Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen ribonukleotidireduktaasia alayksikön M2 (RRM2), mukana deoksiribonukleotidi- synteesiin, ajaa chemoresistance haimasyövän nukleosidi- analogit (esim gemsitabiini). Vaikka hiljentäminen RRM2 synteettisesti on osoittanut lupaus vähentää chemoresistance, kohdistaminen endogeenisia molekyylejä, erityisesti MikroRNA (miRNA), edistää kemoterapia-tuloksia on huonosti tutkittu. Perustuen laskennallinen ennusteita, me arveltu, että

let-7

tuumorisuppressoriproteiinia miRNA estävät RRM2 välittämää gemsitabiini chemoresistance haimasyövän. Alennettu ilmentyminen useimmissa

let-7

miRNA kanssa käänteinen suhde RRM2 ilmentymisen todettiin synnynnäisesti gemsitabiinin kestävä haimasyövän solulinjoissa. Suora sitoutuminen

let-7

miRNA 3′- UTR RRM2 transkriptien tunnistettu transkription jälkeisen sääntelyn RRM2 vaikuttavista gemsitabiinin kemosensitiivisyys. Kiehtovan, yli-ilmentyminen ihmisen precursor-

let-7

miRNA johti differentiaaligeometriaan RRM2 ilmaisun ja kemosensitiivisyys vasteita huonosti eriytetty haimasyöpä solulinja, MIA PaCa-2. Viallinen käsittely

let-7a

esiasteita kypsät muodot, osittain selittää havaittujen erojen kanssa

let-7a

ilmaisulliset tuloksia. Johdonmukaisesti, suhteet kypsä otsonia muodostavien

let-7a

oli alennetaan asteittain gemsitabiinin herkkien L3.6pl ja Capan-1 solulinjat indusoidaan hankkia gemsitabiinia vastarintaa. Sen lisäksi tunnettu sääntelyviranomaisten

let-7

biogeneesin (esim LIN-28), lyhyt hiusneula-RNA-kirjaston seulonta tunnistettu useita uusia RNA sitovia proteiineja, kuten SET onkoproteiinia, differentiaalisesti vaikuttaa

let-7

biogeneesissä ja kemosensi- gemsitabiinin herkkien versus kestävä haiman syöpäsoluja. Edelleen, LIN-28 ja SET pudotus soluissa johti syvällinen vähennykset solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kapasiteettia. Lopuksi, puutteellinen käsittely

let-7a

esiasteita positiivinen korrelaatio RRM2 yli-ilmentymisen todettiin potilaasta peräisin haiman adenokarsinooma (PDAC) kudoksiin. Nämä tiedot osoittavat monimutkainen transkription jälkeisen sääntelyn RRM2 ja kemosensitiivisyys mukaan

let-7a

ja että manipulointi sääntelyyn liittyvien proteiinien

let-7a

transkriptio /käsittely saattaa tarjota mekanismin parantamiseksi kemoterapeuttisten ja /tai kasvaimen kasvun säätelyssä vasteita haimasyövän.

Citation: Bhutia YD, Hung SW, Krentz M, Patel D, Lovin D, Manoharan R, et ai. (2013) Differential käsittely

let-7

esiasteet Vaikutteet RRM2 Expression ja Kemosensitiivisyys in Haimasyöpä: Role of LIN-28 ja SET onkoproteiini. PLoS ONE 8 (1): e53436. doi: 10,1371 /journal.pone.0053436

Editor: Guillermo Velasco, Complutense University, Espanja

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 28 marraskuu 2012; Julkaistu: 15 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Bhutia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI-5-P50-CA128613-SPORE (RG), NCI-1R03CA161832-01 (RG), Georgia Cancer Coalition-Georgia Research Alliance (RG), ja Department of Pharmaceutical ja Biomedical Sciences, University of Georgia , Athens, GA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ribonukleotidireduktaasin (RR) on nopeutta rajoittava entsyymi solun replikaation, joka katalysoi ribonukleotidien pelkistystä deoksiribonukleotideiksi DNA-synteesin aikana. Se on yli-ilmentynyt useissa kiinteiden kasvainten, mukaan lukien haiman [1]. Kertyvät todisteet osoittavat, että RR toimii positiivisena määräävä kasvainsoluproliferaation ja etäpesäkkeiden sekä kehittämään chemoresistance nukleosidi- analogeja käytetään hoitoon haimasyöpä (esim gemsitabiinin, kapesitabiinin, 5-fluorourasiili) [2] – [6]. RR-aktiivisuutta säätelee aikana S-vaiheen solusyklin ensisijaisesti transkription aktivoituminen yksi sen ei-identtiset alayksiköt, nimeltään RRM2 [7], [8]. RRM2 ilmentymisen on osoitettu indusoituvan solunsalpaajaresistentti soluissa geenin monistamisen, transkription aktivaation, ja ehkä muiden tuntemattomien mekanismien [5], [9]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että eksogeeninen manipulointia RRM2 ilmentymisen siRNA tai antisense-oligonukleotidien parantaa kemosensi- haimasyövän [10], [11].

Vaikka downmodulation of RRM2 synteettisesti (esim siRNA) on osoittanut potentiaalia vähentämällä kasvaimen kasvua ja gemsitabiinin chemoresistance, mahdollisuudet manipuloida endogeenisen molekyylien parantamiseksi gemsitabiinin vastauksia ja ehkä parantaa hoitotulosten haimasyövän ei ole koskaan tutkittu. MikroRNA (miRNA), endogeenisesti ilmennetty ~22-nt pitkä RNA: iden, jotka kykenevät transkription jälkeen hiljentäminen kohdegeenin ilmaisuja, tarjoavat useita etuja tässä suhteessa. Esimerkiksi suuri määrä miRNA ihmisen genomin ja niiden erilaiset tavoitteet [12] mahdollistavat valinnan miRNA (t) paitsi parantaa Chemosensiti- vaan myös suotuisasti vaikuttaa monet geeni säätelyverkkojen mukana näkökohtia, kuten kasvaimen kasvua, invaasio, syöpä kantasolujen selviytymistä, jne [13], [14]. Edelleen, koska miRNA usein vaimentua syövät [15], [16], reestablishing niiden ilme on omiaan helpottamaan synergistinen kasvua ohjaus vasteet kemoterapeuttisten aineiden. Lisäksi laajentamalla ymmärrystä miRNA geenisäätelystä tarjoaa mahdollisuuksia manipuloimalla ilmaisu pienten molekyylien kanssa ilman monimutkaisia ​​synteettistä oligonukleotidiä toimituksen kasvaimiin.

Etsiessään otaksuttu miRNA estäjiä RRM2 laskennallisilla miRNA tavoite Ennustusalgoritmien löysimme

let-7

perheen tuumorisuppressorin miRNA hallussaan siemen ottelu -emäspariutumisen 3 ’UTR: RRM2 (konteksti pisteet prosenttipiste: 94; TargetScanHuman 5.1). Johdonmukaisesti, aikaisemmat tutkimukset ovat sekaantuneet kausaalista suhdetta

let-7

ja RRM2 tunnistaminen downregulation monien

let-7

perheenjäsenten RRM2 yliekspressoivia, gemsitabiini kestävä haimasyövän soluja tai väheneminen RRM2 ilmaisun jälkeen

let-7

yliekspressio [17], [18]. Edelleen, yliekspressio

let-7

todettiin lisäävän säteilylle herkäksi haiman kasvainsolujen [19], kun taas inhibitiota RRM2 tunnistettiin herkistää haiman kasvaimia ultraviolent säteilyn [20], [21]. Äskettäin pakko ilmaus

let-7

miRNA osoitettiin estävän haimasyövän soluproliferaatiota

in vitro

muttei kasvaimen kasvua

in vivo

jotka viittaavat monimutkaisia ​​toiminnallisia seurauksia [22]. Siksi tutkia mahdollisia vuorovaikutus

let-7

ja RRM2 ja tutkimaan edelleen mahdollisuus hyödyntää

let-7

haimasyövän terapeuttisten, pyrimme määrittämään suora vaikutus ihmisen

let-7

perheen RRM2 välittämän luontainen gemsitabiini vastus. Kirjoittajat raportoivat monimutkaisen sääntelyn RRM2 ilmaisun ja gemsitabiinin Chemosensiti- mukaan

antaa

-7

esiasteiden ja tunnistaa, että miRNA transkription /koneet mukana kypsä

let-7a

biogeneesissä todennäköisesti toimia ratkaisevana tekijänä pohdittaessa

antaa

-7 terapeuttisten haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvaimen RNA ja kudokset

Yhteensä RNA 10 PDAC kudoksista ja 2 normaalia haiman kudoksista hankitusta Asterand (Detroit, MI). Väestörakenteen ja kliiniset tiedot RNA näytteitä näkyvät

Taulukko S1

. Kuusi PDAC kudosnäytteitä yhdessä vastaaviin normaaleihin viereisiin kudoksiin hankittiin National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA) [23]. NDRI hankkii kirjalliset hyväksynnät lähteistä. Hankinnassa ja käyttää näitä ihmisen kudosten tähän tutkimukseen tehtiin mukaisesti University of Georgia Institutional Review Board. Hallitus on todennut, että käyttö ihmisen biologisten kudosten tässä tutkimuksessa ei täytä tutkimuksen ihmiseen kohdistuvan per 45 CFR 46,102, ja siksi ei vaadi ihmiselle, jonka johtokunta hyväksyy.

reagenssit

Gemsitabiini saatiin ChemieTek (Indianapolis, IN). Naudan sikiön seerumia (FBS) oli peräisin PAA Laboratories, Inc. (Ontario, Kanada). 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli (DAPI), dimetyylisulfoksidi (DMSO), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), propidiumjodidia, etyleeniglykoli-bis (2-aminoetyylieetteri) tetraetikkahappoa (EGTA), fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF), N-etyyli-maleimidin (NEM), natriumortovanadaattia (Na

2VO

4), ja jodiasetamidia saatiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Bikinkoniini- happo (BCA) proteiini reagenssilla ja West Pico kemiluminesenssiin substraatti oli Pierce Chemical (Rockford, IL). Loisteputki anti-fade asennus reagenssia ja Vybrant DyeCycle vihreä saatiin Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasticware soluviljelyyn saatiin Corning (Corning, NY). Kaikki soluviljelyalustoja ostettiin Mediatech (Manassas, VA) lukuun ottamatta ihmisen keratinosyyttien ruselatusaineeseen joka hankittiin Molecular Probes.

Vasta

anti-humaani vuohen polyklonaalinen RRM1 (T- 16), RRM2 (E-16), dCK (L-19), hCNT3 (C-15), ja SET /I2PP2A (E-15) vasta-aineita, samoin kuin hiiren monoklonaalinen hnRNP-A1 (4B10) vasta-aine, saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Yksityiskohtia hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2, ja β-aktiini-vasta-aineita on kuvattu aiemmin [23], [24]. Anti-humaani-kanin polyklonaalista CDA (ab56053) ja anti-humaani hiiren monoklonaalinen KHSRP vasta-aineet on saatu Abcam (Cambridge, MA). Anti-humaani-kanin polyklonaalista LIN-28-vasta-aine saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

konstruktit

RRM2 cDNA ilman 3 ’UTR alue konstruoitiin RRM2 truclone (RRM2 (NM_001165931) Ihmisen cDNA-kloonin, Product ID: SC326997; Origene, MD) käyttäen PCR-pohjaisia ​​menetelmiä. PmiRGLO-G-FUD konstrukti oli alun perin saatu Promega (Madison, WI), ja jota on modifioitu sisältämään GFP fuusioitiin tulikärpäsen lusiferaasi-geeni, jolloin se dual reportterimääritys. Promoottori oli irrotettu ja vaihdettiin CMV-promoottori. Reportterina käsittelyä, rakenteet, jotka sisälsivät -50 emäsparia ylävirtaan ja alavirtaan

let-7a-1

(pmirGLO-GFP /luc-esi-

let-7a-1

) ja

let-7b

(pmiR-GLO-GFP /luc-esi-

let-7b

) MikroRNA tehtiin ja kloonattiin alavirtaan GFP-Luc 3 ’UTR. Oikein käsitelty, lohkaisu mikroRNA destabilizes GFP /Luc-mRNA mikä vähentää sekä proteiineja.

Cell Culture, Immunosytokemia, MTT sytotoksisuutta, virtaussytometria, Colony Formation, ja reaaliaikainen PCR määritykset

Nämä menettelyt suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. TaqMan alukkeita ja koettimia RRM2 (Hs00357251_g1) saatiin Applied Biosystems (Foster City, CA).

miRNA Detection

Yhteensä RNA: n eristys ja cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen

mir

Vana miRNA eristäminen Kit ja TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), vastaavasti, kohti valmistajan ohjeiden. Suhteellinen kvantitointi RNA-transkriptien suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. Validoidut TaqMan alukkeita ja koettimia

let-7a

(hsa000377),

let-7b

(hsa002619),

let-7c

(hsa000379),

kirjaimien 7d

(hsa002283),

let-7e

(hsa002406),

let-7f

(hsa000382),

let-7g

(hsa002282),

let-7i

(hsa002221), yksi-

let-7a-1

(Hs03302533_pri), yksi-

let-7a-2

(Hs03302539_pri), ja yksityisen

let-7a-3

(Hs03302546_pri) hankkia Applied Biosystems käytettiin.

Generation of Gemsitabiini-resistenttien Haiman tuumorisoluissa

Solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia (5-20 nM) gemsitabiinin 5-6 viikon pitoisuutta kohden.

Western-blottaus

Western blotting -analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [24] lukuun ottamatta seuraavia muutoksia. Kokosoluliuotteista valmistettiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM natriumfluoridi, 10 mM NEM, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM jodiasetamidi, 0,5% Triton-X 100, ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Mannheim, Saksa). PH lyysipuskuria pidettiin 7,4. Arvioituaan proteiinipitoisuus kanssa BCA Protein Assay Kit, 50 ug /kaista ladattiin ja elektroforeettisesti erotettiin 10% polyakryyliamidia natriumdodekyylisulfaatti (SDS-PAGE) geelit ja siirretään 150 V 1 h tai 20 V yön aikana polyvinylideeni fluoria ( PVDF) (Millipore, Billerica, MA). Vasta-aineita metaboloivia entsyymejä (RRM1, RRM2, dCK, CDA) ja nukleosidin kuljettajat (hCNT1, hCNT3, ENT1, ENT2) [24] käytettiin 1:500-1000 laimennoksia. Densitometristä analyysit tehtiin edellä kuvatulla tavalla [23].

Generation of MIA PaCa-2 Stable yli-ilmentäviä soluja Pre-

let-7

Members

FIV-let-7 konstruktioita (

let-7a-2

,

let-7a-3

,

let-7b

,

let-7c

,

kirjaimien 7e

,

let-7 f-1

,

let-7 f-2

,

let-7g

, ja

let-7i

) alkaen GeneCopoeia (Rockville, MD) ja HIV-anna-7 konstruktioita (let-7a-1 ja anna-7d) System Biosciences (Mountain View, CA) käytettiin. Lentiviruksen pakkaus solut (293Ta; GeneCopoeia) ympättiin tiheydellä 1,3-1,5 x 10

6 10 cm: n maljoille, jotka sisälsivät 10 ml DMEM: ää, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua FBS: ää. Solujen annettiin saavuttaa 70-80% konfluenssiin aikaan transfektoimalla edellä mainittu konstrukteja. Virusinfektiot tehtiin kohti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 2,5 ug ilmaisun DNA-kloonin ja 5 ui (0,5 ug /ul) Lenti-Pac FIV /HIV sekoitus laimennettiin 200 ui Opti-MEM (Invitrogen). Erillisessä putkessa, 15 ui EndoFectin Lenti myös laimennettiin 200 ui: aan Opti-MEM. Laimennettu EndoFectin Lenti reagenssia lisättiin sitten tipoittain DNA-liuos ja sekoitettiin Vortex: illa. Sitten seosta inkuboitiin 10-25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta DNA-Endofectin kompleksin muodostamiseksi. DNA-Endofectin Lenti kompleksi lisättiin suoraan kuhunkin maljaan ja 293Ta soluja. Maljoja pyöritettiin varovasti jakaa monimutkainen ja sitten niitä inkuboitiin yön yli CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Solut korvattiin tuoreella DMEM-väliaineella 24 tunnin kuluttua, ja lentivirukset kerättiin ja suodatettiin 24-48 h transfektion jälkeen. Sillä transduktio pakattujen lentiviruksen kloonien, MIA PaCa-2-soluja ympättiin 10 cm: n maljoille 24 tuntia ennen virusinfektio. Ne infektoidaan seuraavaksi 3 ml viruksen suspensio liuokseen, jossa on 8 ug /ml polybreeniä. Sitten soluja inkuboitiin yön yli CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa, jonka jälkeen ne on täydennetty tuoretta väliainetta. Jälkeen 24 tunnin kasvun aikana, viljelmät infektoitiin Zeocin vastustuskykyisiä geenejä (pMIF-eGFP-Zeo) valittiin 400 ug /ml Zeocinia (Invitrogen), ja tartunnan saaneiden puromysiiniresistenttiä geenejä (pEZX-MR04) valittiin 10 ug /ml puromysiiniä.

shRNA-pohjainen seulonta Otaksuttavat RNA Processing proteiinit

96 shRNA rakentaa Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Huntsville, AL) saatiin Genome Sciences Resource Vanderbilt Yliopisto. Lentiviruksen pakkaus-solulinja (Phoenix) ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 6 cm: n maljoille, jotka sisälsivät 5 ml DMEM: ää, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua FBS: ää. Soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin aikaan transfektoimalla shRNA konstruktioita. Virusinfektiot tehtiin kohti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 1 ug ilmaisun DNA-klooni, 0,75 ug pakkauksen vektorin (pCMV~DR7.74psPAX2) ja 0,3 ug kirjekuoren vektorin (pMD2.G) sekoitettiin ja lisättiin putkeen, joka sisälsi 200 ui Opti-MEM ( Invitrogen) ja 6 ui Fugene 6 (Roche). Seosta inkuboitiin sitten 25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se lisättiin suoraan kuhunkin maljaan Phoenix soluja. Maljoja pyöritettiin varovasti jakaa monimutkainen ja sitten niitä inkuboitiin yön yli CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Solut korvattiin tuoreella DMEM-väliaineella 24 tunnin kuluttua, ja lentivirukset kerättiin ja suodatettiin 24-48 h transfektion jälkeen. Sillä transduktio pakattujen lentiviruksen kloonien, MIA PaCa-2 ja L3.6pl solut ympättiin 6-kuoppaisille klustereita 24 h ennen virusinfektio. Ne infektoidaan seuraavaksi 1 ml: lla virus-suspension liuoksessa 4 ug /ml polybreeniä. Sitten soluja inkuboitiin yön yli CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa, jonka jälkeen ne on täydennetty tuoretta väliainetta. Sen jälkeen, kun 24 tunnin kasvun jälkeen solut valittiin 0,5 ja 0,1 ug /ml puromysiiniä MIA PaCa-2, ja L3.6pl, vastaavasti. Usean pysyvän seulottiin mikroskoopilla GFP -parin.

Target

In vitro

Reporter Assay

lusiferaasi-sitoutumismääritykset, 293Ta solut ympättiin 24-kuoppaiselle klusteri ( 5 x 10

3 solua /kuoppa) ja transdusoidaan erilaisia ​​let-7 esiasteita käyttäen lentiviruksen geeninsiirtomenetelmällä (aiemmin kuvatulla tavalla). Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen, solut täydennetään tuoreella väliaineella ja transfektoitiin 1 ug: lla ohjauksen tai RRM2 3 ’UTR kohdevektorissa (ID: HmiT053958, GeneCopoeia), 100 ui Opti-MEM (Invitrogen) ja 3 ui FuGeneHD transfektion reagenssia (Roche) kohti valmistajan protokollaa. Kolmekymmentäkuusi h transfektion jälkeen solut hajotettiin passiivinen lyysimenettely ja käsitellään, kuten on kuvattu Dual-Luciferase Assay Kit (Promega). Solulysaatit sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 30 s, ja Lusiferaasimääritys suoritettiin kirkas supernatantti siirrettiin musta 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Kaksikymmentä ui solu- lysaattia sekoitettiin 100 ui LARII liuosta aloittamaan reaktio, ja 100 ui Stop and Glo-reagenssia käytettiin samanaikaisesti sammuttaa lusiferaasi ja aloittaa Renilla reaktion. Lusiferaasi ja renilla luminesenssi kvantitoitiin 100 nm: ssä, ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD.

Tilastollinen analyysi

Studentin t-testiä käytettiin tunnistamaan merkittäviä eroja, ja jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa. Ellei toisin mainita,

p

0,05,

p

0,01 ja

p

0,001 verrattuna ohjaus olosuhteet edustaa yksi, kaksi ja kolme tähdellä, vastaavasti.

tulokset

RRM2 ja

let-7

ovat Kääntäen ilmaistuna ihmisen haimasyöpäsoluissa

varmennettiin ensin RRM2 ilmentymistä haimasyövän solulinjoja, jotka luokiteltiin aiemmin kuin luonnostaan ​​gemsitabiini herkkiä tai kestävä [23]. qRT-PCR (

Fig. 1A

) ja Western blotting (

Fig. 1B

) analyysit osoittivat merkittävästi korkeampia RRM2 mRNA (2-3-kertaisesti) ja proteiini (5-6-kertainen) ilmaisuja, vastaavasti, 2 ulos 3 gemsitabiinin vastustuskykyisten solulinjojen tutkittu (MIA PaCa-2 ja PANC-1) arvioituna vertailuja normaalin ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) solulinjassa. Sitä vastoin verrattavissa RRM2 ilmaisuja tunnistettiin välillä eniten gemsitabiini-herkkiä solulinjoja (L3.6pl ja Capan-1) ja HDPE (

Fig. 1A-B

). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen RRM2 on todennäköisesti tärkeä rooli gemsitabiinin chemoresistance useimmissa haimasyövän solulinjoissa, jos ei kaikkia.

A,

RRM2 mRNA: n ekspression haimasyövän solulinjat suhteessa ilmaisun tunnistettu HDPE.

Sarakkeet,

keskiarvoa kolmesta;

baareja,

SD. n = 3.

B,

Western blotting-analyysi RRM2 (~45 kDa) ja β-aktiini (45 kDa) on kokosolulysaateista HDPE ja haimasyövän solulinjoissa.

C,

Expression of

kirjeet 7

perheenjäsenten haimasyövän solulinjoissa suhteessa ilmaisun HDPE.

Sarakkeet

, keskiarvoa kolmesta;

baareja

, SD. n = 3; *

P

0,05.

D,

RRM2 on välittömänä kohteena

let-7

. 293TA ja MIA PaCa-2-solut virusinfektoitua ilmentämiseen esiasteiden

let-7a-1

,

let-7a-2

,

let-7a-3

let-7b

, ja miR-214 (

negatiivinen kontrolli

) ja myöhemmin transfektoida RRM2 3 ’UTR lusiferaasireportterilla konstruktio. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 36 h transfektion jälkeen (normalisoitu suhteessa renilla aktiivisuutta) piirrettiin.

Sarakkeet

, keskiarvoa kolmesta;

baareja

, SD. n = 3. *

p

0,05, **

p

0,01.

arvioimiseksi

let-7

valvonta RRM2 ilmaisun, me myöhemmin profiloitu edellä mainittuja solulinjoja suhteellisen ilmentymisen kaikista

let-7

perheenjäsenten qRT-PCR. Mielenkiintoista on, että huomattavasti pienempi ilmauksia useimmat

let-7

miRNA havaittiin vain solulinjoissa suhteellisesti suuremman RRM2 ilmaisua. MIA PaCa-2 näytteillä vähensi ilmaus

let-7a

,

let-7b

,

let-7c

,

let-7e

,

anna-7f

, ja

let-7 g

, PANC-1 näytteillä vähensi ilmaus

let-7b

,

let-7c

,

let -7d

,

let-7 g

,

let-7h

, ja

let-7i

ja BxPC-3 näytteillä vähensi ilmaus

kirjaimien 7b

,

let-7c

,

let-7d

,

let-7f

, ja

let-7i

(

Kuva . 1C

). Ei mitään vain muutaman

antaa

-7 jäsenet olivat vähensi ilmaisuja jäljellä solulinjoja, jotka ilmaisivat vastaavia tasoja RRM2 proteiinin HDPE (eli L3.6pl: none; AsPC-1:

let -7c

, Capan-1:

let-7c

,

let-7f

) (

Fig. 1 C

). Nämä tulokset tukevat käänteinen suhde RRM2 ja

let-7

ilmentymistä haiman syöpäsoluja.

testataan suoraa vuorovaikutusta

let-7

kanssa RRM2 transfektoimalla lusiferaasi-ekspressiokonstruktin fuusioituna 3 ’UTR: RRM2 osaksi 293Ta (ATCC-CRL-9078) [23] ja MIA PaCa-2 lyhytaikaisesti yli-ilmentävät

let-7

jäsentä. Vaikka kaikki

let-7

jäsentä merkittävästi vähentynyt lusiferaasin ilmentymistä 239Ta soluissa, monet

kirjeet

7 jäsentä toi huomattava lasku lusiferaasiekspressio in MIA PaCa-2-soluja sekä (

kuva 1D

), mikä viittaa siihen, että suora sitoutuminen

let-7

että RRM2 3 ’UTR aiheuttaa RRM2 tukahduttaminen. Lopuksi, koska

let-7

yli-ilmentyminen lisää G2 /M osa fibroblastien [25] ja RRM2 ilmentyminen on spesifinen S-vaiheessa olevien solujen, arvioimme rooli

let-7

in vähentäminen RRM2 ilmentymistä vähentämällä osuutta MIA PaCa-2 S-vaiheessa. Näissä olosuhteissa ei ole kuitenkaan merkittävä alenemista S-vaiheessa olevien solujen havaittiin jonkin edeltävän

let-7

yliekspressoivia MIA PaCa-2 (

Kuva. S1

). Yhdessä nämä tiedot todennäköisesti viittaavat siihen, että

let-7

jäsenet voivat endogeenisesti estää RRM2 ilmentymistä suoralla transkription jälkeisen sorron MIA PaCa-2.

Human

let-7

esiasteet Differentially Muokkaa RRM2 Expression ja Gemsitabiini Chemosensiti- in MIA PaCa-2

vieressä yritetty tuottaa stabiileja klooneja MIA PaCa-2, joka yli-ilmentää yhtä kymmenestä ihmisen

let-7

esiasteita [27 ] tutkia niiden vaikutukset RRM2 proteiinia ja kemosensitiivisyys. Valitsimme MIA PaCa-2 solulinjan näiden tutkimusten koska se on alhainen herkkyys gemsitabiinin, erityisesti subkonfluenteista olosuhteissa, mutta ilmaisee korkeita RRM2 (

Fig. 1B

) [23]. Lisäksi MIA PaCa-2 edustaa huonosti erilaistunut haimasyöpä solumallin [23] ja

let-7

näyttelee kriittistä roolia solujen erilaistumiseen. MIA PaCa-2, jotka ilmentävät stabiilisti ennen

let-7a-1

, ennen

let-7a-

2, pre-

let-7a-3

, pre-

let-7b

, esi-

let-7d

, esi-

let-7e

, esi-

let-7f-1,

pre-

let-7 f-2

, sekä esi-

let-7i

luotiin onnistuneesti lentiviraalinen geeninsiirto; kuitenkin, toistuvista yrityksistä vakaasti transduce ennalta

let-7c

sekä esi-

let-7 g

epäonnistui puutteen takia elossa pesäkkeitä. Mielenkiintoista, Western blotting-analyysi osoitti merkittäviä vähennyksiä RRM2 proteiinin ilmentymisen ainoastaan ​​MIA PaCa-2, jotka ilmentävät stabiilisti pre

-Anna-7a-3

, pre

-Anna-7e

, pre

-Anna-7f-1

, ja pre

-Anna-7i

mutta vain minimaalisesti in MIA PaCa-2 solut, jotka ilmentävät pre

-Anna-7b

, pre

-Anna -7d

, ja pre

-Anna-7-f-2

solut (

Fig. 2A

). Yllättäen taso RRM2 proteiinin kasvoi MIA PaCa-2 ilmentävät ennen

let-7a-1

(

Fig. 2A

). Immunosytokemi- analyysi näistä stabiileja klooneja RRM2 ilmaisun [26] vahvistivat nämä tulokset (

Fig. 2B

). Nämä tiedot tunnistaa että RRM2 ilmaisullisella tuloksia merkittävästi eroavat yli-ilmentyminen tietyn ennalta

let-7

alatyyppien haiman syöpäsoluja.

, Western blotting-analyysi RRM2 (~45 kDa) ja β-aktiini (45 kDa) on kokosolulysaateista MIA PaCa-2 yli-ilmentävät esiasteiden

let-7

perheenjäseniä. Suhteita, RRM2 ß-aktiini kaistaintensiteettejä (normalisoitu ohjata) kolmen kokeen osoitetaan (

Top). Tähdet osoittavat merkittäviä vähennyksiä (

p

0,05) RRM2 tasoilla kuin verrokkiryhmän.

B

, immunosytokemi- havaitseminen RRM2 eksponentiaalisesti kasvavissa MIA PaCa-2 yliekspressoivia ennen

let-7

perheenjäseniä. Alkuperäinen suurennos, x20.

C

, MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät ennalta

let-7

perheenjäsenet (

punainen

) tai pelkästään vektorilla (

sininen

) olivat gemsitabiini- (0,1 nM 100 uM), ja prosenttia, solun proliferaation inhibitio mitattiin käyttämällä MTT-määritystä.

Pisteitä

, keskiarvoa kolmesta;

baareja

, SE. n = 3. Gemsitabiini IC

50 arvioita merkitty (

sulkeissa

).

Koska useimmat

let-7

jäsentä [27] vaikutti negatiivisesti vaikuttaa RRM2 ilme, me tutki tarkemmin sitä ennen

let-7

voisi lisätä kemosensitiivisyys of MIA PaCa-2 gemsitabiinia. Mielenkiintoista, merkittäviä vähennyksiä gemsitabiinin sytotoksinen IC

50 arvioita tunnistettiin lähes kaikissa pre

let-7

ilmentävä MIA PaCa-2 stabiilien kloonien tuottamista ainoana poikkeuksena ennalta

kirjaimien 7 a-1

joiden käyttöönotto ei tuonut eroja (

Fig. 2C

). Sen testaamiseksi, onko

let-7

-välitteisen kasvu gemsitabiinin sytotoksisuuden helpotettiin RRM2 tukahduttaminen, me yli-ilmentynyt RRM2 cDNA kanssa tai ilman 3 ’UTR alueet osaksi MIA PaCa-2 ilmentävät ennen

let-7a-3

. Tuloksemme tunnistettu alempi gemsitabiini sytotoksisuus IC

50 soluissa, jotka ilmentävät RRM2 kanssa 3 ’UTR (69,34 ± 3,4 nM) verrattuna ilman 3’ UTR (383,4 ± 20,3 nM). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen RRM2 proteiinin seurauksena ennalta

let-7a-3

yliekspressio helpotti posttranskriptionaalisella tukahduttaminen RRM2, vaikka RRM2 riippumattomat mekanismit ovat todennäköisesti pelata hallitseva rooleja muissa pre-

let-7

-overexpressing soluja (esim pre

let-7 f-2

).

Viallinen käsittely esi-

let-7a- 1

in MIA PaCa-2

Vaikka käytimme ennen

let-7

jäsentä synnyttämiseksi kaikille vakaat MIA PaCa-2 klooneja, toiminnallinen RNA-interferenssi odotettiin välittyvän Aikuiset

let-7

miRNA syntyy jälkeen useita solunsisäisen RNA käsittelyn tapahtumia. Erojen vuoksi RRM2 ilmaisun ja gemsitabiinin Chemosensiti- kun yli-ilmentyminen pre

-Anna-7

jäsentä, me epäillään, että jotkin näistä lähtöaineiden käsittely epäonnistui kypsiksi

let-7

lomakkeita MIA PaCa -2. Siksi me määrällisesti suhteellisen kypsä

let-7

tasot qRT-PCR eri pre-

let-7-

ilmentävien MIA PaCa-2 klooneja ja vertasi niitä mock transduktoitu- MIA PaCa- 2. Mielenkiintoista huomattavaa lisääntymistä (keskiarvot vaihtelevat 2-5-kertaisesti) kypsä

let-7

muodot tunnistettiin kaikissa pre

let-7

-overexpressing solut testattiin, paitsi pre

let-7-a-1

-overexpressing soluja joissa ei ole ilmennyt minkäänlaisia ​​muutoksia kypsä

let-7a

tasot (

Fig. 3A

).

, suhteellinen ilmentyminen kypsät muodot

let-7

in MIA PaCa-2, jotka ilmentävät stabiilisti ennen

let-7

perheenjäseniä.

Sarakkeet,

keskiarvoa kolmesta;

baareja,

SD. n = 3.

B,

suhteellinen ilmentyminen esiaste (

täydet pylväät

;

oikea akseli

) ja kypsä (

avoimet pylväät

;

vasen akseli

)

let-7

muotoja haiman syöpäsoluissa ekspressoivat väliaikaisesti

let-7a esiasteita

.

Sarakkeet,

keskiarvoa kolmesta;

baareja,

SD. n = 3.

C,

Kaavamainen esitys rakenteiden ennalta

let-7a-1

ja ennen

let-7a-3

. Kypsän ja matkustaja

let-7a

säikeitä esiasteet boxed jatkuvassa tai katkoviivan, vastaavasti.

D,

puute täydellinen katkaisu esi-

let-7a-1

GFP-mRNA MIA PaCa-2-soluissa. MIA PaCa-2-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko pmirGLO-G-Fud (kontrolli), pmirGLO-GFP-pre-

anna-7a-1

, tai pre-pmirGLO-GFP-pre-

anna -7b

rakentaa, ja GFP-fluoresenssi vangiksi. Alkuperäinen suurennos, x20. *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001.

Koska viallisia miRNA koneet voisivat downmodulate kypsä miRNA [16], tutkimme seuraavaksi sellainen vika vaikuttaa erityisesti

let-7a

biogeneesin haimasyövän. Koska emme tarkkailla yli-kypsillä

let-7a

in MIA PaCa-2 (

Fig. 3A

), päätimme tutkia yksityiskohtaisesti, ilmaus /Kaikkien kolmen

let-7a

prekursorimuotojen (esi

let-7a-1

, ennen

let-7a-2

, sekä esi-

let-7a- 3

), joka on johdettu kolmesta eri geeneistä (sijainnit kromosomissa 9q22.32, 11q24.1, ja 22q13.31, vastaavasti) [27]. Käyttämällä qRT-PCR ja alukkeita, jotka joko kylki koko varsi-silmukka rakenne (joka tunnistaa miRNA esiasteet) tai kypsän sekvenssin (joka havaitsee kypsä miRNA), me määrällisesti solunsisäinen taso kaikkien kolmen

let-7a

esiasteita sekä kypsä

let-7a

eri haimasyöpäsoluissa ohimenevästi yli-ilmentävät ennalta

let-7a-1

, ennen

let-7a-2

, tai pre –

let-7a-3

.

Vaikka prekursorimuotojen olivat erittäin ilmaistaan ​​kaikissa kolmessa tapauksessa (3-38-kertainen), kypsä

let-7a

oli vain johdonmukaisesti lisääntyi ennen

let-7a-3

ilmentävillä soluissa, mutta ei niitä, jotka ilmentävät ennen

let-7a-1

(L3.6pl, MIA PaCa-2) (

Kuva. 3B

).