Krooninen sairaus

tiivistelmä

Merkittävä mekanismi monoklonaalisia vasta-aineita, jotka valikoivasti tavoite insuliinin kaltainen kasvutekijä tyypin 1-reseptori (IGF-1 R) ja estää kasvaimen kasvu tapahtuu vähen- tämisessä reseptori, riippumatta siitä, onko ne pystyvät (antagonistisia) tai kykenemätön (agonistinen) estää sitoutumisen sukulais ligandien. Olemme kehittäneet ja tunnettu siitä, uuden agonistinen anti-IGF-1 R humanisoitu vasta-aine, HR1, ja käyttää Dock-ja-Lock (DNL) tapa rakentaa Hex-HR1, ensimmäinen multivalentti vasta-aine, joka käsittää 6 funktionaalisen Fab HR1, tavoitteena parantaa teho HR1. Perustuen rajat salpaamiskokeita HR1 tunnistaa alue kysteiinipitoisia toimialueen α-alayksikköä, eroaa epitoopit kartoitettiin nykyisten anti-IGF-1 R-vasta-aineita, mutta HR1 on samanlainen kuin muut anti-IGF-1 R-vasta-aineiden vähen- tämisessä IGF-1 R ja proliferaation estossa, pesäkemuodostusta tai invaasion valittu syöpä solulinjoja in vitro, samoin kuin tukahduttaa kasvua RH-30 rabdomyosarkooma ksenograftin nude-hiirissä, kun se yhdistetään mTOR inhibiittorin, rapamysiini. Hex-HR1 ja HR1 ovat yleisesti vertailukelpoisia niiden bioaktiivisuuksiin alle in-intro ja in vivo olosuhteissa tutkittu. Tästä huolimatta valikoiva kokeista, joissa suora vertailu teho, Hex-HR1 osoitti voimakkaampi vaikutus estämällä solujen lisääntymistä stimuloi IGF-1 ja voi tehokkaasti downregulate IGF-1 R pitoisuutena niin alhainen kuin 20 pM.

lainaus: Chang CH, Wang Y, Trisal P, Li R, Rossi DL, Nair A, et al. (2012) Evaluation of Novel Kuusiarvoinen Humanisoitu anti-IGF-1 R-vasta-aineen ja sen rinnakkaiset Parental IgG Monipuolinen Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7 (8): e44235. doi: 10,1371 /journal.pone.0044235

Editor: Zhaozhong Han, Vanderbilt University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2012; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2012; Julkaistu: 31 elokuu 2012

Copyright: © Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu National Cancer Institute myöntää 1R 43CA150742-01 Yhdysvalloista National Institutes of Health. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet seuraavat edut. Vaikka yksi tai useampi tekijöistä työskentelee kaupallisten yhtiöiden Immunomedics, Inc, IBC Pharmaceuticals, Inc., ja keskus Molekyylilääketieteen ja immunologian, tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

signaalit välitetään solun pinnan kasvutekijäreseptoreista sitoutuessaan sukulais ligandeja ovat välttämättömiä säätelevät normaalien solujen kasvua ja erilaistumista, vaan myös edistää, lisääntymistä, eloonjääntiä, liikkuvuuteen ja etäpesäkkeiden erilaisten tyyppien pahanlaatuisten solujen, josta esimerkkinä on hyvin tutkittu insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF: t), ja niiden tärkeimpien signaloinnin reseptoria, IGF-1 R [1] – [4]. IGF signalointi akseli koostuu myös insuliinia ligandina; kolme muuta homo-reseptorit, IGF-2R, insuliini-isoformi A (IRA), ja insuliinin-isoformi B (IRB); kolme hybridi-reseptoreihin, kukin muodostuu IGF-1 R ja IRA, IGF-1 R ja IRB, ja IRA ja IRB; kuusi IGF sitovia proteiineja (IGFBRs); ja ryhmä proteaaseja, jotka hajottavat IGFBP vapauttaa IGF. IGF-1 R on reseptorityrosiinikinaasia, joka käsittää kaksi disulfidi-kytketty solunulkoisen α-alayksiköitä, joista kukin on liittynyt disulfidisidoksella transmembraaninen β-alayksikköön. Sytoplasmisen alueen β-alayksikön satamiin tyrosiinikinaasidomeeni, sekä telakka sivuston jäsenten insuliinin reseptorin alustan (IRS) perheen, ja SH2 sisältävä sovitin proteiinia, Shc [5]. IGF-1 sitoutuu α-alayksikön IGF-1 R, jolla on suurempi affiniteetti kuin IGF-2 [6]. Kytkennän IGF-1 R by IGF indusoi autofosforyloinnin kolmen tyrosiinijäännös kinaasidomeenia β-alayksikön [7], mikä edelleen fosforyloi muut tyrosiinijäännös sytoplasmadomeenista, mikä johtaa rekrytointiin IRS ja Shc, myöhempien aktivointi sekä fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) -Akt ja mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) polkuja [8]. Minimaalinen rakenneosia IGF-1-sitoutumiskohta IGF-1 R on määritelty [9] vaatia N-terminaalin L1 domeeni (aa 1-150), C-päähän runsaasti kysteiiniä sisältävän domeenin (aa 190- 300), ja C-pää α-alayksikköä (aa 692-702). Vertailun toiminnallinen epitooppeja IGF-2: n IGF-1 R kartoitettiin [10] ottamaan N-terminaalin L1 domeenin ja C-terminaalisen pään α-alayksikköä, mutta ei kysteiinirikkaan domeenin. Lisäksi IGFBP: ihin, hyötyosuutta IGF-2 säätelee myös IGF-2R, jolta puuttuu solunsisäinen kinaasiaktiivisuutta ja toimii siten scavenger-reseptorin IGF-2. Vaikka IRB tunnistaa vain insuliini, sen silmukointivariantti, IRA, joka on yleisimmin ilmaistaan ​​kasvaimia, sitoutuu myös IGF-2 [11], joilla on korkea affiniteetti, mikä johtaa mitogeenisiä vaikutuksia ja elonjäämisetua, liikkuvuuteen, ja invasiivisuus syöpäsolujen [12 ]. Monimutkaisuus IGF-merkinantojärjestelmä yhdistyy lisäksi kyky IGF-2 stimuloida IRA ja IRA /IRB, kyky sekä IGF-1 ja IGF-2 stimuloida IGF-1 R, IGF-1 R /IRA, ja IGF-1 R /IRB, ja ylikuulumisen välillä IGF-1 R ja EGFR [13] – [15], jotka kaikki näyttävät olevan väyliä tiettyjen syöpäsolujen paeta IGF-1 R-kohdistettuja hoitoja, ja antaa järkevää cotargeting IGF -1R IR [16], [17] tai EGFR /HER2 [18], [19] parantaa hoidon tehoa.

mahdollisuuksia kohdistamista IGF-1 R syöpien hoitoon osoitettiin aluksi kykyä αIR-3, hiiren monoklonaalinen vasta-aine (mAb), joka estää IGF-1 R sitova [20], inhiboimiseksi in vivo kasvun estrogeeni-riippumaton MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän ksenograftin nude-hiirissä [21]. Kaksi keskeistä strategioita IGF-1 R-täsmähoitoihin (nimittäin estää anti-IGF-1 R-vasta-aineita ja pienmolekyylisalpaajilla tyrosiinikinaasireseptoreihin) ovat aktiivisesti viime vuosikymmenen aikana, jolloin eri prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa erilaisissa syövissä, mikä tarkistettiin määräajoin [22] – [36]. Lisäksi, mahdollisten dual inhibition IGF-1 ja IGF-2: n neutraloivien vasta-aineiden on osoitettu äskettäin [37].

Useimmat mAb: t, joita on kehitetty IGF-1 R mennessä on suunniteltu säästämään IR ja estävät selektiivisesti IGF-IR-välitteisen signaloinnin estämällä IGF sitova. Niillä on myös yhteinen ominaisuus indusoimaan IGF-1 R downregulation kautta sisäistämistä ja hajoaminen [38], jotka voivat vahingossa vaikuttaa insuliinin signalointi vuoksi samanaikainen downregulation hybridi IGF-1 R /IR-reseptorien [39]. Jotka esitetään taulukossa S1 täydentävien tietojen

verkossa

, nämä mAb: t on paitsi hiiren, humanisoituja tai täysin humaaneja, eroavat rakenteellisia ja toiminnallisia ominaisuuksia, jotka sisältävät isotyypin, epitoopin, teho estää jommankumman tai molempien IGF: t, ja affiniteetti IGF-1 R. Kahdeksan tällaista mAb: t (AVE1642, BIIB022, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, ganitumumab, R1507, ja robatumumab) ovat olleet tai ovat parhaillaan kliinisissä kokeissa eri yhdistelminä. Puolueettomia vastauksia raportoitu joidenkin vaiheen II kokeissa, esimerkiksi kaksi tutkimusta [40], [41] osoittaa kliinistä hyötyä ei-pienisoluinen-keuhkosyöpä (NSLCL) hoidetuilla potilailla figitumumab, paklitakselin ja karboplatiinin (FPC) , kahden seuraavan vaiheen III kokeissa FPC ja yhdistelmä figitumumab kanssa erlotinibin valitsemattomat joilla on pitkälle edennyt NSCLC on keskeytetty lokakuussa 2009, puuttumisen vuoksi tehon ja suuremman toksisuuden ennakoitua aikaisen vaiheen data [42]. Huolimatta siis lukuisia vahva prekliinisiin tukevat perustelut IGF-1 R-kohdennettuja syövän hoidossa, on yleensä pettymys kliinisiä tuloksia, mistä kertoo figitumumab, R1507 (kliininen kehittäminen keskeytettiin joulukuussa 2009), ja muut [43], ovat korostaneet tulevaan suuntaan, joka keskittyy tunnistamista ja validointi ennakoivaa biomarkkerit sekä tutkinnan järkevämpää yhdistelmät muiden syöpälääkkeiden torjumiseksi yhteisiä resistenssimekanismeja kehitetty saarto IGF-1 R yksin.

Multivalentit vasta usein lisätä tehoa niiden kahdenarvoisen vanhempansa, osittain korkeampien sitovia aviditeetin sukulais antigeenejä kohdesoluihin. Dock-ja-Lock (DNL) alustan [44], [45] tuottaa kuusiarvoisen vasta-nimetty Hex-HR1, sen kahdenarvoisen vanhemman HR1, uusi humanisoitu vasta-aine (lgG1,

kappa

), joka kohdistuu IGF-1 R, mutta ei IR, tutkimme mahdollisuutta verrata erilaisia ​​biologisia toimintoja näytteillä Hex-HR1 ja HR1 erilaisissa syöpäsolulinjoissa, samoin kuin niiden in vivo teho ksenograftimallia ihmisen rabdomyosarkooma (RH -30) nude-hiirissä, tai ilman lisäämällä rapamysiinin. Me raportoimme tässä, että HR1 sitoutuu alueeseen IGF-1 R sijaitsee puolivälissä ensimmäisen puoliskon runsaasti kysteiiniä sisältävän domeenin (aa 185 -222), joka on erillään epitooppeja raportoitu useita anti-IGF-1 R-mAb: t [46, 47, ja taulukossa S1]. Erilaisuuden HR1 kuin anti-IGF-1 R-mAb: iden kliinisessä kehityksessä myös sen kyvyttömyys estää sitoutumisen joko IGF-1 tai IGF-2: n IGF-1 R, ja kiehtova käyttäytyminen aiheuttaa fosforylaation IGF-1 R ja loppupään signalointi ilman erityisesti stimuloivan solujen kasvua. Toisaalta, HR1 on samanlainen kuin muut anti-IGF-1 R vasta-aineiden kyky säätelevät vaimentaen IGF-1 R ja proliferaation inhiboimiseksi, pesäkemuodostusta tai invaasio valittujen solulinjojen in vitro, sekä hidastaa kasvua RH -30 ksenograftin nude-hiirissä, kun se yhdistetään mTOR-estäjä, rapamysiini. Hex-HR1 ja HR1 ovat yleisesti vertailukelpoisia niiden bioaktiivisuuksiin tutkituissa olosuhteissa, vaikka Hex-HR1 ei käynyt ilmi suurempi teho kuin HR1 vähen- tämisessä IGF-1 R ja proliferaation estossa tiettyjen reagoivien syöpäsolun linjat.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, Antibodies, ja reagenssit

Kaikki solulinjat hankittiin ATCC: stä, lukuun ottamatta RH-30, joka saatiin DSMZ. Humanisoidut vasta-aineet, mukaan lukien HR1, hPAM4 (anti-musiini), HA20 (anti-CD20), hRS7 (anti-Trop-2), hLL2 (anti-CD22), ja HMN-15 (anti-CEACAM6), toimitti Immunomedics . Rekombinantti ihmisen IGF-1 R (rhIGF-1 R), ihmisen rekombinantti-IGF-1, rekombinantti ihmisen IGF-2 ja hiiren anti-ihmis-IGF-1 R-mAb (MAB391) saatiin R Santa Cruz Biotechnology for 2C8, 1H7, 3B7, ja C-20; Milliporesta varten 24-57 ja 24-31; ja Invitrogen varten 17-69, 24-60, ja 1-2. Fosfo-spesifisten vasta-aineiden ja muiden ensisijaisten vasta-aineet hankittiin Cell Signaling tai Santa Cruz Biotechnology. (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja yksi ratkaisu Soluproliferaatiomääritys (MTS) hankittiin Promega. FITC- tai TRITC konjugoitua sekundaarista vasta-aineet olivat peräisin Jackson Immuno- Laboratories. PhosphoSafe uuttoreagenssi ja RIPA puskuria käytetään solun hajoamista saatiin EMD Biosciences ja Cell Signaling, vastaavasti. Soluviljelyalustoissa lisäravinteet, ja naudan transferriiniä (holo lomake) ostettiin Invitrogen. Rapamysiini (Sigma-Aldrich) liuotettiin DMSO: hon, jaettiin osiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Protein Assay Dye Reagent Concentrate oli Bio-Rad. Kaikki muut kemikaalit hankittiin Sigmalta.

Cell Culture

pahanlaatuinen solulinjoja ylläpidettiin rutiinisti 37

o C: ssa 5% CO

2 RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 % lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 1% Glutamax I, 1% HEPES, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1% natriumpyruvaattia (kutsutaan 10% RPMI). For Capan-1, 20% FBS: ää käytettiin (20% RPMI). Elatusaine vaihdettiin vähintään kerran viikossa ja ainoastaan ​​solut, joissa on alle 50 kohtia käytettiin kokeisiin.

Generation R1

Kolme BALB /c-hiiret kussakin immunisoitiin i.p. 15 ug rhIGF-1R (Met1Asn932), joka käsittää molempia käsitellään ja käsittelemättömän solunulkoisen domeenin ihmisen IGF-1 R, täydellisessä Freundin adjuvantissa. Muihin immunisointia epätäydellisessä Freundin adjuvantissa tehtiin 14, 21, ja 28 päivää ensimmäisen immunisoinnin jälkeen. Hybridoomat muodostettiin fuusioimalla pernasolut immunisoiduista hiiristä P3 x 63Ag8.653 myeloomasoluja. Yksi hybridoomaklooni (C-11), joiden supernatantti osoitti sitoutumisen aktiivisuutta IGF-1 R, mutta ei IR, eristettiin ja laajennettiin kulttuureissa saada hiiren vasta-aine, nimetty R1 tai MR1.

Generation CR1

kimerisointi R1 saada CR1 suoritettiin seuraavasti. V

H ja V

K-geenit R1 kloonattiin 5′-RACE. DNA-sekvenssit on kloonattu V

H ja V

K-geenit määritettiin aitous varmistettiin N-pään proteiinisekvensoinnilla, jotka osoittivat tarkka vastaavuus ensimmäisen 15 N-terminaalista aminohappoa vastaavien aminohappojen päätellä DNA-sekvenssit (taulukko S2). Kloonatun V

H ja V

K geenit insertoitiin

pdHL2

vektori tuottaa

cR1pdHL2

, jota käytettiin transfektoimaan SPE-26-soluja, variantti ofSp2 /0-Ag14 itse kehittänyt. Transfektantit valittiin 0,075 uM metotreksaattia (MTX), ja seulottiin ELISA ihmisen Fc sitovaa toimintaa. Korkeampi tuottavat kloonit laajennettiin edelleen saada kaksi parasta kloonia (709.2D2 ja 710.2G2), josta CR1 on tuotettu panosviljelmissä ja puhdistettiin proteiini-A-kromatografialla.

Generation of HR1

Humanisointi [48] on CR1 ja HR1 saatiin aikaan oksastamalla CDR: t päälle ihmisen kehysalueet HMN-14. Tiettyjen puitteissa tehtävissä, hiiren jäännökset R1 jäivät, jolloin aminohapposekvenssien HR1 V

H (kuvio S1A) ja HR1 V

K (kuva S1B). Synteettisiä geenejä, jotka koodaavat HR1 V

H ja HR1 Vk oli muokattu

pdHL2

saamiseksi

hR1pdHL2

, ekspressiovektorin HR1. Myöhemmät pyrkimyksiä varmistaa tuotannon klooni (711.3C11) varten HR1 olivat samankaltaisia ​​kuin edellä kuvattiin CR1, paitsi että positiiviset kloonit valittiin sitoutumisaktiivisuuksien sekä ihmisen Fab ja rhIGF-1R.

Generation Hex -hR1 by DNL

C

H1-DDD2-Fab-HR1 ja C

H3-AD2-IgG-HR1 tuotettiin fuusioproteiinien SpESF soluissa [49] transfektoitu vastaaviin vektoreihin kuvataan C

H1-DDD2-Fab-HA20 ja C

H3-AD2-IgG-HA20 [50]. Hex-HR1 saatiin seuraavasti. C

H1-DDD2-Fab-HR1 sekoitettiin C

H3-AD2-IgG-HR1 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,4, 1 mM EDTA, moolisuhteessa 4,2 saamaan aikaan konjugaatio useimmat, elleivät kaikki, C

H3-AD2-IgG-HR1 C

H1-DDD2-Fab-HR1, mikä vähentää mahdollisia co-puhdistus C

H3-AD2-IgG- HR1 lopullisen tuotetta, proteiini-A-kolonnikromatografialla. DNL Reaktio aloitettiin lisäämällä pelkistettyä glutationia (GSH), 1 mM, minkä jälkeen lisättiin hapettunut glutationi (GSSH) ja 2 mM seuraavana päivänä, ja sen jälkeen inkuboitiin edelleen yön yli, Hex-HR1 puhdistettiin saadusta liuoksesta proteiini A-kromatografiaa.

Purity, koko, ja Mass Analyysit

Size-syrjäytyminen korkean suorituskyvyn nestekromatografia (SE-HPLC) suoritettiin Beckman System Gold Malli 116 BioSep-SEC-S3000 sarakkeessa (300 x 7,80 mm) ja Phenomenex käyttäen 0,04 M PBS: ää (pH 6,8) plus 1 mM EDTA: ta liikkuvana faasina määrittää molekyyli- eheys ja tuotteen puhtauden mAb: iden ja HexAbs. Keskimääräinen hydrodynaaminen halkaisijat HR1 ja Hex-HR1 määritettiin dynaamisella valonsironta (DLS) ja sopimuksen Microtrac. Sähkösumutusionisaatio lentoajan (ESI-TOF) nestekromatografia /massaspektrometria (LC-MS) suoritettiin 1200-sarjan HPLC yhdistettynä 6210 TOF MS (Agilent Technologies). Lyhyesti, HR1 tai Hex-HR1 pelkistettiin 50 mM tris (2-karboksietyyli) fosfiinia 30 minuuttia ja erotettiin käänteisfaasi-HPLC (RP-HPLC), käyttäen 20 minuutin gradientilla 30-80% asetonitriiliä 0,1%: ista muurahaishappoa kanssa Jupiter C4 5μ sarake (Phenomenex). Sillä TOF MS, kapillaarisen ja fragmenttori jännitteet asetettiin 5500 ja 250 V, tässä järjestyksessä.

Competition sitoutumisen tutkimukset

Tasainen polystyreenimikropallolle helmiä päällystetty rhIGF-1R toimia malleina solujen ilmentävät IGF-1 R käytettiin kaikissa kilpailevan sitoutumisen tutkimuksia. Verrata sitoutumisaffiniteetti, vaihtelevia pitoisuuksia leimaamatonta MR1, CR1, ja HR1 sekoitettiin vakiomäärän Alexa Fluor 532-leimattua CR1 (532-CR1). Päällystetyt helmet lisättiin lopulliseen tiheyteen 2 x 10

5 partikkelia /ml, ja seoksia inkuboitiin huoneenlämmössä (RT) 1 h ajan kevyellä heilutuksella. Sitoutunut 532-CR1 määritettiin mittaamalla mediaani fluoresenssin intensiteetti (MFI) 2,000 helmet Guava PCA System (Millipore).

Voit selvittää CR1 voi estää IGF-1 tai IGF-2 IGF-1 R, erilaisina pitoisuuksina (0-670 nM) CR1, IGF-1, tai IGF-2: ta sekoitettiin vakiomäärän

125I-IGF-1 tai

125I-IGF-2. Päällystetyt helmet lisättiin sitten, inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan kevyellä heilutuksella, pestiin ja radioaktiivisuus laskettiin.

koetin sitovan alueen HR1 IGF-1 R, paneeli kaupallisesti saatavilla olevia anti-IGF -1R mAb: t, ja niiden epitooppeja IGF-1 R kartoitettu (paitsi MAB391), arvioitiin kilpailijoiden estämiseksi HR1 sitoutumisen rhIGF-1 R-päällystettyjä helmiä. Näissä kokeissa, R1, CR1, HR1, MAB391, 24-60, ja αIR-3 oli kunkin merkityn R-fykoerytriini (PE), ja niitä inkuboitiin leimaamatonta vasta-aineella on vaihtelevia pitoisuuksia.

Sitoutuminen Cell Surface IGF-1 R

Kukin näyte valmistettiin kahtena sisältää 2 x 10

5-soluja ja 10 ug /ml testi-vasta-aineen lopullisessa tilavuudessa 200 ui. Kun oli inkuboitu 4 ° C: ssa 45 minuutin ajan, näytteet pestiin kahdesti PBS-1% BSA: ta, minkä jälkeen lisättiin FITC-GAH IgG, (H + L), ja seosta inkuboitiin vielä 4 ° C: ssa 45 min tumma. Sitten näytteet pestiin kahdesti PBS-1% BSA: ta, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS-puskuroituun formaliiniin, ja analysoitiin FACScan.

proliferaatiomääritystä

Kaikki inkuboinnit soluja suoritettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Solut irrotettiin trypsiinillä, pestiin kolme kertaa PBS: llä poistaa jälkiä seerumia, ja suspendoitiin uudelleen seerumia, joka sisälsi 10 ug /ml naudan transferriiniä (SFM-Trf). Solut ympättiin 1,0 x 10

3 solua /50 ul /kuoppa ja inkuboitiin yön yli. Seuraavana päivänä kunkin testin artikkeli SFM-Trf oli 5-kertaisesti laimennettiin sarjoittain 400 nM 0,001 nM ja 50 ui kutakin pitoisuutta lisättiin kolmena rinnakkaisena kuoppiin siten, että lopulliset pitoisuudet testiainetta vaihtelivat 200 nM 0,0005 nM. Käsittelemättömät säätökennoja sai ainoastaan ​​50 ui SFM-Trf. Kun oli inkuboitu 1 h, kuoppiin lisättiin 100 ui kunkin testin artikkelin samana pitoisuutena SFM-Trf, joka sisälsi 50 ng /ml IGF-1. Levyjä inkuboitiin sitten ajan kuten on osoitettu, ja elävien solujen lukumäärä jokaisessa kuopassa määritettiin käyttämällä MTS-määritystä kohti valmistajan protokollaa.

Colony muodostumisen määritys kasvatettujen solujen yksikerrosviljelmässä

DU 145 solut irrotetaan trypsiinillä ja maljattiin 60-mm astiat (1 x 10

3-solut) 10% RPMI lisätty 1% penisilliini /streptomysiiniä (P /S). Testattavat tuotteet lisättiin ja alustaa, joka sisälsi koeartikkeleilla korvattiin joka neljäs päivä, 14 päivän kuluttua solut kiinnitettiin 4% para-formaldehydiä ja värjättiin 5% Giemsa ratkaisu. Pesäkkeitä yli 50 solut laskettiin mikroskoopin alla. Erillisessä kokeessa, testi artikkeleita ei lisätty myöhemmin väliaine.

Colony muodostumisen määritys kasvatettujen solujen Soft Agar

Basal agar (0,5%) valmistettiin sekoittamalla 1% agaria ( 40 ° C: ssa), jossa on yhtä suuri tilavuus 2 x 10% RPMI ja lisättiin kuhunkin kuoppaan (0,5 ml) 24-kuoppaiselle levylle. Solut 2 x 10% RPMI sekoitettiin yhtä suuri tilavuus 0,7% agaroosia ja lisättiin (0,5 ml) päälle pohjan agar lopullisen solumäärän 1250 kuoppaa kohti 0,35% agaroosia. Solut syötettiin 0,5 ml: lla 10% RPMI kuhunkin kuoppaan lisättiin viikottain. Käsitelty sisälsivät testi artikkelit agaroosi /solu kerroksen alussa ja myöhemmissä ruokkimista. Kun pesäkkeet olivat selvästi nähtävissä mikroskopian käsittelemätön kontrolli kuoppiin, väliaine poistettiin ja pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla ja keskimääräinen määritettiin viiden eri näkökentät sisällä hyvin.

immunoblot-analyysi

Ellei toisin mainita, soluja nälkiinnytettiin seerumittomassa elatusaineessa 24 h, käsitelty, ja hajotettiin jääkylmää lämpötila puskuriin määritelty. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Bio-Rad Protein Assay ja näytteet (15-30 ug ladataan kuhunkin kaistaan), eroteltiin 4-20% Tris-glysiini geeleillä, siirrettiin PDVF tai nitroselluloosakiekolle kalvoja, blokattiin TBST-puskurissa (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20: tä), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa, pestiin TBST-puskurissa, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Sitten membraanit pestiin TBST neljä kertaa (kerran 15 minuuttia ja kolme 5 min kukin), inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin TBST-puskurissa neljä kertaa edellä kuvatulla tavalla, havaitaan sitten Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific) ohjeiden mukaisesti valmistajan antamia. Immunoblottaustietojen signaaleja visualisoitiin kemiluminesenssimittaus järjestelmä (Thermo Scientific). Digitaaliset kuvat käsittelivät Carestream (Carestream Molecular Imaging).

alassäätely IGF-IR

Solut 10% RPMI ympättiin 1 x 10

6 100 mm lautasen ja viljeltiin yön yli kiinnitystä varten. Seuraavana päivänä alusta korvattiin tuoreella 10% RPMI, joka sisälsi testattavaa artikkeli edun ilmoitettuina pitoisuuksina, ja soluja inkuboitiin edelleen 24 tunnin ajan tai ennalta määrätyn ajan. Analyysiä varten Western blot, käsitellyt solut pestiin kylmällä PBS: llä, kaavittiin astiat, talteen ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 2000 rpm: llä 5 min. Solupelletit hajotettiin 10 minuutin ajan jäällä RIPA-puskurissa tai puskurissa, joka koostui 25 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton ja 1 x Complete, EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori Cocktail (Roche Diagnostics ). Lysaatit selkeytettiin sentrifugoimalla, analysoitiin proteiinipitoisuus, ja analysoitiin immunoblottauksella. Analyysiä varten virtaussytometrillä, käsitellyt solut pestiin kahdesti PBS: llä, inkuboitiin PE-leimattua 1H7 1 h, pestiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, ja analysoitiin FACScan.

fosforylaatio IGF -IR ja Akt

Solut (5 x 10

5 per kuoppa) kasvatettiin 10% RPMI 6-kuoppalevyillä yön yli kiinnitys. Seuraavat kaksi pesua seerumia, soluja inkuboitiin 4 tunnin ajan seerumivapaassa väliaineessa ja käsiteltiin Koeartikkelit ilmoitetuilla pitoisuuksilla tietyn ajan. Soluja stimuloitiin sitten IGF-I 10 min, pestiin PBS: llä, hajotettiin 200 ul: RIPA-puskuria 5 minuutin ajan RT: ssä, ja käsiteltiin immunoblot-analyysillä.

Matrigel Invasion Pitoisuus

valmistajan protokollaa BD BioCoat ™ matrigeelin ™ Invasion jaosto (BD Biosciences) seurattiin käyttäen 24-kuoppaisen, joka tarjoaa 12 insertit, joista jokainen sisältää 8 um huokoskoko ohuella kerroksella MATRIGELiä tyvikalvon Matrix. Ennen käyttöä 24-kuoppaisen kokoonpano poistettiin säilytys -20 ° C: ssa ja annettiin lämmetä RT: hen. Sisätilojen inserttien ja pohja kuopat rehydratoitiin lämpimällä (37 ° C) bikarbonaatti-pohjainen viljelyalustaan ​​2 h, ja poistetaan varovasti. Solut (0,5 ml 5 x 10

4 /ml) seerumia sijoitettiin insertin (ylempi kamari) ja hyvin (alempi kammio) täytettiin 0,5 ml: lla 10% RPMI. 2 h kuluttua, koe artikkeleita lisättiin soluihin ylempään kammioon ja inkubointia jatkettiin 20 tuntia, jona aikana solut, jotka jäivät Matrigel tai kiinnitetty yläosaan kalvon poistettiin puuvillaa vihjeitä. Solut alemman membraanin kiinnitettiin metanolissa, värjättiin joko Wright-Giemsa tahra tai Hoechst 33258, ja tutkittiin fluoresoivalla mikroskoopilla.

immunofluoresenssimikroskoopilla

soluja kasvatettiin peitelaseja pestiin, kiinnitettiin 4% formaliinilla, pestiin, inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin PBS: llä, ja saatettiin reagoimaan FITC- tai TRITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-RT: ssä 40 min. Pesun jälkeen näytteet värjättiin Hoechst 33258, on asennettu, ja tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla.

In vivo teho

nainen 8 viikon ikäisiä SCID-hiirten (Taconic Farms) käytettiin. Jokainen hiiri injektoitiin s.c. 5 x 10

6 RH-30-soluissa. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 0,2 cm

3 kooltaan, eläimet jaettiin kuuteen ryhmään Kaikki 10 hiirtä ja ruiskutettiin i.p. kahdesti viikossa neljän viikon ajan HR1 (1 mg), Hex-HR1 (0,82 mg), rapamysiini (5 mg /kg), HR1 (1 mg) ja rapamysiini (5 mg /kg), Hex-HR1 (0,82 mg) plus rapamysiini (5 mg /kg), ja suolaliuoksella (sisältää 2% DMSO: ta), vastaavasti. Kantaliuos rapamysiinin valmistettiin suolaliuokseen (joka sisältää 2% DMSO) 1 mg /ml ja 100 ui, annettiin kullekin hiirelle injektiota kohti. Kasvaimet mitattiin ja hiirille punnittiin kahdesti viikossa. Eläimet lopetettiin kun kasvaimet saavuttivat 2 cm

3. Toinen tutkimus vertailla tehoa HR1 ja Hex-HR1 annettiin mooliekvivalentilla annoksina (0,33 mg vs. 0,82 mg) myös tehtiin. Protokollat ​​eläinkokeet hyväksyttiin CMMI Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

Tilastollinen analyysi

in vitro -tutkimuksissa, tilastollinen ero kahden populaation määritettiin Studentin

t

-testi. Tilastollinen analyysi kasvaimen kasvua datan perustui ala (AUC) ja mediaani eloonjäämisaika käyttämällä kaksisuuntaista

t

-testi arvioida merkitystä kaikkien eri hoitoryhmissä ja valvontaa, paitsi suolaliuosta ohjaus, jonka yksisuuntaista

t

-testissä käytettiin. Survival käyrät analysoitiin Kaplan-Meier koealojen (log-rank analyysi), käyttäen Prism GraphPad ohjelmistopaketti (v4.03; Advanced Graphics Software, Inc.). Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Merkittäviä Ominaisuudet R1, CR1 ja HR1

vanhempien R1 näytettiin osittain inhiboida

125I-leimattua IGF-1 (

125I-IGF-1), ihmisen rintasyövän MCF-7L (a alalinja MCF7) verrattavissa MAB391 (taulukko S3). Kimerisointi R1 näytti parantaa affiniteettia R1 ja rhIGF-1R immobilisoida polystyreenihelmiä, kuten on esitetty kompetitiomäärityksessä, jossa sitoutuminen R1, jotka on merkitty fluoresoiva koetin (Alexa 532) mitattiin virtaussytometrialla, kun läsnä on vaihtelevia pitoisuudet CR1 tai R1 (kuva S2). Tuottamien vasta-aineiden kaksi kloonia CR1 oli sama affiniteetti 0,1 nM (kuvio S3) ja olivat spesifisiä immobilisoitu rhIGF-1R, mutta ei immobilisoidun rhIR (kuva S4). Kuitenkin CR1 ei estää IGF-1 tai IGF-2 immobilisoituun rhIGF-1 R palko määrityksessä (kuvio S5), toisin kuin aiemmin havainto, että sen hiiren vastine voi osittain inhiboida

125I- IGF-1 MCF-7L-soluja. Onnistunut humanization osoitettiin vastaava teho HR1 ja CR1 kilpailla 532-CR1 sitoutumisesta rhIGF-1 R-immobilisoituja helmiä (kuva S6). Toisaalta, helmi määritys osoitti myös HR1 oli tehoton inhiboimaan

125I-IGF-1 immobilisoituun rhIGF-1R (kuvio S7). Perustuen tuloksiin rajat blokeerauskokeet (taulukot 1 ja 2), epitooppi HR1 pääteltiin oleskella välillä aminohappotähteiden 185 ja 222 puolivälissä ensimmäisen puoliskon runsaasti kysteiiniä sisältävän domeenin. Kiinnostavaa, vaikka MAB391 ei ollut vaikutusta sitoutumiseen PE-leimattua R1 immobilisoituun rhIGF-1R (kuvio S8A), R1 vähensi olennaisesti sitoutumisen PE-leimattua MAB391 (kuvio S8B), viittaa siihen, että R1 voi inhiboivat MAB391 ja immobilisoitu rhIGF-1R allosterically.

Molecular karakterisointi HR1 ja Hex-HR1

SE-HPLC ja DLS profiilit HR1 ja Hex-HR1, kuvassa. 1A ja 1B, osoittavat niiden korkea homogeenisuus. Sillä HR1, yksittäinen piikki 8,51 min havaittiin. Hex-HR1, joka käsittää parin stabiloitua dimeerejä HR1 Fab liitetty koko HR1 IgG on karboksyylipäät kaksi raskasta ketjua, näytetään myös vain merkittävä piikki 7,43 min. Hiukkaskoot HR1 ja Hex-HR1 olivat suureksi osaksi monodispergoituneiden, jossa keskimääräinen hydrodynaaminen halkaisija on 10,34 nm ja 15,83 nm, vastaavasti.

Kuten on esitetty taulukossa 3, massa kunkin käsittävien polypeptidien HR1 ja Hex-HR1 määritettiin LC /MS oli yhdenmukainen massa lasketaan niiden päätelty aminohapposekvenssi sekvenssi ja ennustettu translaation jälkeisiä modifikaatioita, mukaan lukien N-sitoutunut glykosylaatio, ja aminopään pyroglutamaatti raskaan ketjun HR1 ja Hex-HR1, ja Fd-DDD2 ketju Hex-HR1. Sekä HR1 ja Hex-HR1,

kappa

ketju, joka ei ole muuttunut, antoi lähes identtinen massa havaita 20 ppm ennustetun massan. Varten HR1, raskaan ketjun havaittiin useita isoformeja, mukaan lukien karboksipään lysiini vaihtoehtoja ja eri glykomuotojen. Sillä Hex-HR1, Ad2-sulatettu raskaan ketjun oli ehjä, jossa pääasiassa G0F ja G1F glykomuotojen. The HR1-Fd-DDD2 komponentti Hex-HR1 vastasivat myös, että ennustetun massan sisällä 0,1 ppm, ilman ylimääräisiä translaation jälkeiset modifikaatiot lisäksi aminoterminaalisen pyroglutamaattia.

Expression of IGF- 1 R Diverse Cancer Cell Lines

Positive sitoutumisen HR1 ja Hex-HR1 osoitettiin MCF7 (rintasyöpä), DU 145 (eturauhassyöpä), ME-180 (kohdunkaulan syöpä) ja RH-30 (rabdomyosarkooma) virtaussytometrialla (taulukko 4). Joka perustuu havaittu mediaani fluoresenssin intensiteetti (MFI), ilmaus IGF-1 R vaihteli näiden neljän solulinjat, jossa suhteellinen runsaus reseptorin RH-30 kasvoi lähes 2-kertaisesti DU 145 tai ME-180, ja noin 3-kertaiseksi MCF7. Kun otetaan huomioon määrä pinta IGF-1 RS solua kohden, kuten on raportoitu RH-30 [51] ja MCF7 [52] on 20600 ja 43000, vastaavasti, olisi olemassa 2,3-kertainen MCF7 verrattuna RH-30 , joka hyväksyy hyvin 3-kertainen kasvu arvioitiin rahalaitoksen tiedot. Kuva. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.