrosviljelminä RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Wisent, Quebec, Kanada), 100 ug /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja BEAS-2B viljeltiin serum- vapaa LHC-8 väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA) pidettiin inkubaattorissa kanssa kosteutetussa ympäristössä, 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Kemikaalit ja Regents

Xanthatin eristettiin ja puhdistettiin ryhmämme kuten aikaisemmin on kuvattu [10], ja puhtaus ylitti 95% määritettynä HPLC-menetelmällä. 100 mM varasto xanthatin valmistettiin 100% DMSO: hon ja solut, joita käsiteltiin sama määrä DMSO toimi kontrollina. Litiumkloridia (LiCl: ää), SB216763 ja N-asetyylikysteiini (NAC) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Rekombinantti ihmisen IL-6 on saatu R Sykliini D1: gtgctgcgaagtggaaacc ja atccaggtggcgacgatct; c-Myc: taccctctcaacgacagcag ja tcttgacattctcctcggtg; Bcl-2: gtggagagcgtcaaccgggaga ja gggccgtacagttccacaaaggc; XIAP: cgagcagggtttcttttatactgg ja tgtagactgcgcgtggcact. cDNA vahvistusta ja suhteelliset ilmaisun arvot saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Immunosytokemia

Kun A549-soluja lasipeitinlevyille hoidettiin ilmoitti aineita, ne vahvistetaan ennalta kylmällä asetonilla, sitten huuhdeltiin kolme kertaan PBS: llä. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 ja inkuboitiin 1% BSA /PBS: llä estää epäspesifisen sitoutumisen. Tämän jälkeen solut immunovärjättiin inkuboimalla kanin monoklonaalinen vasta-aine β-kateniinin (laimennettu 1:500, Epitomics) yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (laimennettu 1:60, Boster Biotechnology, Wuhan, Kiina). Tumat vastavärjättiin Hoechst 33258 (Biotime Biotech, Haimen, Kiina). Kuvat otettiin ja analysoitiin käyttämällä ZEN 2011 kuvankäsittelyohjelma Zeiss kääntää mikroskooppi (CarlZeiss, Hallbergnoos, Saksa) alle 400-kertainen suurennus.

Dual lusiferaasireportterigeenillä määritys

Solut 96 kuopan viljelylevyille transfektoitiin lyhytaikaisesti 0,1 ug /kuoppa p-STAT3-TA-Luc toimittaja plasmidit (Biotime Biotech, Haimen, Kiina) tai TCF /LEF-reagoiva lusiferaasi (Luc2P /TCF-LEF /Hygro, Promega, Madison, WI, USA ). Transfektiotehokkuutta normalisoitui kanssa Renilla lusiferaasireportterilla plasmideja. 18 tunnin kuluttua transfektion jälkeen, solut käsiteltiin osoitetulla aineita. Suhteellinen promoottorin aktiivisuus mitattiin dual-lusiferaasireportteri (DLR) määritys järjestelmän avulla Glomax 96 Microplate Luminometer (Promega, Madison, WI, USA). Sillä kotransfektiokokeissa, solut 96 kuoppaviljelylevyillä kotransfektoitiin kanssa STAT3 siRNA (0,08 ug /kuoppa), kohde ja valvonta toimittaja plasmidit (0,15 ug /kuoppa yhteensä) 24 tuntia ja sitten käsiteltiin osoitetulla aineita, sitten koki DLR määrityksessä.

tilastollinen

Aineisto esitetään keskiarvona ± SD. Erot tulokset kahden ryhmän arvioitiin käyttäen joko kaksisuuntaisella Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA seurasi

jälkikäteen

Dunnettin testi. Erot

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Xanthatin estää proliferaatiota NSCLC

Pääset syövän vastaisen toiminnan xanthatin , neljä ihmisen NSCLC solulinjoista A549, H1975, H1650 ja HCC827, sekä normaali (ei-neoplastisia) ihmisen keuhkoputken epiteelisolut BEAS-2B käytettiin. Kuten kuviossa 1A on esitetty, olemme huomanneet, xanthatin esti NSCLC proliferaatiota annoksesta ja ajasta reagoiva tavalla. IC

50-arvot jokaisesta tasyöpäsolulinja ja inkubointiaika laskettiin, jotka osoittavat, että xanthatin kohdistama 50% esto alle 20 uM 48 tunnin jälkeen hoidon. Totesimme myös estävää vaikutusta normaaleihin keuhkoputken epiteelisoluissa pidetään korkealla mikromolaarisella pitoisuuksina kuin vaikutus ekvivalenttiannosten ja inkubaatioaika xanthatin in NSCLC. Edustavat kuvat solujen morfologia osoitti, että xanthatin selektiivisesti tappoi kasvainsolut pikemminkin kuin normaalit solut (kuvio 1 B). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että xanthatin on yleinen syövän vastaista aktiivisuutta NSCLC ilman näkyvää fyysistä toksisuutta.

(A) NSCLCs (A549, H1975, HCC827, H1650-solut) ja ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (BEAS-2B) altistettiin on osoitettu pitoisuudet xanthatin (1, 5, 10, 20, 40 uM) 24 tunnin ja 48 tunnin, vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus määritettiin Yksi ratkaisu solujen lisääntymisen määrityksessä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Arvot on ilmaistu prosentteina elävien solujen normalisoida elinkelpoisten solujen prosentuaalinen 0,5% DMSO-käsiteltyihin soluihin. Pitoisuus xanthatin tuloksena 50%: n inhibition ohjaus kasvun (IC

50) laskettiin SPSS-tilasto-ohjelmiston avulla probit. (B) Kuvat ovat solun morfologian BEAS-2B ja H1975 solut otettiin 48 tunnin kuluttua hoidon kanssa tai ilman 20 uM xanthatin (100 x, Mittakaavapalkki edustaa 200 um).

Xanthatin inhiboi ensisijaisesti aktivoituminen STAT3 sijaan GSK3p NSCLC

seuraava arvioidaan onko downregulation GSK3p ja STAT3 toiminta oli samanaikainen kanssa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista xanthatin. Käsittelimme NSCLC eri pitoisuuksilla xanthatin (1, 5, 10, 20 ja 40 uM) ja 6 h, tai 20 uM xanthatin 12 tunnin sisällä. Western blot-analyysi osoitti, että xanthatin annosriippuvaisesti lisätä fosfori-GSK3p (Ser9) ja vähentää fosfori-STAT3 (Tyr705) ilman proteiinin kokonaismäärän tason muuttunut A549, H1975, H1650 ja HCC827 solut (kuvio 2A). Lisäksi havaitsimme, että xanthatin voimakkaasti kumottiin STAT3 aktiivisuus 30 min, mutta fosforyloitu GSK3p alkoi kasvaa 2 h kuluttua hoidon A549 ja H1975-soluja (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että xanthatin ensisijaisesti tukahdutti STAT3 sijaan GSK3p. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että inaktivointi sekä GSK3p ja STAT3 on mukana solun tapahtumat käynnistyvät xanthatin.

(A) NSCLCs (A549, H1975, HCC827, H1650-solut) käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla xanthatin ( 1, 5, 10, 20, 40 uM) ja 6 tuntia, ja sitten alistettiin Western blot mittaamiseksi proteiinin tasot fosfori-GSK3p (Ser9), t-GSK3, fosfori-STAT3 (Tyr705) ja STAT3 vastaavasti. (B) A549 ja H1975-soluja käsiteltiin 20 uM xanthatin eri aikaan (0-12 h) ja sitten tehtiin Western blot mittaamiseksi proteiinin tasot fosfori-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfori-STAT3 (Tyr705 ) ja STAT3 vastaavasti.

inaktivointi GSK3p ja STAT3 kaksi toisensa poissulkevaa tapahtumia xanthatin-solukuolema

vahvista suhde kahden molekyylitason tapahtumia aiheuttama xanthatin ja mahdollisten mekanismit herkkyys xanthatin solukuolema, tutkimme, onko tunnettuja GSK3p-specific estäjät, LiCI: n (ei-ATP-kompetitiivinen inhibiittori) ja SB216763 (ATP-kompetitiivinen inhibiittori) [18] voisi tuottaa samanlaisia ​​syövän vastaista aktiivisuutta ja parantaa syövän vastaisen vasteen xanthatin. Kuten kuviossa 3A, löysimme molemmat 20 mM LiCl ja 20 uM SB 216763 lisääntynyt GSK3p inaktivoitumistehon vaikutusta vahvistaa huomattavasti xanthatin. Mielenkiintoista, toisin kuin LiCI, SB216763 voi vain lisätä fosforylaatiota pohjapinta GSK3p mutta myös hajoamisen koko GSK-3 A549 ja H1975 NSCLC, joka oli pois odotuksiamme. Kuitenkin farmakologinen GSK3p estäjät eivät vaikuttaa tasoon fosfori-STAT3. Tutkia tarkemmin, ovatko GSK3p inaktivaatio voisi olla vaikutusta solujen eloonjäämiseen, huomasimme, että leviämisen A549 ja H1975 solujen inhiboivat merkittävästi GSK3p inhibiittorit yksinään tai yhdessä xanthatin 24 tuntia hoitoa, ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolut heikosti vaikutti GSK3p estäjien kanssa tai ilman xanthatin (kuvio 3B).

(A) A549 ja H1975-soluja käsiteltiin 0,5% DMSO: ta tai 20 uM xanthatin co-inkuboitiin kanssa tai ilman 20 mM LiCl: a tai 20 uM SB216763 6 tuntia . Proteiini näytteet altistettiin Western blot mittaamiseksi fosfori-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfori-STAT3 (Tyr705) ja STAT3. (B) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (A549, H1975-solut) ja BEAS-2B altistettiin 0,5% DMSO: ta tai 20 uM xanthatin co-inkuboitiin kanssa tai ilman 20 mM LiCl: a tai 20 uM SB216763: ssa 24 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (For osoitettuun vertailuissa *

P

0,05, **

P

0,01). (C) Ohjaus siRNA tai siRNA vastaan ​​STST3 transfektoitiin A549-soluja (2 ug siRNA per kuoppa). Sen jälkeen, kun 24 tunnin kuluttua transfektioista soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 20 uM xanthatin 6 h seuraa Western blot mittaamiseksi fosfori-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfori-STAT3 (Tyr705) ja STAT3. (D) Ohjaus siRNA tai siRNA vastaan ​​STST3 transfektoitiin A549-soluja (0,15 ug siRNA per kuoppa). Sen jälkeen, kun 24 tunnin kuluttua transfektioista soluja käsiteltiin 10 tai 20 uM xanthatin edelleen 24 tunnin ajan ja altistettiin soluproleferaatiomäärityksessä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Sillä merkitty vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01.

Käytimme myös siRNA hillitä STST3 toimivat A549-soluissa laaja validointi. Western blot-analyysi vahvisti merkittävästi tukahduttaminen fosfori-STAT3 ja yhteensä STAT3 ilmentymistä kohde- siRNA, joka syntyy lisäaine inhibitio STAT3 aktiivisuuden läsnä ollessa xanthatin. Kuitenkin STAT3 siRNA myöskään muuttaa GSK3p aktiivisuutta verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio 3C). Lisäksi, hiljentäminen STAT3 parannettu kyky xanthatin vähentää kasvua A549-solut 24 tunnin kuluttua käsittelystä (kuvio 3D). Kaikkiaan on todennäköistä päätellä, että tukos GSK3p ja STAT3 toiminta on osallinen antiproliferatiivisia vaikutuksia xanthatin, mutta kaksi tapahtumaa eivät kausaalisesti yhdistetty.

farmakologinen esto GSK3p osittain voimistaa xanthatin aiheuttama solujen pidätystä ja apoptoosin

vahvista parantaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista anti-GSK-3 in xanthatin-altistetuissa soluissa johtui epätasapainossa soluproliferaation tai apoptoosin, me seurataan sitten solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin vasteet virtaussytometrianalyysin A549-soluissa. Kuten kuviossa 4A ja 4C, 20 uM xanthatin ja 20 mM LiCl: a voitaisiin merkittävästi aiheuttaa solujen läpi G2 /M pidätyksen jälkeen 24 h hoito (10,56-31,42% ja 10,56-30,27%, vastaavasti), joka oli liitetty väheneminen G1 vaiheessa (69,26-41,21% ja 69,26-50,33%, tässä järjestyksessä). Toisin kuin LiCl, 20 uM SB216763 vähemmän selvästi vaikuttanut G2 /M jakelun A549-solut (10,56-15,07%), joka oli yhdensuuntainen edellisen raportin [8]. Kun teemme yhteistyötä inkuboitu xanthatin kahdella GSK3p inhibiittorit, merkittävä kasvu solujen G2 /M vaiheessa ilmestyi by LiCl muttei SB216763. Solut värjättiin myös anneksiini V /PI apoptoosin analyysiä. A549-soluja nähtiin selvää apoptoosin pitkäaikaisen altistuksen jälkeen (48 h) mukaan xanthatin (58,8%), LiCl (54,6%), ja SB216763 (48,1%), vastaavasti. Lisäksi xanthatin yhdistettynä SB216763 täydennetty enemmän apoptoottisia soluja kuin LiCl (96,2% vs. 71,9%) (kuvio 4B ja 4D). Yhdessä inhibitio GSK3p on todennäköisesti vastuussa xanthatin indusoiman solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.

(A) A549-solut altistettiin 0,1% DMSO: ta tai 20 uM xanthatin co-inkuboitiin kanssa tai ilman 20 mM LiCl: a tai 20 uM SB216763: ssa 24 tuntia ja sitten värjättiin propidiumjodi- iodidle havaitsemiseksi solusyklin virtaussytometrialla. (B) A549-solut altistettiin 0,1% DMSO: ta tai 20 uM xanthatin co-inkuboitiin kanssa tai ilman 20 mM LiCl: a tai 20 uM SB216763 48 tuntia ja sitten värjättiin propidiumjodi- iodidle ja anneksiiniV-FITC havaitsemiseksi apoptoosin virtaussytometrialla. (C) Quantitative data solukierron (G0-G1, S ja G2 /M vaiheet) ovat peräisin kolmen rinnakkaisen määrityksen keskiarvoa ja näytetään keskimääräisenä ± SD. Sillä merkitty vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01. (D) kokonaismäärä prosentteina apoptoottisia soluja yhteenvedon oikean alakulman neljänneksessä fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu histogrammit (prosentteina varhaisen apoptoottisten solujen) ja oikeassa yläkulmassa neljännekseen (prosentteina myöhäinen apoptoottisten solujen). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Sillä osoitettuun vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01.

GSK3p estäminen on välttämätöntä syövän vastaisen aktiivisuuden xanthatin

suoraan tutkia, inaktivointi GSK3p korreloi xanthatin solukuolema, me transfektoitiin ohimenevästi A549-soluja, joilla on konstitutiivisesti aktiivinen (S9A) rakentaa GSK3p. Kuten olemme huomanneet, ektooppinen ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen GSK3p heikennetty fosforylaatiota GSK3p mukaan xanthatin, mutta vieläkään muuttaa tasoa STAT3 signaloinnin A549-soluja (kuvio 5A), joka ilmoitti lisäksi esto GSK3p mukaan xanthatin ei ole vedottu esto of STAT3. Kuten odotettua, yliekspressio konstitutiivisesti aktiivisen GSK3p siirrettävä vastustuskyvyn syövän vastaisen toiminnan xanthatin aika-riippuvaisella tavalla (kuvio 5B). Lisäksi GSK3p on syvästi mukana apoptoosin paeta ja sen inaktivaatio on ylävirran tapahtuma reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi [19,20]. Tätä varten, havaitsimme, että xanthatin solukuolema oli täysin estetty, kun läsnä on voimakas antioksidantti ja ROS scavenger N-asetyylikysteiini (NAC) (kuvio 5C). Lisäksi NAC täysin heikennetty GSK3p fosforylaation xanthatin (kuvio 5D), joka osoitti rooli GSK3p inhibition xanthatin ROS-välitteistä solukuolemaa. Kaiken kaikkiaan, meidän tiedot osoittavat, että GSK3p inhibitio on välttämätön syövän vastaisen aktiivisuuden xanthatin kautta ROS.

(A) A549-solut siemennettiin 6-kuoppalevyllä transfektoitiin HA-merkitty konstitutiivisesti aktiivinen (S9A) -GSK3β tai tyhjä vektori (2 ug plasmidi-DNA per kuoppa). Sen jälkeen, kun 48 tunnin kuluttua transfektioista soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 20 uM xanthatin 6 tuntia, sitten tehtiin Western blot mittaamiseksi proteiinin tasoja-HA-tag, fosfori-STAT3 (Tyr705) ja STAT3 vastaavasti. (B) A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevylle transfektoitiin HA-tagged konstitutiivisesti aktiivinen (S9A) -GSK3β tai tyhjän vektorin (0,1 ug plasmidi-DNA per kuoppa). Sen jälkeen, kun 48 tunnin kuluttua transfektioista soluja käsiteltiin 10 tai 20 uM xanthatin 24 h ja 48 h vastaavasti, niin alistettiin solujen lisääntymisen määritystä. Sillä merkitty vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01. (C) A549-soluja käsiteltiin 10 tai 20 uM xanthatin läsnä tai poissa ollessa 1 mM NAC: ssa 48 tuntia, sitten tehtiin solujen lisääntymisen määritystä. (D) A549-soluja käsiteltiin 10 tai 20 uM xanthatin läsnä tai poissa ollessa 1 mM NAC: ssa 6 tuntia, sitten tehtiin Western blot mittaamiseksi proteiinin tasot fosfori-GSK3p (Ser9) ja GSK-3 vastaavasti. Esitetyt tiedot ovat edustettuina keskiarvo ± SD. Sillä merkitty vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01.

Xanthatin ei laukaista yleistä posttranskriptionaalisella aktiivisuutta β- kateniinin vastauksena GSK3p inaktivaatioon

arvioida perusteellisesti mahdollisuutta, että xanthatin saattaa aiheuttaa haitallisia seurauksia johtuen GSK3p eston kautta upregulating β-kateniinin välitteisen transkription aktiivisuutta ja oncogenes ilmaisun, ryhdyimme tutkimaan solunsisäiseen signalointiryöpyn vastauksena lisäämiselle xanthatin ja GSK3p estäjä. Kuten on havainnollistettu kuviossa 6A, käsittely 20 uM xanthatin 12 h ei aiheuttanut juuri laaja tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin, kun taas LiCI: n yksin sulatettu β-kateniinin vakauden ja yleisen ydin- jakelu. Koinkubaation kahden aineen aiheuttama vakavin tapaus, mutta solujen määrä pieneni suuresti. Sitten tutkittiin muuttaminen promoottorin aktiivisuuden aktivoitu β-kateniinin käyttäen lusiferaarikonstrukti kanssa LEF /TCF-elementin, joka oli osallisena transkription DNA sitoutumisen β-kateniinin opiskeluun Wnt aktivointia. Olemme havainneet, että xanthatin annoksesta riippuvalla kasvoi (0-10 uM), mutta laski (20-40 uM) esi-transkriptionaalista aktiivisuutta Wnt /β-kateniinin tai ilman 20 mM LiCl: a 6 h inkuboinnin jälkeen (kuvio 6B). Tutkimme lisäksi ajallinen kinetiikka luonnehdinta 20 uM xanthatin on β-kateniinin-LEF /TCF lusiferaasiaktiivisuus. Xanthatin indusoi ajasta riippuva aktivointi reportterigeenin 2 tunnin sisällä, mutta sen jälkeen, suurin vaikutus alkoi laskea alle 6 tuntia. Nämä tiedot vahvistavat, että xanthatin on mahdollisuus aktivoida β-kateniinin /Wnt, mutta tämä tapaus ei ole jatkuvaa.

(A) A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon, 20 uM xanthatin, 20 mM LiCl: a tai 20 mM LiCl: a plus 20 uM xanthatin 12 tuntia, sitten solut kiinnitettiin ja niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden β-kateniinin. A549-soluja immunovärjättiin anti-kaniini FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja sen jälkeen värjättiin Hoechst 33258. Näytteet visualisoitiin ja valokuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (400 ×, Mittakaavapalkki edustaa 50 um). Sininen kuvaa tumaan ja vihreä kuvaa lokalisaation β-kateniinin. (B) A549-soluja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin kotransfektoitiin kanssa Luc2P /TCF-LEF /Hygro ja renilla lusiferaasi (0,1 ug plasmidi-DNA: ta hyvin yhteensä) 18 tuntia, minkä jälkeen ne sitimulated vehikkeliä, 20 mM LiCI: tai 20 mM LiCl: a plus 1, 5, 10, 20 ja 40 uM xanthatin 6 tuntia. Solulysaatit suoritettiin DLR-määritys, ja suhde tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla (suhteellinen lusiferaasi) aktiivisuus määritettiin. Sillä merkitty vertailuja, *

P

0,05, **

P

0,01. N.S., ei-merkitsevä. (C) A549-soluja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin kotransfektoitiin kanssa Luc2P /TCF-LEF /Hygro ja renilla lusiferaasi (0,1 ug plasmidi-DNA: ta hyvin yhteensä) 18 h, sitten stimuloitiin 20 uM xanthatin 0 -6 h. Solulysaatit suoritettiin DLR-määritys, **

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään. (D) A549-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 20 uM xanthatin 12 tuntia, ja sitten koko RNA: t uutettiin. CyclinD1, c-Myc, Bcl-2, XIAP mRNA-tasot määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin tasoon GAPDH mRNA: ta. Kannen muutokset mRNA: n ilmentymisen on osoitettu geenien verrattiin suhteena vehikkelikontrolliin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmen rinnakkaisen kokeissa. **

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään. (E) A549-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 20 uM xanthatin 6 tuntia. Sytoplasminen (Cyto.) Ja ydin- (Nu.)-Uutteet valmistettiin ja altistettiin sitten Western blot mittaamiseksi proteiinin tasot β-kateniinin, fosfori-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfori-STAT3 (Tyr705) ja STAT3 vastaavasti.

Seuraavaksi määritetään mRNA tasot neljän edustavan Wnt kohdegeenien kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR.