Krooninen sairaus

tiivistelmä

antiangiogeenisesti hoito on tärkeää gynekologisten syövän. Kuitenkin terapeuttinen hyöty on johdettu näistä hoidoista on ohimenevä, johtuu pääasiassa valikoivaa aktivointia korvaavia proangiogeeninen polkuja, jotka johtavat nopean kehityksen vastarintaa. Meidän tavoitteena oli tunnistaa ja kohdistaa potentiaalinen vaihtoehto signalointia anti-endoteelikasvutekijä (VEGF) hoito, jotta kohti kehittää yhdistelmä antiangiogeeniset aineet tarjota laajennettu terapeuttisia etuja. Kehitimme Prekliinisessä

in vivo

fenotyyppisen malli munasarjasyöpää resistenttejä antiangiogeenisesti hoitoa. Mittasimme dynaamisia muutoksia erittyy kemokiinien ja angiogeenisen signalointi kasvaimissa ja plasman vastauksena anti-VEGF hoito, kuten kasvaimia kehittynyt alkuperäisestä reagoivan vaiheen taudin etenemiseen. Kasvaimissa että eteni seuraavien sorafenibihoidon, geeni ja proteiinin ekspressiotasot proangiogeeninen CXC-kemokiinien ja niiden reseptorien olivat huomattavasti koholla verrattuna reagoiva kasvaimia. Kemokiinin (C-X-C-motiivi) ligandin 8 (CXCL8), joka tunnetaan myös nimellä interleukiini-8 (IL-8), kasvu oli ajasta riippuva, ​​ja samaan aikaan, kun dynamiikan syövän etenemisen. Käytimme SB225002, farmakologinen estäjä kemokiini (CXC-motiivin) -reseptorin 2 (CXCR2), häiritä CXC-kemokiinin välittämän toiminnot munasarjasyövän solujen

in vitro

kokeissa solujen kasvun esto, pallomainen muodostumista, ja solujen vaeltamiseen. Yhdistelmä CXCR2 estäjän kanssa sorafenibilla johti synergistinen solujen kasvun esto

in vitro

, ja tasapainottunut kasvaimen etenemiseen seuraavat sorafenibille

in vivo

. Tuloksemme viittaavat siihen, että CXCR2 välittämä kemokiinien voi olla tärkeä korvaavia polku, joka edistää vastustuskykyä antiangiogeenistä hoidon munasarjasyövän. Siten samanaikainen tukkeutuminen tämän proangiogeeninen sytokiinin reitin käyttäen CXCR2 estäjät ja VEGF-reseptori (VEGFR) reitin voisi parantaa tuloksia antiangiogeeniset terapia.

Citation: Devapatla B, Sharma A, Woo S (2015) CXCR2 estäminen Yhdistetty jossa Sorafenibi Parempi Antitumoorisen ja antiangiogeenistä Response prekliinisissä malleissa munasarjasyöpä. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10,1371 /journal.pone.0139237

Editor: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, ITALIA

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2015; Hyväksytty 10 syyskuuta 2015 Julkaistu: 28 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Devapatla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Tutkimus raportoitu tässä julkaisussa tukivat National Institutes of General Medical Sciences of National Institutes of Health alle Award Number P20GM103639. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institutes of Health.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy gynekologisista syövistä Yhdysvalloissa Kun käsitelty nykyinen standardi-of-care kemoterapiaa, viiden vuoden eloonjäämisaste edenneen taudin edelleen alhainen. Munasarjojen kasvaimet ovat runsaasti vascularized; välillä on vastaavuussuhde mikrovaskulaariset count ja biologinen aggressiivisuus [1, 2]. Angiogeneesi on keskeinen rooli sekä normaaleissa munasarjojen toiminnan sekä kehittymistä ja etenemistä munasarjasyövän [3]. Kasvaimen angiogeneesi on kriittinen askites kehitystä ja munasarjasyöpä metastaasin kohdalla vatsakalvon tilaan [4]. Koska angiogeneesi on kriittinen vaihe eteneminen pahanlaatuinen kasvain kasvun ja etäpesäkkeiden [5], angiogeneesi on pätevä tavoite hoidossa munasarjasyöpä [6]. Useita proangiogeeninen tekijät edistää prosessia aluksen muodostumisen VEGF keskeisenä toimijana kasvaimen välitteisen angiogeneesin [5]. Useita antiangiogeeniset aineet, mukaan lukien terapeuttiset vasta-VEGF bevasitsumabi ja multi-kohdistetun estäjät VEGF-reseptorien (VEGFR), ovat aktiivisesti tutkittu tai ovat kehityksen hoitoja edenneen taudin. Hoito bevasitsumabia tarjosi etenemistä elinaika (PFS) hyötyä pitkälle munasarjasyövän, kun sitä annetaan yhdessä kemoterapian [7, 8]. Useita VEGFR-kohdistaminen multi-estäjät kuten nintedanib, trebananib, patsopanibille sunitinibi sorafenibia cediranib on testattu eri vaiheissa munasarjasyövän kliinisissä tutkimuksissa [9]. Joillakin näistä aineista, kuten patsopanibille, nintedanib, cediranib, ja trebananib, on arvioitu satunnaistetuissa vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa, ja kaikki ovat osoittaneet ilman taudin etenemistä (PFS) hyötyä [10]. Kuitenkin terapeuttinen hyöty anti-VEGF-hoito on lyhytaikainen. Syövän etenemistä lopulta palautunut ensimmäisen vastauksen, joka osoittaa kehittyvien vastus. Ymmärtäminen mekanismien kasvaimen paeta anti-VEGF hoito on kriittinen löytää strategioita kiertää vastarintaa. Useat mekanismit ovat mukana kehittynyt resistenssi VEGF-hoidon, mukaan lukien aktivoituminen vaihtoehtoisia väyliä kiertää VEGF esto, mikä jatkamista kasvaimen angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua [11]. Täten yhdistelemällä eri antiangiogeeninen hoitomuodot voi olla strategia tarjota kestäviä terapeuttisia etuja.

Monet kasvutekijöitä, jotka ovat mukana munasarjasyöpä invasion ovat myös näkyvästi sen angiogeneesissä [4]. Inflammatorinen kemokiinit tärkeä rooli angiogeneesissä ja etenemistä munasarjasyöpä. Välisten vuorovaikutusten kemokiinit tuottaman munasarjasyöpäsoluja ja kemokiinireseptoreita ilmaisema endoteelisolujen ja kasvaimen microenvironment edistää kasvaimen kasvua stimuloimalla angiogeneesiä ja liikkuvuuden lisääntyminen, invaasio, ja solujen lisääntymistä [12-14]. Niistä kemokiini osajoukot, CXC-kemokiinit kanssa 3-aminohappo (Glu-Leu-Arg /ELR) motiivi (ELR

+), mukaan lukien CXCL1, 2 ja 3 (GRO-α, β ja γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, ja CXCL8 (IL-8), ovat tehokkaita säätelijöitä angiogeneesin ja välittää niiden angiogeeninen aktiivisuus kautta kemokiinireseptori CXCR2 [14]. Yliekspressio proangiogeeninen kemokiinien ja CXCR2 korreloi huonon ennusteen munasarjasyöpäpotilaalle [12, 15-17]. Siten ELR

+ CXC proangiogeeninen kemokiini reitit ovat potentiaalinen vaihtoehto edistää angiogeneesiä munasarjojen kasvaimia.

tehokkaiden kiertää mekanismia, jolla munasarjasyöpä ohittaa VEGF-hoidon, me tuotti ksenografti malli antiangiogeeninen terapia kestävyyden, että tiiviisti jäljittelee kliinistä resistenssiä munasarjasyöpään. Havaitsimme muutoksia sytokiini- ja angiogeenisen reittejä kasvaimissa vastustuskykyisiä antiangiogeenisesti hoitoja, kuten kasvaimia eteni alkuperäisestä reagoi vaiheessa tulenkestävään vaiheeseen. Meidän

in vitro

ja

in vivo

tulokset osoittivat, että yhteistyössä kohdistettu CXCR2 proangiogeeninen sytokiini akselin anti-VEGF esto on tehokas strategia tarjota laajennettu terapeuttisia hyötyjä prekliinisissä malleissa munasarjasyövän syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

SKOV-3 munasarjasyövän solulinja saatiin the American Type Culture Collection. A2780 ja OVCAR429 munasarjasyövän solut ystävällisesti Dr. Danny Dhanasekharan (Stephenson Cancer Center, OUHSC). A2780 munasarjasyövän solulinja oli alun perin saatu Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). OVCAR429 ovat munasarjasyövän soluja, jotka on aiemmin julkaistu [18, 19]. A2780 ja OVCAR429-soluja ylläpidettiin RPMI-alustassa (Invitrogen). SKOV-3-soluja ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (Invitrogen). Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) ja endoteelisolujen media ostettiin Cell Applications (San Diego, CA). Sorafenibi saatiin LC-laboratorioista (Woburn, MA). SB225002 (

N

– (2-hydroksi-4-nitrofenyyli) –

N

’- (2-bromifenyyli) urea) on tehokas ja selektiivinen ei-peptidi-inhibiittori CXCR2 (IL- 8R) kemokiinireseptori. SB225002 hankittiin Tocris Bioscience (Bristol, UK). Drug valmisteet sorafenibia ja SB225002 tehtiin menetelmillä kuvataan muualla [20, 21].

Eläimet ja lääkehoito

Six-viikkoisen naaras-kateenkorvattomiin

nu /nu

nude-hiiret hankittiin Charles River Laboratories, Inc. kautta, NCI (Frederick, MD). Kaikki toimenpiteet, joissa hiirille suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), ja protokolla hyväksyi Oklahoman yliopiston Health Sciences Center (OUHSC) Institutional Animal Care ja Käytä komitea (Protocol Number: 12-154-H). Hiirille annettiin ihon alle injektiota 5 x 10

6 SKOV-3 solujen oikeaan kylkeen. Kasvaimen koko mitattiin kaksi kertaa viikossa käyttämällä digitaalista jarrusatulat (Mitutoyo), joiden tarkkuus on ± 0,02 mm. Kasvaimen tilavuus laskettiin 4/3 π pituus x leveys x korkeus. Hiiriä käsiteltiin suolaliuoksella tai sorafenibilla, kun kasvaimet saavuttivat noin 80 mm

3 tilavuudessa, 32 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Sorafenibi annettiin päivittäin suun kautta letkulla annoksella 30 mg /kg. Hoitoa jatketaan, kunnes kasvaimet kasvoivat 20 mm (maksimi kasvu sallittu by IACUC), minkä jälkeen hiiret lopetettiin. Ksenograftikasvaimissa että lisääntynyt alle 50% alkuperäisestä kasvaimen tilavuuden alussa hoidon katsottiin hoitoon reagoivaa, koska tämä oli pitkäaikainen suuntaus kasvain pysähtymiseen [22]. Kasvaimet, jotka eteni pitkän aikavälin suuntaus kohti jatkuvan kasvun jälkeen alustavan hoitovastetta katsottiin näyttämään kehittyvien fenotyyppisiä hoito-vastus. Eri ajankohtina, käytimme retro-orbital puncture kerätä noin 30 ui verta EDTA sisältävään putket määrittää aika-profiilit kiertävien sytokiinien ja angiogeenisten tekijöiden. Eläimet nukutettiin ennen silmäkuopantakaisesta verinäytteen käyttäen 2% isofluraanilla hengitykselle kammiossa säännelty kalibroidulla höyrystin. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin ja lopetettiin heti kun oli todisteita siitä, että hiiri oli kipu kasvaimen tai huumeiden tai jos kasvain taakka saavutti 20 mm. Varhainen eutanasia päätepisteitä ovat kohtalainen tai vakavaa myrkyllisyyttä, mukaan lukien nopea painonpudotus yli 10% painostaan, asteittainen laihtuminen on suurempi kuin 15%, heikkous, ei vastata, hengitysvaikeuksia, vakava epänormaali neurologisia oireita, verenvuoto, trauma tai kyvyttömyys syödä tai juoda. Kun kahdeksan viikon lääkehoidon, kaikki hiiret lopetettiin käyttämällä CO

2 tukehtumisen ja niille tehdään ruumiinavaus. Veri ja kasvainten kudokset kerättiin analyysien kuvattu alla. Plasma eristettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti.

in vivo

yhdistelmänä tutkimuksessa, SKOV-3 -ksenografteja käsiteltiin 30 mg /kg /vrk sorafenibille kunnes syntyminen fenotyyppisen kuten edellä on määritelty. Sorafenibi-resistenttejä eläimiä satunnaistettiin kolmeen ryhmään saamaan sorafenibia, SB225002, tai yhdistelmä sorafenibin ja SB225002. SB225002 annettiin kerran päivässä vatsaontelonsisäisellä (IP) injektiolla annoksena 10 mg /kg. Yhdistelmä hoitoryhmässä päivittäin sai suun kautta annoksella 30 mg /kg sorafenibia plus 10 mg /kg SB225002 (IP), kunnes tutkimuksen loppuun.

Sytokiiniagonistit ja angiogeenisen kasvutekijän multiplex määrityksessä

suoritetaan multiplex määritys tunnistaa muutokset verenkierrossa angiogeenisten kasvutekijöiden hoitoon herkkä ja kestävä eläimiä. Pitoisuudet plasmassa kasvain- ja strooman /isäntä-peräisin angiogeeninen kasvu proteiinit määritettiin erikseen käyttämällä ihmisen (Millipore, cat # HAGP1MAG-12K) ja hiiren (Millipore, cat # MAGPMAG-24K) angiogeneesiä /kasvutekijä magneettihelmi paneelit, vastaavasti. Kaikkiaan 17 ihmisen ja 24 hiiren liukoista angiogeenisten tekijöiden kvantitoitiin. Luettelo määrällisesti analyyttien annetaan tukea menetelmillä (S1 File). Liukoinen tasot CXC-kemokiinien CXCL1, 2, 5, ja 6 hiiren plasmassa näytteistä määritettiin kautta multiplex määritystä (Bio-Rad, cat # 171- AK99MR2).

kasvun inhibitiotesti

In vitro

solukasvuneston mitattiin kautta MTS-määritys (Promega). Lyhyesti, 5 x 10

3 HUVEC tai SKOV-3-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Lisäsimme eri konsentraatioissa 0,01-100 uM sorafenibiannos tai SB225002 100 ui tuoretta alustaa ja inkuboitiin solujen määritettynä ajankohtana. Lisäsimme 20 ui CellTiter 96 vesikerros ratkaisu reagenssia ja inkuboitiin solujen kanssa 1 tunnin ajan. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä. Solujen elinkelpoisuus laskettiin suhteessa kontrolleihin (solut, joita käsiteltiin pelkällä vehikkelillä). Keskiarvot kolme rinnakkaista näytettä kohden käytettiin analyysiä varten.

yhdistetyt vaikutukset sorafenibin ja SB225002 määritettiin käyttämällä erilaisia ​​munasarjasyöpäsoluja ja HUVEC. IC

50 arvot määritettiin molempien lääkkeiden kanssa kunkin solulinjan. Top pitoisuus yhdistelmä valmistettiin sekoittamalla sorafenibia ja SB225002 1: 2 suhdetta niiden IC

50 munasarjasyöpäsoluja ja 1: 1 suhde HUVEC perustuu niiden IC

50-arvot. Sarjalaimennokselle (3x) toteutettiin ylhäältä pitoisuuden saamiseksi yhteensä 5 laimennoksia (

n

= 3 toistoa). Solut (5000 solua /kuoppa) inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan. Solujen eloonjääminen tutkittiin käyttäen MTS-määritystä edellä kuvatulla tavalla. Luonne kombinatoorista vaikutuksia kahden lääkkeen määritettiin laskemalla yhdistelmä indeksi (CI) arvot, joka luonnehtii synergian (CI 1) additiivisuuteen (CI = 1), tai antagonismia (CI 1) käyttäen CalcuSyn- (Biosoft, Cambridge, UK).

Angiogeneesi putken muodostumiseen määrityksessä

kasvutekijä vähennetty matrigeeliin matriisi (Corning) sulatettiin 4 ° C: ssa yön yli ja sitten pohja päällystetty 96-hyvin levy (50 ui kuoppaa kohti) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Seuraavaksi 100 ui elatusainetta, joka sisälsi HUVEC (10000 solut), kanssa tai ilman sorafenibilla, ja SB225002 lisättiin kuhunkin kuoppaan päälle jähmettyi Matrigel matriisi ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Kuopat kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja verkostoja kuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa. Kvantifiointia varten verkkojen WimTube ohjelmistoa käytettiin (Wimasis).

Transwell migraatiokokeessa

solumigraation analyysit suoritettiin käyttämällä 8 um huokosia Transwell-irto-(Corning), kuten aiemmin on kuvattu [23 ]. Jotta alakammioissa, 500 ui endoteelisolujen kasvualustaa lisättiin. Alikvootit 2 x 10

4 HUVEC 200 ul: ssa endoteelisolujen Peruselatusaineen ympättiin yläkammiot. Sekä ylä kammiot sisälsivät sorafenibille tai SB225002 ilmoitettuina pitoisuuksina. Sen jälkeen, kun määritys kesti 24 tuntia 37 ° C: ssa, ei-siirretyn solut poistettiin ylemmältä pinnalta suodattimen avulla vanupuikoilla. Solujen alapinnalle kalvon kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Solut laskettiin optisen mikroskoopin alla (x 40).

sferoidi määrityksessä

SKOV-3 solujen sferoidit kasvatettiin käyttäen nestemäistä overlay menetelmällä [24]. Solut maljattiin agaroosilla pinnoitettu 96-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät 200 ui alustaa (2000 solua /kuoppa). Soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan, kunnes pallosia muodostettu. Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla sorafenibin tai SB225002. Joka toinen päivä, me korvattiin 100 ui vanhan väliaineen tuoreella alustalla ja lääkkeitä. Sferoidit seurattiin jopa 10 päivää. Koot sferoidien mitattiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa (https://imagej.nih.gov/ij/).

immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) tietojen kvantifiointi on kuvattu tukevat menetelmillä ( S1 File). Käytimme spesifisten vasta-aineiden CD-31 (Abcam, kissa # ab28364) ja Ki-67 (Abcam, kissa # ab16667) määrittää mikroverisuonitiheys ja kasvainsoluproliferaation, vastaavasti. Kaikkiaan CXCR2 ilmentyminen kasvainsoluissa ja strooman solut määritettiin hiiren ksenograftikasvaimissa käyttäen anti-CXCR2 vasta-ainetta (Abcam, kissa # ab14935).

Geenien ilmentyminen ja ELR

+ CXC-kemokiinien

transcriptome sekvensointi suoritettiin käyttäen Illumina MiSeq sekvensseri ja Illumina TruSeq RNA v2 näytteen valmistus kit ja protokollat ​​(Illumina, Inc.). Näytteiden valmistelu ja kirjasto rakentaminen on kuvattu tukevat menetelmät (S1 File).

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin keskiarvo ± keskihajonta (SD) arvoiksi käyttämällä Studentin t-testiä, ellei toisin ilmoiteta. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin

P

0,05. Lääkeyhdistelmä analysoitiin CalcuSyn- ohjelmiston mediaani-vaikutus menetelmä Chou ja Talalay [25]. Immunohistokemia analysoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Lyhyt menetelmiä annetaan tieto-. Käytimme GeneSifter ohjelmisto (Geospiza, Inc.) analysoimaan tietoja meidän tutkimuksista geenien ilmentymisen ksenograftikasvaimissa.

Tulokset

In vivo

fenotyyppinen kasvain vastustuskykyä antiangiogeenisesti hoitoon

Havaitsimme kasvaimen kasvun estämistä jopa kolmen viikon sorafenibihoidon (kuvio 1A). Tämän ensimmäisen reagoiva aikana, jotkut kasvaimet alkoivat etenee, mistä on osoituksena lisääntynyt kasvaimen koko hoidon jatkamisesta huolimatta. Yli kahden kuukauden hoitojakson aikana, 10 19 (53%) -ksenografti hiiret osoittivat kasvaimen etenemistä ja uusiutumista. Yksikään hiiristä sairastui tai kuolleita ennen kokeellisen päätepisteeseen. Tiedot IHC värjäys paljasti tyypillisen antiangiogeenisen kestävä allekirjoitus kasvainkudoksissa (kuvio 1 B). Kasvaimen suonitiheys (CD-31), ja solujen lisääntymistä (Ki-67) olivat merkittävästi suuremmat (2-4-kertaisesti,

P

0,05) kasvaimia, jotka eteni hoidon kuin reagoiva kasvaimia (kuvio 1C), mikä viittaa siihen, että asteittainen kasvaimet pystyivät jatkamaan angiogeneesiä ja siten kasvaimen uusiutumista.

A) SKOV-3 ksenograftit hoidettiin kahdeksan viikon ajan 30 mg /kg sorafenibia kautta päivittäin letkulla suun kautta. Controls käsiteltiin hoidossa pelkkää vehikkeliä. Tuumoritilavuudet mitattiin kahdesti viikossa ja ovat edustettuina mm

3 ± SEM. Out of 19 hiirillä, 10 kehittänyt vastustuskyvyn sorafenibihoidon. Musta, punainen, ja vihreä viivat osoittavat kasvaimen keskimääräinen tilavuus progressions ohjaus, SR, ja SS hiirille. Merkittävä ero kasvaimen tilavuus (*

P

0,05) havaittiin välinen hoitoresistenteillä ja herkkien ryhmien, alkaen viikolla viisi hoidon. SS = sorafenibi herkkä; ja SR = sorafenibin kestävä. B) edustaja immuunivärjäykseen CD-31 (ylärivi), ja Ki-67 (alin rivi) hallinnassa, sorafenibi herkkä (SS), ja sorafenibi kestävä (SR) kasvaimia. C) Aluksen tiheys (CD-31) ja leviämisen indeksi (Ki-67) lisättiin merkittävästi sorafenibin kestävä kasvaimista verrattuna sorafenibilla herkkien kasvainten.

Dynaaminen muutoksia kiertävien angiogeenisten tekijöiden vastauksena anti-VEGF hoito

tunnistaa muutokset erittyvä angiogeeninen ja sytokiinisignaloinnin vertasimme kiertävän angiogeenisen tekijän pitoisuuksia plasmassa kerättyjen näytteiden käsittely-herkkä ja kestävä hiirillä. Näytteet saatiin aikana reagoiva (2-3 viikon kuluttua hoidon) ja tulenkestävät vaiheiden (6-8 viikon kuluttua hoidon). Koska kasvaimen verisuonistossa ksenografteissa muodostetaan hiiren endoteelisolujen esisolut, käytimme multiplex angiogeenisten paneelit niin hiirillä ja ihmisillä erottaa alkuperää.

Vuoden kolmen ensimmäisen viikon aikana, ei ollut merkittäviä eroja pitoisuudet angiogeenisten proteiinien tahansa ryhmissä (kuvio 2A). Kun fenotyyppisen ilmennyt 6-8 viikkoa hoidon jälkeen, angiogeeninen tekijä erot olivat ilmeisiä ryhmien välillä. Erilaisia ​​hiiren peräisin angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien fibroblastien kasvutekijä (FGF) -2, hepatosyyttikasvutekijän (HGF), KC, ja prolaktiini, ilmentyivät sorafenibin kestävä ryhmä, mutta ei sorafenibin-herkän ryhmän (kuvio 2A) . Aikana tulenkestävä vaiheessa kasvaimen erittyy CXCL8 (IL-8) tasot nousivat 4 taittuu (

P

0,05) sorafenibin vastustuskykyisten kasvainten.

A) Taita muutokset verenkierrossa angiogeenisten tekijöiden välillä hoitoresistenteillä ja herkkien ryhmien aikana reagoiva (2-3 viikkoa) ja resistenttejä (6-8 viikkoa) vaiheet käsitellyillä hiirillä sorafenibilla. Sekä hiiri (strooman) ja ihmisen (kasvainsolun) liukenee angiogeenisten tekijöiden kvantitoitiin multiplex määrityksen. Vain angiogeenisten tekijöiden havaitsemia sekä hiiren ja ihmisen paneelit ovat edustettuina Log

2-kertaiseksi muutoksia hoidon vastustuskykyisten versus hoito-herkkä ksenografteissa. Merkitsevä (

P

0,05) välisten muutosten herkkä ja kestävä vaiheet on merkitty tähdellä (*). B) aika-riippuvainen vertailu plasman IL-8 pitoisuus (pg /ml ± S.D.) välillä hoitoresistenteille (SR) ja herkkien (SS) ryhmät hiiriä hoidettiin sorafenibilla. Profiilit plasman IL-8 olivat mukaisesti kasvaimen etenemisen fenotyyppisten vastustuskykyisten ja herkkien kasvainten. Hoidon aikana, plasma kerättiin viikoittain porrastettu näytteenottomenetelmä, ja IL-8-tasot mitattiin multiplex-määrityksellä. C) Illumina Sekvensointianalyysin Ihmisen ja hiiren ELR

+

CXC

kemokiini geeniekspressiota. Ihmisen ELR

+

CXC

kemokiini geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että

CXCL6

ilme oli merkitsevästi korkeampi resistenttien ryhmässä (2,5 kertaa suurempi,

P

0,05) kuin riskiryhmän. Mitään merkittävää eroa ei havaittu sorafenibille-herkkiä ja kestäviä ryhmiä CXCL1, 2, 3, 4, 5, ja 7 ekspressiotasot. Hiiri ELR

+

CXC

kemokiini geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että kaikki ilmoitettu sytokiinit, paitsi

Cxcl2

, olivat merkittävästi korkeammat resistenttien ryhmissä ( 2 kippaa,

P

0,05) kuin herkkiä ryhmiä. SS = sorafenibi herkkä; ja SR = sorafenibin kestävä. D) CXC-kemokiini plasmassa (pg /ml) SKOV-3-ksenografti-hiirissä. CXCL1, CXCL2, ja CXCL6 tasot olivat merkitsevästi (

P

0,05) korkeampi sorafenibin kestävä ryhmissä kuin sorafenibin herkkien ryhmien.

Myös määrällisesti IL-8 tasoa viikoittain jopa kahdeksan viikon sorafenibihoidon. Korkeintaan 4 viikkoa sorafenibin hallinnon, me ei havaittu huomattavia eroja IL-8 tason välillä hoidon herkkä ja kestävä ryhmät (kuvio 2B). Alkaen viikolla viisi, merkittävästi koholla (

P

0,05) tasoja IL-8 havaittiin sorafenibin kestävä kasvaimista. Nämä tulokset osoittavat, että IL-8 tasoa dynaamisesti muuttunut ajan myötä, jolloin myös aika profiilin syövän etenemisen. Sen lisäksi, että IL-8, data from geenin ilmentymisen tutkimuksessa (kuvio 2C) ja sytokiinien multiplex-määritys (kuvio 2D) osoittivat, että ilmentyminen muiden ELR

+ CXC-kemokiinien (esim CXCL1, -2, -5 ja – 6) oli korkea hoitoresistenteille kasvaimissa verrattuna heidän kollegansa.

CXCR2 ilmaisun ovarioiden

Suoritimme CXCR2 värjäytymistä ksenograftikasvaimissa sorafenibia hoitoja verrata sen ilmentymistä (kuvio 3A) herkillä ja kestävä ryhmiä. CXCR2 ilmentyminen koholla kestävä kasvaimissa verrattuna herkkä ja ohjaus kasvaimia. Havaitsimme että kolminkertainen vastustuskykyisten kasvainten verrattuna herkkien kasvainten (

P

0,05, kuvio 3B) on sorafenibihoidon ryhmässä.

A) edustaja immuunivärjäykseen CXCR2 hallinnassa, sorafenib- herkkä (SS), ja sorafenibi kestävä (SR) kasvaimia. B) CXCR2 ilmentyminen koholla sorafenibin kestävä kasvaimista (

P

0,05) verrattuna sorafenibilla herkkien kasvainten.

In vitro

synergiavaikutuksen sorafenibi ja SB225002

edellä esitettyjen havaintojen ylössäätelyyn CXCR2 ilmaisun ja useita ELR

+ CXC proangiogeeninen sytokiineja, jotka välittävät niiden angiogeenisten vaikutusten kautta CXCR2 reseptorin, tutkimme CXCR2 välittämää sytokiinien vaikutuksia käyttäen SB225002, eli pienmolekyylisalpaaja- kemokiinireseptorin CXCR2 (IL-8R), yhdistettynä sorafenibin

in vitro

. Valitsimme CXCR2 reseptorin salpaajat yli anti-CXC-kemokiini vasta välttää tarpeeton toiminto ELR

+ CXC-kemokiini signalointi. Yhdistelmä sorafenibin ja SB225002 tuotti merkittävästi korkeampia kasvun estäminen (

P

0,005) tuumorisoluissa ja HUVECeja kuin teki jompikumpi hoito yksinään (kuvio 4A ja 4B). CI-arvot eri pitoisuussuhteet SKOV-3 (0,32-0,61) ja HUVEC (0,87-1,1) osoitti synergiaa tai additiivisuutta välillä SB225002 ja sorafenibin. IC

50-arvot sorafenibin ja SB225002 testatussa munasarjasyövän solulinjoissa ja HUVEC annetaan tieto- (S1 taulukko). Pitoisuus-aikavaikutuskuvaajia yhdistelmähoidon verrattuna sorafenibilla yksinään on esitetty S1 Fig.

SB225002 paransi merkittävästi kasvun estäminen vaikutuksia sorafenibin SKOV-3 (A) ja HUVEC (B) soluista. A) yhdistelmä 10pM sorafenibin ja 4 uM SB225002 synergistisesti inhiboi kasvua SKOV-3-soluissa, verrattuna kunkin lääkkeen yksinään (

P

0,005). B) yhdistelmä 4 uM sorafenibin ja 2 uM SB225002 synergistisesti inhiboi kasvua HUVEC-solujen, verrattuna kunkin lääkkeen yksinään (

P

0,01). C) Kuvat ovat putken muodostumisen määrityksen HUVEC käsitelty tai ilman 1 uM SB225002 tai 2 uM sorafenibin. Putken muodostumiseen analysoitiin käyttämällä Wimtube analyysin ohjelmisto ja putken pituus on esitetty pikseliä. Lisäämällä SB225002 sorafenibille indusoi tilastollisesti merkittävä lasku HUVEC-putken muodostumiseen (

P

0,005). Data näytetään keskimääräisenä putken pikseliä ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. D) edustavat kuvat HUVEC migraatiokokeessa käyttäen Transvvell- kammioon. Kvantitoimiseksi vaeltavien solujen, kolme riippumatonta alalla muuttavien solua kuoppaa kohti valokuvattiin alla faasikontrastimikroskooppia. Solujen lukumäärä per kenttä laskettiin ja keskiarvo. Solulaskennat ilmaistaan ​​suhteellinen solujen määrän siirtynyt alapuolelle siirtokuoppaan kammion tuloksiin kontrollista soluista annetaan 1. estävä vaikutus sorafenibin (2 uM) maahanmuutosta merkittävästi parantaa 1 uM SB225002 (

P

0,01). E) Pallografiitti- kasvu on heikentynyt CXCR2 esto in SKOV-3-soluissa. Sferoidiviljelmiä alueet mitattiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. Edustamat arvot y-akselille ovat pikseleitä ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

endoteelisolujen putken muodostumiseen ja muuttoliike ovat tärkeitä ominaisuuksia kasvaimen angiogeneesiä. Suoritimme siirtokuoppaan kammion muuttoliike määrityksiä ja matrigeeliä-pohjainen putken muodostumiseen määrityksiä käyttäen HUVEC arvioida antiangiogeenisen potentiaali sorafenibin ja SB225002 yhdistelmänä. Kuten kuviossa 4C sorafenibi (2 uM) ja SB225002 (1 uM) yhdistelmä hoidon lähes täysin tukahdutetaan HUVEC-putken muodostumiseen. Yhdistelmä sorafenibin ja SB225002 esti merkittävästi endoteelisolujen putken pituus verrattuna sorafenibilla (≥ 2-kertaiseksi,

P

0,005) tai SB225002 (≥ 3-kertaiseksi,

P

0,005) yksin. Lisäksi tulokset siirtokuoppaan migraatiokokeessa osoittaneet SB225002 merkittävästi voimisti sorafenibia estoa endoteelisolujen muuttoliike (kuvio 4D). Tämä yhdistelmä aiheutti noin kaksinkertaiseksi vähennystä HUVEC maahanmuutto verrattuna sorafenibin ja SB225002 hoitoja yksin (

P

0,01). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmä hoito sorafenibin ja SB225002 voisi merkittävästi heikentää angiogeeninen potentiaali HUVEC

in vitro

.

Koska IL-8 on rooli kasvaimen soluaggregaation, teimme sferoidi määritys tutkia, mitä vaikutuksia sorafenibin ja SB225002 on pallomainen kasvuun. SB225002 häiritsi muodostumista SKOV-3 pallosia at 2 uM: sorafenibille ei (kuvio 4E). Yhdistelmä sorafenibin ja SB225002 vähensi kasvua pallosia (kuvio 4E).

SB225002 ja sorafenibi yhdistelmähoitoa sorafenibin kestävä ksenograftissa hiiret

Arvioimme lisäksi vaikutukset ja hoidon sorafenib- kestävä tuumoriksenografteja

in vivo

. Me käsitellyistä hiiristä sorafenibilla kunnes ksenograftikasvaimissa vastustuskykyisiksi. Sen 46 päivän sorafenibihoidon, hiirten sorafenibi vastustuskykyisten kasvainten sai sorafenibia, SB225002, tai näiden kahden yhdistelmä huumeita. Kasvaimet käsiteltiin sorafenibia yksin edennyt, mutta teki niin hitaammin kuin kontrolli kasvaimet (kuvio 5). Syövän etenemistä merkittävästi tukahdutettiin kun SB225002 lisättiin sorafenibille (kuva 5). Lopussa hoidon, kasvainten hiiristä, jotka saivat yhdistelmähoitoa oli 42% pienempi tilavuus kuin kasvaimia hiirillä, jotka saivat sorafenibi yksin. Mielenkiintoista, hoito SB225002 yksinään ei estää kasvaimen kasvua, joka eteni sorafenibihoidon, mikä viittaa tarvetta jatkaa tukoksia VEGF signalointireitin. Tuloksemme osoittavat, että yhdistetty CXCR2 inhibitioastetta sorafenibilla tehokkaasti lievittää taudin etenemiseen ja jos laajennettu terapeuttista hyötyä.

SKOV-3 -ksenografteja käsiteltiin annoksella 30 mg /kg sorafenibia kunnes kasvaimia kehittyi fenotyyppisen hoitoon (~ 46 päivää). Hiiret, joissa on resistenttejä kasvaimia satunnaistettiin sitten ryhmiin saamaan yhden seuraavista: 30 mg /kg sorafenibille yksinään (

n

= 6), 10 mg /kg SB225002 yksinään (

n

= 6 ), tai sorafenibi plus SB225002 (

n

= 6). Nuoli osoittaa hoidon aloittamista päivänä 46. Kasvaimen tilavuus mitattiin ilmoitettuina aikoina ja esitetään keskiarvona ± S.D. Sorafenibi ja SB225002 yhdistelmä johti 42% vähennys kasvaimen kasvua verrattuna sorafenibilla yksinään (

P

0,05).

Keskustelu

Angiogeneesi on tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen munasarjasyöpä. Munasarjojen kasvaimet ovat runsaasti vascularized, ja korkea tuumoriangiogeneesin ovarioiden ennustaa huono kliinisistä tuloksista [1, 2, 26]. Munasarjojen tuumorit yli-ilmentävät proangiogeeninen tekijöistä, mukaan lukien VEGFs, FGF, angiopoietiini, verihiutaleperäinen kasvutekijät (PDGF), ja useita angiogeneesiä sytokiinit [10]. Tähän mennessä rohkaisevia tuloksia on saatu munasarjasyövän tutkimuksissa, joissa on VEGF-reitin inhibiittorit, terapeuttinen vasta-aine bevasitsumabi, ja pienimolekyylisiä reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) [27]. Lisäämällä bevasitsumabia kemoterapiaa vähensi taudin pahenemisen ja /tai kuoleman 62% verrattuna pelkkää kemoterapiaa [8, 28]. Tämä havainto johti hiljattain FDA: n hyväksynnän bevasitsumabia yhdessä kemoterapian uusiutuva sairaus.