Krooninen sairaus

tiivistelmä

yliaktivoituvan Wnt /β-kateniinin reitin aikuisen kudoksissa on yhdistetty moniin sairauksiin, kuten kolorektaalisyöpä. Löytäminen kemiallisia aineita, jotka voivat estää tämän ilmiön on syntymässä ongelma. Viime aikoina useita luonnollisia yhdisteitä on kuvattu Wnt /β-kateniinin inhibiittorit ja ehkä lupaava aineita valvontaa syövän. Tässä me kuvaamme kaksi luonnollisia aineita, derricin ja derricidin, kuuluvat kalkonin alaluokkaan, jotka osoittavat voimakkaita transkription inhibitio Wnt /β-kateniinin kautta. Molemmat kalkonien pystyvät vaikuttamaan solun jakautumista β-kateniinin, ja estävät Wnt-erityinen toimittaja aktiivisuus HCT116-soluissa ja

Xenopus

alkioita. Derricin ja derricidin myös esti voimakkaasti kanoninen Wnt aktiviteetti

in vitro

, ja pelasti Wnt aiheuttama kaksinkertainen akseli fenotyypin

Xenopus

alkioita. Seurauksena Wnt /β-kateniinin esto, derricin ja derricidin hoitoja vähentää solujen elinkelpoisuutta ja johtaa solukierron pysähtymisen kolorektaalisyövässä solulinjoissa. Yhdessä tuloksemme voimakkaasti tukea näitä kalkonien uusina negatiivinen modulaattorit Wnt /β-kateniinin reitin ja paksusuolen syövän solujen kasvua

in vitro

.

Citation: Fonseca BF, Predes D, Cerqueira DM, Reis AH, Amado NG, Cayres MCL, et al. (2015) Derricin ja Derricidin esto Wnt /β-kateniinin Merkinanto ja Estä Colon Cancer Cell Growth

In vitro

. PLoS ONE 10 (3): e0120919. doi: 10,1371 /journal.pone.0120919

Academic Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 09 helmikuu 2015; Julkaistu: 16 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Fonseca et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat Brasilian rahoitusorganisaatioiden Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnológico, Fundação de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, ja Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel superior .

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt /β-kateniinin signalointi on tärkein syy monien eri neoplasioihin, ja on läheinen yhdessä peräsuolen syöpä (CRC). Noin 80% kaikista CRC on mutaatioita Wnt komponentteja, mikä johtaa yliaktivoituvan koulutusjakson paksusuolen soluissa. Yleisin mutaatiot johtavat APC lakkaa toimimasta, jotka ovat negatiivisia säätelijöitä tämän signalointireitin; ja voitto toiminto mutaatiot β-kateniinin, tärkein efektoriproteiini tämän signalointi [1,2,3,4]. Nämä mutaatiot aiheuttavat hallitsemattoman yli-ilmentyminen useiden onkogeenien ja solusyklin geenien, erityisesti peräisin olevat solut Suolen crypts [5].

CRC on pahanlaatuinen sairaus, jossa suuri esiintyvyys, ja kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä maailmassa [6]. On vaikea hoitaa; leikkaus ja adjuvantti lääkkeitä käytetään yleisesti, mutta parantaa vain pieni osa kasvaimia [7]. CRC liittyy vahvasti geneettisiä sairauksia, joka on seurausta mutaatioista tärkeitä solukierron ja apoptoosin säätelygeenejä, kuten KRAS, TP53 ja BRAF [8]. Lisäksi CRC voi myös olla seurausta ihmisen ravitsemuksellisen kuvioita. On osoitettu, että suuri kulutus kasvien alkuperää ruoan liittyy vähenemiseen CRC esiintymistä, koska suuria määriä luonnon antitumor yhdisteitä, kuten flavonoideja ja muita polyfenoleja [7,9].

Flavonoidit ovat polyfenoliyhdisteiden monissa laitoksissa ja niillä on laaja valikoima biologisia vaikutuksia. Koska flavonoidit ovat suuri osa ihmisen ravinnosta, ne on intensiivisesti tutkittu huomioon niiden hyödylliset vaikutukset monissa ihmisen sairauksiin, kuten syöpään. Heillä on antiproliferatiivisia, anti-invasiivisia ja pro-apoptoottinen vaikutus [10,11,12]. Monet flavonoideja kuvattu Wnt estäjät on mielenkiintoisia vaikutuksia CRC valvontaa ja myös auttaa estämään tämän taudin [13,14,15,16,17]. Flavonoidit egcg ja quercetin on raportoitu lupaava syöpälääkkeitä [18,19]. Niistä vaikutuksia näillä flavonoidien on sääntelyn signalointipolkujen läheisesti liittyvät syöpään, kuten Wnt /β-kateniinin signalointi, vaikka yksikään niistä ei ole onnistuttu yhtä tehokas lääke syövän hoitoon.

Täällä tutkimme vaikutus kaksi vähän tunnettu flavonoideja, derricin ja derricidin, jotka oli kopioitu

Lonchocarpus sericeus

[20]. Derricin ja derricidin voivat vähentää CRC kasvua

in vitro

, ohjaamalla solusyklin etenemisen. Lisäksi derricin ja derricidin esti voimakkaasti Wnt8 aiheuttama kaksinkertainen akseli

Xenopuksen

alkioita, mikä viittaa vahvasti siihen, että nämä flavonoideja ovat modulaattoreita Wnt /β-kateniinin reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, kemikaaleja ja reagensseja

Kaikki soluviljelmässä reagenssit hankittiin Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja anti-β-kateniinin hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Toissijainen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Life Technologies (CA, USA). Solulinjat käytettiin HEK293T-, L-solu, L-Wnt3a, HCT116, DLD-1 ja IEC-18 (ATCC) ja RKO-pBAR /

Renillaa

[21]. Kalkonien derricin ja derricidin tässä tutkimuksessa käytetyt uutettiin ja puhdistettiin Nascimento ja Mors (1972) [20].

Wnt-lusiferaasireporttiterilla Analyysit

RKO-pBAR /

Renilla

-soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä, 1,0 x 10

4 solua /kuoppa DMEM: ssä, korkea glukoosi, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Gibco). Sen jälkeen, kun yhtymäkohta, soluja käsiteltiin derricin (10, 20 tai 50 uM) tai derricidin (10, 20 tai 50 uM), kun läsnä on Wnt3a väliaine [22], vielä 24 tuntia. L-solujen elatusainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. DMSO lisättiin myös ajoneuvon ohjaus. 24 tunnin kuluttua hoidon, Firefly ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet havaittiin mukaisesti valmistajan protokollan (Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega).

Hek293T ja HCT116 viljeltiin 96-kuoppalevyillä 1,0 x 10

4 solua /kuoppa DMEM-F12, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Gibco). Sen jälkeen kun 70% konfluenssiin saavutettiin, kukin hyvin transfektoitiin 50 ng TOP-Flash tai FOP-Flash plasmidit, 5 ng TK

Renillaa

-luciferase, tai ilman β-kateniinin [23]. Transfektioreagenssi käytettiin Lipofectamine (Invitrogen). 15h transfektion jälkeen solut käsiteltiin kalkonien läsnä Wnt3a conditioned medium, 24 h, käyttäen 10, 20 tai 30 uM derricin tai 10, 20 tai 30 uM derricidin. Seuraavana päivänä, Firefly ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet havaittiin mukaan valmistajan protokollan (Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega).

Alkio käsittelyt.

Frog kokeiluja suoritettiin ohjeiden mukaisesti myöntämän Animal Care ja Käytä Ethic komitea (Comissão de etica ei Uso de Animais-CEUA) liittovaltion yliopiston Rio de Janeirossa ja hyväksyi tämän valiokunnan nojalla lupa nro 152/13. Aikuisten sammakot (Nasco Inc., WI, USA) stimuloitiin koriongonadotropiinia (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Xenopuksen

alkiot saatiin

in vitro

lannoitus ja järjestetään mukaan Nieuwkoop ja Farber [24]. Kaikki kokeet suoritettiin 22 ° C: ssa. Synteettistä xWnt8 mRNA, plasmidi linearisoitiin Notl: llä ja transkriptoitiin SP6-RNA-polymeraasin avulla mMessage mMachine Kit (Applied Biosystems). Neljän cell-vaiheessa alkiot ruiskutetaan ventral reunavyöhykkeen jotta aiheuttaa toissijaisen akselin muodostumiseen. Lisäksi neljä-solu-vaiheessa alkiot yhteistyössä ruiskutettiin 10 ug /alkio xWnt8 mRNA plus 0,4 pmol /alkio kunkin Kalkonin tai 250 pg Wnt /β-kateniinin lusiferaasireportteriplasmidin (S01234-Luc) ja 50 pg TK –

Renillaa

suorittaa alkion Lusiferaasimäärityksiä. Injektion jälkeen alkioita pidettiin 0,1x Barth (8,89 mM NaCl; 0,1 mM KCI; 0,24 mM NaHCO

3; 0,08 mM MgSO

4.7H

2O; 1 mM Hepes; 0,03 mM Ca (NO

3)

2,4H

2O; 0,04 mM CaCl

2,2H

2O; pH 7,7), kunnes vaiheessa 27, kun fenotyypit analysoitiin tai kunnes gastrulavaihe (st 10), kun havaittu lusiferaasiaktiivisuutta mukaisesti valmistajan protokollan (Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega).

MTT-määritystä.

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) käytettiin määrittämään mitokondrioiden toimintaa eläviin soluihin. Solut maljattiin konsentraatiolla 1,0 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisiin kudosviljelylevyihin DMEM: ssä, F-12 väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja viljeltiin 24 tuntia ennen käsittelyä kalkonien (10, 20, 30, 50 tai 100 uM) 0, 24, 48, tai 72 tuntia. MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka lopullinen pitoisuus on 150 mg /ml: ssa 4 tuntia ennen solujen keräämistä. Formatsaanipitoisuus Reaktiotuote liuotettiin DMSO ja kvantitoitiin spektrofotometrisesti 570 nm: ssä (Modulus II mikrolevyn multimode lukijaa).

Immunovärjäys.

HCT116 solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, pestiin PBS: llä, ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100. Sitten näytteet blokattiin 1 tunnin ajan 5% naudan seerumialbumiinia. Kanin anti-β-kateniinin (1: 200) primääristä vasta-ainetta inkuboitiin yön yli. Toissijaisen vasta-aineita, jotka on konjugoitu Cy3 fluorokromilla (1: 5000) inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun PBS pesujen DAPI-värjäyksellä (4,6-diamino-2-fenyyli) (Cell Signaling) suoritettiin 5 minuutin ajan, ja sitten objektilasit asennettu Fluorsave’lla (Calbiochem), ja havaittiin Nikon TE 2000-S käänteismikroskoopilla (Melville , NY, USA). Kuvat otettiin käyttäen CoolSNAP-Pro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA) digitaalikamera, jossa on zoom 100x ja 600x.

Soluproliferaatiomääritys

soluproleferaatiomäärityksessä, 5 , 0 x10

4 solut maljattiin edellisenä päivänä ja käsiteltiin 30 uM tai 50 uM derricin tai derricidin 24 tuntia. Click-iT edu (Life Sciences) määritys suoritettiin valmistajan protokollan. DMSO: ta käytettiin ajoneuvon liuottamiseksi flavonoideja ja lisättiin valvoa viljelmiä olosuhteissa 0,5%.

Solusyklianalyysiä.

Cell cycle analyysi suoritettiin käyttäen virtaussytometriaa. Solut huuhdeltiin lyhyesti kalsiumin ja PBS: llä ja irrotettiin trypsiinillä huoneenlämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen, 1 x 10

6 solut suspendoitiin 0,5 ml: aan jääkylmää Vindeløv liuosta [25], joka sisälsi 0,1% Triton X-100, 0,1% sitraattipuskuria, 0,1 mg /ml RNaasi ja 50 ug /ml propidiumjodidilla ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). 15 min kuluttua, solut analysoitiin DNA-pitoisuuden käyttäen FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Living solut analysoitiin DNA-sisältöä. Soluja, jotka osoittivat hajanaista DNA ja mahdolliset dupleteiksi jätettiin pois analyysistä. Solujen diploidi DNA sisältöä (2n, G0-G1-vaiheessa), syntetisoimalla DNA ( 2n mutta 4n, S-vaiheessa), ja monistaa DNA (4n, G2 /M vaiheessa) hankittiin ja analysoitiin CellQuest- ja WinMDI 2.9 ohjelmisto, vastaavasti.

tilastollinen analyysi.

Kukin koe suoritettiin vähintään kolme kertaa. Lusiferaasi, solusyklin ja MTT-määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Solujen värjäys kvantifiointi suoritettiin laskemalla DAPI ja joka määrää ei-ydin- ja ydinvoiman β-kateniinin värjätään solut satunnaisesti valittu mikroskooppikenttää, ja sitten prosenttiosuus kuin ydinenergian ja ydinaseiden solujen kokonaismäärästä solujen laskettiin. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta Studentin t-testiä. MTT määrityksissä, käytimme kaksisuuntaista ANOVA jälkeen Bonferronin testin jälkeen (GraphPad Prism versio 5.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Xenopus

Wnt /β-kateniinin reportterianalyysi käytimme yksisuuntainen ANOVA jälkeen Kruskal-Wallis (GraphPad Prism versio 6.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Tilastollinen merkitys asetettu * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Tulokset

Derricin ja derricidin inhiboimaan CRC solulinjojen

Useat luonnolliset yhdisteet, kuten flavonoideja, voivat vaikuttaa solujen lisääntymistä ja apoptoosia ja siten ovat tärkeitä ehdokkaita syövän valvontaa. Suoritimme on vähäistä Wnt erityisiä reportterimääritys seulomiseksi luonnollisia yhdisteitä uutetaan eri Brasilian kasveista (tuloksia ei ole esitetty). Niistä inhibiittorit, löysimme havaittavissa Wnt /β-kateniinin inhibitioaktiivisuus näyttämä kalkonien derricin ja derricidin (Fig. 1). Tässä olemme käyttäneet kahta CRC-solulinjat, HCT116 ja DLD-1, ja selvittää, jos derricin ja derricidin voi vaikuttaa paksusuolen solujen kasvuun. Tutkimme myös kalkoneita vaikutus IEC-18, ei-transformoitu solulinja on johdettu rotan suolen epiteelissä. Ensin käsitellään nämä solut eri pitoisuuksina (10-100 uM) näiden kalkonien eri hoitojaksojen (0-72 h), ja analysoitiin solujen elinkykyisyys, MTT-määrityksellä. Vuonna HCT116, havaitsimme merkittävää laskua solujen elinkelpoisuuden 100 uM derricin ensimmäisen 24 tunnin kuluessa hoidon. 48 tunnin kuluttua hoidon, 20 uM derricin pystyi vähentämään MTT absorbanssi (Fig. 2A). Derricidin oli samankaltaisia ​​vaikutuksia HCT116 ja myös vähensi solujen elinkelpoisuuden pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2B). Lisäksi hoito derricin ja derricidin vähensi HCT116-solujen, saavutetaan noin 58% ja 65% vähennys DAPI-värjättiin ytimet 50 uM derricin ja derricidin, vastaavasti (Fig. 2C). DLD-1, derricin voisi vähentää solujen elävyys 100 uM kanssa miedompi vaikutusta 18 h ja voimakas vähentäminen jälkeen 48 h hoidon (Fig. 2D). Derricidin, toisaalta, vaikutus oli voimakkaampi DLD-1, 50 uM tämän Kalkonin oli riittävä voimakkaasti vähentää solujen elinkelpoisuuden 18 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 2E). Nämä kalkonien oli myös mahdollisuus vähentää määrää DLD-1-soluille, saavuttaa noin 50% ja 70% vähennys 50 uM derricin ja derricidin, vastaavasti (kuvio. 2F). Kun olemme analysoineet vaikutuksia derricin ja derricidin solujen elinkelpoisuus IEC-18-solujen, voisimme havaita, että molemmat flavonoideja vähenee MTT absorbanssi, alkaen 18 tuntia hoidon klo 100gM. Mielenkiintoista on, ei vaikutuksia solujen elinkelpoisuuden havaittiin pienemmillä pitoisuuksilla (Kuva. 2G, H). Lisäksi, 50 uM derricin ja derricidin hoito johti maksimaalisen väheneminen 32% ja 38% IEC-18 solujen määrä (Fig. 2 I).

(A, B, D, E, G, H) Kuvaajat osoittavat MTT absorbanssi tasoilla HCT116, DLD-1 ja IEC-18 solulinjoissa, käsittelyn jälkeen jopa 72 tuntia 10-100 uM derricin tai derricidin. (A) In HCT116-soluissa, on havaittu merkittävä väheneminen solujen elinkyky 100 uM derricin 24 h ja 20 uM derricin 48 h (B) jälkeen derricidin hoidon väheneminen solujen elinkelpoisuuden tapahtui 100 uM derricidin 24 h ja 30 uM 72 tunnin jälkeen. (D) In ​​DLD-1-soluissa, se on havaittu lievempi vaikutus 100 uM 18 tunnin kuluttua hoidon. Muussa tapauksessa voimakas väheneminen MTT absorbanssin havaitaan 48 tunnin kuluttua hoidon 100 uM derricin. (E) Derricidin hoito vähentää merkittävästi DLD-1 solujen elinkykyä 18 tunnin kuluttua hoidon 50pM flavonoidi ja 20 uM 72 h kuluttua. (G) In IEC-18-solujen, vähentäminen kannattavuus on havaittu 100 uM derricin, alkaen 18h hoidon. (H) Samanlainen profiili on suhteessa derricidin hoidon. (C, F, I) DAPI-värjätty tumat laskettiin 24 tunnin kuluttua hoidon derricin ja derricidin. (C) 30 ja 50 uM of derricin pienentää noin 30% ja 58% määrän HCT116 ytimiä, vastaavasti; kun taas derricidin pienentää noin 39% ja 65%, vastaavasti. (F) DLD-1 tumat pieneni noin 44% ja 50%, kun derricin hoitoa 30 ja 50 uM pitoisuuksina, vastaavasti. Derricidin hoito pienentynyt noin 50% ja 70%, vastaavasti. (I) IEC-18 tumat myös vähentynyt, joiden arvot 25% ja 32% alennus 30 ja 50 uM of derricin, vastaavasti, ja 40% ja 38% 30 ja 50 uM of derricidin, vastaavasti. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Ensimmäinen analyysit paljastivat, että derricin ja derricidin pystyivät vähentää solujen elinkelpoisuuden, mikä viittaa siihen, että molemmat flavonoidit vaikuttavat syöpäsolujen kasvua . Sen testaamiseksi derricin ja derricidin voivat estää leviämisen CRC solulinjojen, suoritimme Edu-sisällyttäminen määrityksessä. Havaitsimme, että molemmat kalkonien pystyivät vähentämään lisääntyvien solujen, 30 ja 50 uM, kaikissa solulinjoissa (Fig. 3 A-O). Sen jälkeen määrällisesti, voitiin havaita, että 30 uM molempien kalkonien estävät noin 40% soluproliferaation HCT116 ja noin 50%: in DLD-1 (Fig. 3 P, Q). Mielenkiintoista, 30 uM sekä flavonoideja pystyivät inhiboimaan vain noin 20% soluproliferaation IEC-18, joka osoittaa eron säätelyyn solunjakautumisen tuumori- ja ei-tuumori- solulinjoissa (kuvio. 3R).

Edu sisällyttäminen paksusuolen soluissa hoidon jälkeen 30 ja 50 uM sekä derricin ja derricidin 24 tuntia. (A, A ’, B, B’, C, C ’) Valvonta olosuhteissa, havaitaan huomattava määrä Edu-positiivisia soluja. (D, D ’, E, E’, F, F ’, G, G’, H, H ’, I, I’) hoidon jälkeen derricin, on havaittu, pienempi määrä Edu-positiivisia soluja. (J, J ’, K, K’, L, L ’, M, M’, N, N ’, O, O’) Derricidin käsittely vähentää myös Edu-positiivisia soluja. (P, Q, R) kvantifiointi Edu-positiivisten solujen HCT116, DLD-1 ja IEC-18. Mittakaava 50 pm, ** p 0,01, *** p 0,001.

Seuraava kysytään nämä vaikutukset voivat liittyä solusyklin pysähtymiseen. Voit tehdä tämän, käsittelimme HCT116, DLD-1 ja IEC-18-solujen kunkin flavonoidi 96 tuntia ja määrällisesti solujen prosenttiosuus eri solusyklivaiheista (Fig. 4). DMSO-käsiteltyjen HCT116-soluja lähinnä G1 /G0 solusyklin vaiheessa (Fig. 4A M1 alue). Derricin indusoi merkittävää häiriötä näissä diploidisoluissa, jotka laskivat solumäärää G1 /G0 vaihe 67,6% ja 54%, kun hoidettiin 30 ja 50 uM tämän flavonoidi, vastaavasti (kuvio. 4A M1 alue). Derricin vaikuttaa solusyklin annoksesta riippuvalla tavalla, kun otetaan huomioon, että 30 uM pidätetty solusyklin S-vaiheessa ja 50 uM pidätettiin solusyklin G2 /M-vaiheessa (Fig. 4A, D). Derricidin arvioitiin myös sen kyky hallita solusyklin. Hoito 30 uM ja 50 uM derricidin vähensi prosenttiosuus Diploidisoluista 53,8% ja 35,5%, tässä järjestyksessä ja indusoi merkittävän solukierron pysähtymisen G2 /M vaiheessa niin pitoisuuksina (Fig. 4E). Taajuus DLD-1-soluissa, jotka sisältävät monistaa DNA-pitoisuus oli noin 50% kontrollisoluissa ja kasvoi 30,3% ja 59,3% soluista hoidon jälkeen 30 uM ja 50 uM derricidin. Toisaalta, elävät DLD-1-adenokarsinoomasoluja kertynyt G0 /G1 vaiheen solusyklin jälkeen 30 uM ja 50 uM derricin (Fig. 4B, M1 alue). 31,6% soluista oli G0 /G1 vaiheeseen käsittelemättömän tai DMSO-käsitelty olosuhteissa. Tämä määrä saavutetaan 66,9% ja 65,7% solujen 30 uM ja 50 uM, vastaavasti derricin. Nämä tulokset osoittavat myös ei-riippuvainen annosvaste derricin hoidon (Fig. 4F). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin, kun käsitellään näitä solu- linjassa derricidin molemmissa pitoisuuksissa (Fig. 4B, M1 alue, 4G). Mielenkiintoista on, että IEC-18 esitetään heikko solusyklin vaihemodulaatio sekä derricin ja derricidin hoitoja, lukuunottamatta lievempi vaikutus 50 uM derricin (Fig. 4C, H, I). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että anti-proliferatiivista vaikutusta derricin ja derricidin, joka toimi pysäyttämällä solusyklin HCT116 ja DLD-1 tuumorisolulinjoja.

(A, D, E) In HCT116, käsittelemätön solut osoittivat noin 75% soluista G1 /G0 vaihe, kun taas 30 ja 50 uM derricin vähennetään tämä osuus 67,6% ja 54%, vastaavasti, jolloin solusyklin pysähtymisen S ja G2 /M vaiheessa, vastaavasti. Derricidin vähennetään tämä osuus 53,8% ja 35,5%, vastaavasti ja myös indusoi solukierron pysähtymisen G2 /M vaiheessa. (B, F, G) Toisaalta, DLD-1-soluja kertynyt G0 /G1 vaiheen solusyklin jälkeen 30 uM ja 50 uM derricin tai derricidin. (C, H, I) Derricin ja derricidin hoito oli mietojen vaikutuksia solukierron etenemisessä IEC-18-solujen, mutta esitetään hieman pysäyttävät G2 /M 50 uM derricin. Pylväsdiagrammit edustavat solujen prosenttiosuus mukaan hoidon ja merkittävät tiedot olivat edustettuina kuvassa. Mustat palkit: G0 /G1 vaiheeseen; Valkoiset pylväät: S-vaiheessa; ja harmaat pylväät: G2 /M-vaiheessa.

Derricin ja derricidin kuten estäjän Wnt /β-kateniinin signalointi

vapauttaminen kanonisessa Wnt-signalointi liittyy läheisesti paksusuolen syöpäsoluja [ ,,,0],1,3]. Esimerkiksi, HCT116-solut on mutaatio CTNNB1 geeni, joka koodaa β-kateniinin proteiinia, ja siten on suuri aktiivisuus Wnt /β-kateniinin reitti [2]. Kysyimme, onko solujen elinkykyä ja solukierron-pidätys vaikutukset derricin ja derricidin in HCT116-soluja johtuen modulaatioon Wnt /β-kateniinin signalointi. Ensin analysoidaan solujen jakautumista β-kateniinin. Käsittelemättömissä tai DMSO-käsiteltyjä soluja, β-kateniinin proteiini havaittiin ytimet lähes 50%: lla soluista (Fig. 5A, B, C, J). Kuitenkin, kun käsitellään soluja derricin, vain 25% soluista osoitti tumavärjäystä kanssa β-kateniinin (Fig. 5D, E, F, J). Kun kyseessä on derricidin, 26% soluista osoitti ydin- β-kateniinin, joka oli myös merkittävä väheneminen tuman värjäytymisen (kuvio. 5G, H, I, J). Koska nämä tulokset tukevat mahdollisen Wnt /β-kateniinin esto, me käsitelleet Wnt-reitin aktivointi tilassa suoremmin, suorittamalla Wnt /β-kateniinin erityinen toimittaja määrityksiä HCT116 transfektoitu TOPFlash plasmidilla. Johdonmukaisesti aikaisempien tietojen derricin ja derricidin nimenomaan esti Wnt reportteriaktiivisuutta (Fig. 5K). Nämä tulokset osoittavat, että derricin ja derricidin pystyivät estämään Wnt /β-kateniinin väylän HCT116-kasvainsolulinjaa.

(AI) β-kateniinin immunovärjäys HCT116-soluja käsiteltiin 30 uM kutakin Kalkonin 24 h. (A-C) In ohjausehtojen, suurin osa soluista näyttää β-kateniinin värjäys tuman. (D-F) hoidon jälkeen derricin, tämä värjäys katoaa ja useimmat solut näyttävät β-kateniinin sytoplasmassa ja kalvo. (G-I) Derricidin käsittely vähentää myös tuman värjäytymisen ja β-kateniinin. (J) kvantifiointi immunovärjäyksen osoitti, että sekä kalkonien vähentää ydinaseiden β-kateniinin. (K) Wnt /β-kateniinin erityinen toimittaja määritys TOPFlash /

Renillaa

transfektoitujen HCT116-soluissa. Molemmat kalkonien vähentää Wnt reportteriaktiivisuutta jälkeen 30 ja 50 uM hoito 24 tuntia. Mitta-asteikko: 50 uM, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

kokeellisesti HCT116 vahvasti siihen, että derricin ja derricidin ovat voimakkaita estäjiä kanoninen Wnt signalointia . Ongelman vaikutuksen tarkemmin, suoritimme klassinen kokeiluja analysoida Wnt koulutusjakson asetus, so lusiferaasireportterigeenin-geenin määrityksissä in RKO-pBAR /

Renillaa

solut ja HEK293T soluja. Näitä soluja käsiteltiin 10, 20 tai 50 uM derricin läsnä ollessa Wnt3a kunnostettu alusta. Derricin vähensi Wnt reportteri aktiivisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla sekä solulinjoissa (Fig. 6A, C). Derricidin hoito oli myös mahdollisuus vähentää Wnt reportteri aktiivisuutta, vaikka korkein inhibitio saavutettiin vasta, kun soluja käsiteltiin 50 uM (Fig. 6B, D). Havaitsimme hieman laski Wnt reportteriaktiivisuutta hoidon jälkeen 20 uM derricidin. Tietää derricin ja derricidin teko ylävirtaan tai alavirtaan efektoriproteiini β-kateniinin, aktivoimme Wnt signalointia transfektoimalla HEK293T solujen β-kateniinin ja arvioitiin kalkonien eston vaikutuksia. Derricin kykeni inhiboimaan β-kateniinin aktivointi Wnt-reitin, kun taas derricidin ei ollut, mikä viittaa siihen, että derricin toimii alavirtaan β-kateniinin, kun derricidin säädösten ylävirtaan (Fig. 6E). Nämä tiedot osoittavat, että derricin ja derricidin käyttäytyvät inhibiittoreina Wnt /β-kateniinin signalointireitin, mutta eri pitoisuuksina ja eri tasoilla tämän signaloinnin.

(A, C) Derricin estää Wnt-reportterin aktiivisuus alkaa 10 uM Lusiferaasimäärityksiä of RKO-pBAR /

Renillaa

ja Hek293T. (B, D) Derricidin hieman inhiboi Wnt-reportterin aktiivisuus 20 uM RKO-pBAR /

Renillaa

ja Hek293T. In RKO-pBAR /

Renilla

, suurempi inhibitio saavutetaan 50 uM derricidin (B). (A, B) 10, 20, 50 uM kutakin Kalkonin. (C, D) 10, 20, 30 uM kunkin Kalkonin. (E) HEK293T aktivointi Wnt signalointia transfektio β-kateniinin tukahdutetaan kun derricin hoitoon, mutta ei derricidin. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Derricin ja derricidin estää kaksinkertainen akseli muodostumista

Xenopus

alkioiden ja tukahduttaa Wnt /β-kateniinin lusiferaasireportterista aktiviteetti

in vivo

Wnt aiheuttama sekundaarinen akselin muodostuminen

Xenopus

liittyy yliaktivoituvan Wnt /β-kateniinin signalointi kehityksen aikana

Xenopus

alkiot, ja siten, negatiivinen modulaattorit tämän reitin pystyvät kääntämään tai vähentämään kaksinkertaista akselin fenotyyppi [26,27]. Kuten tiedot korostettu sitä, että nämä flavonoideja ovat estäjiä kanoninen Wnt signalointia, päätimme analysoida kyky derricin ja derricidin vaikuttaa Wnt aiheuttama kaksinkertainen akseli muodostuminen

Xenopus

alkioita. Teemme yhteistyötä pistetään alkioiden

x

Wnt8 mRNA ja derricin tai derricidin vatsanpuoleisissa blastomeerien 4-cell-vaiheen

Xenopus

alkioita. Havaitsimme, että noin 73%: n alkioiden näkyy toissijainen akselinsa

x

Wnt8 injektion (Fig. 7B, E, F). Kuitenkin, co-injektio

x

Wnt8 kanssa derricin tai derricidin vähentää induktion ectopic akselin (Fig. 7C, D). Co-injektion derricin pystyi vähentämään kaksinkertainen akselilla 43%, kun taas derricidin vähensi sitä 41% (Kuva. 7E, F). Lisäksi suoritimme lusiferaasin kokeita ruiskuttamalla plasmidi S01234-Luc ventraalisella puolella

Xenopus

alkioita. Tämä

siamois

-reporter pystyy vastaamaan Wnt signalointia aktivaation aiheuttama yhteistyössä johtamiseen xWnt8 mRNA. Me pistetään samanaikaisesti 0,4 pmol /alkio derricin ja derricidin testata onko ne voivat estää reportteri aktivointi. Tämän seurauksena, sekä kalkonien vähentää reportterin aktiivisuus merkittävästi (kuvio. 7G). Nämä tiedot osoittavat, että derricin ja derricidin voivat myös estää Wnt /β-kateniinin reitin

in vivo

Xenopus laevis

alkio malli.

Kuvat ovat alkioiden CO- ruiskutetaan xWnt8 mRNA plus DMSO (B) tai xWnt8 mRNA plus derricin tai derricidin (C, D). Noudata epätäydellinen kaksinkertainen akselin muodostumista tai toissijainen akseli ablaatio alkioiden ruiskutetaan kalkonien. (E-F) Kuvaajat osoittavat prosenttiosuudet alkion fenotyyppejä. Huomaa, että co-injektio Kalkonien kanssa xWnt8 mRNA vähensi prosenttiosuus alkioiden kaksinkertainen akseli, ja kasvattanut normaali alkioiden, yhdellä akselilla. (G)

Xenopuksen

alkioiden pistetään S01234 toimittaja +

Renillaa

, xwnt8 (10 pg) kanssa DMSO tai kalkoneita (0,4 pmol /alkio). Aktivointi toimittaja estettiin kalkonisyntaasia injektiona. Arrowheads: sementti rauhanen; nuoli: epätäydellinen kaksinkertainen akseli; A-P: etu-taka-akseliin.

Keskustelu

Flavonoidi kulutus on ollut pitkään mukana valvontaa ja hoitoon eri ihmisen syövistä [28]. Sen osalta kolorektaalisyövän, monet flavonoideja on yhdistetty ohjaus- ja taudin ennaltaehkäisyä [9,16-18]. Kalkonien esimerkiksi voi tarjota etuja antituumoriaineina, verrattuna muihin flavonoideja, koska heillä on vähän vuorovaikutusta DNA ja siten vähäinen mutageneesin [29]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että kaksi flavonoideja (Fig. 1), mistä kalkonin alaluokka, on voimakas anti-proliferatiiviset vaikutukset peräsuolen kasvainten solulinjoissa, HCT116 ja DLD-1. Derricin ja derricidin molemmat voimakkaasti esti solujen kokonaismäärään ja elinkelpoisuus näiden solujen

in vitro

(Fig. 2) ja myös vähensi HCT116 ja DLD-1 solujen lisääntymistä oli samaa tasoa kuluttua 24 h (Fig. 3). Analysoimme myös derricin ja derricidin vaikutuksia IEC-18, ei-transformoitu epiteelisolulinja. Solujen elinkelpoisuus vasta alentunut korkeampia pitoisuuksia, toisin mitä tapahtuu HCT116 ja DLD-1-soluissa. Lisäksi 30 uM molempien kalkonien oli hieman vaikuttaa IEC-18-solujen lisääntymisen, kun taas vähentää noin 50% havaittiin HCT116 ja DLD-1-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutus enemmän rajoitettu CRC soluihin.

Derricin ja derricidin vaikutukset liittyvät modulaatiota solusyklin etenemisen, pääasiassa muuttamalla solujen prosenttiosuus G2 /M ja S vaiheissa solusyklin in HCT116 ja G0 /G1 DLD-1 (Fig. 4). Mielenkiintoista on, derricin ja derricidin solusyklin pysähtymisen tapahtuu eri vaiheissa solusyklin kussakin solulinjassa. Nämä vaikutukset voivat liittyä tiettyyn flavonoidi vaikutus modulaatiota erilaisten solusykliä sääteleviä proteiineja, ja erot taustalla mutatoitujen geenien kussakin solulinjassa voi selittää näitä erillisiä vaikutuksia [30]. Lisäksi, derricin ja derricidin ei ollut merkittäviä vaikutuksia IEC-18, ei-tuumorisolulinjassa. Nämä tulokset voidaan korreloida muiden raporttien tärkeiden sytotoksisia vaikutuksia näillä flavonoidien [31,32]. Toiset kalkonien hallussaan apoptoottisia ja antiproliferatiivisia vaikutuksia [33,34,35].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat parantaneet ymmärrystä vaikutusmekanismeja flavonoidien. Esimerkiksi monet flavonoideja ovat modulaattoreita eri signalointireittien, kuten Wnt /β-kateniinin, joka liittyy yleisesti peräsuolen syövän etenemistä [1,2,3,5,36]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että antituumorivaikutukset derricin ja derricidin voi liittyä Wnt-reitin modulointi, koska ne merkittävästi vähentää lokalisoituminen tumaan β-kateniinin ja vähentää Wnt-reportterin aktivoitumisen HCT116-soluissa (kuvio. 5). Jotta ymmärtää paremmin vaikutusta Wnt signalointia näillä kalkonien, suoritimme geeni-reportteri määrityksissä on RKO-pBAR /

Renillaa

ja HEK293T- solulinjoja, joita perinteisesti käytetään tutkimaan tämän reitin [21,26]. Derricin esti voimakkaasti Wnt signalointia pitoisuutena 10 uM, kun taas derricidin saavutetaan samanlainen inhiboiva tasolla vain 50 uM molemmissa solulinjoissa (Fig. 6A, C). Myös derricin ja derricidin estävät Wnt signalointia erilaisten mekanismien kautta, koska derricin pystyy torjumaan β-kateniinin Wnt signalointia aktivointia, vaikka derricidin ei ole (Fig. 6E). Tämä ero pitoisuus liittyviä vaikutuksia kahden kalkonien saattavat liittyä niiden kemiallisia rakenteita ja /tai siten, että ne ovat vuorovaikutuksessa Wnt osia tai solun osastoihin, joilla on merkittäviä vaikutuksia niiden teho ja selektiivisyys.