Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdunkaulan syövän solut osoittavat lisääntynyt vaatimus ubikitiinistä riippuvaisten proteiinien hajoaminen liittyy kohonnut metabolisen vaihtuvuus, ja erityisiä signalointireittejä, erityisesti HPV E6 kohdistetun hajoamista p53 ja PDZ proteiineja. Luonnolliset yhdisteet hapettumisenestoaine ominaisuuksia kuten flavonoideja ja triterpenoids olla lupaava syöpälääkkeiden häiritsemällä ubikitiinistä riippuvainen proteiinien hajoaminen. Yhä useammat todisteet osoittavat, että niiden α-β tyydyttymättömiä karbonyyli järjestelmä on molekyyli tekijä eston ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen ajan virran katalyyttinen sivustoja 20S-proteasomin. Tässä raportoimme tunnistamisesta ja luonnehdinta uuden luokan Kalkonin-pohjainen, voimakas ja solun läpäisevä kemiallinen estäjiä ubikitiinistä riippuvaisten proteiinien hajoaminen, ja lyijy yhdiste RAMB1. RAMB1 estää ubikitiini-riippuvainen proteiinien hajoaminen vaarantamatta katalyyttinen toiminta 20S-proteasomin, mekanismi eroaa Bortetsomibi. Kohdunkaulan syövän hoitoon solujen RAMB1 laukaisee laskostumattoman proteiinin vasteita, mukaan lukien aggresome muodostuminen ja Hsp90 vakauttamiseen, ja lisää p53 vakaassa tilassa tasoilla. RAMB1 hoitotuloksia aktivoitumiseen lysosomaalisen riippuvaisten hajoamisreitit mekanismina kompensoimaan lisääntyvää poly-ubikitiinipromoottori rikastettu myrkyllisiä aggregaatteja. Tärkeää on, RAMB1 synergistisesti laukaisee solukuoleman kohdunkaulan syövän soluja, kun se yhdistetään lysosomissa inhibiittorin Chloroquine.

Citation: Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong T, Felthauser A, Iizuka Y, Gavioli R, et ai. (2011) Korostaen Ubiquitin-Proteasome System ilman 20S proteolyyttiset esto valikoivasti tappaa kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10,1371 /journal.pone.0023888

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2011; Julkaistu: 31 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Anchoori et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health ATIP ja SPORE kohdunkaulan syövän P50 CA098252 on SRK, RKA ja RBSR ja HERA Foundation (Health, Empowerment, tutkimus- ja Awareness) ja puolustusministeriön Munasarjojen Cancer Research Program (OCRP) OC093424 MB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ubiquitin riippuvan proteiinien hajoaminen kautta ubikitiinistä proteasomin järjestelmä (UPS) on ratkaisevaa sääntelyn monissa solun prosessien kuten solusyklin etenemistä, erilaistumista ja apoptoosia sekä normaaleissa ja syöpäsolujen [1]. Poikkeava ilmentymä komponenttien UPS-järjestelmän mukaan lukien ubikitiinistä ligaaseina de-ubiquitinating entsyymien ja proteasomien on raportoitu useissa syövän hoito kuten kohdunkaulan syövän [1], [2], [3], mikä viittaa siihen, että jotta voidaan ylläpitää niiden korkeammalle tasolle aineenvaihdunnan aktiivisuutta syöpäsolujen luottavat raskaammin kun toimivuus UPS verrattuna niiden normaaliin vastine [4], [5], [6], [7]. Siten molekyylejä, jotka kykenevät häiritsemään ubikitiinistä riippuvainen proteiinien hajoaminen, mukaan lukien Bortetsomibi, osoittavat syövän vastaista aktiivisuutta [5]. Ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on ensisijainen syy kohdunkaulan syövän ja vastaa 5% kaikista syövistä maailmanlaajuisesti [8]. Vaikka HPV-rokotteisiin voi olla tehokas ennalta ehkäisevä vaikutus kohdunkaulan syövän, ei tällä hetkellä ole virus erityisiä hoitoja, ja tehoa standardin kirurgisten ja Chemo /sädehoidot on rajoitettu edenneen taudin [9]. Expression kahden viruksen onkogeenien, E6 ja E7, on tarpeen induktioon ja ylläpitoon transformoidun fenotyypin [10]. E6 onkoproteiinia kykenee sen kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden sitoutumalla E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla E6-AP ja ohjaa sen toimintaa kohtaan p53 ja muissa elimissä vaimennin proteiineja niiden nopeaa ubikitiinistä välittämää proteasomaalisten hajoaminen [11], [12], [13]. Tämä vähentää taso tämän avaimen solujen solusyklin säädin ilman mutaatiota. Siksi me arveltu, että vakauttaminen p53 kautta estää sen ubikitiinistä välittämän hajoamisen on terapeuttista potentiaalia kohdunkaulan syövän ja mahdollisesti muiden syöpien villityyppisen p53.

Natural yhdisteitä flavonoidien ja triterpenoids perheille myös curcumin, Celastrol, vihreä tee polyfenolit ja kalkonien ovat osoittaneet lupausta syöpälääkkeet erilaisissa syövän asetukset, kuten kohdunkaulan [14], paksusuolen [15], [16], ruokatorven [17], haiman [18] ja eturauhasen [19], [ ,,,0],20], [21] syöpä, liittyy pro-apoptoottisten ominaisuudet liittyvät proteasomaalisten inhibitioon. Olemme äskettäin osoittaneet, että kalkonisyntaasia-johdannaisia ​​sisältävä yksittäinen aminohappo substituutioita rakenteeltaan toimivat proteasomiestäjät ja luonne aminoacidic osan määrittelee niiden selektiivisyys eri katalyyttinen toimintaa 20S-proteasomin [14]. Kuitenkin muut havainnot viittaavat siihen, että kalkonisyntaasia molekyylit saattavat sisältää niiden α- tyydyttymättömiä karbonyyli- järjestelmä molekyylitason määräävä eston ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen ylävirtaan 20S-proteasomin [22], [23], [24], [25].

Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että sarjan kalkonin-johdannaisten puuttuu aminoacidic komponentit, tässä kutsutaan RAMBs, ovat ubikitiini-proteasomin järjestelmä (UPS) -stressors inhibition kautta ubikitiinipromoottori-välitteisen proteiinien hajoaminen ylävirtaan 20S proteasomaalisten katalyyttinen aktiviteetti . Erityisesti, meidän RAMBs yhdisteet kykenevät selektiivisen tappamisen kohdunkaulan syövän soluihin kerääntyminen poly-ubikitinoituja proteiini, jota seuraa liipaisu laskostumattoman proteiinin vasteita, mukaan lukien aggresome muodostumista ja Hsp90 vakauttamiseen. Edelleen, tämä kertyminen poly-ubikitinoitu proteiinien mukana on korvaavia aktivoituminen lysosomifuusio riippuvaisten proteiinien hajoaminen, stabilointi p53, epävakautta sykliini D1 ja alkaa apoptoosin. Tulosten perusteella näyttää, että hoito RAMB yhdiste, mahdollisesti yhdistettynä lysosomin estäjän Chloroquine, on lupaava uusi väylä varten kohdunkaulan syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja HeLa, SiHa, CaSki ja ME180, saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinillä, 5% CO

2. Keratinosyytit saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA) ja niitä viljeltiin määritelty Keratinosyyttien-SFM.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin 2,3-bis [2-metoksi-4- nitro- 5-sulfofenyyli] -2H-tetratsolium-5-karboksanilidi sisäinen suola (XTT) määritys (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa). Solut ympättiin pitoisuus 1000 per kuoppa 100 ui väliaineessa 96-kuoppaisella levyllä käsiteltiin kalkonisyntaasia perustuvat johdannaiset määrätyin pitoisuuksina. Sen jälkeen kun ilmoitettu aikana, soluja inkuboitiin mukaan valmistajan protokollan kanssa XTT merkintöjä seosta 4 tunnin ajan. Formatsaanikiteet väriaine kvantitoitiin käyttäen spektrofotometrisellä levynlukijalla mitata absorbanssi 450 nm: ssä (ELISA-lukijalla 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

määritys apoptoottisten solujen virtaussytometrialla

Apoptoosin määritettiin anneksiini V /7-AAD värjäystä. Anneksiini-V /7-AAD värjäys tehtiin käyttämällä anneksiini V-PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti, 1 x 10

5-solut suspendoitiin uudelleen Binding Buffer, 5 ui anneksiini V-PE ja 5 ui 7-AAD lisättiin sitten soluihin, jotka sitten inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuuttia, ja analysoitiin virtaussytometrialla Becton Dickinson FACSCalibur. Tietojen analysointi tehtiin CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA).

Vasta-aineet ja Western Blot analyysi

totaalisoluproteiinia (10-20 ug) kustakin näytteestä erotettiin SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-kalvoille ja altistettiin Western blot-analyysi. Vasta-aineiden Western blot analyysiä saatiin seuraavia kaupallisia lähteitä: anti-ubikitiinipromoottori (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p53-kloonin DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) anti-PARP (BD Pharmingen, San Diego , Kalifornia), anti-GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), peroksidaasi-kytketty anti-hiiri-immunoglobuliini G (Amersham, Piscataway, NJ) ja sitä käytetään pitoisuutena valmistajan suosittelemia. Antiubikitiinivasta-ja anti-vimentiinista vasta-aineiden immunofluoresenssianalyysillä saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas red-leimattua vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini G ja fluoreskeiini-leimattua hevosen anti-kani-immunoglobuliini G saatiin Molecular Probes (Carlsbad, CA), ja Vector Laboratories (Burlingame, CA), vastaavasti, ja käytettiin pitoisuutena valmistajan suosittelemia.

Cellular morfologia ja immunologiseen fluoresenssi analysoidaan

Nikon Eclipse TE 2000E käänteismikroskooppi käytettiin kuvantamisen solujen morfologia vaihekontrasti ja immunofluoresenssimenetelmällä. Analysointiin ubikitiinipromoottori ja vimentiinista subsellulaarisella lokalisointi, viljelmiä HeLa-soluja kasvatettiin kuten kuvataan Lab-Tek II chambered peitelevyllä (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Ilmoitettuina aikoina, solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin metanolia ja inkuboitiin ilmoitetuilla ensisijaisen vasta-aineita. Fluoresoivat toissijainen vasta-aineita käytettiin visualisoida proteiinia lokalisointi ja tuman DNA visualisoitiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäys. Asennettu näytteet tarkasteltiin Nikon Eclipse TE 2000E käänteismikroskooppi ja kuville Spot 3.5.8 hankinnan ohjelmistot (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

mittaus proteasomaalista aktiivisuutta 20S Puhdistettu proteasomien

Solut (5 x 10

8) pestiin kylmässä PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl

2, 1 mM DTT (Sigma), 2 mM ATP: tä ja 250 mM sakkaroosi. Lasihelmiä vastaava tilavuus solususpensiota lisättiin, ja seosta vorteksoitiin 1 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Helmet ja solujäänteet poistettiin 5 min sentrifugoinnilla 1000 g, jonka jälkeen 20 min sentrifugoimalla 10000

g

[27]. Lysaatit kirkastettiin ultrasentrifugoimalla 1 h 100000

g

, ja supernatantit edelleen ultrasentrifugoitiin 5 tunnin ajan 100,000

g

. Proteasomi sisältävät pelletit suspensoitiin uudelleen 0,5 ml: aan homogenointipuskuria [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM KCI, 15% glyseroli]. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-protokollaa (Pierce, Rockford, IL). Fluorogeeniset substraatit Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC ja Ac-YVAD-AMC käytettiin mittaamaan kymotryptisen-like, tryptinen kaltainen ja kaspaasi-like toimintaa, vastaavasti. Puoliksi puhdistetun proteasomien (10 l), esikäsitelty tai ei estäjillä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, analysoitiin 37 ° C: ssa 45 min käyttäen eri peptidisubstraatteja puskurissa, joka sisältää 50 mM TRIS-HCl: ää (pH 7,5), 5 mM MgCl

2 ja 1 mM DTT (lopullinen tilavuus 100 l). Reaktio sammutettiin 1 ml: lla 1% SDS: ää ja fluoresenssi määritettiin fluorimetriä (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK), jossa eksitaatio 380 nm ja emissio 440 nm: ssä [18]. Tiedot ilmaistaan ​​inhibitioprosenttina verrattuna käsittelemättömiin proteasomaalisten valmisteita.

mittaus proteasomaalista aktiivisuutta 26S proteasomien elävissä soluissa

Eksponentiaalisesti kasvavat solut (1 x 10

6) maljattiin 60 mm astiat ja joko mock käsitelty tai niitä käsiteltiin eri pitoisuus RAMB1 yli 4 tunnin ajan. Proteasomaalista aktiivisuutta solulysaateista (NP-40 lyysipuskurilla: 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glyserolia ja 1 mM DTT) määritettiin mittaamalla jäljellä luminesenssi aktiivisuuden lisäyksen jälkeen Suc -LLVY-Glo ™ substraattia (Promega, Madison, WI), joka on spesifinen kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus proteasomin mukaan valmistajan suositusten mukaisesti.

määritys 4XUbiquitin-Luciferase degron

4Xubiquitin- lusiferaasin fuusio nimetty rakenne Ub-FL ja ohjaus suunnitellun plasmidin CMV-FL ystävällisesti toimittanut tohtori David Piwnica-Worms (Washington University, St. Louis, MO) [26]. Sub-konfluentteja viljelmiä HeLa-solut transfektoitiin plasmideilla DNA käyttämällä Lipofectamine 2000-reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL ja Ub-FL transfektoituja HeLa-soluja ympättiin 50000 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille tai 200000 solua /kuoppa 6-kuoppaiseen levyyn 24 tuntia transfektion jälkeen ja inkuboitiin yhdisteiden kanssa tai vehikkeliä (DMSO) annoksina ja ajat on ilmoitettu. Lusiferaasiaktiivisuuden solulysaattia määritettiin lusiferaasin Assay Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvat otettiin 1 min kanssa Xenogen IVIS 200 (Etu, Hopkinton, MA). Samankokoisen alueet analysoitiin Living Image 2.20 ohjelmisto.

klonogeeninen määritys

Eksponentiaalisesti kasvavat SiHa, CaSki ja HeLa kohdunkaulan syövän soluja ympättiin joko 1000 tai 100 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille. Eräänä päivänä ymppäämisestä, solut käsiteltiin joko vain vehikkelillä (mock) tai RAMB1 osoitetuissa annoksina, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 10 päivää. Lopussa hoidon väliaine poistettiin ja solut huuhdeltiin PBS: lla ennen kiinnitystä ja värjäystä pesäkkeistä käyttäen seosta, jossa oli 6,0% glutaraldehydiä ja 0,5% kristalliviolettia, kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Pesäkkeet kuvattiin ja laskettiin käyttäen Nikon Eclipse TE 2000E käänteismikroskooppi ja kuville Spot 3.5.8 hankinnan ohjelmistot (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

Tulokset on esitetty keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitys erot arvioitiin kaksisuuntaisella Studentin

t

Prism (V.5 Graphpad, San Diego, CA) ja Excel. Merkitsevyystasoksi asetettiin p≤0.05. Yhdistelmä-indeksi (CI), ja RAMB1 ja Chloroquine laskettiin mediaani-vaikutus analyysin mukaan menetelmän Chou ja Talaly [28]. CI 1 osoittaa synergismiksi CI = 1 osoittaa additiivisuuteen, ja CI 1 tarkoittaa antagonismia. Edelleen regressio analyysit tehtiin vakauttamiseksi arvioihin.

Tulokset

RAMB yhdisteitä valikoivasti vähentää elinkelpoisuutta kohdunkaulan syövän solujen riippumatta HPV-genotyypin

kautta

salpaamalla proteasomaalisten hajoamisen

Flavonoidit ja triterpenoids perheenjäsenet mukaan lukien Celastrol [19], resveratroli [29], [30], kurkumiini [17], epigallocatechin-3-gallate [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] ja kalkonien [35], [36] osoittavat syövän ominaisuuksia liittyvät toiminnastaan ​​proteasomiestäjät [14], [15], [16], [21]. Olemme äskettäin raportoitu, että kalkoni-pohjainen proteasomiestäjät luonteen aminohapon osa molekyylistä antaa spesifisyys kohti katalyyttistä toimintaa 20S-proteasomin [14]. Perustuen useiden aikaisempien tutkimusten [22], [23], [37], me arveltu, että α-β ketoni järjestelmä Kalkonien voivat edustaa vähintään molekyyli- määräävä eston ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen ylävirtaan proteasomien.

tämän hypoteesin testaamiseksi olemme aluksi seulotaan kirjasto kalkonin perustuvat johdannaiset kuljettaa eri substituentteja aromaattiset renkaat vieressä α-β ketonin järjestelmä ja puuttuu aminoacidic osia, niiden solujen kasvua inhiboiva kapasiteetti eksponentiaalisesti kasvavissa HPV18-positiivisia HeLa kohdunkaulan syövän solulinja pitoisuusalueella 100-+0,01 uM (ei esitetty). Neljä kalkoni johdannaiset, jäljempänä kutsutaan RAMBs, kykenee vähentämään solujen elinkelpoisuuden eksponentiaalisesti kasvavia HeLa kohdunkaulan syövän solujen annoksesta riippuvalla tavalla IC

50-arvot alle 5 uM, valittiin lisäarviointia varten (kuvio 1). Määrittää mahdollisuutta käyttää RAMBs yhdisteiden kohdunkaulan syövän hoitoon, testasimme onko RAMB1-4 hoito olisi nimenomaan estää solujen elinkelpoisuuden kohdunkaulan syövän solujen yli normaalin keratinosyytit ja onko väheneminen solujen elinkelpoisuuden kohdunkaulan syöpäsolut on riippuvainen HPV -genotype. Kuten kuviossa 2 on esitetty, RAMB1 tai RAMB4 hoito tuotti annoksesta riippuvan vähentäminen elinkelpoisuuden HPV16-positiivisia SiHa ja CaSki-solujen ja HPV-39-positiivisia ME180 kohdunkaulan syövän solulinjat vastaavasti minimaaliset vaikutukset elinkelpoisuuden primaaristen ihmisen keratinosyyttien ja IC

50 samanlainen saatiin HeLa. Samanlaisia ​​tuloksia on hieman suurempi IC

50 saatiin käyttäen RAMB2 ja RAMB3 (ei esitetty). Sen testaamiseksi, onko väheneminen solujen elinkelpoisuuden havaittu kohdunkaulan syövän solujen altistuksen jälkeen on RAMB1-4 yhdisteiden johtui niiden kapasiteetin häiritä ubikitiinipromoottori-välitteisen proteiinien hajoaminen, tarkkailtiin tasot kertyminen poly-ubikitinoituja proteiinien hoidon jälkeen. Erityisesti HeLa-soluja käsiteltiin 5 uM RAMB1, RAMB2, RAMB3 tai RAMB4 tai 10 nM Bortetsomibi, jälkimmäisen ollessa käytetään UPS-stressitekijästä positiivinen kontrolli, yli 6 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa 3 (

vasen paneeli

), immunoblot-analyysi ubikitinoituja proteiinin ilmentymisen tasot HeLa-soluissa paljasti selkeä kuvio kertymisen poly-ubikitinoituja proteiinien RAMBs hoidetun HeLa kulttuureissa. Puolikvantitatiivista analyysi polyubiquitinated proteiinin tasot osoittavat, että GAPDH-normalisoidut tasot polyubiquitinated proteiinit ovat jatkuvasti suurempi (jopa 3-kertainen) in RAMB saaneilla versus valehoidettujen soluissa (kuvio 3,

oikeassa paneelissa

). Nämä havainnot viittaavat siihen, että väheneminen solujen elinkelpoisuuden havaittu kohdunkaulan syövän solujen paneeli, mutta ei normaaleissa soluissa seuraavasti RAMBs hoitoon liittyy häiriön ubikitiinipromoottori-välitteisen proteiinien hajoaminen ja tapahtuu riippumatta siitä, onkogeenisten HPV-tyypin.

IC

50-arvot määritettiin XXT määrityksessä. IC

50-arvo raportoitiin ovat keskimäärin kolme riippumatonta määrityksen.

Cultures of HPV-transformoitujen kohdunkaulan syövän soluja (SiHa-, CaSki ja ME180) tai primaarisista ihmisen keratinosyyttejä käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla RAMB1 (

vasen paneeli

) tai RAMB4 (

oikea paneeli

) aikana 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin XTT-määrityksellä, ja piirrettiin osa käsittelemätön kontrolli viljelmissä.

Vasen paneeli:

immunoblot-analyysi ubikitinoituja proteiinien HeLa-soluissa, sen jälkeen 6 tuntia altistuksen kanssa tai ilman 10gM RAMBs. Bortetsomibi käytettiin positiivisena kontrollina. Equal Proteiinilisäyksen kussakin vyöhykkeessä varmistettiin käyttämällä vasta-ainetta GAPDH.

Oikea paneeli:

kvantifiointi Ubiquitin /GAPDH-suhteet.

RAMB hoitoa laukaisee Ubiquitin-Proteasome-System (UPS) -stress vasteen vaikuttamatta 20S-proteasomin katalyyttinen toiminta

Sen testaamiseksi, onko nopea (kuusi tuntia tai vähemmän, julkaisematon data) kertyminen poly-ubikitinoituja proteiinien seuraavat RAMBs altistuminen tapahtuu samanaikaisesti suoraan inhibition katalyyttistä toimintaa proteasomien, me testattiin kyky RAMB1 ja RAMB4 (joka indusoi suuremman kertymistä polyubiquitinated proteiinia kuin muut RAMBs, kuva 3) estää katalyyttinen alayksiköiden sisällä 20S-proteasomin. Erityisesti RAMBs testattiin niiden valmiuksia estää kymotrypsiinin kaltaisia ​​(CT-like), trypsiinin kaltaista (T-kaltainen) ja peptidylglutamyl peptidi hydrolysointiaktiivisuuden kaltainen (PGPH kaltainen) toiminta 20S puhdistetussa proteasomin esialtistettu nousevia annoksia jopa 10 uM RAMBs ajaksi 30 minuuttia lisäyksen jälkeen fluorogeenisen substraatteja [38]. FDA lisensoitu proteasomin inhibiittoria Bortetsomibi käytettiin positiivisena kontrollina. Kuten kuviossa 4 on esitetty profiili proteasomin esto osoittaa, että toisin kuin Bortetsomibi, RAMB1 ja RAMB4 hoito eivät estäneet proteasomaalisten toimii, kun testattu pitoisuuksia jopa 10 uM (samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden yhdisteiden sarja, jota ei ole esitetty).

Puhdistetut 20S proteasomien käsiteltiin 30 min kanssa tai ilman RAMB yhdisteitä tai Bortetsomibi, tässä käytettiin positiivisena kontrollina, ilmoitettuina pitoisuuksina ja erityiset fluorogeenisen substraatteja kymotrypsiinin kaltaisia, trypsiinin kaltaista ja peptidylglutamyl peptidin hydrolysoiva-like hydrolyyttinen proteasomin kapasiteetit lisättiin seuraavaksi. Tyypillinen esimerkki kahden itsenäisen kokeen esitetään.

Sen arvioimiseksi, onko vika estää proteasomaalisten toiminnon

in vitro

voidaan toisteta ehjässä proteasomin löydetty elävissä soluissa, käytimme kahta eri lähestymistapaa. Ensin käytettiin ubikitiinipromoottori-lusiferaasi bioluminesoiviin reportteri 4XUb-FL, joka vastustaa katkaisun Ubiquitin hydrolaaseissa [26], transfektoi- HeLa-solut. Käyttämällä Ub-FL ja FL transfektoituja HeLa-soluja olemme seuranneet lusiferaasiaktiivisuuden altistumisen jälkeen RAMBs yli 6 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa 5

(vasemmalla)

toisin Bortetsomibi tai meidän äskettäin tunnistettu proteasomin inhibiittoria RA1 [14], tässä käytetään proteasomiestäjät positiivisina kontrolleina, RAMB1 tai RAMB4 indusoi heikomman vakauttaminen Ub-FL toimittaja, kun testattiin pitoisuuden jopa 20 uM kuin nähty joko RA-1 tai Bortetsomibi. Kvantifiointi Ub-FL /FL suhteen mock verrattuna RAMBs alttiina kulttuuri on esitetty kuviossa 5 (

keskimmäinen

paneeli). Seuraavaksi inhibition puutteen 20S proteasomaalista aktiivisuutta RAMB-käsitellyissä soluissa varmistettiin mittaamalla jäljellä fluorogeenisen aktiivisuus 20S-proteasomin puhdistettiin CaSki kohdunkaulan syövän soluja esi-altistettiin RAMB1 tai RAMB4 4 tuntia. Kuten kuviossa 5 (

oikea paneeli

), toisin kuin Bortetsomibi, RAMB1 hoito epäonnistui estämään kymotryptinen aktiivisuutta proteasomien testattaessa pitoisuuksille jopa 20 uM. Yhdessä tämä viittaa siihen, että menetys solujen elinkelpoisuuden kohdunkaulan syövän soluissa RAMBs altistuminen tapahtuu samanaikaisesti kertyminen polyubiquitated proteiinien ilman suoraa esto 20S proteasomaalista aktiivisuutta.

Vasen paneeli:

lusiferaasiaktiivisuutta lysaateissa Ub-FL tai FL-vektorin transfektoidut solut tai ilman hoitoa RAMB yhdisteiden tai Bortetsomibi määrä määritettiin Suhteellinen luminenssi Units (RLU) ja ilmaistiin% valvonnan. Virhe palkit ovat keskihajonnan (SD) varten kolmen erillisen kokeen.

Middle paneeli:

kvantifiointi UB-FL /FL-suhde.

Oikea paneeli:

luminenssi aktiivisuus solulysaateista peräisin CaSki- kohdunkaulan syöpäsolujen kanssa tai ilman RAMB tai Botezomib hoito määrällisesti Suhteellinen luminenssi Units (RLU). *, P 0,05, **, P 0,02.

RAMB1 hoito indusoi aggresome muodostumista ja laukaisee lämpöisku- vasteet

ja muut ovat osoittaneet, että esto ubikitiinistä välitteisen proteiinien hajoaminen kautta proteasomaalisten eston laukaisee lämpö-shock ja laskostumattoman proteiinin vasteita mukaan lukien muodostuminen solua suojaavien rakenteiden kutsutaan aggresomes mekanismina kompensoimaan eston proteasomaalisten toimintojen ja yltyviin UPS stressiä syöpäsoluja [4], [6], [39] . Sen testaamiseksi, nopea kertyminen poly-ubikitinoitu proteiini upon RAMB1 käsittely tapahtuu samanaikaisesti lämpöä pösokkiproteiini vasteet (UPR) seurasimme proteiinin ekspressiotasot Hsp90 HeLa kohdunkaulan syöpäsoluja altistetaan 10pM RAMB1-3 8 tuntia. Kuten kuviossa 6A (

vasen paneeli

) immunoblot-analyysi Hsp90-proteiinin ekspressiotasoja paljasti, että voimakas kuvio kertyminen Hsp90 in RAMB1-käsiteltyjen versus valehoidettujen HeLa soluviljelmissä (samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden johdannainen sarja, jota ei ole esitetty). Puolittain kvantitatiivinen analyysi Hsp90-proteiinin tasot osoittavat, että GAPDH-normalisoidut tasot polyubiquitinated proteiinit ovat lähes 2 kertaa suurempi käsitellyn vs. ei-käsitellyissä soluissa on esitetty kuviossa 6A (

oikea paneeli

).

.

Vasen paneeli:

immunoblot-analyysi Hsp90 ekspressiotasoja HeLa kohdunkaulan syöpäsolut kuluttua 8 tunnin altistuksen kanssa tai ilman 10pM RAMBs hoitoa. Bortetsomibi käytettiin positiivisena kontrollina. Equal Proteiinilisäyksen kussakin vyöhykkeessä varmistettiin käyttämällä vasta-ainetta GAPDH.

Oikea paneeli:

kvantifiointi Hsp90 /GAPDH-suhde. B. HeLa-soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 5 uM RAMB1 tai 10 nM Bortetsomibi 18 tuntia ennen kiinnitystä ja immunologiseen fluoresenssivärjäys DNA (sininen), ubikitiini (vihreä) ja vimentiinista (punainen) ennen kuvantaminen (60 x).

Seuraavaksi arveltu, että kertyminen poly-ubikitinoitu proteiinit seuraavista RAMB yhdiste altistuksen johtaisi aktivoitumiseen vaihtoehtoisia korvaavia väyliä ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen, erityisesti lysosomireitin aktivointia. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme seurataan osa-sijainti solun ubikitiinipromoottori immunofluoresenssimikroskopialla analyysi HeLa kohdunkaulan syövän soluja altistettiin 10 uM RAMB1. Kuten kuviossa 6B immunofluoresenssianalyysillä poly-ubikitinoituja proteiinien HeLa-soluissa käsiteltiin RAMB1 tuloksista käy ilmi vimentiinista-häkissä, ubikitiini-positiivisia, aggresomes rakenne, joka on yhdenmukainen edellä on kuvattu käsittelemällä Bortetsomibi [6]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että in RAMB1 käsiteltyjä soluja kertymistä poly-ubikitinoituja tulokset samanlaisia ​​soluja suojaava vasteita esto proteasomin katalyyttisen toiminnan Bortetsomibi, mutta tapahtuu mekanismin kautta, joka on riippumaton siitä.

RAMB1 hoito johtaa p53 vakauttaminen, sykliini D1 epävakautta ja apoptoosin alkaminen

E6 onkoproteiinia HPV kykenee sen kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden kohdentamalla p53 ja muissa elimissä vaimennin proteiinien nopean ubikitiinistä välittämän proteasomaalisten hajoamista. Tämä vähentää taso tämän avaimen solujen solusyklin säädin ilman mutaatio p53. Voit testata, onko arvonalentumisesta ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen seuraavat RAMBs hoitoa johtaa vakauttamiseen p53 potentiaalisesti edistää mekanismi aloittamista solukuoleman, tutkimme ekspressiotasot p53 seuraavien 6 tunnin altistuksen yhdisteitä 10 uM RAMBs. Kuten kuviossa 7A, 8 tuntia RAMB1 altistus liittyy annoksesta riippuva kertymistä p53 CaSki kohdunkaulan syövän soluja verrattuna vale-ohjaus. Tärkeää on, p53 vakauttaminen aiheuttaa tukahduttaminen sykliini D1 promoottorin tuloksena aktiivinen tukahduttaminen sykliini D1 transkription [40]. Sen testaamiseksi, onko tämä johtaa vähentäminen sykliini D1 ilmentymisen tasoja, CaSki kohdunkaulan syövän solut altistettiin kasvavat annokset RAMB1 aikana jopa 8 tuntia. Kuten kuviossa 7B

(vasen paneeli) B RAMB1 käsittely aiheuttaa aikariippuvainen (

Top) ja annoksesta riippuvainen (

alhaalla

) laskua sykliini D1 tasoilla viittaa vika kohdunkaulan syövän tulla S- vaiheen solusyklin syynä solun myrkyllisyys [41]. Puolittain kvantitatiivinen analyysi β-aktiini-normalisoidut sykliini D1 tasoilla on kuvassa 7B (

oikea paneeli ylhäällä ja alhaalla

).

. Immunoblot-analyysi p53-ilmentymisen taso CaSki-soluissa on käsitelty ilmoitetun pitoisuuden RAMB1 ajan 8 tuntia. Equal lastaus on kunkin kaistan varmistettiin amidomusta- värjäystä. B.

Top vasemmassa paneelissa:

immunoblottianalyysi sykliini D1 ekspressiotaso CaSki soluissa tai ilman 10pM RAMB1 ajaksi jopa 8 tuntia. Proteiinimäärän tutkittiin käyttäen vasta-ainetta vastaan, β-aktiini.

oikean yläreunan:

kvantifiointi sykliini D1 /β-aktiini-suhde.

Alhaalla vasemmalla paneeli:

immunoblottianalyysi sykliini D1 ekspressiotaso CaSki soluissa tai ilman RAMB1 oltava oikean pitoisuuden 8 tunnin jakson. Equal Proteiinilisäyksen kussakin vyöhykkeessä varmistettiin käyttämällä vasta-ainetta β-aktiini.

Bottom oikea paneeli:

kvantifiointi sykliini D1 /β-aktiini-suhde. C.

Vasen paneeli

. HeLa-soluja käsiteltiin 10 uM RAMB1 8 tuntia ja analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen ja anneksiini V: n sitoutumisen ja 7-AAD sisällyttämistä.

Keskipaneeli

: immunoblot-analyysi täyspitkä ja pilkotaan PARP HeLa-soluissa, joita käsiteltiin 10 uM RAMBs ajan 8 tuntia. Proteiinimäärän arvioitiin käyttämällä vasta-ainetta β-aktiini.

Oikea paneeli

: kvantitointi pilkotun PARP /β-aktiini-suhde.

Sen testaamiseksi, onko tämä johtaa vähentäminen sykliini D1 ilmentymisen tasoja, CaSki kohdunkaulan syövän solut altistettiin suurempia annoksia of RAMB1 aikana jopa 8 tuntia. Puolittain kvantitatiivinen analyysi β-aktiini-normalisoitu sykliini D1 tasoilla on kuvassa 7B (

oikea paneeli ylhäällä ja alhaalla

). Kuten kuviossa 7B

(vasen paneeli) B RAMB1 hoito aiheuttaa erittäin nopean (

Top) ja annoksesta riippuvainen (

alhaalla

) laskua sykliini D1 tasoilla viittaa epäonnistuminen kohdunkaulan syöpä tulla S-vaiheen solusyklin voi edistää menetys solujen elinkelpoisuuden [41].

stabilointi p53 vakaan tilan tasoja ja epävakauteen sykliini D1 tasot viittaavat siihen, että vähentäminen solujen elinkelpoisuuden havaittu paneeli kohdunkaulan syövän solujen seuraavat RAMBs altistuminen saattaa laukaista apoptoosin alkaminen. Tämän hypoteesin testaamiseksi, HeLa kohdunkaulan syövän solut altistettiin 5 uM RAMB1 ja analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen for anneksiini V: n sitoutumisen ja 7-AAD sisällyttäminen. Anneksiini V: ja 7-AAD värjäys mahdollistaa syrjiä elinkelpoisia (anneksiini V

neg /7-AAD

neg), apoptoottinen (anneksiini V

pos /7-AAD

neg), ja kuolleet (anneksiini V

pos /7-AAD

pos) soluja. Kuten kuviossa 7C (

vasen paneeli

), 24 tunnin altistus RAMB1 aiheutti kasvu sekä varhaisen (anneksiini V positiivinen väestöstä) ja myöhäinen (anneksiini V ja 7-AAD kaksinkertainen positiivisia väestöstä) ja apoptoottisten väestö käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolleihin. Sen arvioimiseksi, onko tämä johtuu kaspaasin aktivaatio, mittasimme tasot PARP pilkkominen HeLa syöpäsolujen altistuksen jälkeen RAMB1. Kuten kuviossa 7C (

keskipaneeli

), korkeampi pilkotun PARP ovat ilmeisiä käsitellyissä verrattuna käsittelemättömiin viljelmiin osoittaa kaspaasi-3 aktivaation. Kvantifiointi pilkotun PARP /GAPDH on esitetty kuviossa 7C (

oikea paneeli

). Nämä havainnot tukevat hypoteesia, että RAMBs hoito laukaisee apoptoosin kohdunkaulan syöpäsoluja.

RAMB1 käsittely estää ankkurointi kasvain-pesäkkeiden muodostumisen kohdunkaulan syöpäsolujen ja toimii synergiassa lysosomissa estäjän Chloroquine

tunnusmerkki