Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotta ymmärtäisimme paremmin eturauhasen funktio ja sairauden, on tärkeää määritellä ja tutkia molekyyli ainesosia jotka merkitsevät eturauhanen. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää eturauhasen erityisten transcriptome ja Proteome, verrattuna 26 muuta ihmisen kudoksissa. Syvä sekvensointi mRNA (RNA-kohdat) ja immunohistokemia-pohjainen proteiini profilointi yhdistettiin tunnistamaan eturauhasen geeniekspressiomalleja ja tutkia kudosten biomarkkereita mahdollisia kliiniseen käyttöön eturauhassyövän diagnostiikassa. Havaitsimme 203 geenien koholla ilmentyminen eturauhasessa, joista 22 osoittivat yli viisi kertaa suurempi ekspressiotasoja verrattuna kaikkiin muihin kudoksiin tyyppejä. Lisäksi aiemmin tunnettu proteiinien tunnistimme kaksi huonosti tunnettu proteiineja, TMEM79 ja ACOXL, jolla on mahdollisuudet erotella hyvänlaatuisia ja syöpä eturauhasen rauhaset kudosbiopsioista. Lopuksi olemme soveltaneet genominlaajuisia analyysi tunnistaa prostataspesifisen Proteome käyttäen transkriptomiikka ja vasta-pohjainen proteiini profilointi geenien tunnistamiseen koholla ilmentymistä eturauhasen. Meidän data tarjoaa lähtökohdan edelleen toiminnallisia tutkimuksia tutkia molekyylitasolla ohjelmistoon normaalien ja sairaiden eturauhasen lukien mahdolliset eturauhassyöpä markkereita, kuten TMEM79 ja ACOXL.

Citation: O’Hurley G, Busch C, Fagerberg L, Hallström BM, Stadler C, Tolf A, et al. (2015) analyysi Human Prostate-Specific Proteome Määritellään transkriptomiikka ja Vasta-Based profilointi Tunnistaa TMEM79 ja ACOXL kuin kahden mahdollisen, Diagnostic merkkiaineet eturauhassyövässä. PLoS ONE 10 (8): e0133449. doi: 10,1371 /journal.pone.0133449

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 03 elokuu 2015

Copyright: © 2015 O’Hurley et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Rahoitusta saatiin, kun Knut ja Alice Wallenbergin säätiön ja Ruotsin Syöpäsäätiön ja Marie Curie-Academia kumppanuudet ja Pathways ohjelma, FAST-PATH ( nro 285910). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. OncoMark Ltd tuettiin muodossa palkkojen tekijän GOH, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. OncoMark Ltd tuettiin muodossa palkat tekijän GOH. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

prostataspesifisen antigeenin (PSA) on tullut käyttökelpoinen tuumorimarkkeri syöpätautien ja PSA-pohjainen seulonta on käytetty laajalti, vaikka suhteellinen vähyys molempien spesifisyyden, mikä ylidiagnostiikka ja hoitoon varhaisessa vaiheessa eturauhassyöpä, ja herkkyys, joka johtaa eturauhassyövän ei havaita riittävän aikaisin [1-5]. Näin ollen on olemassa tarve parantaa markkereita varhainen havaitseminen eturauhassyövän.

PSA on seriiniproteaasi ja yksi kolmesta runsaimmin erittämät proteiinit eturauhanen [6]. Vuonna pahanlaatuinen eturauhas-, kudosrakenne on epänormaalia, joka helpottaa PSA vuotoa kapillaareja strooman osastoon. Non-pahanlaatuisia eturauhasen ehtoja, kuten eturauhastulehdus ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH), voi johtaa kohonnut seerumin PSA, rajoittamalla spesifisyys PSA korkeus syövän havaitsemiseen [7]. Näin ollen, mitkä potilaat tarvitsevat jatkotarkastelua transrectal ultraääni (TRUS) -Opastettu koepaloja on edelleen merkittävä ongelma.

Useita muita merkkiaineita ovat sekaantuneet mahdollisina biomarkkerit eturauhassyövän, kuten alfa-methylacyl koentsyymi A: rasemaasin ( AMACR), jonka on osoitettu olevan merkitsevästi säädellään ylöspäin eturauhassyövässä ja havaittavissa sekä seerumin ja syöpäkudoksessa. Muita tällaisia ​​diagnostisia biomarkkerit kuuluvat eturauhassyöpä limaa kuten antigeeni (PMA), GOLM1, rasvahappojen syntaasia (FASN), TMPRSS2-ERG fuusio eturauhassyövän antigeeni 3 (pCA3), KLK3, KLK2, HOXB13, GRHL2 ja FOXA1 [8-12] . Kuitenkin ajan tasalla, ei yksittäinen merkki on osoittautunut parempi kuin PSA.

Eturauhassyöpä on diagnosoitu perustuu histopatologinen tutkimus useiden TRUS-ohjattu eturauhasen core koepaloja. Tunnistaminen syövän eturauhasen on altis subjektiivisuus ja virhe, joka johtuu riippuvuutta ihmisen tulkintaa ja että koepaloja kattaa vain pieni määrä kudosta, joka sisältää usein vain muutama pahanlaatuinen rauhaset ja histologisia hyvänlaatuinen jäljittelee syövän. Löytö spesifinen merkki joko eturauhassyövän tai eturauhasen hyvänlaatuisen rauhaset, jotka myös voidaan mitata seerumista olisi hyödyllistä välttää tarpeetonta invasiivisia diagnostisia testejä.

tulkinta kvantitatiivinen transkriptomiikka tiedot perustuvat mRNA sekvensointi kudosnäytteiden on haaste, koska heterogeenisyys solutyyppien, jotka käsittävät eri kudostyyppejä. Tässä olemme analysoineet geenit ilmentyy normaaleissa ihmisen eturauhasessa ja verrattuna nämä tiedot trancriptomes 26 muu normaali ihmiskudostyypeistä perustuu äskettäin julkaissut RNA-seq data [13]. Transkriptomiikka analyysi yhdistettiin immunohistokemiallisesti-pohjainen proteiini profilointi käytettävissä tietoja Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) [14, 15] tarjoamaan kartan geenin ilmentymisen sekä RNA ja proteiini tasolla eturauhasen. Ekspressiokuviota kaksi koodaamien proteiinien aiemmin tuntemattomia geenejä, TMEM79 ja ACOXL, koholla ilmentyminen eturauhasessa analysoitiin tarkemmin käyttämällä kudossiruina (TMA), sisältää normaalit eturauhasen ja eturauhasen syöpä, tutkia niiden mahdollisesti arvoa diagnostisia biomarkkereita.

Materiaalit ja menetelmät

Kudosnäytteiden

tuore ihmisen kudosta edustavat 27 eri normaalista ihmiskudostyypeistä sisällytettiin RNA-seq analyysi aikaisemmin kuvatulla [13], mukaan lukien 4 näytteitä eturauhasen kudosta. Morfologisesti normaali, ei-syöpä eturauhasen kudosta näytteeksi eturauhasen näytteitä välittömästi näytteenoton 4 miehillä (ikä 62-68 v), joilla oli paikallinen eturauhassyöpä.

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen kudosnäytteitä kerättiin kliininen Patologian osasto, Uppsalan yliopistollisen sairaalan, Uppsala, Ruotsi ja kootaan TMA. TMA luotiin ja käytettiin proteiinien profilointiin aikaisemmin kuvatulla [16]. Seulonta TMA sisälsi 1 mm ytimet 46 eri normaaleissa kudoksissa kolmena kappaleena, joista kolme terveessä eturauhasessa sekä 216 syöpä kudoksiin edustavat 20 yleisimmistä syövistä, mukaan lukien 12 tapausta eturauhassyövän [17]. Neljä validointi TMA sisälsi normaalia ja syöpä- eturauhasen kudosta; tiedot jokaisen validoinnin TMA on esitetty taulukossa 1, ja niitä on kuvattu aiemmin [18, 19]. Eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia jätettiin pois tästä tutkimuksesta.

Kaikki ihmisen kudosnäytteitä käytetään RNA-kohdat ja seulonta proteiinin ilmentymisen olivat anonymisoidaan ja käytettiin mukaisesti hyväksynnän ja neuvonta raportti Uppsalan eettisen Review Board (Reference # 2002 -577, 2005-338 ja 2007-159 (proteiini) ja # 2011-473 (RNA)). Validointi TMA kohortteja hyväksyttiin Keski- Ethical Review Board Ruotsissa (Dnro Ö25-2006, päiväys 29.6.2006) ja alueellinen Ethical Review Board Lundin yliopistossa Ruotsissa (hyväksymisnumero DN. 445-07). Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa.

Transcript profilointi (RNA-kohdat) ja data-analyysi

Transcriptomic profilointia on kuvattu aiemmin [13]. Lyhyesti, hematoksyliini- eosiinilla (HE) värjättiin jääleikkeille (4 pm) valmistettiin kustakin näytteestä käyttäen kryostaattia ja CryoJane Tape-siirtojärjestelmä (Instrumedics, St. Louis, MO, USA) ja tarkistetaan patologi varmistaa asianmukainen kudos morfologia. Kolme 10 um: n leikkeet leikattiin kunkin pakastetun kudosnäytekappaleessa ja homogenoitiin ennen uuttamista kokonais-RNA käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettu RNA-näytteet analysoitiin käyttäen joko Agilent 2100 Bioanalyzer järjestelmä (Agilent Biotekniikka, Palo Alto, USA) RNA: n kanssa 6000 Nano LabChip Kitin tai Experion automatisoitu elektroforeesijärjestelmään (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) standardin -sensitivity RNA siru. Vain näytteet laadukkaita RNA (RNA Integrity Number ≥7.5) käytettiin seuraavassa mRNA näytteen valmistus sekvensointia. Illumina HiSeq2000 ja 2500 koneiden (Illumina, San Diego, CA, USA) käytettiin suorittamaan mRNA sekvensointi käyttäen standardi Illumina RNA-seq protokolla lukea pituus 2×100 emästä.

Raaka lukee saatu sekvensointijärjestelmällä karsittiin heikkolaatuisen päättyy ohjelmiston Sirppi. Phred alarajan 20 käytettiin. Lukee lyhyempi kuin 54 emäsparin jälkeen leikkaus hylättiin. Jalostetut lukee kartoitettiin sen GRCh37 versio ihmisen genomin Tophat v2.0.3 [20]. Mahdolliset PCR kaksoiskappaleet eliminoitiin soveltamalla MarkDuplicates moduulin Picard 1,77. Saadakseen määrällisesti tulokset kaikille 20050 ihmisen proteiinia koodaavan geenien, FPKM (fragmentteja kohti kiloemästä eksonin mallin miljoonassa kartoitettu lukee) arvot laskettiin Cufflinks v2.0.2 [20], joka korjaa transkriptio pituus ja kokonaismäärä kartoitettu lukee kirjastosta kompensoimaan eri lukea syvyyksistä eri näytteitä. Keskimääräinen prosenttiosuus onnistuneesti yhdistetty lukee oli 77%. Geeni malleja Ensembl rakentaa 69 [21] käytettiin Cufflinks. Lisäksi Cufflinks, HTSeq v0.5.1 ajettiin laskea lukea laskee kullekin geenille, joka käytettiin analyyseihin differentiaalisesti ilmentyvien geenien käyttäen DESeq paketti [22]. Kaikki tiedot analysoitiin R Statistical ympäristö [23] ja verkko analyysi suoritettiin käyttäen Cytoscape 3,0 [24]. Analyyseihin tehty tässä tutkimuksessa, jossa log2-asteikolla käyttänyt tietoja, pseudo-laskennat +1 lisättiin tietojen käyttöä.

erityisyys luokitus

Keskimääräinen FPKM arvo kaikissa näytteitä tietyssä kudoksessa käytettiin arvioitaessa koko geeni-ilmentymisen tasolla. Cut-off-arvo on 1 FPKM, suunnilleen vastaa keskimäärin 1 mRNA-molekyylin solua kohti, määriteltiin määritysrajan [25]. Kukin 20050 geenien luokiteltiin yhdeksi yhdeksästä kategorioihin ilmentämiskuviota eturauhasessa suhteessa kaikkiin muihin kudoksiin (taulukko 2).

Vasta validointi: siRNA transfektiolla, immunofluoresenssilla, kuvantaminen ja tilastollinen analyysi

Laajennettu vasta-validointi että tarjotaan HPA-tietokanta (www.proteinatlas.org) kaikkien proteiinien toteutettiin edelleen todentamiseksi spesifisyyden ensisijaisen vasta TMEM79 (HPA055214) ja ACOXL (HPA035392 ). Tämä tehtiin käyttämällä siRNA-pohjainen knock-down geeniekspression. U-2 OS ja MCF-7-soluja käytettiin siRNA knock-down kokeilut ACOXL ja TMEM79. U-2 OS-soluja viljeltiin McCoyn-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja MCF-7-solut EMEM täydennetty 10% FBS: ää, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA) ja 1% L-glutamiinia ( kaikkea FisherScientific, Tukholma, Ruotsi).

päivänä transfektion, 10000 U-2 OS -soluihin tai 12000 MCF-7-solut ympättiin 96-kuoppaisille lasipohja (VWR, Tukholma, Ruotsi) pre -pinnoitettu fibronektiinin. Sen jälkeen Solukiinnittymisen, väliaine korvattiin 100 ul Optim-MEM, joka sisälsi 0,5 ui Lipofectamine 2000 (kat. Nro 11668019, Life Technologies) ja 2,5 pmol ACOXL siRNA (Äänenvaimennin Select Pre-suunniteltu siRNA tuote s30651, Life Technologies) tai TMEM79 siRNA (Äänenvaimennin Select Pre-suunniteltu siRNA tuote s228349, Life Technologies). Salatun siRNA-sekvenssin (Äänenvaimennin Valitse Negatiivinen kontrolli ei. 1, cat. No 4390843, Life Technologies) käytettiin negatiivisena kontrollina ja AllStar (SI04381048, Qiagen) käytettiin positiivisena kontrollina, jotta varmistetaan onnistunut transfektiota.

72 h kuluttua inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin käyttämällä 4% paraformaldehydillä (PFA) ja permeabilisoitiin käyttäen 0,1% Triton x-100, kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Solut värjättiin vasta-aineiden kohdistaminen ACOXL tai TMEM79 sekä konsentraationa 2 ng /ul. Solut värjättiin myös vasta-aineen kohdistaminen mikrotubulusten (ab7291, Abcam) pitoisuutena 3 ng /ul, ja ydin- koettimella 4 ’, 6-diamidini-2-fenyyli (DAPI) pitoisuutena 300 nM, ja automaattisten kuvantaminen ja kvantifiointi alennetun värjäytymisen intensiteettiä.

kuvantamis- ja määritys lukemisen ulos siRNA kokeita tehtiin aikaisemmin kuvatulla [27]. Kolhi alas mitattiin suhteellista fluoresenssin intensiteetti (RFI) verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Aineisto graafisesti esitetty box-koealojen ja Mann-Whitneyn testiä käytettiin arvioimaan merkitystä mediaani RFI on vaiennettu solupopulaation verrattuna RFI vastaavan negatiivisen kontrollin.

Vasta-aineisiin perustuvia kudos profilointi

TMA leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja niitä käytetään immunohistokemiallisella värjäyksellä, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Immunohistokemialli- värjätään ja diojen skannattiin käyttäen Aperio ScanScope XT Dia Scanner (Aperio Technologies, Vista, CA) sukupolven korkean resoluution digitaalisia koko dia kuvaa, jota seuraa merkintä sertifioitujen patologia. Lyhyesti, manuaalinen pisteet IHC-pohjainen proteiini lauseke kaikki proteiinit seulottiin määritettiin osa-positiivisten solujen määritellään eri kudoksissa: 0 = 0-1%, 1 = 2-25%, 2 = 26-75%, 3 75% ja voimakkuus immunoreaktiivisuus: 0 = negatiivinen, 1 = heikko, 2 = kohtalainen ja 3 = voimakas värjäytyminen. Kaikki huomautusta ja immunohistokemiallista dataa seulonnasta TMA yhdessä validointi tiedot kaikista ensisijaisen vasta-aineiden on julkisesti saatavilla Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) [28]. Ensisijainen käytetyt vasta immuunivärjäystä validointi TMA mukana HPA055214 (laimennus 1: 250) havaitsemiseksi transmembraaniproteiinin 79 Tmem 79) ja HPA035392 havaitsemiseksi Asyylikoentsyymi-CoA oksidaasin kaltaisen proteiinin (ACOXL) (laimennus 1: 1000).

Pisteytys tai TMEM79 ja ACOXL proteiinin ilmentyminen

immunoreaktiivisuus TMEM79 arvioitiin kalvon ja solulimassa, ja ACOXL sytoplasmassa epiteelisolujen eturauhasen. Vasta-aineet, jotka vastaavat molemmat proteiinit olivat immunohistokemiallisesti värjätään ja tulos analysoitiin kaikki validointi TMA. Pisteytys suoritettiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa (GOH, CB).

varten tilastollisen analyysin immunohistokemiallinen värjäys mallia molempien vasta-aineiden porrastettu seuraavan asteikon: 0, puuttuminen reaktiivisuus, 1, heikko mutta selvästi havaittavissa reaktiivisuus 30% epiteelisolujen, 2, kohtalainen reaktiivisuus 30% epiteelisolujen ja 3, vahva reaktiivisuus 30% epiteelisolujen.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi TMEM79 ja ACOXL ilmaisun vs. histopatologisia piirteitä, värjäytymisen intensiteetti epiteelisolujen jaettiin kahteen ryhmään: pieni lauseke (immunohistokemiallinen pisteet 0 tai 1), mukaan lukien tapaukset, joissa negatiivinen tai heikko värjäystä, ja korkea ilmaisun (immunohistokemiallinen pisteet 2 tai 3), mukaan lukien tapaukset, joilla on kohtalainen tai voimakas värjäytyminen. Pearson Chi square testejä ja Spearmanin ja Pearson korrelaatio suoritettiin testaamiseksi yhdistyksen välillä proteiinin ilmentymisen ja histopatologisia ominaisuuksia kaksisuuntainen virhematriiseja. Diagnostiset suorituskyvyn kriteerit testattiin synnyttämällä ROC käyrät. Kaplan-Meier selviytymisen analysointi ja monimuuttuja Coxin regressioanalyysi suoritettiin myös potilasalaryhmässä, jossa biokemiallisten toistumisen (BCR) tiedot oli saatavilla (N = 148), analysoida yhdistyksen välillä BCR ja proteiinin ilmentyminen, seerumin PSA-arvo pre-prostatektomia ja Gleason pisteet. Kaikki laskelmat suoritettiin IBM SPSS 20 for Windows (SPSS, New York, NY, USA).

Tulokset

Euroopan transcriptomic analyysi eturauhasessa

transcriptomes neljän eturauhasessa kvantitoitiin RNA-kohdat ja normalisoitiin mRNA-tasot, laskettu FPKM arvot [13], määritettiin kullekin näytteelle. Kaikkiaan 14040 geenien havaittiin eturauhasessa, käyttäen sulku keskimääräisen ilmaisu arvon 1 FPKM. Näin ollen noin 70% kaikista oletetun proteiinin koodaavan geenien (n = 20050) havaittiin eturauhasessa. Jakelu FPKM arvojen (mRNA: n ilmentymisen tasoa) vaihteli välillä 0 FPKM jopa 8238, jolloin saadaan dynaaminen alue 10

4

välillä korkeimman ja matalimman ilmentyvien geenien. 30 geenit, joilla on korkein ilmentymistasoissa eturauhasen luetellaan S1 taulukossa. Suurin osa näistä geeneistä koodaavat proteiineja ”talon pitäminen” toiminnot ilmentyy kaikissa analysoitiin kudoksissa.

Biologinen vaihtelu neljä yksittäistä eturauhasessa analysoitiin vertaamalla ekspressiotasoja kaikista proteiinia koodaavan geenin pareittain scatterplots. Korrelaatio yleinen oli korkea kanssa Spearman kertoimet vaihtelevat 0,98 (kuvio 1A) 0,91, joiden keskimääräinen korrelaatiokerroin 0,96 kaikkien neljän eturauhasessa. Nämä tulokset osoittavat matalan yksilöiden välisiä eroja poikki genominlaajuisten ekspressiokuviota ja osoittavat suurta teknistä toistettavuus välillä eturauhasessa. Kuten odotettua, korkeamman vaihtelua havaittiin, kun vastaavat vertailut tehtiin välillä eturauhasen ja muiden kudosten tyyppejä. Pienin korrelaatio välillä todettiin eturauhasen ja kiveksen kanssa Spearman kertoimella 0,72 (kuvio 1 B), kun taas kudos, jolla on korkein samankaltaisuutta eturauhasen oli kohdun limakalvo kanssa Spearman kertoimella 0,92 (kuvio 1 C).

Geenien ilmentyminen scatterplots näkyvät kaikki FPKM arvoja ja pareittain Spearmanin ja Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä: (A) kaksi eturauhasessa korkeimpien korrelaatiokerroin, (B) alin korrelaatio muihin kudostyypin (eturauhasen vs. kiveksissä näytettä), ja (C) korkein korrelaatio muihin kudostyypin (eturauhasen vs. endometrium). (D) piechart osoittaa jakautuminen osa kaikista ihmisen proteiinia koodaavan geenien kustakin luokasta, joka perustuu transkripti ilmentymistason eturauhasessa verrattuna kaikkiin muihin kudoksiin.

luokittelu ekspressoidut geenit eturauhasen

transkriptomiikka saatuja tietoja 27 kudoksista meille mahdollisuuden luokitella kaikki 20050 proteiinia koodaavan geenien neljään pääryhmään, ensinnäkin perustuu niiden ilmentymistason eturauhasessa (kuvio 1 D). Nämä pääryhmään sisältyy i) geenit, joita ei havaittu eturauhasessa (30%), ii) geenit, jotka oli sekoitettu ilmentymiskuvio, on ilmaistu useissa mutta ei kaikissa kudostyypeissä (23%), iii) geenit, jotka on ilmaistu kaikki kudokset ja siten luonnehtia ”talon pitäminen” geenit (46%) ja iv) geenien kohonnut ekspressiotaso eturauhasessa verrattuna muihin kudostyyppeihin (1%). Sitten 203 geenien luokan iv, joka osoitti kohonnut ekspressiota eturauhasessa, jaettiin edelleen neljään muut alaluokat riippuen asteesta kudosspesifisyyttä.

kuusi geenit määriteltiin hyvin rikastettu eturauhasen (taulukko 3 ), tunnettu siitä, koska korkein kudosspesifisyyttä vähintään 50-kertainen FPKM tason eturauhasen verrattuna muihin kudoksen tyyppi. Kuusitoista geenit määriteltiin kohtalaisen rikastunut eturauhasessa (taulukko 3), jossa on vähintään 5-kertainen FPKM tason eturauhasen verrattuna kaikkiin muihin kudoksiin; 85 geenit määriteltiin ryhmässä rikastettu (S2 taulukko), jossa on 5-kertainen keskimääräisen FPKM tason ryhmässä 2-7 kudosten kuten eturauhasen verrattuna kaikkiin muihin kudoksiin; ja 96 geenejä eturauhasen parannettu (S3 taulukko), määritellään siten, että 5-kertainen FPKM tasolle eturauhasen verrattuna keskimääräiseen FPKM kaikkien käytettyjen 27 kudoksiin. Kaksi hyvin tutkittu geenien eturauhasen, SLC45A3 ja MSMB, tunnistettiin tähän luokkaan.

verkosto juoni ryhmän rikastetun geenien eturauhasen on esitetty kuviossa 2, joka esittää joukko geenejä jaettu tietylle kudosten (jopa neljä eri kudoksiin) sekä useita korkeasti ja kohtalaisen kudoksen rikastunut geenejä eturauhasen. Niistä 27 kudostyypeistä analysoitu, 22 kudostyypeistä ollut yhteinen ryhmä rikastettu geenien kanssa eturauhasen. Kudostyyppi useimpien ryhmän rikastettu geenien yhteistä eturauhasen on ruokatorven (n = 15), minkä jälkeen kiveksissä (n = 6), aivot ja sydän (n = 5). Jaettu geenit välillä ruokatorven ja eturauhasen hallitsevat geenit ilmaistu eri lihassolujen, sisältyvät seinän ruokatorveen ja integroitu eturauhasen.

ryhmät ilmaisivat geenejä edustettuina sininen ympyrä solmut ja liittyy vastaaviin rikastettu kudokset edustettuina harmaa piireissä. Koot solmut liittyvät määrä rikastettua geenejä. Vaaleansininen ympyrä osoittaa kokonaismäärä korkeasti ja kohtalaisen kudoksen rikastettu geenejä. Verkosto edustaa yleiskuvan ryhmitelty rikastettu geenejä, joissa on korkeintaan 4 kudosten yhdistää.

Vasta perustuvat profilointi eturauhasen erityisten geenien

Geenit koholla eturauhasessa (n = 203) arvioitiin käyttämällä verkossa Human Protein Atlas-tietokanta (HPA, www.proteinatlas.org) voidaan verrata määrällisten RNA-seq datan paikkatietojen ekspressiotietojen vastaavien proteiinin tasoja. Tutkimaan edelleen proteiinin ilmentyminen malleja eturauhasessa Tästä proteiineista, jotka sisältävät sekä aikaisemmin hyvin tutkittu sekä tuntemattomia proteiineja, immunohistokemiallinen värjäytyminen arvioitiin visuaalisesti osalta hyvänlaatuinen eturauhasen spesifisyys ja solujen jakeluun. Esimerkkejä ekspressiokuvioiden normaalissa eturauhasessa proteiinien kohonnut ilmentyminen eturauhasessa on esitetty kuviossa 3.

esimerkkejä ilmentymisen hyvänlaatuisia rauhas soluissa on esitetty osajoukon vastaavien proteiinien geenejä, joilla on kohonnut ilmentyminen eturauhasessa. Scale, 100 pm.

Differentially ilmaistu proteiinien hyvän- että pahanlaatuisia eturauhaskudoksessa

transmembraaniproteiiniksi 79 (TMEM79).

Differential proteiinin ilmentymistä eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksen versus eturauhassyöpä kudosta seuraavan arvioitiin tuntemattomia geenejä, jotka validoituja kohtaan suunnatut vasta vastaavat proteiinit olivat saatavilla.

TMEM79

, todisteet olemassaolon vain transkriptio tasolla mukaan UniProt [29], todettiin ”ryhmä rikastettu” geeni joiden FPKM arvo 39 eturauhasessa. TMEM79 geenin ilmentymistä havaittiin myös ruokatorven (54 FPKM) ja ihon (65 FPKM) korkeammalla tasolla kuin eturauhasessa (katso S2 taulukko). Kuitenkin proteiinitasolla TMEM79 osoitti selvemmin immunoreaktiivisuus normaalissa eturauhasessa rauhaset verrattuna ilmentämiskuviota levyepiteeleissä ihon, ruokatorven, suun limakalvojen, emätin ja kohdunkaula. Vahva kalvomainen immunovärjäys havaittiin 3/3 hyvänlaatuista eturauhasen kudosta tapauksissa taas ei ollut ilmeistä kalvomainen värjäytyminen syöpäsolujen 12/12 tapauksia eturauhassyövän (kuvia immuno- normaali ja syöpä- eturauhaskudoksiin ovat saatavilla osoitteessa www.proteinatlas.org ja kuviossa 4).

(A) TMEM79 kalvo ilmentymistä hyvänlaatuinen rauhanen puutteelliseen TMEM79 ilmaisun ympäröivä kasvain. (B) Dual IHC värjäys TMEM79 (punainen) ja TP63 (Blue tyvisolusyöpä värjäys) on hyvänlaatuinen rauhanen. (C) puute TMEM79 proteiinin ilmentymistä eturauhassyövässä (Gleason aste 3). (D) puute TMEM79 proteiinin ilmentymisen eturauhasen metastaattinen kasvain (Bone etäpesäke). Scale, 100pm.

vahvistaa alkuperäisen proteiiniseulontalaitteissa tulokset havaittu TMEM79 eturauhasessa, IHC suoritettiin neljä riippumatonta eturauhassyöpä ikäryhmät. Kudoksille 333 tapausta oli saatavilla analyysiä varten (156 hyvänlaatuinen tapauksissa 162 ensisijainen eturauhassyövän tapauksista ja 15 metastaattinen eturauhassyöpä tapauksia). Noin 81% (127/156) hyvänlaatuisen eturauhasen kudosnäytteitä oli positiivinen kalvo ilmaus TMEM79 ja noin 84% (148/156), eturauhasen syöpä kudosnäytteiden ei näihin TMEM79 (taulukko 4). Näin ollen, TMEM79 näkyy suuri herkkyys (81%) ja spesifisyys (84%), joka erottaa eturauhasen hyvänlaatuisen rauhaset eturauhassyöpää. Tilastollisesti arvioida oletusta, että positiivinen TMEM79 ilmentyminen on kääntäen liittyy eturauhassyöpään, kaksisuuntainen kontingenssitaulukkomenetelmillä perustettiin (taulukko 4), jossa luokitellaan testin muuttujia luokkiin; hyvänlaatuinen kudos versus kasvain (Gleason arvosana 2-5 ja etäpesäke). Tilastollisesti arvioida diagnostinen suorituskyky kriteerit TMEM79 ROC käyrä muodostettiin (S1 kuvio), joka tuotti AUC-arvo 0,825 ja merkittävä

P arvo

on 0.000 osoittaa, että TMEM79 on hyvä diagnostinen testi erottamaan hyvänlaatuinen rauhaset ja kasvain eturauhasen. Ei assosiaatio BCR, seerumin PSA-arvo pre-prostatektomia, Gleason pisteet ja TMEM79 ilmentymistä havaittiin joko Kaplan-Meier selviytymisen analyysin tai monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä osajoukko 148 potilasta analysoitiin.

asyyli- CoA-oksidaasi-kaltaisen proteiinin (ACOXL).

Samanlaisia ​​TMEM79, ACOXL tunnistettiin uusi kudos markkeri eturauhasen hyvänlaatuisen seulonnan jälkeen proteiinin ilmentyminen Ihmisen proteiini Atlas. Toisin kuin kalvomainen ilmentymisen TMEM79, ACOXL osoitti vahvaa rakeinen, sytoplasmista ekspressiota eturauhasen hyvänlaatuista rauhaset.

ACOXL

tunnistettiin ”ryhmä rikastettu” geeni myös joiden FPKM arvoon 3 eturauhasen kudosta. Muita kudoksia, jotka on luokiteltu ”ryhmään rikastettu” varten ACOXL geeni oli keuhkosyöpä (15 FPKM), virtsarakon (13 FPKM) ja kives (4 FPKM). Immunovärjäystä ACOXL proteiinin osoitti vahvaa rakeinen, sytoplasmista värjäytymistä myös keuhkoputkien ja munanjohdin sekä heikompi ja diffuusi värjäyskuvion keuhkojen, ihon, sappirakon, sylkirauhasen, kilpirauhasen, lisämunuaisen, emättimen ja aivojen.

3/3 hyvänlaatuista eturauhasen kudosta tapauksissa myönteisesti värjäytymistä ACOXL ilmaisun ja mitään värjäytymistä ei havaittu 8/12 eturauhassyövissä (kts 5 ja www.proteinatlas.org varten kuvia immuno- normaali ja syöpä- eturauhasen).

(A) Rakeinen, sytoplasmista ekspressiota ACOXL on eturauhasen hyvänlaatuista liikakasvua. (B) puute ACOXL proteiinin ilmentymistä eturauhassyövässä (Gleason aste 3). (C) puute ACOXL proteiinin ilmentymisen eturauhasen metastaattinen kasvain (imusolmuke etäpesäke). (D) Rakeinen, cytoplamic ilmaus ACOXL on hyvänlaatuinen rauhanen puutteelliseen TMEM79 ilmaisun ympäröivä kasvain. Scale, 100pm.

IHC edelleen suoritettiin neljä itsenäistä eturauhassyöpä ikäryhmät. Noin 86% (132/154) hyvänlaatuinen eturauhasen kudosnäytteitä oli positiivinen sytoplasmista ACOXL ilmaisun ja noin 72% (129/179) eturauhassyövän kudosnäytteitä eivät ilmaisseet ACOXL, mikä viittaa korkea spesifisyys ja herkkyys myös ACOXL tunnistaa hyvänlaatuinen eturauhasen rauhaset.

samanlainen kontingenssitaulukkomenetelmillä ja tilastollisia analyysejä kuten tehtiin TMEM79 suoritettiin ACOXL (taulukko 5). Sekä Pearson ja Spearman korrelaatioita osoitti myös, että on olemassa kohtalainen käänteinen suhde kalvomainen ilmaus TMEM79 ja eturauhassyöpää. Erottaminen kasvain luokka, Gleason laadut ja etäpesäkkeitä osoitti suuntaus laskivat ACOXL ilmentymistä kehittyneempiä ja aggressiivinen kasvaimia. Ei assosiaatio BCR ja ACOXL ilmentyminen eturauhassyövässä kudoksessa havaittiin. Tilastollisesti arvioida diagnostinen suorituskyky kriteerit ACOXL ROC käyrä muodostettiin (S1 kuvio), joka tuotti AUC-arvo 0,788 ja merkittävä

P arvo

on 0.000 osoittaa, että ACOXL on hyvä diagnostinen testi erottamaan hyvänlaatuinen rauhaset ja kasvain eturauhasen. Ei assosiaatio BCR, seerumin PSA-arvo pre-prostatektomia, Gleason pisteet ja ACOXL ilmentymistä havaittiin joko Kaplan-Meier selviytymisen analyysin tai monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä osajoukko 148 potilasta analysoitiin.

Vasta validointi Rabbit Polyklonaaliset anti-TMEM79 (HPA 055214) ja kaniinin polyklonaalista anti-ACOXL (HPA035392) B

arvioimiseksi spesifisyyden ensisijaisen vasta kohdistaminen ACOXL (HPA035392) ja TMEM79 (HPA055214), kohde proteiinit pudotettiin käyttämällä siRNA U-2 OS ja MCF-7-solut, ja analysoitiin käyttäen immunofluoresenssilla (S2 Kuva). Immunofluoresenssikokeisiin värjäys ACOXL oli pääasiassa sytoplasmista värjäyskuvio, joka oli merkittävästi vähentynyt, kun hiljentäminen vastaavan transkriptin sekä U-2 OS ja MCF-7-soluissa, mikä osoittaa spesifistä sitoutumista ACOXL vasta-aineen aiottu kohdeproteiinin kanssa RFI on 58 ja 70%: lla (S2 Kuva).

TMEM79, merkittävä lasku värjäytymisen voimakkuuden havaittiin molemmissa solulinjoissa (RFI 74 ja 70% U-2 OS ja MCF-7), myös osoittaa spesifinen sitoutuminen vasta-aineen TMEM79 proteiinin (S2 kuvassa). Sen lisäksi, että värjäytymistä solukalvon, joita nähdään IHC, immunofluoresenssivärjäyksen havaittiin nucleoli. Muita kuva analyysi tumavärjäystä intensiteetti osoitti lievää laskua vaimennettu soluissa kontrolleihin verrattuna (aineistoa ei esitetty). Kuitenkin tämä lasku ei ollut merkittävä.

Keskustelu

Nykyinen kliininen biomarkkereita eturauhassyövän puuttuu spesifisyys ja herkkyys luotettavasti erottaa aggressiivinen vs. ei-aggressiivinen eturauhassyöpä [2-5]. Siten mitkä potilaat tarvitsevat hoitoa ja kerrostuminen potilaita, jotka hyötyvät aggressiivinen hoito strategiat edelleen diagnostinen ja kliininen ongelma.

Vaikka merkittäviä edistysaskeleita proteomic ja metabolomic tutkimus on nähty viime vuosikymmenellä tuottamismahdollisuudesta biomarkkereita syöpä useimmat eivät ole korvata nykyisiä merkkiaineiden puutteesta lisäarvon [30]. Konkreettinen lähestymistapa löytää ja tunnistaa erityiset biomarkkerit on etsiä proteiineja, jotka on erityisesti ilmaistu kiinnostavaan kudokseen ennen etsivät tällaisia ​​erotteleva proteiineja verestä tai virtsasta [31].

Toisin kuin muut aiemmin julkaistu kudos erityisilmaus tutkimuksia, yhdistimme uusinta RNA-seq datajoukon kuvaava prostataspesifisen transcriptome vastaaviin

in situ

proteiinin ilmentymistä hyvänlaatuinen eturauhasen. Meidän RNA-seq analyysi tunnistettu 6 korkeasti rikastetun geenejä eturauhasessa, 16 kohtalaisen rikastettu geenejä, 85 ryhmä rikastettu geenejä ja 96 eturauhasen parannettu geenejä.