Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Curcumin estää niiden kasvun haimasyövän kasvain nude-hiirissä; kuitenkin, vaikutusmekanismi ei ole täysin ymmärretty. On käymässä yhä selvemmäksi, että RNA sitovia proteiineja säädellä posttranskriptionaalisella geeniekspressiota ja on kriittinen rooli RNA vakautta ja kääntäminen. Täällä olemme päättäneet, että curcumin moduloi ilmentymistä RNA sitovan proteiinin CUGBP2 estävän haimasyövän kasvua.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että curcumin käsitelty tuumoriksenografteja on merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuuden ja angiogeneesiä. Curcumin inhiboivat, vaikka asiakkuutta G2-M pysähtymiseen ja apoptoosiin johtavat mitoosi katastrofi erilaisten haiman syöpäsoluja. Tämä vahvistettiin lisääntynyt fosforylaatio Checkpoint kinaasi 2 (Chk2) proteiiniin yhdistettynä korkeamman ydin- sykliini B1 ja CDC-2. Curcumin lisääntynyt ilmentyminen syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) mRNA, mutta proteiinin tasot olivat alhaisemmat. Lisäksi kurkumiini lisääntynyt ekspressio RNA sitovien proteiinien CUGBP2 /CELF2 ja TIA-1. CUGBP2 sitoutumista COX-2: n ja VEGF-mRNA: ta myös parannettu, mikä lisää mRNA: n stabiilisuuteen, puoliintumisaika muuttuu 30 min 8 h. Toisaalta, äänenvaimennin-välitteisen knockdovvn CUGBP2 palautti osittain ilmentymisen COX-2: n ja VEGF jopa curcumin hoitoon. COX-2: n ja VEGF-mRNA: n tasot alenivat valvoa tasoja, kun taas proteiinit taso oli korkeampi.

Päätelmä /merkitys

Curcumin inhiboi haiman kasvainten kasvua mitoosi katastrofin lisäämällä ilmentymistä RNA sitovan proteiinin CUGBP2, estäen siten translaation COX-2: n ja VEGF-mRNA: n. Nämä tiedot viittaavat siihen, että translaation esto on uusi vaikutusmekanismi ja kurkumiinin aikana terapeuttisen intervention haiman syövät.

Citation: Subramaniam D, Ramalingam S, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, et ai . (2011) RNA sitovan proteiinin CUGBP2 /CELF2 välittää Curcumin aiheuttama Mitoottista katastrofi haimasyövän Cells. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10,1371 /journal.pone.0016958

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 lokakuu 2010; Hyväksytty: 18 tammikuu 2011; Julkaistu: 11 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Subramaniam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana NIH myöntää DK062265, CA109269 ja CA135559. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta edistysaskeleet molekyyli- synnyssä, haimasyövän edelleen merkittävä ratkaisematon terveysongelma Yhdysvalloissa [1]. Haimasyöpä on nopeasti invasiivinen, metastaattinen kasvain, joka on resistentti standardi hoitojen [2], [3]. Tällä hetkellä ainoana lääkkeenä kemoterapian (esimerkiksi Gemsitabiini) on tukipilari hoito metastasoituneen adenokarsinooman haima. Gemsitabiinihoidon on tuumorivasteita on alle 10%; Samoin mikään käytettävissä nykyisen kemoterapia-aineiden on objektiivinen vaste oli yli 10% [4], [5]. Viime aikoina huumeiden yhdistelmät gemsitabiinihoito myös tutkitaan, mutta se on liian aikaista sanoa, jos ne ovat kliinisesti parempi. Kuitenkin suuruus tämän ongelman valtuuttaa tarvitaan uusia terapeuttisia aineita.

Epidemiologiset tutkimukset viittaavat siihen, että ruokavalio on merkittävä rooli ehkäisyssä moniin syöpiin. Curcumin, aktiivinen ainesosa mauste kurkuma, on osoittanut, anti-kasvain vaikutuksia prekliinisissä tutkimuksissa [6], [7]. Anti-kasvain ominaisuudet curcumin ovat kasvaimen kasvun inhibition ja apoptoosin induktion [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Pilot faasin I kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että curcumin on turvallista silloinkin kun kulutetaan päivittäinen annos on 12 g 3 kuukautta [17], [18], [19]. Kaikkein Viime vaiheen I /II tutkimus osoitti, että yhdistelmähoito käyttäen 8 g suun curcumin päivittäin gemsitabiinihoidon oli turvallinen ja toteutettavissa potilaille haimasyöpä oikeuttaneet lisätutkimisesta sen tehokkuudesta [20].

Anti-kasvain ominaisuuksia kurkumiinin on katsottu johtuvan ainakin osittain, sen kyky estää ilmentymisen ja aktiivisuuden syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) [21], [22]. Se on nopeutta rajoittava entsyymi arakidonihapon prostaglandiinisynteesireitillä. Proteiini on yli-ilmentynyt tulehduksessa ja erilaisia ​​syöpiä. Haiman syövät, COX-2 overexpresssion liittyy apoptoosin inhibitio, lisääntynyt kasvaimen invasiivisuus ja angiogeneesin edistäminen. CELF (CUGBP-ETR3 kaltaiset tekijät) perhe RNA sitovia proteiineja on kuusi jäsentä, jotka ovat mukana solujen eri prosesseissa kuten mRNA, editointi, vakautta ja käännös [23]. Yhden jäsenen, CUGBP2 (tunnetaan myös nimellä CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) ilmaistaan ​​kaikkialla läsnä, joskin korkeammilla tasoilla lihassoluissa [24], [25]. Aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että kun CUGBP2 yli-ilmentyy, solut käyvät läpi mitoosi katastrofin [26], [27]. Olemme myös osoittaneet, että CUGBP2 voi sitoutua AU-rikas sekvenssit 3’untranslated alueella COX-2: n mRNA ja lisäämään vakautta mRNA, samalla kun estetään sen käännös [28]. Hur liittyvä RNA sitovan proteiinin kanssa rakenteellista samankaltaisuutta CUGBP2 toisaalta on sekaantunut kasvaa COX-2: n mRNA vakautta ja parantaa sen käännöksen sitoutumalla saman AU-rikas jaksoelementin [29]. Kolmas RNA sitovaa proteiinia, joka toimii transkription jälkeinen geeniekspression säätelijä tunnistamalla U-rikas sekvenssi RNA on TIA-1 (T-solujen vapaan intrasellulaarisen antigeeni-1). TIA-1: n on osoitettu estävän mRNA translaation olosuhteissa ympäristön stressin [30], [31]. Tässä artikkelissa olemme määritti kurkumiinista ilmaisun RNA sitovien proteiinien haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläimet käsiteltiin tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntö määrittelemät asianomaisten kansallisten ja /tai paikallisten eläinten hyvinvoinnin elimet, ja kaikki eläinten työ hyväksyi Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (Protocol # 07-009) yliopiston Oklahoma Health Sciences Centerissä.

solut ja reagenssit

AsPC-1, MiaPaca-2, Panc-1, BxPC-3 ihmisen ja Pan02 hiiren haiman syöpäsoluja (kaikki American Type Culture Collection, Manassas, VA) kasvatettiin RPMI 1640: ssä, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja 1% antibioottista-antimykoottista liuosta (Mediatech Inc., Herndon, VA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2. Curcumin ostettiin LKT Laboratories, St. Paul, MN.

leviämisen ja apoptoosi määritykset

arvioimiseksi lisääntymistä, solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin yön yli. Solut käsiteltiin sitten kasvavia annoksia curcumin RPMI 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Analyysi soluproliferaatiota suoritettiin entsymaattisella määrityksellä [32]. Apoptoosin, kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin käyttäen Apo-one homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (Promega, Madison, WI).

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Lyhyesti, 6 ja maljaa ympättiin 500 eläviä soluja, ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin, kun läsnä ollessa tai ilman eri konsentraatioiden curcumin jopa 48 tuntia. Curcumin sisältävä väliaine poistettiin sitten ja solut pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin vielä 10 d täydelliseen alustaan. Kukin käsittely tehdään kolmena kappaleena. Pesäkkeet saatiin pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 10% formaliinilla 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten PBS: llä, mitä seurasi värjäys hematoksyliinillä. Pesäkkeet laskettiin ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna.

Cell kaarianalyysien

Soluja käsiteltiin curcumin 12 h ja 24 h, ja tämän jälkeen trypsinoitiin ja suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Yksisoluiset suspensiot kiinnitetään käyttäen 70% etanolissa 2 tuntia, ja sen jälkeen tehtiin läpäiseviksi PBS: llä, joka sisälsi 1 mg /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ja 2 ug DNaasi-vapaata RNaasi (Sigma-Aldrich) huoneen lämpötilassa. Virtaussytometria tehtiin FACSCalibur analysaattori (Becton Dickinson, Mountain View, CA), syömällä 50000 tapahtumien jokaisesta näytteestä. Tulokset analysoitiin ModFit LT ™ -ohjelmiston (Verity Software House, Topsham, ME).

Real Time Reverse-transkriptio polymeraasiketjureaktio Analysis

eristetty kokonais-RNA MiaPaca-2, Pan02 solut ja tuumoriksenografteja käyttäen TRIZOL-reagenssia, tehtiin käänteistranskriptio Superscript II käänteistranskriptaasilla läsnä ollessa ta satunnaisheksanukleotidialukkeilla (kaikki Invitrogen, Carlsbad, CA). Täydentävät DNA: t käytettiin sitten Reaaliaikainen PCR: llä käyttämällä Jumpstart Taq DNA-polymeraasia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja SYBR Green nukleiinihapon tahra (Molecular Probes, Eugene, OR). Crossing kynnystä geenien normalisoitiin p-Actin. Muutoksia mRNA: n ilmentymisen ilmaistiin kertainen muutos suhteessa kontrolliin. Alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ’ja 5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3′; COX-2: 5’-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ’ja 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; VEGF: 5’-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 ’ja 5′-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3′; Hur: 5′-GTGAACTACGTGACCGCGAA-3’and 5’-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3 ’; CUGBP2: 5’-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 ’ja 5′-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3′; TIA-1: 5’-ACCCATCTGTTGAATGGCGT-3’and 5’GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3 ’; Sykliini D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ’ja 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3’.

RNA vakaus- määrityksessä

Soluja käsiteltiin curcumin 2 tuntia. Aktinomysiini-D (10 ug /ml lopullinen konsentraatio), joka on voimakas estäjä mRNA-synteesin lisättiin soluihin ja kokonais-mRNA uutettiin 0-8 h. RNA alistettiin Reaaliaikainen PCR edellä kuvatulla tavalla. Aineisto esitetään suhteessa kontrollisoluihin, aikaan lisäämällä aktinomysiini D.

Western blot -analyysi

Solulysaatit altistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja blotattiin Immobilin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore , Bedford, MA). Vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Abcam Inc (Cambridge, MA) ja Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) ja tiettyjen proteiinien havaittiin tehostetun kemiluminesenssin (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

immunosaostus

immunosaostuksella, solut kiinnitettiin 1% formaliinin avulla. Lysaatit valmistettiin ja immunosaostettiin anti-CUGBP2 vasta-aine. Pelletti ja supernatantti sen jälkeen inkuboitiin 70 ° C: ssa 1 h kääntää ristisidosten, ja RNA puhdistettiin ja sille suoritettiin RT-PCR määrittämään COX-2: n ja VEGF-mRNA-tasot.

siRNA

Sequence kohdistaminen CUGBP2 mRNA 5′-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 ’(liittymistä mumber ns. NM_001025076) ja salatun ohjaus siRNA ei vastaa mitään ihmisen geenit saatiin Ambion Inc, Texas, USA ja transfektoitiin SIPORT transfektioreagenssia (Ambion).

Pan02 ksenograftikasvaimissa

Viisi viikkoa vanhoja koiraspuolisia kateenkorvattomia nude-hiirten hankittiin Jackson Laboratories hyödynnettiin

in vivo

kokeita. Hiiriä pidettiin vedellä ja tavallisen hiiren Chow

mainos libidum

jota käytetään protokollien hyväksymässä yliopiston Animal Studies komitea. Eläimet injektoitiin 1 x 10

6 Pan02 solujen vasen ja oikea kylki ja annettiin muodostaa ksenograftit. Viikko istutuksen jälkeiseen solujen ja todettuaan, että läsnä on ilmeni selvänä kasvain, kurkumiini (200 ug /kg) 5% Na

2 HCO

3 puskuria yksin annettiin vatsaonteloon päivittäin 23 d. Tuumorin koko mitattiin viikoittain. Lopussa hoidon jälkeen eläimet tapettiin ja tuumorit poistettiin, punnittiin, ja valmistettu käytettäväksi histologia (hematoksyliinillä 0,05). (B) Curcumin hoito alensi merkitsevästi kasvaimen painoa verrattuna kontrolleihin (* p 0,05). (C) Kasvaimen leikkeitä värjättiin CD31, endoteelisolujen spesifinen pinta-markkeri ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05).

Curcumin estää haiman syöpäsolujen kasvua

määrittämiseksi mekanismi curcumin- välitteistä kasvun pysähtymisen, tutkimme haimasyöpäsoluissa

in vitro

. Tästä käytimme viisi erilaista viljellyt solulinjat MiaPaca-2, Panc-1, AsPC-1, BxPC-3 ja Pan02. Curcumin merkittävästi tukahdutti leviämisen haimasyövän solulinjoissa MiaPaca-2, Pan02, AsPC-1, BxPC-3 ja Panc-1 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Tämä anti-leviämisen vaikutusta kasvaimen soluihin havaittiin kuluessa 24 h ajan, joka jatkoi merkittävästi seuraavien 72 h (Fig. 2A). Määrittää pitkän aikavälin vaikutus curcumin hoidon, soluja käsiteltiin 30 uM curcumin 24 tuntia, jonka jälkeen solujen annettiin kasvaa normaaliin media. Curcumin hoito tukahdutti pesäkkeiden muodostumista kaikissa haimasyövän solulinjoissa (Fig. 2B), mikä viittaa siihen, että kurkumiini n vaikutukset kasvainsoluihin oli peruuttamaton. Sykliini D1 on solusyklin sääntelyn proteiini, joka säätelee G1 S-vaiheeseen siirtymistä solusyklin ja toimii kofaktorina useiden transkriptiotekijöiden [33]. Sykliini D1 yli-ilmentyminen on yhdistetty kehittymistä ja etenemistä syövän [34]. Sekä MiaPaca-2 ja Pan02 soluja, kurkumiini hoito johti vähentää sykliini D1 ilmentymisen 24 h (Fig. 2C, D). Lisäksi sykliini A2, joka säätelee S /G2 etenemistä, on vaimentua mahdollisesti hidastaa etenemistä solujen joukosta S-vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Curcumin inhiboi proliferaatiota haimasyövän soluja. MiaPaca-2, Pan02, AsPC-1 ja BxPC-3-soluja inkuboitiin kurkumiini (1-50 uM) enintään 72 tunnin ajan. Solujen proliferaatio analysoitiin heksosaminidaasin entsyymin aktiivisuutta. Curcumin hoito johti merkittävään annoksesta ja ajasta riippuvaa vähenemistä solujen lisääntymisen kaikissa soluissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. (B) Curcumin estää pesäkkeiden muodostumista. MiaPaca-2 ja Pan02 soluja inkuboitiin 30 uM curcumin 24 h ja pesäkkeet annettiin muodostaa inkuboimalla säännöllisesti väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää vielä 10 d. Hoito curcumin esti pesäkkeiden muodostumista. Edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) Expression of sykliini D1 on vaimennettu 24 tuntia. RNA MiaPaca-2 ja Pan02 soluja inkuboitiin 30 uM curcumin tehtiin Reaaliaikainen PCR sykliini D1 mRNA: n ilmentymisen. Oli merkittävä tukahduttamista mRNA 24 h mutta 12 h (* p 0,05). (D) Lysaatit MiaPaca-2 tai Pan02 inkuboitiin 30 uM curcumin analysoitiin western-blottauksella ja sykliini D1 ekspressiotasoja. Curcumin hoito estää sykliini D1 mRNA ja proteiinin ilmentymisen.

Curcumin indusoi G2-M-solusyklin pysähtymisen ennen mitoosi katastrofia

Seuraava ratkaistava, onko curcumin vaikuttaa solusyklin etenemisen ja seuraus vaikutus. Curcumin johtuvan kasvun pidätys MiaPaca-2 24 tuntia G

2M vaiheessa (Fig. 3A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Panc-1 ja Pan02 soluja (tietoja ei esitetty). Kurkumiinia tiedetään indusoivan apoptoosia erilaisissa syöpäsoluissa. Kaspaasi-3 ja 7 ovat keskeisiä efektorimolekyylien tiedetään indusoivan apoptoosia eri syöpäsolujen vahvistamalla signaalia initiaattorin kaspaasit, kuten kaspaasi 8 tai kaspaasi-10 [35], [36]. Capsase 3 ja 7 lisättiin 24 h MiaPaca-2-solujen kohdista jokin käsiteltiin curcumin viittaa apoptoosin (Fig. 3B). Western blot-analyysit MiaPaca-2 ja Pan02 solulysaateista osoitti merkittävää kasvua aktivoitu kaspaasi-3 kurkumiini käsitellyissä soluissa (Fig. 3B upotus). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kurkuma kasvaimen soluja apoptoosin. Voit selvittää, onko pidätys G2 vaiheessa tai puute eteneminen mitoosia edistää korkeampaa solujen nähdään G

2M vaiheessa arvioimme ilmaisua, ja lokalisointi sykliini B1 ja seriini /thereonine kinaasin Cdc- 2. Sykliini B1 /CDC-2 kompleksi on merkittävä rooli G

2M faasimuutoksen solusykliä. Aiheuttavan mitoosia, sykliini B1 ja CDC-2 heterodimerisoitua ja paikallistaa tumaan, joka puolestaan ​​aktivoi entsyymien, joka säätelee kromatiinin tiivistyminen, tumakalvoa erittely ja mitoosin mikrohaaroihin uudelleenjärjestely [37], [27]. Immunosytokemiallinen analyysi osoitti merkittävästi korkeammat ydinvoiman tasoja sekä sykliini B1 ja CDC-2 in curcumin käsitellyissä soluissa viittaa siihen, että curcumin käsitelty soluja käynnissä mitoosi katastrofi (Fig. 3C). Tämän lisäksi, Western blot-analyysi osoitti, voimistunutta ilmentymistä sekä sykliini B1 ja Cdc-2 kurkumiinin käsitellyissä soluissa ja fosforylaatio Chk2 kinaasin sekä MiaPaca-2-soluille ja Pan02 -tuumoriksenografti kudoksissa (Fig. 3d). Ottaen huomioon, että solut apoptoosin samalla, että ne olivat G2-M-pidätys, viittaa siihen, että kurkumiini indusoi solujen läpi mitoottisia katastrofin.

A) Cell cycle profiilit MiaPaca-2: lla käsiteltyjen solujen curcumin 12 h ja 24 h ja määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä propidiumjodidivärjäys DNA-sisältöä. Curcumin hoito lisäsi merkittävästi solujen S- ja G

2M vaiheen solusyklin 12 tunnin sisällä. (B) Curcumin hoito indusoi apoptoosia. MiaPaca-2 ja Pan02 soluja inkuboitiin 30 pM curcumin analysoitiin apoptoosi kaspaasi 3/7 aktivointi. Curcumin käsittely lisäsi solujen lukumäärä apoptoosin käsittelemättömiin kontrolleihin verrattuna (* p 0,05). (Upotus) Curcumin indusoi kaspaasi 3, apoptoosin sovittelija. Lysaatit MiaPaca-2 tai Pan02 soluja inkuboitiin 30 gM curcumin analysoitiin western-blottauksella kaspaasi 3-proteiinin. Curcumin käsitellyt solut osoittaa halkaistut (aktivoitu) kaspaasi 3, kun taas käsittelemättömät solut eivät lohkaistaan ​​kaspaasi-3. (C) Curcumin käsittely nostivat sykliini B1, CDC-2 ja fosforyloidun tarkistuspisteen kinaasi Chk2. Lysaatit curcumin käsitelty MiaPaca-2-solut (vasemmalla) ja Pan02 tuumoriksenografteissa (oikealla) analysoitiin western-blottauksella varten phospho Chk2, ja sykliini B1 ja CDC-2-proteiinin ekspressiotasot. Curcumin hoito fosforyloi tarkistuspiste kinaasien ja kohonneeseen sykliini B1 ja CDC-2 sekä MiaPaca-2-soluissa ja Pan02 tuumoriksenografteissa. (D) Curcumin käsittely johtaa ydinvoiman lokalisointi sykliini B1 ja CDC-2. Immunosolukemialliset Kurkumiinin käsitelty MiaPaca-2-soluissa sekä cyclinB1 ja CDC-2-proteiinin tasot olivat pääasiassa tumassa verrattuna kuin käsittelemättömiin soluihin. Fosforylaatiota Chk2 yhdistettynä lisääntyneeseen ilme ja tumaansiirtymiseen sykliini B1 ja CDC-2 osoittaa mitoottisiin etenemistä soluja.

Curcumin estää COX-2: n ja VEGF ilme taas indusoimiseksi CUGBP2 ja TIA-1

COX-2 on merkittävä rooli syövän synnyssä, mukaan lukien lisääntynyt invasiivisuus, angiogeneesin edistäminen ja kestävyys apoptoosin [38]. Siksi määräytyy sen ilmentymistä tuumoriksenograftien. Reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että COX-2-mRNA: n ekspressio oli merkittävästi vähäisempää curcumin käsiteltiin ksenograftien verrattuna kontrollien tuumoreiden (Fig. 4A). Tämä vahvistettiin Western blot ja immunohistokemia analyysit, joissa alhaisempi COX-2-proteiinin havaittiin curcumin-käsiteltyjen kudosten (Fig. 4B, C). Prostaglandiinit ja muut kasvaimen promoottorit tiedetään indusoivan VEGF: n ilmentymistä epiteelisoluissa, joka edistää angiogeneesiä ja siten kasvaimen kasvua [39]. VEGF-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen analysoitiin ja havaittiin myös olevan merkittävästi pienempi curcumin käsiteltiin ksenograftien verrattuna kontrollien tuumoreiden (Fig. 4A, B). Immunohistokemia osoitti myös, että kurkuma hoito vähensi VEGF: n värjäytyminen verrattuna ohjaamaan kasvaimeen (Fig. 4C). Sykliini D1 on solusyklin sääntelyn proteiini, joka säätelee G1 S-faasimuutoksen ja toimii kofaktorina useiden transkriptiotekijöiden [40]. Sykliini D1 yli-ilmentyminen on myös yhdistetty kehittymistä ja etenemistä syövän [34]. Curcumin hoito inhiboi sykliini D1 ilmentymisen tuumoriksenografteja viittaa siihen, että se estää syöpäsolujen proliferaatiota (Fig. 4A, B). Useita RNA-sitovia proteiineja on tunnistettu tunnistaa ARE-sekvenssit sisältävän ja säädellä mRNA: n stabiilisuuteen. Jäsenet CELFin (CUGBP2) ja ELAV (Hur) perhe RNA sitovien proteiinien osallisina solujen eri prosesseissa kuten mRNA, editointi, vakautta ja käännös [23], [41]. Olemme aiemmin osoittaneet, että CUGBP2 indusoituu apoptoosin alaisten solujen ja toiminnot COX-2: n mRNA käännös [28], [42]. T-solu- rajoitettu solunsisäinen antigeeni-1 (TIA-1) on myös RNA sitovaa proteiinia, joka toimii translaation vaimennin, erityisesti olosuhteissa, stressiä [43]. Täällä havaitsimme, että curcumin hoito johti merkittävään kasvuun sekä CUGBP2 ja TIA-1-mRNA ja proteiini ilmaisun tuumoriksenografteja (Fig. 4A, B, D). Toisaalta, ei ollut merkittävää muutosta havaittu sekä Hur mRNA: ta ja proteiinia tasot vastauksena kurkumiini (Fig. 3A, B, D).

(A) Kokonais-RNA Pan02 ksenograftien alistettiin Reaaliaikainen PCR. Curcumin hoito johti vähensi COX-2, VEGF ja sykliini D1-mRNA-tasot verrattuna kontrolleihin. Toisaalta, CUGBP2 ja TIA-1-mRNA: n ekspressio lisääntyi (* p 0,05). Data on keskiarvo ksenografteina 5 hiirtä. (B) Western blot-analyysi osoitti, että kudos lysaatit curcumin hoidettujen eläinten on huomattavasti vähemmän COX-2, VEGF, ja sykliini D1 proteiineja, mutta kohonnut CUGBP2 ja TIA-1-proteiinit. (C) immunohistokemia osoittaa, että kurkuma hoito vähensi merkittävästi ekspressiota COX-2: n ja VEGF. (D) immunohistokemia osoittaa lisääntyneen ekspression CUGBP2 ja TIA-1 tuumoriksenografteja.

Curcumin estää COX-2: n ja VEGF mRNA käännös haimasyöpäsoluissa

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet kohonnut COX-2: n mRNA ja proteiinin ilmentyminen haiman adenokarsinoomat [38]. Siksi me seuraavaksi määritellään vaikutuksia curcumin hoito COX-2: n ilmentymisen. Curcumin hoito lisäsi merkittävästi COX-2-mRNA-tasoja in MiaPaca-2-solut (Fig. 5A). Kuitenkin, oli merkittävä väheneminen COX-2-proteiinin tasot (kuvio. 5B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Pan02 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös päättäneet vaikutus kurkumiinista VEGF-geenin ilmentymistä soluissa. Curcumin hoito lisäsi merkittävästi VEGF-mRNA: ta, samalla kun estetään proteiinin tasot MiaPaca-2-solut (Fig. 5A, B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Pan02 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, kurkumiini lisääntyi merkittävästi sekä CUGBP2 ja TIA-1-mRNA: n ja proteiinin ekspression (Fig. 5A, B). Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta havaittu Hur ilmentymisen (Fig. 5A, B). Aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että CUGBP2 sitoutuu COX-2: n 3’UTR estää sen translaation [28]. Ottaen huomioon, että COX-2-mRNA-tasot ovat korkeammat, mutta proteiinin tasot ovat alhaisemmat vasteena curcumin hoitoon, päätimme onko curcumin lisää sitoutumista CUGBP2 COX-2: n mRNA. Immunosaostus kytketty RT-PCR osoitti, että oli korkeampi CUGBP2 sitoutumista COX-2: n ja VEGF-mRNA: n verrattuna kontrolliin, käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 5C). Lisäksi aktinomysiini D kokeet osoittivat, että kurkuma-hoito johti huomattavasti korkeampi COX-2-mRNA: n stabiilisuuteen, puoliintumisaika kasvaa 30 min käsittelemättömien solujen ~8 h (Fig. 5D). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin VEGF; puoliintumisaika VEGF mRNA myös kasvoi 30 min 8 tuntia curcumin käsitellyissä soluissa (Kuva. 5D).

(A) mRNA: n ilmentymisen. MiaPaca-2-soluja käsiteltiin curcumin 2 tuntia. Curcumin käsittely lisäsi tasot COX-2, VEGF, CUGBP2 ja TIA-1-mRNA: n. Ei ollut merkittävää muutosta Hurin mRNA: n ilmentymisen (* p 0,05). Tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Western blot-analyysit osoittavat, että lysaatit kanssa curcumin käsitelty MiaPaca-2-solut ovat alempia COX-2: n ja VEGF-proteiinien ja yltyviin CUGBP2 ja TIA-1. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. (C) (vasen paneeli), lisääntynyt sitoutuminen CUGBP2 sitoutumista COX-2 tai VEGF mRNA seuraavat curcumin hoitoa. Kokosolu-uute (T) välillä curcumin-käsitellyt solut immunosaostettiin anti-CUGBP2-vasta-aineen, ja RNA: n immunosaostumien (P) ja supernatantti (S) eristettiin ja altistettiin RT-PCR COX-2: n ja VEGF-mRNA: n. Data, lisäsi COX-2 tai VEGF mRNA: n pelletti curcumin käsiteltyjä soluja. (Oikea paneeli) Tiedot kvantitoitiin ja siellä oli selvä nousu COX-2: n ja VEGF mRNA pellettiin curcumin käsiteltyjen solujen. (D) MiaPaca-2-soluja käsiteltiin curcumin 2 h ja vakautta COX-2: n ja VEGF-mRNA: n määritettiin seuraavan lisäämällä aktinomysiini D (lopullinen konsentraatio: 10 ug /ml). Curcumin lisää puoliintumisaikaa COX-2: n mRNA 30 min 8 h. Vastaavasti, kurkumiini lisääntynyt puoliintumisaika VEGF mRNA: n 30 min 8 h. Data osoittaa, kurkumiinin hoito lisäsi merkittävästi vakautta COX-2 tai VEGF-mRNA: n.

Curcumin välittämän COX-2: n ja VEGF-mRNA: n vakaus edellyttää CUGBP2

Olemme aiemmin osoittaneet, että CUGBP2 sitoutumista COX -2 3’UTR lisää vakautta COX-2: n mRNA, ja estämällä sen käännös [28]. Siksi määritti CUGBP2 pudotus on curcumin-välitteisen käännös tukahduttaminen COX-2: n ja VEGF-mRNA: n. Real Time PCR mittaukset osoittivat, että kurkuma-hoito johti huomattavasti korkeampi COX-2: n ja VEGF-mRNA: n, joka laskettiin kontrollien tasoihin, kun CUGBP2 ilmentyminen oli pudotus (Fig. 6A). Me seuraavaksi määrittää, onko mitään vaikutusta proteiinin ilmentymiseen. Curcumin hoito vähensi tasot sekä COX-2: n ja VEGF-proteiinia. Kuitenkin, kun CUGBP2 pudotettiin tietyn siRNA, COX-2: n ja VEGF-proteiinien tasot eivät vaikuttaneet curcumin hoito (Fig. 6B). Olemme myös päättäneet, onko curcumin välittämä vaikutus COX-2: n ja VEGF mRNA: n stabiilisuuteen vaikuttavat CUGBP2 knockdown. Vaikka curcumin käsittely lisäsi vakautta COX-2: n ja VEGF-mRNA oli pienempi vaikutus kun CUGBP2 myös pudotettiin käyttämällä erityisiä siRNA. Puoliintumisaika COX-2: n mRNA nostettiin 30 min ~8 h seuraavat curcumin hoidon, joka laskettiin ~ 2 h, kun CUGBP2 ilmentyminen estyi (Fig. 6C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin VEGF jossa knockdovvn CUGBP2 vähensi curcumin-välitteisen vakautta 8 h 1 h (Fig. 6C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että curcumin välittämä lisäys COX-2: n ja VEGF-mRNA: n vakautta tapahtuu osittain läpi CUGBP2.

(A) CUGBP2 on tarpeen curcumin-indusoidun COX-2: n ja VEGF-mRNA: n tasoja.