Krooninen sairaus

tiivistelmä

histoni metylaatio on keskeinen rooli eri biologisten ja patologisten prosessien kuten syövän kehitystä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että JARID2, joka on vuorovaikutuksessa komponentin Polycomb tukahduttavaa kompleksi-2 (PRC2), joka katalysoi metylaatio lysiinin 27 histoni H3 (H3K27), oli mukana Transforming Growth Factor-beta (TGF-ß) aiheuttaman epiteelin -mesenchymal siirtyminen (EMT) A549-keuhkosyövän solulinjassa ja HT29 koolonisyöpäsolulinja. Ilmaus

JARID2

lisättiin aikana TGF-ß-indusoidun EMT näistä solulinjoista ja pudotus on

JARID2

inhiboi TGF-ß-indusoidun morfologiset muuntaminen liittyvät solut EMT.

JARID2

pudotus itsessään ei ollut mitään vaikutusta ilmaus EMT liittyvien geenien mutta antagonisoivat TGF-ß-riippuvaista ilmentyminen muuttuu EMT liittyviä geenejä, kuten

CDH1

,

ZEB

perhe ja

microRNA-200

perhe. Kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä osoittivat, että JARID2 oli osallisena TGF-ß aiheuttama transkription tukahduttamisesta

CDH1

ja

microRNA-200

perheen geenien kautta sääntelyn histoni H3 metylaatio ja EZH2 occupancies niiden säätelyalueita . Tutkimuksemme osoittaa, uusi rooli JARID2 proteiinia, joka voi ohjata PRC2 rekrytointi ja histoni metylaation aikana TGF-ß-indusoidun EMT keuhkojen ja paksusuolen syövän solulinjat.

Citation: Tange S, Oktyabri D, Terashima M, Ishimura A, Suzuki T (2014) JARID2 osallistuu Transforming Growth Factor-beta-aiheuttama epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon Lung ja Colon Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (12): e115684. doi: 10,1371 /journal.pone.0115684

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean Tasavalta

vastaanotettu: 16 syyskuu 2014; Hyväksytty 25 marraskuuta 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Tange et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Grants-in-Aid tieteellisen tutkimuksen C (lupanumeroon 24590346 TS) ja tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (lupanumeroon 22112010 TS) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lysiini (K) metylaatio on aminoterminaalinen häntä histoni H3 (K4, K9, K27 ja K36) on noussut tärkeäksi translaation jälkeisen modifikaation koska sillä on erityinen dynamiikka transkription säätelyyn [1], [2]. Metylointi H3K4 on tiukasti liitetty aktiiviseen transkriptio taas metyloinnin H3K9 ja H3K27 ovat tukahduttavia merkkejä chromatin. Näitä muutoksia säätelee histoni lysiiniä metyylitransferaasit (kmts) ja lysiiniä demethylases (KDMs). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että vapauttaminen näiden entsyymien voivat edistää kehityshäiriöitä vikoja ja patogeneesi ihmisen sairauksia kuten syöpää [1] – [3].

Jotta voitaisiin löytää uusia geenejä sekaantuneet syövän kehitystä, meillä on suoritetaan retroviruksen insertiomutageneesin hiirillä. Tämä näyttö johti eristämiseen satojen ehdokas syövän geenien myös monia geenejä, jotka koodaavat kmts ja KDMs [4], [5]. Aiemmin kerroimme, että KDM5B /PLU1 /JARID1B, joka on H3K4 demetylaasientsyymin ja yksi ehdokas onkogeenien, alassäädetty ilmaus

KAT5

ja

CD82

geenit lisätä solujen invaasiota [6] ja tukahdutettu ilmaus

microRNA-200

(

miR-200

) perhe, mikä edistää epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsolujen [7]. Näin ollen meidän tutkimukset paljastivat, että histoni metyyli-modifioivia entsyymejä olivat mukana ei ainoastaan ​​kasvain aloittamista, mutta myös kasvaimen etenemistä.

Kasvaimen eteneminen on liitetty aktivointi EMT ohjelma, joka on indusoitu ulkoisten signaalien, kuten Transforming Growth Factor-beta (TGF-ß) [8], [9]. EMT on ominaista muutosten epiteelin ja mesenkymaaliset geeniekspressiota. Varsinkin, alas-säätely E-kadheriinin on välttämätöntä EMT. Useat transkriptiorepresso- kuten ZEB1 ja ZEB2 ovat mukana E-kadheriinin transkription repression aikana EMT [10]. Reversiibeliä ominaisuudet EMT mukaan epigeneettisellä asetusta kuten DNA: n metylaatio, histonimodifikaation ja microRNA voi olla mukana [11]. On olemassa useita papereita myös meidän tutkimus osoittaa yhteys E-kadheriinin tukahduttaminen ja toiminta histoni metyyli-modifioivia entsyymejä [7], [12], [13]. Kuitenkin rooli histonien metylaatio vuonna EMT on vasta alkamassa paljastanut.

JARID2 on yksi JARID proteiineja, jotka sisältävät JmjC (jumonji C) domain ja kuivilla (AT-rikas vuorovaikutus domain) [2]. Kuitenkin JARID2 proteiini puuttuu histoni demetylaasin aktiivisuuden ominaisuus muiden JmjC domeenin proteiineja, koska se on aminohapposubstituutioita konservoituneen alueen [2]. JARID2 on raportoitu lisälaite osa Polycomb tukahduttavaa kompleksi-2 (PRC2), joka säätelee tärkeää geeniekspressiomalleja kehityksen aikana [14]. PRC2 sisältää ydin alayksiköt: EZH2, SUZ12, TE ja RBBP4 /7, ja on vastuussa tukahduttamistoimista H3K27 metylaation [15]. JARID2 on osoitettu ohjaamaan PRC2 käyttöasteen ja aktiivisuus kohde- geenien alkion kantasolut (ESC) [16] – [19]. Toisaalta, vapautuminen PRC2 aktiivisuuden arvellaan vaikuttavan ihmisen syövän kehitykseen. EZH2, entsymaattinen komponentti PRC2, osoitettiin olevan yli-ilmentynyt metastaattisen syövän, ja ilmentymistasot liittyy kasvaimen etenemistä [20], [21]. Kuitenkin rooli JARID2, joka on vuorovaikutuksessa komponentin PRC2 aikana syövän etenemisessä on edelleen tuntematon.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin funktio JARID2 aikana TGF-ß-indusoidun EMT A549 keuhkosyövän solulinjassa ja HT29 paksusuolen tasyöpäsolulinja. Huomasimme, että TGF-ß-riippuvaista ekspressiota muutokset EMT liittyviä geenejä inhiboi

JARID2

Knockdown ja parantaa

JARID2

yli-ilmentymisen. Mekanistinen tutkimukset ehdotti, että JARID2 oli mukana TGF-ß aiheuttama transkription tukahduttamisesta

CDH1

ja

miR-200

perheen geenien kautta modulaatioon histoni H3 metylaatio.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

pieni hiusneula-RNA (shRNA) ilmentävä retrovirusvektorit konstruoitiin kuten aiemmin on kuvattu [6]. Juosteen sekvenssit oligonukleotidit olivat seuraavat:

JARID2

shRNA # 1, 5′-ccgggaaacaggtttctaaggtaaactcgagtttaccttagaaacctgtttcttttt-3 ’

JARID2

shRNA # 2, 5′-ccgggcccaacagcatggtgtatttctcgagaaatacaccatgctgttgggcttttt-3 ’

sekvenssi ohjaus shRNA on kuvattu aiemmin [6]. Olemme vahvisti, että ilmentyminen

JARID2

on alas-säädellä infektio sekä

JARID2

shRNA ilmentävien retroviruksia myös läsnä TGF-ß kvantitatiivisen RT-PCR: llä (QRT-PCR ) ja Western blot (S1 Kuva.). Olemme myös vahvistaneet, että molemmat

JARID2

shRNAs aiheuttivat samat vaikutukset meidän EMT tutkimuksissa (S2 kuvassa.), Ja näin me esitteli datan

JARID2

shRNA # 1 edustajana tulos (kuvattu kuten JARID2 KD). Ihmisen

JARID2

cDNA merkitty FLAG-6xHis-tag, ja sitten kloonattiin pDON-5 Neo-plasmidin (Takara) tuottamaan retroviruksia ilmentävien JARID2.

Soluviljely ja transfektio

A549 ihmisen keuhkosyövän solulinjassa ja HT29 ihmisen paksusuolen syövän solulinjan toimitti ystävällisesti Dr. Y. Endo (Cancer Research Institute, Kanazawa Univ.) ja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jossa oli 10% FBS: ää, 2 mM glutamiinia ja penisilliini /streptomysiiniä (Sigma) 37 ° C: ssa 5% CO2: ta. EMT induktio, A549-soluja käsiteltiin 1 ng /ml TGF-ß (R 0,01 vertaamalla hallita). (F) Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi JARID2 proteiinien aikana TGF-ß-indusoidun EMT. Kontrollina, anti-GAPDH-vasta-ainetta käytettiin osoittamaan, että yhtä suuret määrät proteiineja ladattiin geeliin.

knockdovvn JARID2 esti morfologiset muutokset solujen aiheuttama TGF-ß

Valaistaan ​​toiminnon JARID2 vuonna EMT, me tutki knockdovvn

JARID2

vaikuttaisi EMT prosessin aiheuttama TGF-ß. A549-soluja infektoitiin ohjaus retrovirus tai retrovirus ekspressoivat

JARID2

shRNA, ja infektoidut solut käsiteltiin tai ei TGF-ß. Sen jälkeen TGF-ß hoito, ohjaus solut hajallaan, pitkänomainen ja oletettu fibroblasti kaltainen ulkonäkö liittyy EMT (Fig. 2A).

JARID2

pudotus itse ei muutu solun muotoja merkittävästi, mutta esti morfologisia muutoksia solujen aiheuttama TGF-ß (Fig. 2A). Seuraavaksi suoritettiin immunofluoresenssimäärityksellä käyttämällä vasta-ainetta E-kadheriinin, joka on epiteelisolujen markkeri. Käsittelemättömän verrokin A549-solut osoittivat heterogeeninen E-kadheriinin värjäys, ja tämä värjäytyminen oli lähes hävinnyt TGF-ß-käsiteltyjä soluja, kuten on kuvattu aiemmin (Fig. 2B) [23]. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, E-kadheriinin värjäys oli selvästi havaittavissa

JARID2

pudotus solut, joita käsiteltiin tai ei TGF-ß, mikä viittaa siihen, että epiteelin ominaisuus voidaan ylläpitää

JARID2

pudotus soluja, vaikka TGF-ß hoitoon. Olemme edelleen tutki asemaa aktiini in soluista TRITC konjugoitu phalloidin värjäystä, koska aktiini uudelleenjärjestely tapahtuu EMT prosessin [8]. Toisin kuin käsittelemätön kontrolli soluihin, TGF-ß dramaattisesti aiheuttama aktiini kuidunmuodostukseen tyypillisiä EMT (Fig. 2C). Kuitenkin

JARID2

pudotus soluja, emme tarkkailla aktiini kuitujen muodostuminen vaikka läsnä TGF-ß (Fig. 2C).

(A) Cell morfologiset muutokset A549-soluja sen jälkeen, kun TGF-ß hoitoa. A549-solut infektoitiin retrovirusten ilmentävät ohjaus shRNA tai

JARID2

shRNA (kuvattu

JARID2

KD) ilman tai hoitoon 1 ng /ml TGF-ß 48 tuntia. (B) Immunofluoresenssi kuvia solujen osoittaa lokalisoinnin E-kadheriinin. Paneelit A549 solut samalla järjestely (A) värjättiin anti-E-kadheriinin ainetta ja DAPI. (C) Fluoresenssikuvat solujen osoittaa uudelleenjärjestelyn aktiinisytoskeletonin värjäämällä TRITC- phalloidin (aktiini) ja DAPI. Mittaviivat: 20 pm.

Meillä on myös tutkinut,

JARID2

Knockdown aiheuttaisi samanlaisia ​​vaikutuksia toisessa EMT malliin. Käytimme ihmisen koolonisyöpäsolulinja, HT29, koska se vastaa TGF- ß EMT [7]. Ekspressiota varten

JARID1A

,

JARID1B

,

JARID1C

ja

JARID1D

, QRT-PCR osoitti, että vain

JARID1B

ilmaisu lisääntyi merkittävästi käsittelyn jälkeen 5 ng /ml TGF-ß (Fig. 3B). Ilmaus

JARID1D

ei havaittu HT29, koska

JARID1D

geeni sijaitsee Y-kromosomissa ja HT29-solut ovat peräisin naisten paksusuolensyöpä potilaalle. QRT-PCR ja Western blot paljasti, että

JARID2

ilmentyminen lisääntyi myös HT29 jälkeen TGF-ß hoitoa (Fig. 3d ja 3E). Kuten on esitetty kuviossa. 4, TGF-ß indusoi morfologiset muutokset, katoaminen E-kadheriinin värjäys ja muodostumista aktiini stressin kuidun HT29.

JARID2

pudotus itse ei aiheuta merkittäviä muutoksia verrattuna valvoa soluihin, mutta antagonisoivat nämä TGF-ß aiheuttama fenotyypit (Fig. 4). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että pudotus on

JARID2

torjua TGF-ß-indusoidun morfologisia muutoksia ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä A549 ja HT29-syöpäsolujen ominaisuus EMT.

QRT-PCR-analyysi suoritettiin havaitsemiseksi ilmaus

JARID1A

(A),

JARID1B

(B),

JARID1C

(C) ja

JARID2

(D) HT29 ennen ja käsittelyn jälkeen 5 ng /ml TGF-ß (12 h, 24 h, 48 h ja 72 h) (*,

P

0,01 vertaamalla valvoa; **,

P

0,05 verrataan hallita). (E) Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi JARID2 proteiinien aikana TGF-ß-indusoidun EMT. Kontrollina, anti-GAPDH-vasta-ainetta käytettiin.

(A) Cell morfologiset muutokset HT29 jälkeen TGF-ß hoitoon. HT29-solut infektoitiin retrovirusten ilmentävät ohjaus shRNA tai

JARID2

shRNA (kuvattu

JARID2

KD) ilman tai hoitoon 5 ng /ml TGF-ß 72 tuntia. (B) Immunofluoresenssi kuvia solujen osoittaa lokalisoinnin E-kadheriinin. Paneelit HT29 solut samalla järjestely (A) värjättiin anti-E-kadheriinin ainetta ja DAPI. (C) Fluoresenssikuvat solujen osoittaa uudelleenjärjestelyn aktiinisytoskeletonin värjäämällä TRITC- phalloidin (aktiini) ja DAPI. Mittaviivat: 20 pm.

knockdovvn JARID2 vaikutti ilmentymisen muutosten EMT liittyvien geenien aiheuttama TGF-ß

EMT on ominaista muutosten epiteelin ja mesenkymaaliset merkki geenin ilmentymisen [8]. Niinpä olemme analysoineet ilmaisuksi epiteelin merkki,

CDH1 /E-kadheriinin

, ja mesenkymaalisten markkereita,

FN1 /fibronektiinin

ja

vimentiinista

JARID2

pudotus soluja. QRT-PCR osoitti, että TGF-ß väheni ilmaus

CDH1 /E-kadheriinin

mRNA A549-solut (Fig. 5A), kuten aiemmin on raportoitu [23].

JARID2

pudotus itsessään ei ollut mitään vaikutusta

CDH1

ilme, mutta esti tukahduttaminen

CDH1

aiheuttama TGF-ß (Kuva. 5A). Sillä

FN1 /fibronektiinin

ja

vimentiinista

joiden ilmaisut olivat ajan säätelee TGF-ß,

JARID2

Knockdown antagonized vaikutusta TGF-ß (Fig. 5B ja 5C ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

JARID2

pudotus estivät geeni-ilmentymisen ohjelman TGF-ß-indusoidun EMT A549-soluissa.

QRT-PCR-analyysi suoritettiin ekspression havaitsemiseksi

CDH1 /E-kadheriinin

(A),

FN1 /fibronektiini

(B),

vimentiinista

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(E),

miR-200a

(F),

miR-200c

(G) ja

JARID1B

(H) A549-soluissa tartunnan retrovirusten ilmentävät ohjaus shRNA tai

JARID2

shRNA kanssa tai ilman hoitoa 1 ng /ml TGF-ß 24 tuntia (*,

P

0,01 verrataan hallita). (I) Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi E-kadheriinin, fibronektiinin, vimentiinin, ZEB1, ZEB2, fosforyloidun Smad3 (P-Smad3) ja GAPDH-proteiineja käyttäen vastaavia vasta-aineita.

aikana EMT prosessi, on raportoitu, että ilmaisu E-kadheriinin säätelee transkription repressors kuten ZEB1 ja ZEB2 [10]. Niinpä olemme analysoineet ilmaus ZEB perheen transkriptio repressorit

JARID2

knockdown soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 5D ja 5E, TGF-ß käsittely sääteli ilmaus

ZEB1

ja

ZEB2

A549-soluissa.

JARID2

pudotus sinänsä ei vaikuttanut ilmaus

ZEB1

ja

ZEB2

merkittävästi, mutta esti TGF-ß-riippuvainen lisäys molemmat kopiot (Fig. 5D ja 5E ). Tämä havainto sai meidät tutkimaan mahdollisuutta, että vaikutus voi johtua sääntelyn

miR-200

perheen MikroRNA.

miR-200

perhe on raportoitu estävän ZEB1 ja ZEB2 aikana spesifisesti EMT [24], [25]. Niinpä me tutki

JARID2

Knockdown vaikuttaisi ilmaus kahden edustavan miRNA,

miR-200a

ja

miR-200c

. Yhdenmukainen aiempien raporttien [24], TGF-ß-hoito johti vähentynyt ilmentyminen

miR-200a

ja

miR-200c

in A549-solut (Fig. 5F ja 5G).

JARID2

pudotus sinänsä ei vaikuttanut ilmaisua, mutta esti säätely alaspäin kummankin MikroRNA aiheuttama TGF-ß (Fig. 5F ja 5G). Seuraavaksi tutkimme ilmaus

JARID1B

JARID2

Knockdown soluja, koska

JARID1B

havaittiin olevan säädelty jälkeen TGF-ß hoitoa ja olevan osallisena EMT [7]. Kuten on esitetty kuviossa. 5H,

JARID2

pudotus sinänsä ei vaikuttanut ilmaus

JARID1B

merkittävästi, mutta esti TGF-ß-riippuvainen lisäys

JARID1B

transkriptio.

Analysoimme myös muutoksia proteiinin ilmentymisen joidenkin EMT liittyviä geenituotteita A549-soluja.

JARID2

Knockdown peruutettu TGF-ß-riippuvainen väheneminen E-kadheriinin proteiinia ja kasvua fibronektiinin, vimentiinistä, ZEB1 ja ZEB2 proteiineja (Fig. 5I), jonka avulla voimme vahvistaa QRT-PCR-tuloksiin. Seuraavaksi yritimme tutkia TGF-ß signalointireitistä heikkenisi tai ei

JARID2

Knockdown soluja tunnistamalla fosforyloidun Smad3 proteiinit jälkeen TGF-ß käsittely [9]. Kuten on esitetty kuviossa. 5I, fosforyloitu Smad3 proteiinit aiheuttama TGF-ß ja niiden tasot olivat samanlaiset ohjaus soluissa ja

JARID2

knockdown soluja. Tämä tulos osoitti, että aktivointi loppupään Smad3 transkriptiotekijän TGF-ß-signaali ei saa haitata

JARID2

knockdown. Lisäksi olemme vahvistaneet vaikutukset

JARID2

Knockdown sääntelyssä EMT liittyvien geenien toisessa tasyöpäsolulinja, HT29 (Fig. 6). QRT-PCR osoitti, että

JARID2

Knockdown samalla esti TGF-ß aiheuttamiin muutoksiin on

CDH1 /E-kadheriinin

,

FN1 /fibronektiinin

,

ZEB1

,

miR-200a

,

miR-200c

ja

JARID1B

ilmentymistä HT29 (Fig. 6A-F), ja Western blot meille mahdollisuuden vahvistaa LRT -PCR tuloksia (Fig. 6G). Nämä tulokset yhdessä ehdottaneet, että JARID2 ei vaikuttanut aktivointi alavirran transkriptiotekijöiden TGF-ß-signaali, mutta oli mukana TGF-ß-riippuvaisen transkription säätely EMT liittyvien geenien A549 keuhkosyövän solulinjaa ja HT29 koolonisyöpäsolulinja.

QRT-PCR-analyysi suoritettiin ekspression havaitsemiseksi

CDH1 /E-kadheriinin

(A),

FN1 /fibronektiini

(B),

ZEB1

(C),

miR-200a

(D),

miR-200c

(E) ja

JARID1B

(F) HT29 infektoitu retrovirusten ilmentävät ohjaus shRNA tai

JARID2

shRNA kanssa tai ilman hoitoa 5 ng /ml TGF-ß 24 tuntia (*,

P

0,01 vertaamalla valvoa; **,

P

0,05 verrataan hallita). Ilmaisu on

vimentiinista

ja

ZEB2

alun perin alhainen tai ei havaita HT29. (G) Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi E-kadheriinin, fibronektiinin, ZEB1 ja GAPDH proteiineja käyttäen vastaavia vasta-aineita.

JARID2 on liitetty transkription säätelyyn CDH1 ja miR-200 perheen geenin TGF-ß muuntamalla histoni H3 metylaatio

JARID2 on tärkeä kofaktori PRC2 entsyymi monimutkaisia, joka katalysoi metyloinnin H3K27 [14], [15] ja mukana transkription sorto alakohtaisten neuvostojen [16] – [19]. Siten tutkimme metyloitu tilan histoni H3 sääntelyn alueille

CDH1

ja

miR-200

perheen geenejä, jotka kopiointia tukahdutettu aikana TGF-ß aiheuttama EMT, jonka chromatin immunosaostuksella ( chip) määritys. Geneettisesti,

miR-200

perhe on ryhmitelty kahteen polykistronisessa yksikköä:

miR-200B /200A /429

ja

miR-200C /141

[26]. Immunosaostuksen, alukesarjojen sijoitettu ylävirtaan transkription aloituspaikat

CDH1

geeni ja kaksi microRNA klustereita käytettiin kvantitatiivista PCR: ää [7].

Koska JARID2 voi rekrytoida PRC2 monimutkainen kromatiinin in alakohtaisten neuvostojen [16] – [19], ensin analysoineet kopiointia tukahduttavaa tri-metyloitu H3K27 (H3K27me3) asema A549-soluja. On säätelyalueita

CDH1

,

miR-200B /200A /429

ja

miR-200C /141

geenit, tasot H3K27me3 lisääntyivät merkitsevästi jälkeen TGF- ß hoitoon (Fig. 7), joka korreloi transkriptionaalisen tukahduttamisen näiden geenien. Toisaalta, kopiointia ajatellen aktiivisen H3K4me3 merkkejä väheni merkittävästi seuraavilla säätelyalueita TGF-ß (Fig. 7). Vielä tärkeämpää on, havaitsimme tehostettu rekrytointi EZH2, katalyyttisen alayksikköä PRC2 monimutkaisia, seuraavilla säätelyalueita jälkeen TGF-ß hoitoa (Fig. 7). Nämä tulokset viittaavat siihen, TGF-ß aiheuttama rekrytointi EZH2 sääntely-alueet saattavat olla vastuussa transkription sortoa A549-soluja.

JARID2

pudotus sinänsä ei aiheuttanut muutoksia histoni metylaation ja EZH2 occupancies näihin alueisiin. Lisäksi TGF-ß hoitoa

JARID2

Knockdown solut eivät johda kasvu H3K27me3 määrä pieneni H3K4me3 ja kasvu EZH2 rekrytoinnin (Fig. 7). Tämä havainto korreloi inhibitioon TGF-ß-riippuvaisen transkription tukahduttamisesta

CDH1

ja

miR-200

perheen geenien

JARID2

taintumisen soluja (Kuva. 5A, 5F ja 5G). Emme havainneet rekrytointi endogeenisen JARID2 proteiinin säätelyalueita Chip määrityksessä anti-JARID2 vasta-, mahdollisesti johtuen sen alhaisen reaktiivisuus immunosaostus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että JARID2 oli vastuussa TGF-ß aiheuttama transkription tukahduttamisesta

CDH1

ja

miR-200

perheen geenien aikana EMT A549 soluja ja että sen toiminta liitettiin sääntely rekrytointi EZH2 kromatiiniin varten histoni metylaation. Kontrollina koe, suoritimme ChlP määritys on säätelyalue liity

GAPDH

geenin A549-soluja. Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia H3K27 ja H3K4 metylaation ja EZH2 occupancies sääntelystä alueella

GAPDH

geenin JARID2 Knockdown ja /tai TGF-ß hoito (S3 kuvassa.). Tämä osoitti, että JARID2 välittämää muutoksia histoni H3 metylaatio ja EZH2 rekrytointi voisi olla erityinen kohde geenejä säätelee JARID2 ja TGF-ß, joka korreloi spesifisyyden transkription sääntelyn.

ChIP analyysit H3K27me3, H3K4me3 ja EZH2 on säätelyalueita

CDH1

(A),

miR-200B /200A /429

(B) ja

miR-200C /141

geenit (C ) A549-soluissa on esitetty. Occupancies Metyloitujen histonien tai EZH2 proteiinin alueita analysoitiin kvantitatiivinen PCR (*,

P

0,01 vertaamalla valvoa; **,

P

0,05 verrataan hallita) .

lisäksi tutkimme myös vaikutuksia

JARID2

knockdown statuksen histoni H3 metylaatio ja EZH2 rekrytoinnin sääntelyn alueille

CDH1

ja

miR-200

perheen geenien toisessa tasyöpäsolulinja, HT29 (Fig. 8). ChIP analyysit paljastivat, että

JARID2

pudotus samalla esti TGF-ß-riippuvainen lisäys H3K27me3 ja EZH2 occupancies ja väheneminen H3K4me3 seuraavilla säätelyalueita (Fig. 8). Nämä JARID2-välittyvät vaikutukset ei havaittu säätelyalue GAPDH-geenin (S4 Fig.). Siksi nämä tulokset sekä ehdotti, että JARID2 vaadittiin TGF-ß-riippuvia muutoksia histoni H3 metylaatio ja EZH2 rekrytointi erityisistä kohdegeeneissä aikana TGF-ß aiheuttama EMT prosessi A549 ja HT29 syöpäsolun linjat.

ChIP analyysit H3K27me3, H3K4me3 ja EZH2 on säätelyalueita

CDH1

(A),

miR-200B /200A /429

(B) ja

miR-200C /141

geenit (C) HT29 on esitetty. Occupancies Metyloitujen histonien tai EZH2 proteiinin alueita analysoitiin kvantitatiivinen PCR (*,

P

0,01 vertaamalla valvoa; **,

P

0,05 verrataan hallita) .

Yli-ilmentyminen JARID2 tehostetun TGF-ß-riippuvaisen transkription säätelyyn EMT liittyvien geenien

laajentamaan ymmärrystä sääntelyn EMT mukaan JARID2 selvitimme vaikutuksia on

JARID2

yli-ilmentymisen A549-solut. Yli-ilmentyminen

JARID2

varmistettiin QRT-PCR ja Western blot ja taso yliekspressoitujen

JARID2

ei merkittävästi muuttunut ennen ja jälkeen TGF-ß hoito (S5 Fig.) . Sitten tutkittiin ilmaus

CDH1 /E-kadheriinin

,

FN1 /fibronektiinin

,

vimentiinista

,

ZEB1, ZEB2, miR-200a

ja

miR-200c

A549-solujen

JARID2

yli-ilmentyminen.

JARID2

yli-ilmentyminen itse eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia ilmaus EMT liittyviä geenejä, mutta parannettu vaikutukset TGF-ß ilmaus EMT liittyvien geenien (Kuva. 9A-G).

JARID2

yli-ilmentävien solujen ilmentymisen

CDH1, miR-200a

ja

miR-200c

tukahdutettiin enemmän TGF-ß, ja ilmaus

FN1

,

ZEB1

ja

ZEB2

aktivoitiin enemmän TGF-ß (Kuva. 9A-G). Meillä on myös vahvistanut, että

JARID2

yli-ilmentyminen tehosti TGF-ß-riippuvainen vähentäminen E-kadheriinin proteiinia ja kasvua fibronektiinin, vimentiinin, ZEB1 ja ZEB2 proteiineja (Fig. 9H). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen

JARID2

voimistua TGF-ß-riippuvaisen transkription säätelyyn aikana EMT prosessin A549-solut.

QRT-PCR-analyysi suoritettiin ekspression havaitsemiseksi

CDH1 /E-kadheriinin

(A),

FN1 /fibronektiini

(B),

vimentiinista

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(E),

miR-200a

(F) ja

miR-200c

(G) A549-soluissa, jotka oli infektoitu kontrolli retrovirus tai retrovirus ekspressoivat

JARID2

hoitoa tai TGF-ß 24 tuntia (*,

P

0,01 vertaamalla valvoa; **,

P

0,05 vertaamalla valvoa; ***

P

0,05 vertaamalla hallita plus TGF-ß). (H) Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi E-kadheriinin, fibronektiinin, vimentiinin, ZEB1, ZEB2 ja GAPDH proteiineja käyttäen vastaavia vasta-aineita.

Seuraava yritimme tutkia

JARID2

yli-ilmentyminen A549-soluja vaikuttaisi metyloitu asemaan histoni H3 ja rekrytointi EZH2 on säätelyalueita

CDH1

,

miR-200B /200A /429

ja

miR-200C /141

geenit Chip analyysi. Näiden säätelyalueita,

JARID2

yli-ilmentyminen ei itse muuttaa tasoa H3K27me3 ja H3K4me3 merkittävästi, mutta parantaa vaikutuksia TGF-ß sekä muutoksia (Fig. 10), joka korreloi hyvin ekspressiotasot

CDH1

ja

miR-200

perheen geenejä. Lisäksi

JARID2

yli-ilmentyminen itse oli vähän vaikutusta EZH2 asumisviihtyvyytenä mutta parannettu EZH2 rekrytointi seuraavilla säätelyalueita jälkeen TGF-ß hoitoa (Fig. 10). Olemme voisi myös havaita lisääntynyt rekrytointi FLAG-merkitty JARID2 proteiinien alueisiin ainoastaan ​​läsnä TGF-ß (Fig. 10).