Krooninen sairaus

tiivistelmä

uutteen inkivääri (

Zingiber officinale Roscoe

) ja sen tärkeimpien pistävä osat, [6] -shogaol ja [6] -gingerol, on osoitettu olevan anti -proliferative vaikutus useita tuumorisolulinjoja. Kuitenkin syövänvastainen aktiivisuus inkivääriuute haimasyövän ymmärretään huonosti. Tässä osoitamme, että etanoli-aineksen inkivääri tukahdutetaan solusyklin etenemisen ja näin ollen indusoi syöttämällä ihmisen haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien Panc-1-soluja. Taustalla mekanismi merkitsi AutoSIS, hiljattain tunnettu siitä, solukuoleman muoto, mutta ei apoptoosin tai necroptosis. Uute selvästi lisäsi LC3-II /LC3-I-suhde laski SQSTM1 /P62-proteiinia, ja parannettu vakuolisaation sytoplasmaan Pancin-1-soluissa. Se aktivoituu AMPK, positiivisena säätelijänä autophagy, ja se esti mTOR, negatiivinen autophagic säädin. Autophagy inhibiittorit 3-metyyliadeniinin ja klorokiini esti osittain solukuolemaa. Morfologisesti kuitenkin polttoväli kalvo repeämä, ydin- kutistuminen, polttoväli turvotus perinuclear tilaa ja elektroni tiheän mitokondriot, jotka ovat ainutlaatuisia morfologisia piirteitä AutoSIS, havaittiin. Uute parannettu reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi, ja antioksidantti N-asetyylikysteiini heikennettyjä solukuolemaa. Tutkimuksemme osoitti, että päivittäinen intraperitoneaalinen anto uutteen huomattavasti pidensi elinaikaa (P = 0,0069) on vatsakalvon levittämisen mallin ja tukahdutti kasvaimen kasvu käytettäessä potilaalle tehdä mallin haimasyövän (P 0,01) ilman vakavia haittavaikutuksia. Vaikka [6] -shogaol mutta ei [6] -gingerol osoitti samanlaisia ​​vaikutuksia, kromatografinen analyysissä todettiin läsnäolo muista ainesosista (t) vaikuttavina aineina. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että inkivääriuute on tehokas syövän tehoaa haimasyöpäsoluissa indusoimalla ROS-välitteisen AutoSIS ja optio lisätutkimuksia, jotta voitaisiin kehittää tehokkaaksi kandidaattilääkettä.

Citation: Akimoto M, Iizuka M, Kanematsu R, Yoshida M, Takenaga K (2015) Anticancer vaikutus inkivääriuute vastaan ​​haimasyöpäsoluissa Pääasiassa reaktiivisia happiradikaaleja välittämää Autotic solukuolema. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10,1371 /journal.pone.0126605

Academic Editor: Guillermo Velasco, Complutense University, ESPANJA

vastaanotettu: 06 tammikuu 2015; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2015; Julkaistu: 11. toukokuuta 2015

Copyright: © 2015 Akimoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Grants-in-Aid alkaen: Shimane University ”SUIGANN” Project (https://www.shimane-u.ac .jp) (KT); Tieteellinen tutkimus alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology, Japani (https://www.mext.go.jp) (nro. 25430110 KT); ja Japani Valtimonkovettumistautiin Research Foundation (KT). Tätä työtä tukee myös tuki Super Science lukiot Japanista Science and Technology Agency Izumo High School (https://rikai.jst.go.jp) (KT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin aggressiivinen kasvain, johon liittyy monia kemoterapian ja sädehoidon kestävä fenotyyppejä. Ilmaantuvuus haimasyövän kasvaa vuosittain maailmanlaajuisesti, tulossa neljänneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa. Itse arvioitu uusia haimasyövän tapauksia oli 277000 vuonna 2008 ja 338000 vuonna 2012, ja oli 266000 haimasyövän kuolemia vuonna 2008 ja 331000 haimasyövän kuolemia vuonna 2012 [1, 2]. Koska suurin osa haimasyövän potilaat ovat diagnosoitu ampumakelvottomaksi vaiheessa [3, 4], yleinen 5 vuoden suhteellinen eloonjääminen on alhainen, ja mediaani eloonjäämisaika on vain 6 kuukautta siitä saavilla potilailla laadun hoitoa. Saadakseen uusia johtolankoja kehittämiseen ennaltaehkäiseviä ja terapeuttisia strategioita, monet tutkimustyötä on keskittynyt ymmärtäminen molekyyli- mekanismien haimasyöpä etenemistä [3, 4].

Inkivääri (

Zingiber officinale Roscoe

), rhizomatous monivuotinen kasvi, on laajalti käytetään mausteena elintarvikkeiden ja juomien ja hyödynnetään ensisijaisesti korjata ruoansulatuskanavan häiriöt kuten dyspepsia, pahoinvointi, gastriitti, oksentelu, koliikki, ja ripuli [5, 6]. Inkivääriuute ja sen pistävä komponentteja, kuten [6] -gingerol ja [6] -shogaol, tiedetään myös osoittavan monia biologisia vaikutuksia, mukaan lukien anti-tulehdus, antioxidation ja syövän vastaista aktiivisuutta [5, 6]. Koska se on vahva tulehdusta ehkäisevä vaikutus, inkivääri on viime aikoina kiinnittänyt huomiota kuin korjata nivelrikon ja nivelreuman [7, 8]. Mitä tulee syövän vastaista aktiivisuutta, inkivääri ja sen ainesosien on osoitettu estävän lisääntymistä ja aiheuttaa apoptoosin erilaisia ​​syöpäsolutyyppien

in vitro

[9-15]. Lisäksi käyttö inkivääri varten kemopreventiolle kolorektaalisyövän on herättänyt huomiota [16-18]. Kuitenkin syövän vastaisen aktiivisuuden inkivääriuute ja sen ainesosien vastaan ​​haimasyöpä on huonosti tutkittu.

Tässä tutkimuksessa selvitimme syövän vastaisen aktiivisuuden inkivääriuute vastaan ​​haimasyöpäsoluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

ja tutkitaan sen mahdollisuuksia mekanismi. Tässä me raportoimme, että inkivääriuute johtaa vähentää solujen elinkelpoisuuden ja kasvaimen kasvua Panc-1-soluissa pääasiassa ROS-välitteisen AutoSIS, hiljattain tunnettu solukuoleman muoto.

Materiaalit ja menetelmät

solut ja soluviljelmä

Ihmisen haimasyövän soluja, Panc-1, AsPC-1, BxPC-3, CAPAN-2, CFPAC-1, MiaPaca-2 ja SW1990, ja hiiren haiman syöpäsoluja, Panc02 , käytettiin tässä tutkimuksessa. Panc-1 ja MiaPaca-2-solut saatiin RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japani), ja muut ihmisen haiman solulinjat hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA). Panc02 solut ystävällisesti Dr. T. Hollingsworth, University of Nebraska Medical Center [19, 20]. Panc-1-Luc-ZsGreen solujen ja Panc02-Luc-ZsGreen soluja, jotka ilmentävät tulikärpäsen lusiferaasi ja ZsGreen vahvistettiin lentiviruksen transduktion plasmidin pHIV-Luc-ZsGreen, joka on talletettu Addgene (https://www.addgene.org /Bryan_Welm /), ja sen jälkeen kloonausta. Ihmisen keuhkorakkuloiden epiteelisolujen (HPAEpiC) ostettiin ScienCell (Carlsbad, CA, USA) ja niitä ylläpidettiin keuhkorakkuloiden epiteelin solujen väliaine (AEpiCM), jota oli täydennetty 2% naudan sikiön seerumia (FBS), epiteelisolujen kasvun täydennysosa (EpiCGS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, USA) ja kasvatettiin EBM-2, johon on lisätty EGM SingleQuats (Lonza). Mitokondriot DNA-vähemmän P29 (ρ

0P29) soluihin ja cybrid P29mtP29 solut, jotka vietiin takaisin kanssa P29 mtDNA osaksi ρ

0P29 solut perustetaan Lewisin keuhkosyöpä P29 soluissa [21]. Paksusuolen syövän soluja (Colo320DM, HT29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], mahasyöpä soluja (MKN1, MKN45) [23], keuhkosyövän soluja (A549, QG56, PC-10, PC-1) [24 ], rinta- syöpäsolujen (MCF7, BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-468) [25, 26], leukemia-soluja (THP-1, K562) [27], osteosarkooma-soluja (Saos-2) [28 ], kohdunkaulan syövän soluja (HeLa) [29], hepatoomasoluja (HepG2) [30], fibrosarkoomasoluissa (HT1080) [29], ja hiiren koolonkarsinooma LuM1 peräisin olevia soluja paksusuolen 26 kasvaimen [31] käytettiin myös tässä tutkimuksessa . HT29, LS174T, SW480, SW620 ja MDA-MB-468 ostettiin ATCC: ltä. MCF7 ja HT1080-solut saatiin JCRB Cell Bank. THP-1 ja K562-solut ystävällisesti Dr. Y. Honma, Shimanen yliopisto Lääketieteellinen tiedekunta. Mahalaukun syöpä solulinjoja toimittamia Patologian osasto (Dr. S. Morikawa), Shimanen yliopisto Lääketieteellinen tiedekunta. Muut solulinjat toimitti tohtori A. Nakagawara, Chiba Cancer Centerin Research Institute. Ominaisuudet solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on kuvattu muualla [19-31]. Leukemiasolulinjoja viljeltiin RPMI1640, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 40 ug /ml gentamysiini. Muut solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), joka sisälsi 10% FBS: ää ja 40 ug /ml gentamisiinin: ssa kosteutetussa ilmakehässä, jossa 21% O

2/5% CO

2 (normoksia), tai 1% O

2/5% CO

2 (hypoksia). Hypoksinen viljelyolosuhteet saavutettiin kosteutetussa automaattinen O

2 /CO

2 inkubaattoriin (Wakenyaku, Kioto, Japani).

reagenssit

[6] -Shogaol ja [6 ] -gingerol ostettiin TOKIWA phytochemical CO., Ltd. (Chiba, Japani).

valmistaminen inkivääriuute (SSHE) B

jauhe juuren osat Syussai Shoga (inkivääri japani), joka oli viljelty Hikawa alueella Izumo, Shimane prefektuurissa, uutettiin etanolilla (10: 1, tilavuus painonhallintaan) 20 minuutin ajan sonication vesihauteessa. Etanoli haihdutettiin 80 ° C: ssa, jolloin saatiin raakaa etanolia uutteen inkivääri (jäljempänä SSHE). Uute punnittiin ja liuotettiin etanoliin tai dimetyylisulfoksidissa (DMSO) halutussa konsentraatiossa.

Solun kasvun ja elinkyvyn

Solun kasvun ja elinkykyisyys mitattiin käyttämällä MTT (3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) määrityksessä. Lyhyesti, solut (2×10

4 solua /kuoppa) viljeltiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja käsiteltiin kolmena kappaleena 100 ui DMEM /10% FBS: ää, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia SSHE tai pelkkää liuotinta annetun ajanjakson. Lopussa Inkubaation 10 ui MTT: tä (2,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japani) lisättiin kuoppiin muodostumisen mahdollistamiseksi MTT formatsaanikiteet 4 tuntia. Jälkeen väliaine poistettiin, kiteet liuotettiin 100 ul: aan DMSO: ta. Absorbanssi rekisteröitiin 550 nm: ssä. Solujen elinkelpoisuus määritettiin myös jonka trypaanisinivärin -ekskluusiotestillä.

Solusyklianalyysiä

Panc-1-soluja käsiteltiin SSHE 20 h kiinnitettiin 70% etanolilla ja varastoitiin -20 ° C käyttöön asti. Kiinnitetyt solut pestiin Dulbeccon PBS: llä (DPBS), ja inkuboitiin 100 ug /ml RNaasi A: ta ja 50 ug /ml PI (Sigma-Aldrich Japani). Sitten solut altistettiin virtaussytometria-analyysillä käyttäen FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

mittaus mitokondrioiden membraanipotentiaalille

mitokondrioissa kalvon potentiaalia seurattiin JC- 1 Mitokondrioiden kalvojännite Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Tässä määrityksessä 100 ui /ml JC-1 Värjäys Solution lisättiin Panc-1-soluja käsiteltiin SSHE 20 h 6-kuoppaisille levyille, ja soluja inkuboitiin 15 min. Sen jälkeen solut irrotettiin trypsinoimalla, pestiin kahdesti koepuskurissa, ja altistetaan sitten virtaussytometrialla.

anneksiini V /propidiumjodidilla (PI) värjäämällä

anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BECKMAN COULTER Inc., Pasadena, CA) käytettiin tunnistamaan anneksiini V ja /tai PI-positiivisia soluja. Lyhyesti, Panc-1-solut pestiin jääkylmällä DPBS: llä ja sitten värjättiin anneksiini V-FITC: llä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä ja PI jääkylmään Binding Buffer. Anneksiini V ja /tai PI-positiiviset solut laskettiin käyttämällä FACS Calibur virtaussytometrillä.

mittaus ROS

tuotanto ROS seurattiin virtaussytometrialla 2 ’, 7’- dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H2DCFDA) (Molecular Probe-Life Technologies, Carlsbad, CA) ja mitokondrioiden superoksidi-ilmaisin MitoSOX Red (Invitrogen) koettimina. Lyhyesti, Panc-1-soluja käsiteltiin SSHE inkuboitiin 10 uM H2DCFDA tai 5 uM MitoSOX Red seerumivapaassa DMEM 10 minuutin ajan. Väliaine poistettiin ja solut irrotettiin lyhyt hoito 0,25% trypsiiniä Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen. Kun oli lisätty tuoretta viljelyalustaa, solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran DPBS: llä ja suspendoitiin DPBS: ssä. Fluoresenssia seurattiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä tai alle laser -konfokaalimikroskoopilla (Fluoview FV1000, Olympus, Tokio).

Western blotting

Solu-uutteet valmistettiin lysoimalla solut RIPA-puskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksikolaattia, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia, 2 mM EDTA, proteaasi-inhibiittoriseosta ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail) jäillä 20 minuutin ajan. Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit käytettiin seuraaviin analyyseihin. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja immunoblottaus analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat kanin monoklonaalista anti-SQSTM1 /p62 (D5E2, 1: 1000 laimennus, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kanin polyklonaalinen anti-LC3B (1: 1000 laimennus, Cell Signaling), kanin polyklonaalinen anti-fosfo- mTOR (S2481) (1: 1000 laimennus, Cell Signaling), kanin monoklonaalinen anti-mTOR (7C10, 1: 1000 laimennus, Cell Signaling), kanin monoklonaalinen anti-fosfo-AMPKα (T172) (40H9, 1: 1000 laimennus, Cell signalointi), ja kanin monoklonaalista anti-AMPKα vasta-ainetta (23A3, 1: 1000 laimennus, Cell signaling). Toissijainen vasta-aineet olivat HRP-konjugoitua kanin tai anti-hiiri-IgG: tä (1: 3000 laimennus, Cell Signaling). Sillä lastaus valvonta, anti-β-aktiini vasta-ainetta (sc-47778, 1: 3000 laimennus, Santa Cruz Biotechnology) käytettiin. Signaalit visualisoitiin käyttämällä ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Kalvot skannattiin Luminoimaging Analyzer LAS4000 (GE Healthcare).

immunofluoresenssivärjäyksellä

Pancin-1-soluja on käsitelty liuottimella yksinään tai SSHE fiksoitiin 4% formaldehydiä /5% sakkaroosia DPBS: ssä 20 min, huuhdeltiin DPBS: llä ja permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100 DPBS: ssä 4 min. Joissakin kokeissa solut värjättiin 100 nM MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) 10 minuuttia ennen kiinnitystä. Solut blokattiin 3% BSA /0,1% glysiiniä DPBS: ssä 1 h ajan, huuhdeltiin, ja sitten inkuboitiin kanin monoklonaalista anti-AIF (D39D2, 1: 200 laimennos, Cell Signaling) tai kaniinin polyklonaalista anti-LC3B-vasta-ainetta (1: 200 laimennos) 1 h. Perusteellisen pesemisen jälkeen DPBS: llä, soluja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG: tä (1: 300 laimennos, Invitrogen) 1 h. Solut vastavärjättiin DAPI ja tarkkailtiin laser skannaus -konfokaalimikroskoopilla.

Transmission (TEM) analyysi

Käsittelemätön Panc-1-soluja ja soluja käsiteltiin 200 ug /ml SSHE varten 28 h pantiin 2% paraformaldehydiä ja 2% glutaraldehydillä 30 mM HEPES-puskuria (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl

2, pH 7,4) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja sen jälkeen kiinnitettiin 1 % OsO

4 1 tunti 4 ° C: ssa. Näytteet olivat dehydratisoidaan porrastettu alkoholin ja upotettu TAAB812 hartsia (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, UK). Ultraohuet leikkeet värjättiin 1 tunti 3%: ista uranyyliasetaatilla, pestiin ja vastavärjättiin 0,3% lyijyä sitraattia, ja ne tutkittiin transmissioelektronimikroskoopilla (EM-002B, JEOL Ltd., Tokio, Japani).

GFP-LC3 plasmidin ja transfektio

EGFP-LC3B fuusio plasmidi (pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP) rakennettiin kloonaamalla LC3B cDNA, joka monistettiin PCR: llä, tulee pCMX-SAH /Y145F-GFP-vektorilla [33]. Konstrukti varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Panc-1 ells transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmidilla käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 tunnin kuluttua solut olivat altistuneet SSHE ja tutkitaan laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla.

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen institutionaalisten suuntaviivat hoitoon ja käyttöön eläimen tutkimus. Protokolla hyväksyttiin Izumo Campus Animal Care ja käyttö komitea Shimane University (Käyttöoikeus Number: IZ26-7). Kaikki hiiret oli sijoitettu eläinten keskellä Shimanen yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa valvotussa lämpötilassa 23 ± 2 ° C, suhteellinen kosteus 55 ± 10%, ja 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä sykliä. He saivat ruokaa ja vettä

halun

. Hiiret tarkastettiin heidän terveyttään aikana koko koejakson vähintään kerran päivässä jälkeen kasvaimen injektion. Kaikki Leikkaus suoritettiin medetomidiini (0,3 mg /kg) /midatsolaamia (4,0 mg /kg) /butorfanoli (5,0 mg /kg) anestesia. Hiiret normaalisti lopetettiin CO

2 hengitysteitse lopussa tutkimuksen. Sillä vatsakalvon levittämisen mallin, Panc02-Luc-ZsGreen soluja (5×10

5 solua /hiiri) injektoitiin intraperitoneaalisesti solujen suspension 7 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiriä (Crea Japani, Tokio, Japani), ja hiiret satunnaistettiin ja ryhmitelty ohjaus (n = 8) ja SSHE ryhmät (n = 8). Hoito-aloitettiin seuraavana päivänä tuumorin istutuksen jälkeen. Hiiret lopetettiin on CO

2 kammioon, kun ne olivat kuolemaisillaan, mitattuna puute jatkuvaa määrätietoinen vastaus lempeä ärsykkeisiin. Kaikki pyrkimykset lukien ihon alle ja meloksikaami (5 mg /kg) tehtiin minimoida kärsimyksen. Koe suoritettiin kahdesti ja yhdistetyn datan tehtiin analyysejä. Sillä ortotooppisten mallin haimasyövän, Panc-1-Luc-ZsGreen soluja (1×10

6 solua /hiiri) istutettiin 50% Matrigel haimaan 6-viikkoisen naaras-nude-hiirten (BALB /c nu /nu, Japan SLC, Shizuoka, Japani) [32]. Yksi viikko injektion jälkeen, ne satunnaistettiin ja ryhmitelty ohjaus (n = 6) ja SSHE ryhmät (n = 6). Hoito-aloitettiin viikon kuluttua kasvaimen injektion. Hiiren paksusuolen syöpä kokeissa LuM1 soluja (3 x 10

5 solua) ihon alle implantoitiin Balb /c-hiiriä (n = 6 torjunta- ja SSHE ryhmä). Volyymit LuM1 kasvainten arvioitiin mittaamalla kaksi kohtisuorassa halkaisijat jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: V =

(a

2

XB) /2

, jossa

on pieni halkaisija ja

b

läpimitta on suuri. Vuonna SSHE ryhmässä hiirille annettiin intraperitoneaalisesti 80 mg /kg SSHE kerran päivässä. Kontrolliryhmän hiirille annettiin pelkkää liuotinta DPBS: ssä.

Bioluminescent kuvantamisen

in vivo

bioluminescent kuvantaminen suoritettiin käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä (Etu Life Sciences, Hopkinton , MA). Kaikki hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti 150 mg /kg d-lusiferiini (Promega, Fitchburg, WI), ja ne nukutettiin 2,5% isofluraania. Kymmenen minuuttia myöhemmin, fotonit eläinten koko elimet oli kuvattu käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä (Caliper Life Sciences) mukaan valmistajan ohjeiden. Tiedot analysoitiin elävät kuva 2,50 ohjelmisto (Caliper Life Sciences).

Veri hematologian ja biokemian testit

Hiiret nukutettiin ja otettiin verta sydämestä. Perifeerisen veren profiilit analysoitiin Sysmex KX-21NV automatisoitu hematologian analysaattori (Sysmex, Kobe, Japani). Tasot valkosolujen (WBC), punasolut (RBC), verihiutaleiden (PLT), hemoglobiini (HGB), hematokriitti (HCT), MCV (MCV), keskimääräinen Punasolujen hemoglobiini (MCH), ja keskimääräinen solususpension hemoglobiinin pitoisuus (MCHC) tutkittiin. Glukoosi (Glu) tasot, kokonaiskolesteroli (T-Cho) tasot, alaniiniaminotransferaasin (ALT) ja aspartaattiaminotransferaasin (ASAT) tasot, ja veren ureatyppi (BUN) tasot analysoitiin automatisoidulla analysaattori kliinisen kemian, SPOTCHEM EZ SP- 4430 (Arkray, Inc., Kioto), käyttäen SPOTCHEM II testiliuskoja.

käänteisfaasilla korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) B

Nestekromatografianalyysi erotukset suoritettiin käyttämällä käänteisfaasi-C -18, 3 um, 2,4 x 250 mm: n kolonni (Cosmosil. Nakarai TESQUE, Inc., Kioto, Japani), virtausnopeudella 1 ml /min. Liikkuva faasi oli 70% metanolia. Eluutioprofiilia seurattiin UV-spektrofotometrillä 228 nm: ssä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkitys välillä aineistoja testattiin parittomia Studentin

t

testiä. Hiirten eloonjäämistä analysoitiin käyttäen log-rank-testi. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

SSHE estää solusyklin etenemisen ja aiheuttaa kuoleman haimasyövän solulinjoissa

hoito Pancin-1 solut SSHE varten 20 h johti pidätykseen G0 /G1 vaiheessa solusyklin (kuvio 1A). Nostamalla subG1 murto, ominaisuus apoptoosin, oli marginaalinen. SSHE lopulta aiheuttama kuolema Pancin-1-soluissa ja muissa ihmisen ja hiiren haimasyövän solulinjoissa (kuvio 1 B). Normaalit solut, kuten HUVEC ja HPAEpiC olivat resistenttejä SSHE verrattuna Panc-1-soluissa (kuvio 1C). Myöhemmissä vaiheissa solukuolemaa Panc-1-soluissa, polttoväli solukalvon repeämisen ja kutistuminen ydin oli ilmeinen (kuvio 1 D). On huomattava, että pirstoutuminen ytimen, toinen ominaisuus apoptoosin, oli harvoin tässä vaiheessa. SSHE oli myös tehokas indusoimaan kuoleman Panc-1-solujen hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 1 E). Se myös aiheutti merkittävän kasvun hidastumista ja kuoleman erilaisia ​​muita kasvainsolulinjoja, kuten paksusuolen syöpä, mahalaukun syöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä, leukemia, osteosarkooma, hepatooma, kohdunkaulan syöpä ja fibrosarkooman (S1 kuvio).

(A) Cell cycle. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml SSHE tai 200 ug /ml SSHE 20 h, kiinteät, värjättiin PI, ja altistetaan sitten cytometry. (B) Solujen elinkelpoisuus. Haimasyövän solulinjoissa käsiteltiin vehikkelillä tai eri pitoisuuksia SSHE 42 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Bars; SD. (C) vaikutus SSHE normaaleihin soluihin. HUVEC, HPAEpiC ja Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai 100 ug /ml SSHE 38 h. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Bars; SD. (D) Morfologia. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä (vasemmalla) tai 200 ug /ml SSHE 40 h (oikealla). (E) vaikutus SSHE on Pancin-1-soluissa hypoksisissa olosuhteissa. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai eri pitoisuuksia SSHE 42 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin MTT-määrityksellä.

SSHE indusoi autotic solukuolemaa sijaan apoptoosin tai necroptosis in Panc-1-soluissa

tutkimiseksi mekanismi, jonka SSHE indusoi kuoleman Panc -1-solut, tutkimme eri markkereita apoptoottisten solujen. JC-1 määritys paljasti vähentynyt selvästi mitokondrioita membraanipotentiaalille jälkeen SSHE hoidon (kuvio 2A). Anneksiini V /PI-värjäyksen myös kasvoi prosenttiosuuden anneksiini V-positiivisia ja /tai PI-positiivisia soluja, riippuen pitoisuudesta SSHE (kuvio 2B). Kuitenkin yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä zVAD-fmk ei parantaa solujen selviytymistä (kuvio 2C). Lisäksi pilkottiin kaspaasi 3 oli tuskin havaittavissa hoidon jälkeen 200 ug /ml SSHE 24 tuntia. Sen jälkeen SSHE hoito, lähes 30% soluista oli PI positiivisia, kun taas hoito Solujen pifithrin-μ ja TRAIL aktivoitu kaspaasi-3 (kuvio 2D), jolloin myös aiemman raportin [34]. Perustuen tietoihin, jotka viittaavat siihen, että SSHE ei lisännyt prosenttiosuus subG1 fraktion (kuvio 1A) eikä indusoi pirstoutuminen ytimet (kuvio 1 D), emme voineet saada konkreettisia todisteita apoptoosin SSHE saaneilla Pancin-1-soluissa. Lisäksi, translokaatio apoptoosin-indusoivan tekijän (AIF), mitokondrio kaspaasi-riippumaton syöttämällä efektori, tumaan ei ollut ilmeinen (S2 kuvassa), ja necrostatin-1, inhibiittori RIP1 kinaasi-välitteinen necroptosis, onnistuttu estämään SSHE- solukuolema (S2 Kuva). Näin ollen, ei ole mitokondrioita riippumaton apoptoosin eikä necroptosis oli mukana SSHE solukuolema.

(A) Mitokondrioiden kalvon potentiaalia. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml SSHE tai 200 ug /ml SSHE 20 tuntia, ja sitten altistettiin JC-1-määrityksellä. Terveet solut toiminnallisia mitokondrioita, jotka sisältävät punainen JC-1 J-aggregaattien ja apoptoottisten tai epäterveellistä soluja romahtanut mitokondrioita, jotka sisältävät pääasiassa vihreä JC-1 monomeerit havaittiin sytometrialla. (B) anneksiini V /PI värjäystä. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml SSHE tai 200 ug /ml SSHE 24 h ja sitten suoritettiin anneksiini V /PI-värjäyksen. (C) vaikutus zVAD-fmk (zVAD) on SSHE solukuolema. Panc-1-soluja inkuboitiin 42 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Bars; SD. (D) Kaspaasi-3 aktivaation. Panc-1-soluja inkuboitiin 200 ug /ml SSHE eri ajanjaksoja tai käsiteltiin 10 uM pifithrin-μ ja 100 ng /ml TRAIL 60 h (toimi positiivisena kontrollina). Solulysaatit altistettiin Western blot -analyysillä anti-kaspaasi-3-vasta-aine.

Toisaalta, SSHE merkittävästi lisäsi LC3-II /LC3-I-suhde, joka on indikaattori autophagosome muodostuksena, annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. SSHE myös vähentynyt SQSTM1 /p62-proteiinin tasoa, joka on yksi spesifisiä substraatteja hajonnut kautta autophagy-lysosomireitin, ja Panc-1-soluissa (kuvio 3A ja 3B). SSHE aktivoitu AMPK, positiivisena säätelijänä autophagy, ja esti mTOR, negatiivinen autophagic säädin (kuvio 3C ja 3D). Autophagy inhibiittorit 3-metyyliadeniinin ja klorokiini esti osittain solukuolemaa (kuvio 3E). Morfologisesti, SSHE käsiteltyjä soluja osoittivat massiivista vakuolisaation sytoplasman noin 24 tuntia käsittelyn jälkeen (kuvio 4A). Nämä sytoplasminen vacuoles todennäköisesti autophagosomes koska GFP-LC3 puncta esiintyi hoidon jälkeen SSHE (kuvio 4B). Jotkut LC3 puncta oli yhteistyössä paikallistaa MitoTracker-positiivisia mitokondriot soluissa käsiteltiin 100 ug /ml SSHE 20 h, mikä viittaa siihen, esiintyminen mitophagy (kuvio 4C). Siten SSHE solukuolema näytti olevan autophagic solukuolemaa. Kuitenkin TEM analyyseja 28 h kuluttua SSHE hoidon osoitti elektronitiheisiin mitokondriot, tyhjiä onteloita ja polttoväli perinuclear turvotus (kuvio 4D), joita ei ole havaittu klassista autophagy [35]. Niinpä pääteltiin, että SSHE solukuolema oli kaspaasi-riippumaton ja muistuttivat autophagy solukuolemaa. Tämä muoto solukuoleman osuu hyvin AutoSIS, äskettäin tunnettu Na

+, K

+ – ATPaasi-säänneltyjen solukuoleman muotoa [36]. Valitettavasti koska sydänglykosidi digoksiinin, antagonisti Na

+, K

+ – ATPaasi, joka on raportoitu estävän AutoSIS [36], oli liian sytotoksisia Pancin-1-soluissa, emme voineet arvioida sen vaikutuksia SSHE solukuolema.

(A) vaikutus SSHE ekspressioon autophagy liittyviä proteiineja. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml SSHE tai 200 ug /ml SSHE 24 tuntia. Solulysaatit altistettiin Western blot -analyysillä anti-SQSTM1 /p62 tai anti-LC3 vasta-aine. p-Actin toimi latauskontrollina. (B) aika-kulku muuntaminen LC3-I LC3-II. Panc-1-soluja käsiteltiin 200 ug /ml SSHE varten ilmoitettu kertaa. (C) AMPK ja mTOR ilme. Panc-1-soluja käsiteltiin 200 ug /ml SSHE eri aikoja. Solulysaatit altistettiin Western blot -analyysillä anti-AMPK, anti-fosfo-AMPK-vasta-ainetta, anti-mTOR, tai anti-fosfo-mTOR. p-Actin toimi latauskontrollina. (D) AMPK aktivointi ja mTOR inhibition SSHE. Voimakkuus bändejä (C) kvantitatiivisesti Image J ohjelmisto. (E) Vaikutus 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​ja klorokiinin (CQ) on SSHE solukuolema. Panc-1-soluja käsiteltiin SSHE on ilmoitetun pitoisuuden poissa tai läsnä ollessa 10 uM 3-MA (vasen) tai 40 uM CQ 42 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Western blot kuvaa (A-C) on rajattu esitettäväksi. Täysikokoinen kuvat on esitetty S13 kuvassa Bars; SD.

(A) Faasikontrasti-. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai 100 ug /ml SSHE 40 tuntia. Bars; 100 um. (B) LC-3 puncta. Panc-1-solut transfektoitiin pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP-vektorilla, käsiteltiin vehikkelillä tai 100 ug /ml SSHE 24 h ja havaittiin alle konfokaalisella laser mikroskoopilla. Bars; 20 um. (C) Kaksoisvärjäys MitoTracker ja anti-LC3 vasta-aine. Panc-1-soluja käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml tai 200 ug /ml SSHE 24 h, värjättiin 100 nM MitoTracker Red 10 minuuttia, kiinteä, ja käsiteltiin sitten LC3 immunovärjäyksellä. Bars; 20 um. (D) ultrastruktuuri. Pancin-1-solujen käsiteltyjen ajoneuvo yksin tai 200 ug /ml SSHE 28 tuntia käsiteltiin TEM analyysiä. Alkuperäinen suurennos, x2,500. PC, perinuclear tilaa.

Mitokondrioiden ROS sukupolvi on mukana SSHE-solukuolema

Muutokset ROS sukupolvi, joka arvioidaan H2DCFDA värjäys käsittelyn jälkeen Panc-1-solujen kanssa SSHE osoitti kaksivaiheinen malli. Alkuvaiheessa (noin 10 h), ROS sukupolvi estyi SSHE (S3 kuvassa). Kuitenkin pitkäaikainen hoito johti voimakkaaseen kasvuun ROS sukupolvi (kuvio 5A ja 5B). MitoSOX Red värjäys osoitti myös tuotannon kasvun mitokondrioiden superoksidi (S4 kuvio). Antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC) vaimensi merkittävästi indusoimaa solukuolemaa SSHE kuin arvioinut trypaanisinivärin -ekskluusiotestillä (kuvio 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, ROS: n syntyminen syyksi SSHE solukuolema.

(A) Panc-1 solut, joita käsiteltiin vehikkelillä, 100 ug /ml SSHE tai 200 ug /ml SSHE 20 h värjättiin 10 uM H2DCFDA 10 minuuttia ja välittömästi niitä tarkkailtiin konfokaalisella laser mikroskoopilla. (B) Pancin-1-soluja käsitellään A joutuivat cytometry. (C) vaikutus NAC on SSHE aiheuttamaa solukuolemaa. Panc-1-soluja käsiteltiin 200 ug /ml SSHE läsnä tai poissa ollessa 10 mM NAC 42 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin jonka trypaanisinivärin -ekskluusiotestillä. Bars; SD.

Mitochondria ilmoitetaan olevan ensisijainen lähde ROS tarvitaan autophagy induktioon [37]. Sen tutkimiseksi, onko mitokondrion ROS rooli SSHE aiheuttama autotic solukuoleman, käytimme mitokondriaalisen DNA (mtDNA) -tön ρ

0P29 soluja, jotka ovat peräisin oli Lewisin keuhkokarsinooma, P29-solut, ja P29mtP29 soluja, jotka muodostetaan uudelleen käyttöön villin kirjoita mtDNA osaksi ρ

0P29 soluja. Kun ρ

0P29 soluja käsiteltiin SSHE he tuskin tuotettu ROS, kun taas P29mtP29 solut riittävästi valmistettu ROS (S5 kuvio). Mielenkiintoista, ρ

0P29 solut paljastui olevan vastustuskykyisiä SSHE verrattuna P29mtP29 soluihin (S5 kuvio).

SSHE hidastaa kasvaimen kasvua haimasyövän

Kun Panc02-Luc-ZsGreen soluissa (5 x 10

5 solua) vatsaonteloon istutetaan C57BL /6, ne pyrkivät muodostamaan levitetty kyhmyjä ensisijaisesti ympärillä haima ja vatsakalvon pintaan, ja hiirille kehittyi askites (noin 2,4 ml /hiiri kuolemaisillaan olevien) ( S6 kuvio). Tutkimme terapeuttinen teho SSHE tässä vatsakalvon levittämiseen mallia. Bars, SD. Bars, SD.