Krooninen sairaus

tiivistelmä

Antrasykliinejä (kuten doksorubisiini tai daunorubisiini) ovat yksi tehokkaimmista syöpälääkkeet, mutta niiden käyttökelpoisuutta vaikeuttaa riskin peruuttamaton kardiotoksisuuden. Deksratsoksaani (ICRF-187) on ainoa kliinisesti hyväksytty sydäntä aineena antrasykliinin kardiotoksisuuden. Sen toiminta on perinteisesti katsottu johtuvan rauta-kelatoivien vaikutukset sen aineenvaihduntatuotteen myöhempien suojaa oksidatiivista stressiä. Kuitenkin deksratsoksaani on myös katalyyttinen estäjä topoisomeraasi II (TOP2). Siksi me tutki deksratsoksaanin ja kaksi muuta TOP2 katalyyttinen estäjiä eli sobuksoksaani (MST-16) ja merbaronin, suojaavat cardiomyocytes päässä antrasykliini myrkyllisyys ja arvioida niiden vaikutukset antrasykliini antineoplastisten tehosta. Deksratsoksaani ja kaksi muuta TOP2 estäjien suojattu eristetty vastasyntyneen rotan sydänlihassolujen vastaan ​​aiheuttama myrkyllisyys Sekä doksorubisiini ja daunorubisiini. Kuitenkin mikään TOP2 estäjien merkittävästi suojattu sydänlihassoluja mallissa vetyperoksidin aiheuttaman oksidatiivisen vahinkoa. Sen sijaan, katalyyttisen inhibiittorit eivät vaaranna antiproliferatiivisia vaikutuksia antrasykliinien, että HL-60-leukemiasolulinjan; sen sijaan, synergistiset vaikutukset olivat enimmäkseen havaittavissa. Lisäksi antrasykliinin aiheuttamasta kaspaasin aktivaatio differentiaalisesti moduloidaan TOP2 inhibiittorit sydämen ja syöpäsoluja. Kun taas deksratsoksaani oli hydrolyysissä pystynyt merkittävästi kelaatin solunsisäiseen labiili rauta- ioneja, ei tällaista vaikutusta todettiin joko sobuksoksaani tai merbaronin. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että deksratsoksaani saattaa suojata sydänlihassolujen

kautta

sen katalyyttinen TOP2 estävä aktiivisuus pikemminkin kuin rauta-chelation aktiivisuutta. Differentiaalinen ilmaisun ja /tai sääntelyn TOP2 isomuotojen sydämen ja syöpäsolujen katalyyttinen inhibiittorit voivat olla vastuussa selektiivinen modulaatio antrasykliinin toimintaa havaitaan.

Citation: Vavrova A, Jansova H, Macková E, Machacek M, Haskova P, Tichotova L, et ai. (2013) katalyyttinen estäjät topoisomeraasi II Eri moduloida myrkyllisyys antrasykliinien sydämen ja syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10,1371 /journal.pone.0076676

Editor: Rajesh Mohanraj, UAE yliopisto, Lääketieteellinen tiedekunta Health Sciences, Arabiemiirikunnat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2013; Hyväksytty: 25 elokuu 2013; Julkaistu: 07 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Vavrova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Tšekin tiedesäätiön (hanke 13-15008S; www.gacr.cz), Kaarlen yliopisto (hanke SVV 267 004, www.cuni.cz) ja osarahoittaa Euroopan sosiaalirahastosta ja valtion talousarvio Tšekissä (projekti no. CZ.1.07 /03.02.00 /30,0022, www.msmt.cz). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Antrasykliinin (ANT) antibiootit, kuten doksorubisiini (DOX, kuva 1), daunorubisiinin (DAU, kuva 1) tai epirubisiini, joukossa tehokkain ja usein käytetyt syöpälääkkeet ja yhä välttämättömiä komponentteja nykyaikaisten kemoterapiaohjelmat lukuisille hematologisia syöpäsairauksia sekä kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin riski peruuttamatonta ja mahdollisesti hengenvaarallisia myrkyllisyys sydänkudoksen on tärkein haittapuoli ANT käyttö kliinisessä käytännössä [1].

Antrasykliinejä doksorubisiinin (DOX) ja daunorubisiini (DAU) ja topoisomeraasi II katalyyttinen estäjät deksratsoksaani ( DEX), sobuksoksaani (SOB) ja merbaronin (MER) käytettiin tässä tutkimuksessa.

lukuisia hypoteeseja on ehdotettu koskien mekanismeista sekä antineoplastinen ja kardiotoksisia vaikutuksia muurahaisia ​​[2]. Tällä hetkellä topoisomeraasi II (TOP2) pidetään yleisesti pääasiallisena molekyylikohteena ANT antituumorivaikutuksen toimintaa. ANTS kuuluvat ryhmään ”TOP2 myrkkyjä”, jotka koostuvat sytotoksisia aineita, jotka stabiloivat ”katkaistavissa monimutkainen” [3]. Kannalta kardiotoksisuuden, rauta (Fe) -catalysed intramyocardial reaktiivisten hapen lajien (ROS) on perinteisesti ollut mukana. C rengas ANT aglykoni helposti läpikäy redox-pyöräily, ja Fe-ionit voivat muodostaa hapetus-aktiiviset aineet muurahaisia, jolloin muodostuu superoksidi, peroksidi ja lopulta erittäin reaktiivinen ja toksinen hydroksyyliradikaaleja [4], [5].

Tämä perinteinen ”ROS ja Fe” hypoteesi ANT-kardiotoksisuuteen on vahvistettu suojaava tehokkuus deksratsoksaani (DEX, ICRF-187, kuvio 1), joka on ainoa kliinisesti hyväksytty sydäntä suojaavan. Sydäntä suojelevat vaikutukset DEX on katsottu johtuvan hydrolyysituotteensa ADR-925, silmiinpistävän samankaltaisia ​​tunnettu metallikelaattorin EDTA. Sen jälkeen aineenvaihduntaa DEX osaksi ADR-925, tämä tuote voi kelatoivat vapaasti ja redox-aktiivisen solunsisäisen Fe ja /tai korvata Fe ANT-Fe komplekseja, mikä estää paikkasidonnainen hydroksyylitähdettä muodostumista ja hapettumista sydänkudoksen [6].

kuitenkin DEX on myös vakiintunut katalyyttinen estäjä TOP2 [7], ja siksi sitä ei voida sulkea pois, että DEX voinut käyttää suojaavia vaikutuksia häiritsemällä ANT aiheuttama TOP2 myrkytys sydämessä [8], [9]. Todellakin, tuoreessa tutkimuksessa raportoitiin, että poisto TOP2 beetaisomuoto (

TOP2B

geeni) suojattu sydänlihassolujen DNA double-säikeen katkoksia ja transcriptome aiheuttamien muutosten akuutti in vivo DOX hoidossa, minkä jälkeen ehkäisy viallisten mitokondrioiden biogeneesiä ja ROS muodostumista. Lisäksi sydänlihassolujen-erityisiä poisto

TOP2B

geeni suojattuja hiiriä kehittyy progressiivinen sydämen vajaatoiminnan aiheuttama toistuva DOX hoito, mikä viittaa siihen, että DOX-kardiotoksisuuteen välittyy pääasiassa sydänlihassolujen TOP2B [10].

Kysymyksiä johtuvat aiemmista tutkimuksista kannusti meitä tutkimaan osallistumista TOP2 vuonna ANT kardiotoksisuutta ja arvioimaan muiden TOP2 katalyyttinen estäjien mahdollisina sydäntä suojaavat. Tässä tutkimuksessa käyttämällä ensisijaisena viljelmiä eristetyn rotan vastasyntyneen kammion sydänlihassolujen (NVCMs), tutkimme suojaavia vaikutuksia DEX ja kaksi muuta katalyyttinen estäjiä top2, sobuksoksaani (SOB, MST-16, kuva 1) ja merbaronin (MER, kuva 1 ), vastaan ​​kardiotoksisuus aiheuttama DAU ja DOX. Vertailun vuoksi tutkimme myös vaikutuksia näiden aineiden mallin H

2O

2 aiheuttamaa oksidatiivista cardiomyocyte vammoja. Lisäksi HL-60-leukemiasolulinjan käytettiin arvioimaan, TOP2 katalyyttinen estäjät voivat vaikuttaa ANT kardiotoksisuuden vaarantamatta antiproliferatiivinen teho vastaan ​​leukeemisia syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

1. Materiaalit

Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), DMEM, jossa ravinneseosta F-12 (DMEM /F12), hevosen seerumia (HS), naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä /streptomysiiniä liuosta (5000 U /ml ; P /S) ja natriumpyruvaattia (100 mM; PYR) ostettiin Lonza (Belgia). Seerumit inaktivoidaan ennen käyttöä. DEX saatiin Huaren Chemicals (Chang-Zhou, Kiina). RPMI-1640-väliaineessa, jossa L-glutamiinia ja NaHCO

3, maitohappo, nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD

+), MTT: tä (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi bromidi, SOB, MER, dimetyylisulfoksidia ja 4- (2-hydroksietyyli) -1 piperazineethanesulphonic happo (HEPES) ostettiin Sigma (Tšekki) ja muita kemikaaleja (esim ainesosia eri puskureita) alkaen Penta (Tšekki) ja olivat korkeimmat käytettävissä lääke- tai analyysilaatua. Dimetyylisulfoksidi käytettiin liuottamaan DEX, SOB ja MER. Muovinen varten soluviljelmä saatiin TPP (Sveitsi).

2. sydänlihassolujen eristäminen ja myrkyllisyyden arvioinnit

Kaikki eläin menettelyt ja valmistelua NVCMs hyväksyttiin ja valvoma Kaarlen yliopiston animal Care komitea. primaariviljelmät NVCMs valmistettiin 2-päivän ikäiset Wistar. eläimet nukutettiin CO

2, ja mestattu. arkut avattiin ja sydämet kerättiin jääkylmään Ca

2 + vapaata puskuria, joka sisälsi 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1,2 mM MgSO

4, 1,13 mM NaH

2PO

4, 5 mM glukoosi ja 20 mM HEPES (pH 7,40). Kammiot perusteellisesti jauhettu ja sarjaan pilkottiin seosta kollagenaasia (0,25 mg /ml; Invitrogen, USA) ja pankreatiinia (0,4 mg /ml; Sigma) liuokseen 37 ° C: ssa. Solususpensio asetettiin suurelle (15 cm) petrimaljaan (n. 20 sydämet per malja), ja jätettiin 2 h 37 ° C: ssa erottaa myocytes (kelluu väliaineessa) fibroblasteista (kiinnitetty lautasen). Lihassolu–rikas jousitus kerättiin ja elävät solut laskettiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla. Eristäminen menettely johti konfluentin solujen yksikerroksista kanssa ~90% sydänlihassolujen pelaajan synkronoidusti. Arvioimaan sytotoksisuuden, solun morfologia ja kaspaasiaktiivisuus, solut maljattiin 12-kuoppaisille levyille, jotka oli esipäällystetty 1% gelatiinia tiheydellä 0800000 solua kuoppaa kohti. Mitata glutationi sisältöä, solut maljattiin 60 mm: n petrimaljoille tiheydellä 4800000 solua per malja. NVCMs viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, DMEM /F12, johon oli lisätty 10% HS, 5% FBS: ää, 4% PYR ja 1% P /S. Vasta eristetty NVCMs jätettiin 40 h, sitten väliaine vaihdettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 5% FBS: ää, 4% PYR ja 1% P /S. Elatusaine korvattiin kerran toisensa jälkeen 24 h. Kaikki kokeet alkoi neljäntenä päivänä eristämisen jälkeen. Käyttäen sekä seerumin ja PYR-väliaineessa, NVCMs inkuboitiin 37 ° C: ssa testattavien aineiden joko yksin tai yhdistelmänä. Aktiivisuus laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautunut sydänlihassolujen määritettiin soluviljelyalustoissa standardina merkki sytotoksisuuden ja solujen jakautuminen käyttäen vakiintuneita spektrofotometrinen menetelmä; meidän aiemmissa tutkimuksissa, tämä menetelmä korreloi hyvin julkaisun sydän- erityisiä troponiinit T ja I [11]. LDH-aktiivisuus vapautuu sydänlihassolujen ilmaistiin prosentteina koko solun LDH mitattuna solulyysiksen jälkeen 15 min (0,1 M kaliumfosfaatti, 1% Triton X-100, 1 mM DTT: tä [(-) -1,4-ditio -L-treitolilla], 2 mM EDTA, pH 7,8) huoneenlämpötilassa. Kaikki näytteet jäädytettiin välittömästi ja säilytetään -80 ° C: ssa ennen mittausta. LDH-aktiivisuus määritettiin Tris-HCl-puskuria (100 mM, pH 8,9), joka sisälsi 35 mM maitohappoa ja 5 mM NAD:

+. Nopeus NAD

+ vähennys tarkkailtiin spektrofotometrisesti 340 nm: ssä 2 minuutin ajan. Kulmakerroin lineaarisen alueen ja molaarisen absorptiokertoimen e = 6,22 * 10

3 M /cm käytettiin laskemiseen LDH-aktiivisuus ja data ilmaistiin prosenttiosuutena koko LDH määrästä.

Muutokset solumorfologialtaan dokumentoitiin käyttäen Eclipse TS100 käänteinen epifluoresenssimikroskooppia (Nikon, Japani), ja NIS-elementit AR 2,20 ohjelmisto (Laboratory Imaging, Tsekin tasavalta). Visualisoida aktiivisia mitokondrioita, solut ladattiin 0,5 uM JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Pieninä pitoisuuksina, JC-1 esiintyy soluissa vihreä-fluoresoiva monomeerisen muodon ja kerääntyy aktiivisesti respiring mitokondrioissa. On JC-1 monomeerien aggregoitua ohjaa olemassa olevien kalvon mahdollinen ero (ΔΨ

m) sisemmän ja ulomman mitokondriokalvon. Tämä ΔΨ

m-riippuvainen muodostumista ”J-aggregaattien” edustaa aivohalvauksen-shift vihreästä punaiseksi fluoresenssin.

3. Leviämisen tutkimukset

HL-60-solulinja, joka on johdettu potilaasta, jolla akuutti promyelosyyttinen leukemia [12], hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% P /S 75-cm

2 kudosviljelykolveissa) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Proliferaatiomäärityksissä, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 10000 solua per kuoppa. Yhdistelmä tutkimukset suunniteltiin mukaan Chou – talalay menetelmä [13]. Lyhyesti, pitoisuudet kelaattorien asiakkuutta 50% proliferaation vähennys (IC

50) kaikkien yksittäisten aineiden ensin määritettiin. Sitten molemmat yksittäisten aineiden ja yhdistelmän seoksia testattiin vastaavina pitoisuuksina useita fraktioita ja kertoimiin (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) niiden yksittäisten IC

50-arvot.

Soluproliferaatio arvioitiin käyttämällä elinkyvyn perustuu kykyyn aktiivisen mitokondrioita muuttaa keltaista 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyltetrazolium bromidi tetratsolia (MTT, Sigma) violetti formatsaaniksi mukaan valmistajan ohjeiden Lyhyesti, 25 ui 3 mg /ml MTT-liuosta fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa lisättiin viljelyalustaan ​​(100 ui) ja sen jälkeen 2 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa solut lyysattiin lyysipuskurilla (isopropanoli , 0,1 M HCl: lla, 10% Triton X-100) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Liuottamisen jälkeen optinen tiheys liukoisen MTT mitattiin käyttäen Tecan Infinite 200 M levynlukijalla λ = 570 nm, vähentämällä λ = 690 nm tausta. Lisääntyminen hinnat koeryhmät ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien kontrollien (100%).

4. Arviointi kaspaasiaktiivisuus

toiminta caspases 3/7, 8 ja 9 määritettiin käyttäen kaupallista kittiä (Caspase Glo määritykset, Promega, USA), joka perustuu kykyyn caspases pilkkoa tiettyjä aminohapposekvenssejä esillä in substraatti lusiferaasin. Kaspaasit toiminta määritettiin suhteessa valkuaispitoisuus, joka arvioitiin käyttämällä bikinkoniini- happoa menetelmän mukaisesti valmistajan protokollan (Sigma). Lysaatit laimennettiin yhtä suuri proteiinin pitoisuudet.

5. Kokonaismäärän määritys ja hapettuneen glutationin

NVCMs pestiin PBS: llä (2 x 2,5 ml, 4 ° C), otettiin talteen solukaapimella, ja sentrifugoitiin (10 min, 700 x g, 4 ° C), ja pelletti suspendoitiin uudelleen 250 ul: aan 4 ° C: ssa kylmää sulfosalisyylihappo (Sigma) ja sonikoitiin sitten jäillä 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Saksa). Sitten näytteet sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 18000 x g, ja supernatantit käytettiin määrittämään määrää vähennetään ja hapettuneen glutationin (GSH /GSSG) mukainen Tietze [14] käyttämällä entsymaattista kierrätys menetelmää 5,5′-Ditio bis (2-nitrobentsoehappo) (Sigma) ja GSH-reduktaasi (Sigma) mikrolevyn muodossa. Nopeus 2-nitro-5-merkapto- happo muodostus kirjattiin 405 nm: ssa 2 min ja rinne verrattiin standardikäyrän hapettuneen glutationin (GSSG). Pitoisuus yhteensä glutationin (GSH + GSSG) laskettiin käyttäen menetelmää lineaarisen regression, tulokset korjattiin proteiinipitoisuus ja ilmaistaan ​​prosentteina glutationi kontrollinäytteessä (100%). GSSG pitoisuus näytteessä määritettiin jälkeen johdannaisen GSH 2-vinyylipyridiini (Sigma). Tulokset korjattiin proteiinipitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen bikinkoniini- happoa mukaista menetelmää valmistajan protokollan (Sigma).

6. Virtaussytometria solusyklin analyysi

inkuboinnin jälkeen, HL60-soluja sentrifugoitiin 300 x g, pestiin PBS: ssä 5% FBS: ää (PBS + FBS) ja suspendoitiin pieneen määrään PBS: ää + FBS: ää. Sitten jääkylmää 70% etanolia, lisättiin tipoittain, ja solut kiinnitettiin 3 tuntia – 20 ° C: ssa. Kiinnityksen jälkeen etanoli poistettiin sentrifugoimalla; Solut pestiin PBS: llä + FBS: ää ja suspendoitiin 4 mM natriumsitraattia PBS + FBS: ää. Lopuksi soluja inkuboitiin 200 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma) ja 30 ug /ml propidiumjodidia (PI) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut analysoitiin käyttäen Accuri C6 virtaussytometrillä (Accuri Solumittauslaitteet Europe Ltd., UK), kuten aiemmin on kuvattu [15]. PI viritettiin 488 nm: ssä, ja fluoresenssia analysoitiin 585 nm (FL-2). Per analyysi, 10000 tapahtumaa kerättiin. Solusyklianalyysiä arvioitiin käyttämällä multicycle AV Software (Phoenix Flow Systems, USA). Solusyklin luvut luotiin Cyflogic ohjelmisto (CyFlo Oy, Suomi).

7. Calcein-AM määritys määrityksissä solunsisäisen Fe-kelatoivia ominaisuuksia

Kokeet analysoimalla Fe-kelatoivaa solunsisäisen hyötysuhteet tarkastelluilla agentit suoritettiin Glickstein et al. [16] pienin muutoksin. H9c2 solulinja on peräisin alkion rotan sydänkudoksen [17] hankittiin American Type Culture Collection (USA). Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% P /S ja 10 mM HEPES: in 75 cm

2 kudosviljelypulloissa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Aliyhtyvät solut jatkoviljeltiin 3-4 päivän välein. H9c2-solut ympättiin 96-kuoppalevyille (10000 solua per kuoppa) ja jätettiin 24 tunnin liittää. Sen jälkeen elatusaine korvattiin serum- ja pyruvaatti-DMEM: llä. 24 tunnin kuluttua seerumin puutteen, solut olivat pääasiallisesti ei-lisääntyvän, ja niitä käytettiin kokeissa. Solut ladattiin 100 uM rauta-ammoniumsitraattia (FAC) seerumittomassa väliaineessa 24 h ennen koetta. Sitten solut pestiin, ja estää mahdolliset häiriöt (erityisesti eri hivenaineiden) alusta korvattiin puskurilla valmistettu Millipore-suodatettua (demineralisoitua) vettä, joka sisälsi 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM CaCl

2, 1,2 mM MgSO

4, 1,13 mM NaH

2PO

4, 5 mM glukoosi ja 20 mM HEPES (pH 7,4). Sitten soluihin lisättiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa 1 uM solun läpäisevä asetoksimetyyliesteriä calceinia vihreää (Molecular Probes /KRD, Tsekin tasavalta), ja pestään. Cellular esteraasit pilkkovat asetoksimetyyli ryhmät tekevät solukalvon läpäisemätön calcein vihreä, joka fluoresenssi pysäytettiin FAC. Solunsisäinen fluoresenssi (λ

ex = 488 nm; λ

em = 530 nm) seurattiin sitten 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa käyttäen Infinite 200 M (TECAN, Itävalta). DEX, SOB ja MER verrattiin vahva lipofiilistä Fe kelaattoria SIH, jota käytettiin referenssinä aineena.

8. Data-analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Tiedot suoritettiin yksisuuntainen tai kaksisuuntainen ANOVA Dunnettin testin jälkeen käyttäen GraphPad Prism 5,00 (GraphPad Software, Kalifornia, USA) kanssa P≤0.05 kuin taso merkitys. Kaikki mittaukset tehtiin yli neljä itsenäistä kokeita. IC

50-arvot (pitoisuus aineiden asiakkuutta 50% proliferaation väheneminen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin) sekä yhdistelmä indeksin arvot (

CI

-a kvantitatiivinen mitta aste Lääkeyhteisvaikutuksen) laskettiin käyttäen CalcuSyn- 2.0 ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, UK).

IC

50-arvot (pitoisuus aineiden indusoimiseksi 50% proliferaation väheneminen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin tai mediaanivaikutusyhtälöstä annos) laskettiin seuraavasti:

Missä

F

on osa vaikuttaa (proliferaatio estyy) jonka lääkehoitoa;

F

u

on estoton fraktio;

D

x

on lääkeannos;

D

m

on mediaanivaikutusyhtälöstä annos (IC

50) ja m on kulmakerroin käyrän. Jälkimmäinen ohjelmistoa käytettiin myös saada yhdistelmä indeksi (

CI

) -a tiukka määrällinen mitta aste Lääkeyhteisvaikutuksen:

Missä

D

ja

D

b

ovat annoksia lääkkeitä käytetään yhdessä, kun taas

D

xa

ja

D

xb

ovat isoeffective annoksia. Chou ja Talalay kuvaavat lääkeyhteisvaikutukset kannalta lähes additiivinen vaikutus (

CI

0,9-1,1), vähäinen synergia (

CI

0,85-0,90), kohtalainen synergia (

CI

0,7-0,85), synergia (

CI

+0,3-0,7), epätehokkaalla (

CI

+0,1-+0,3), erittäin voimakas synergia (

CI

0,1) lievää antagonismi (

CI

1,1-1,2), kohtalainen antagonismi (

CI

1,20-1,45), antagonismi (

CI

1,45-3,3), voimakas antagonismi (

CI

3,3-10) tai erittäin voimakas antagonismi (

CI

10). Lisäksi arvioida muutoksia lääkeaineinteraktioita funktiona pitoisuuden tai aktiivisuuden, murto vaikuttaa (

F

) – yhdistelmä indeksi (

CI

) tontteja laskettiin CalcuSyn tietokonesimulaatioiden.

tulokset

1. In vitro sydäntoksisuuden tutkimuksissa

Ensinnäkin kardiotoksisia vaikutuksia muurahaisten ja mahdollisten suoja- toimenpiteiden arviointi käyttäen aiemmin julkaistu protokolla [18], joka koostuu 3-h altistuminen NVCMs on DAU tai DOX, mitä seurasivat pesut poistamiseksi muurahaisia ​​ja lihassolujen inkuboitu ANT-väliaineessa; soluvauriosta määritettiin käyttäen LDH vapautumisen määrityksellä. Kuten havaitaan kuviossa 2A-B, altistuminen eristetyn sydänlihassolujen ja DAU tai DOX: ssa 3 tuntia ja sen jälkeen 48-h pesujakso johti tilastollisesti merkittävän menetyksen elinkelpoisuuden (määritetään prosenttiosuus kaikista LDH: n vapautuminen) vaihtelevat -20 % 0,6 uM molempien muurahaisia ​​noin 55% 2,0 uM. Pre-solujen inkubaation 10, 100 ja 1000 uM DEX 3 h indusoi merkittävää suojaa myrkyllisyys molemmat muurahaisia ​​pitoisuuteen saakka 1,2 uM (DAU) ja 1,4 uM (DOX). Tämä vaikutus ei näytä olevan annosriippuvainen, sillä useimmissa kokeissa 10 uM ja 100 uM DEX pitoisuudet tarjosi paremman suojan kuin 1000 uM (kuva 2A-B). Sen sydänlihassolujen alttiina oksidatiivisen stressin aiheuttavalle aineelle H

2O

2, myrkyllisyys vaihtelee ~36% 200 uM -50% 500 uM H

2O

2 havaittiin. Kuitenkaan mitään merkittävää suojaa H

2O

2 aiheuttamaa toksisuutta havaittiin mitään analysoituna pitoisuus DEX (kuvio 2C). Jatkotutkimuksiin, 1,2 uM DAU tai DOX valittiin, koska tässä keskittyminen sekä muurahaiset aiheuttivat merkittävää toksisuutta ehkäistävät DEX esi-inkubointi. Vastaavasti 300 uM H

2O

2 valittiin vertailuun, koska tämä pitoisuus aiheutti verrattavissa myrkyllisyys 1,2 uM DAU tai DOX. Kolmesta TOP2 katalyyttinen estäjiä käytetään tässä tutkimuksessa, DEX (10-1000 uM) ja SOB (pitoisuus enintään sen liukoisuusraja 300 uM) ei aiheuttanut merkittävän menetyksen NVCM elinkelpoisuuden. Kääntäen, MER näytteillä merkittävää myrkyllisyyttä pitoisuuksina ≥60 uM (kuvio 3D). DEX, SOB ja MER verrattiin sitten niiden sydäntä mahdollisten konsentraatiossa 30 uM, eli korkein pitoisuus, jossa yksikään lääkkeiden indusoiman oman toksisuuden. Kaikki kolme TOP2 katalyyttinen inhibiittorit pystyivät osittain mutta merkittävästi suojata NVCMs vastaan ​​1,2 uM DAU tai DOX kanssa -10 – 15% myrkyllisyyden vähentäminen verrattuna DAU tai DOX myrkyllisyys yksin, mutta TOP2 estäjiä ei ollut merkittävää vaikutusta myrkyllisyyttä aiheuttamaa 300 uM H

2O

2 (kuvio 3A-C).

Soluja esi-inkuboitiin kolme pitoisuudet deksratsoksaanin 3 tuntia ja sitten co-inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa antrasykliinien daunorubisiini (DAU, A) tai doksorubisiinin (DOX, B) 3 h jälkeen 48-h antrasykliini-vapaa ajanjakso tai 48 tuntia H

2O

2 (C). Myrkyllisyys arvioitiin kuten% kaikista laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautuu sydänlihassoluja soluun elatusaineeseen. Saadut tiedot ≥4 itsenäisestä kokeesta ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, tilastollinen merkitsevyys: c – verrattuna huumeettomia ohjaus (DMSO); d – verrattuna DAU tai DOX; p – verrattuna H

2O

2 (yksisuuntainen ANOVA Dunnettin testin jälkeen, P≤0.05).

Vastasyntyneen rotan sydänlihassolujen esi-inkuboitiin deksratsoksaanihoidon (DEX) , sobuksoksaani (SOB) tai merbaronin (MER) 3 h ja sitten inkuboitiin antrasykliineillä daunorubisiini (DAU, A) tai doksorubisiinin (DOX, B) 3 h jälkeen 48-h antrasykliini-vapaa ajanjakso tai 48 tuntia vetyperoksidilla (H

2O

2, C). DEX, SOB ja MER yksittäisten myrkyllisyyttä kuluttua 48-tunnin inkuboinnin näkyy paneelissa D. vaikutukset DEX esikäsittely 3 h 3-h DAU inkubointi ja myöhemmin 48-h DAU vapaakausi solu- hapettuneen ja pelkistetyn glutationin pitoisuus on esitetty paneelissa E. saadut tiedot ≥ 4 itsenäisestä kokeesta ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, tilastollinen merkitsevyys: c – kontrolliin verrattuna; d – verrattuna DAU tai DOX (yksisuuntainen ANOVA Dunnettin testin jälkeen, P≤0.05).

Kuten havaitaan kuviossa 3E, inkubointia NVCMs 1,2 uM DAU 3 tuntia, minkä jälkeen 48 h DAU väliaineessa ei johtanut tilastollisesti merkittävää kasvua joko GSH tai GSSG huolimatta merkittävää toksisuutta aiheuttamien keskittyminen ja inkubaation aikataulu. Ennalta inkubointi sydänlihassolujen 30 uM DEX 3 h seurasi koinkubaation kanssa DAU osoittivat merkityksetön nousussa kasvu GSH, mutta tämä tapahtui ilman muutoksia GSSG. Ohjaus inkubointi DEX yksinään ei aiheuttanut mitään merkittävää eroa säätöarvot joko GSH tai GSSG (kuvio 3E).

Kolmen tunnin altistuminen NVCMs 1,2 uM DAU tai DOX aiheuttanut voimakkaita muutoksia cardiomyocyte morfologiassa mukaan lukien sytoplasman vakuolisaatiota ja rakeisuuden, joka eteni osaksi lopettamisen solun yksikerroksisen ja solu- ja ydinvoiman kutistuminen. Sydänlihassoluja värjättiin JC-1 koetin, ja sen signaali visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Sen jälkeen altistuminen DAU tai DOX oli näkyvään siirtymän normaalin puna-värjätty mitokondriot polarisoiduilla sisemmän kalvoja hajanainen vihreän fluoresenssin osoittaa kuolevat solut depolaroidulla mitokondrioita. Pre-inkubointi 30 uM DEX, SOB ja vähemmässä määrin, MER, esti osittain sekä ANT aiheuttamiin muutoksiin solumorfologialtaan sekä hukkaamisen mitokondrion sisäkalvon potentiaali (kuva S1).

2. Leviämisen tutkimukset

inkubaation jälkeen 72-h, kaikki tutkitut oli merkittävä ja annosriippuvainen antiproliferatiivisia vaikutuksia HL-60-solujen. Muurahaisia ​​(DAU ja DOX) olivat tehokkaita pitoisuuksina, jotka olivat kolme kertaluokkaa pienempi kuin katalyyttinen inhibiittorit; IC

50-arvot kaikkien huumeiden olivat seuraavat: 19 nM DAU, 38 nM DOX, 25 uM DEX, 48 uM SOB ja 38 uM MER. Single aineet ja yhdistelmät muurahaisia ​​ja TOP2 katalyyttinen estäjiä inkuboitiin sitten 72 tuntia vastaavina pitoisuuksina niiden IC

50-arvot, ja niiden vuorovaikutukset analysoitiin mukaan Chou-talalay menetelmällä. Lisäksi, kuten lääkkeiden yhteisvaikutukset voivat muuttua funktiona pitoisuuden tai aktiivisuuden, tutkimme myös yhdistelmiä kelaattoreita ja syöpälääkkeiden klo jakeet ja kertoimiin (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) ja niiden IC

50-arvot, ja fraktion (

Fa

) – yhdistelmä indeksi (

CI

) tontteja laskettiin käyttäen tietokonesimulaatioita (kuva 4). Leviämisen tiedot esitetään paneeleissa A ja B kuvioista S2-S4, ja yhdistelmä-indeksi (

CI

) lasketut arvot esitetään yhteenveto taulukoissa S1-S3. Nämä analyysit paljastivat, että DEX, SOB ja MER voimisti antiproliferatiivisia vaikutuksia sekä DAU ja DOX kun nämä aineet yhdessä inkuboitiin samanaikaisesti, kun vastaava

CI

arvot vaihtelivat kohtalaisesta epätehokkaalla.

Soluja inkuboitiin joko jatkuvasti deksratsoksaanihoidon (DEX, A), sobuksoksaani (SOB, B) tai merbaronin (MER, C) ja daunorubisiini (DAU) tai doksorubisiinin (DOX) 72 h tai esi-inkuboitiin DEX (A), SOB (B) tai MER (C) 3 h tai 6 h ja sitten inkuboitiin 72 tuntia kaikkien lääkkeiden vastaavina pitoisuuksina niiden IC

50-arvot ja IC

50 jakeet ja kertoimiin (1/8; 1 /4, 1/2, 1, 2, 4). Vaihtoehtoisesti, solut joko yhdessä inkuboitiin 72 h tai esi-inkuboitiin DEX: ssa 3 tuntia ja sitten co-inkuboitiin DAU 72 h suhteessa 1:20 DAU: DEX (A). Tietokonesimulaatioiden yhdistelmän indeksi (

CI

) – solujen lisääntymistä (jae vaikuttaa –

Fa

) dependences saatiin käyttämällä CalcuSyn- 2.0 -ohjelman.

Toisessa sarjassa kokeita, DEX, SOB ja MER esi-inkuboitiin 3 tai 6 tuntia ennen lisäämistä DAU kanssa myöhemmin 72-h co-hoitoa (paneelit C ja D kuvissa S2-S4, taulukot S1-S3). Kuten havaitaan Näissä kaavioissa ja taulukoissa, nämä lääkeyhdistelmien pysyivät synergististä lukuun ottamatta yhdistelmiä DAU DEX korkeimmillaan pitoisuus; tässä tapauksessa

CI

arvot olivat lisäaineen tai yhdessä harvinainen tapaus kohtalaisen vastakkaisia. Lisäksi lukuun ottamatta standardin Chou-Talalay yhdistelmä tutkimuksen suunnittelu (jos aineita käytetään yhtä tehokkaina annoksina), DAU ja DEX tutkittiin käyttämällä kiinteää 01:20 pitoisuussuhde kliinisessä käytössä [19]. Vaikka hieman vähemmän korostunut synergia havaittiin varten pienempiä pitoisuuksia, täällä, ei antagonismia tapahtunut, vaikka seuraava preinkuboimalla DEX 3 h, ja tässä ympäristössä, kaikki pitoisuudet DEX voimisti antiproliferatiivinen DAU kohti HL-60-solujen (kuvio S2E- F, taulukko S1).

3. Kaspaasiaktiivisuus määrityksissä

yhdistelmät muurahaisia ​​ja TOP2 katalyyttinen inhibiittorit tutkittiin niiden kyky aktivoida caspases, jotka ovat keskeisiä välittäjiä apoptoosin. Inkubointi NVCMs 1,2 uM DAU 3 tuntia sen jälkeen 48 h DAU vapaakausi aiheutti merkittävää kaspaasien aktivaatio 8 ja 9, jotka ovat keskeisiä ulkoisia (reseptorivälitteisen) ja sisäinen (mitokondrion) apoptoottista koulutusjakson initiaattorit, vastaavasti, kuten sekä toteuttamisen caspases 3/7 on -200% verrokkiarvoista. Inkubointi 30 uM pitoisuuksilla kaikkien kolmen TOP2 katalyyttinen estäjiä ei aiheuttanut merkittävää kasvua toimintaa, jossa kaspaasi, mutta DEX ja SOB merkittävästi suojattu sydänlihassolujen vastaan ​​kaspaasin aktivaatio DAU. Vaikka MER esikäsittely osoitti myös suuntaus vähentynyt aktivaatio kaiken kaspaasien, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä verrattuna DAU ryhmään. Yhdenmukaiset niiden tulosten kanssa, että LDH-vuoto-määrityksessä kaspaasien aktivaatio inkuboinnin jälkeen DOX oli yleensä vähäisempää kuin jälkeen DAU inkuboinnin. Aktivointi Molempien aloittamisesta caspases oli merkityksetön verrattuna kontrolliin (kuvio 5E-F), vaikka oli lievää kasvua. Kaiken esi-inkubointi solujen kanssa DEX, SOB tai MER ei merkittävästi muuttunut aloittamista kaspaasin aktivaatio, vaikka alenemissuuntauksen aktiivisuutta. Kuitenkin aktiivisuus toimeenpanevan kaspaasi 3/7 lisääntyi merkittävästi seuraavan DOX hoidon, kun taas TOP2 katalyyttinen estäjät esti tehokkaasti tämän muutoksen (kuvio 5D).

Vastasyntyneen rotan sydänlihassolujen (A – F) esi-inkuboitiin 30 uM deksratsoksaani (DEX), sobutsoksaani (SOB) ja merbaroni (MER) 3 tuntia ja sitten co-inkuboitiin 1,2 uM daunorubisiini (DAU, A – C) tai doksorubisiinin (DOX, D – F) 3 tuntia, jonka jälkeen antrasykliini-vapaa 48-tunnin aikana.