Krooninen sairaus

tiivistelmä

Puudutteilla käytetään usein hienoksi neula toive kilpirauhasen vaurioiden ja Paikallista valvonnan pysyvä tai toistuva kilpirauhassyöpä. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että paikalliset anesteetit on laaja kirjo vaikutuksia, mukaan lukien soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktion hermosolujen ja muita soluja. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että käsittely lidokaiinia ja bupivakaiini alensivat solujen elinkelpoisuuden ja pesäkkeiden muodostuminen sekä 8505C ja K1-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Lidokaiini ja bupivakaiini aiheuttaman apoptoosin ja nekroosin suurina pitoisuuksina, määritettynä virtaussytometrialla. Lidokaiini ja bupivakaiini aiheuttanut häiriöitä mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapautumista sytokromi c: n, mukana kaspaasi 3 ja 7, PARP pilkkominen, ja induktio suurempi suhde Bax /Bcl-2. Perustuen microarray ja koulutusjakson analyysi, apoptoosin on merkittävä transkription muutos yhteisiä lidokaiini ja bupivakaiini hoitoa. Lisäksi lidokaiini ja bupivakaiini heikennettyjä ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi 1/2 (ERK1 /2) aktiivisuus ja indusoitiin aktivointi p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) ja c-jun N-terminaalisen kinaasin. Farmakologinen inhibiittorit MAPK /ERK-kinaasin ja p38 MAPK tukahdutti kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen. Yhdessä tuloksemme ensimmäistä kertaa osoittaa sytotoksisia vaikutuksia puudutteiden kilpirauhasen syövän solujen ja sotkea MAPK reitit on tärkeä mekanismi. Meidän havainnot on mahdollista kliinistä merkitystä, että käytössä puudutteiden voidaan antaa aikaisemmin tuntemattomia hyötyjä potilaiden hoitoon kilpirauhassyöpä.

Citation: Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Hu MC, Cheng SP (2014) paikallispuudutteet apoptoosin in Human Kilpirauhasen Syöpäsolut läpi mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi Pathway. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10,1371 /journal.pone.0089563

Editor: Yong Jiang, Southern Medical University, Kiina

vastaanotettu: 25 syyskuu 2013; Hyväksytty: 22 tammikuu 2014; Julkaistu: 21 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Science neuvoston Taiwan (NSC 100-2314-B-195-001-MY3), ja Mackay Memorial Hospital (MMH-10206 ja MMH-E-101-10). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhassyöpä on yleisin kaikista hormonaalisten syöpien, ja kilpirauhasen syöpä kasvaa maailmanlaajuisesti [1], [2]. Valtaosa kilpirauhassyövän ovat hyvin eriytettävä papillaarinen ja follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma on yleisin tyyppejä. Vaikka hyvin kilpirauhassyöpäpotilailla on yleisesti ottaen myönteisen ennusteen, yleistä uusiutuminen voi olla jopa 35% [3]. Jatkuva tai uusiutuva sairaus esiintyy laajalti niskaan. Lisäksi kehitys toistumisen liittyy lisääntynyttä kuolleisuutta. Kolmekymmentä vuotta syövän kuolleisuus on raportoitu olevan noin 12% potilailla, joilla on paikallisen uusiutumisen ja 43% niillä, joilla etäpesäkkeenä [3].

hoitovaihtoehtoja jatkuva tai uusiutuva sairaus sisältää ylimääräisiä kirurgian ja radioaktiivista jodia terapiassa. Compartmental kauladissektio varten Paikallista toistumisen suositellaan American Kilpirauhasen Association ohjeet [4]. Toinen vaihtoehto hoito lupaavia tuloksia on ultraääni-ohjattu perkutaaninen etanolia injektio ja radiotaajuisen ablaatio [5] – [7]. Menettelyn aikana, lidokaiinia tunkeutumista pistokohta ja pehmytkudoksen ympärillä toistuva kasvain on yksinkertainen ja tehokas menetelmä kivun [8]. Haittavaikutuksia ei raportoitu lukuun ottamatta, että ultraääni kuvanlaatu voi vaarantua suurella määrällä lidokaiinia [7].

Lisäksi vakiintunut toiminta kivunlievityksen ja antiarrhythmia, tutkimukset ovat osoittaneet, että paikallispuudutteet on laaja kirjo vaikutukset, kuten tulehdusta ja mikrobilääkkeiden ominaisuudet [9]. Viimeaikaiset havainnot niiden chondrotoxicity edellyttävät varovaisuutta kliinisen käytön nivelensisäisten injektiot [10]. Lisäksi on yhä enemmän näyttöä siitä puudutteet voisi käyttää hyödyksi toimia syövän hoidossa estämällä solujen lisääntymisen, invaasio, ja muuttoliike [11] – [13]. Nämä vaikutukset näyttävät liity niiden modulaatio natriumkanavien [14]. Tässä suhteessa olemme osoittaneet, että apoptoosin tärkeä rooli paikallisen anestesia-indusoitua solun myrkyllisyyttä rintasyövän solujen [15]. Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen, että hermosolujen indusoiman apoptoosin puudutteita välittyy, ainakin osittain,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitti [16], [17]. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän siitä, samanlaisia ​​mekanismeja sovelletaan puudutteen aiheuttaman sytotoksisuuden syöpäsoluissa.

Koska paikalliset nukutusaineet käytetään usein hienoksi neula toive kilpirauhasen vaurioiden ja Paikallista valvonnan pysyvä tai toistuva kilpirauhassyöpä, olisi mielenkiintoista selvittää, onko puudutteiden on antiproliferatiivinen vaikutus kilpirauhasen syöpäsoluja. Me raportoitu tässä, että yleisesti käytetyt paikallispuudutteet, lidokaiini ja bupivakaiini, estivät solujen kasvua ja indusoi apoptoosin ihmisen kilpirauhasen syöpäsoluja kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina. Lisäksi yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, ja meidän microarray ja koulutusjakson analyysi, havaitsimme, että MAPK signalointireittejä olivat mukana.

Tulokset

esto solujen kasvua ja pesäkemuodostuksen puudutteita

Solun elinkelpoisuus 8505C ja K1 kilpirauhasen syöpäsolujen määritettiin inkuboimalla lidokaiinia ja bupivakaiini on laimennussarjalle 24 ja 48 tuntia. Lidokaiini ja bupivakaiini inhiboivat sekä kilpirauhassyöpä solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A). 24 tunnin, mediaani tehokkaan annoksen (ED50) lidokaiinin oli 7,3 mM 8505C soluja ja 6,8 mM K1-soluissa, vastaavasti. Nämä olivat alhaisemmat kuin yleisesti käytetty pitoisuus on 1% (w /v) lidokaiini (42,67 mM). Samoin ED50 24 tuntia bupivakaiinipitoisuutena oli 3,1 mM 8505C soluja ja 1,3 mM K1-soluissa. Molemmat olivat paljon pienempi kuin kliininen konsentraatio on 0,5% (w /v) bupivakaiinin (17,34 mM).

(A) 8505C ja K1-soluja käsiteltiin laimennussarjoja lidokaiini ja bupivakaiinin, yksittäin tai yhdistelminä, 24 ja 48 tuntia. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. (B) konservatiivisen isobologrammia osoittaa, että lidokaiinin ja bupivakaiini toimii antagonistisesti estämään solujen kasvua kilpirauhasen syöpäsoluja. ED osoittaa tehokas annos. ED50 (punainen X), ED75 (vihreä ristit) ja ED90 (sininen ympyrä) piirretään. (C) Käsittely lidokaiini ja bupivakaiini johti vähentäminen pesäkkeen muodostumisen 8505C ja K1 solulinjoissa. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. *, P 0,01

verrattuna

ohjaus.

tutkia sytotoksinen vaikutus rajoittuu amidityyppisille paikallispuudutteiden, kilpirauhasen syöpäsolut käsiteltiin myös esterin tyyppinen paikallinen anestesia, prokaiini. ED50 oli 39,6 mM ja 30,9 mM, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että vaikutus korreloi teho, mutta ei luokan, puudutteiden. Lisäksi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että muutokset pH: n tai osmolaliteetti selittäisi sytotoksisille vaikutuksille, pH ja osmolaalisuus elatusaineet kokeissa määritettiin. Ei ollut merkittäviä vaihteluita pH tai osmolaliteetti (Fig. S1), mikä osoittaa, että vaikutukset olivat farmakologisen luonteeltaan.

Drug synergia määritettiin yhdistelmän indeksi (CI) ja isobologram- analysoi mukaan mediaanivaikutusyhtälöstä menetelmiä (Fig. 1 B). CI oli 1,17 ± 0,03 8505C soluja ja 1,14 ± 0,06 K1-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä lidokaiini ja bupivakaiinin tuotti lievää antagonismia.

Lisäksi vaikutukset puudutteiden kasvainsolujen kasvuun määritettiin klonogeeniset määrityksessä. Tulokset on esitetty kuviossa. 1C. Merkittävä annoksesta riippuvaa vähenemistä pesäkkeiden havaittiin 8505C ja K1-soluissa. Kilpirauhasen syöpäsolut eivät muodostaneet pesäkkeitä hoidon jälkeen lidokaiinin 4 mM tai bupivakaiinin 0,8 mM.

Apoptoosin paikallisten anesteettien

määrittämiseksi perusteella alennettu solujen elinkykyä, solu sykli analyysi. Ei ollut solusyklin pysähtymisen kilpirauhassyövän hoitoon soluissa, joita käsiteltiin lidokaiinia ja bupivakaiini 6, 24, ja 48 tuntia (dataa ei esitetty). Olemme kuitenkin havaittu annoksesta riippuva nousu sub-G1 (hypodiploid) osa-hoidon jälkeen lidokaiinia ja bupivakaiini (Fig. 2A). Käytimme myös anneksiini V /propidiumjodidi (PI) dual värjäytymisen lisävahvistusta puudutteiden aiheuttaman apoptoosin kilpirauhasen syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, hoito lidokaiinia ja bupivakaiini johti apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla. Nekroosia havaittiin myös suuria pitoisuuksia lidokaiinia ja bupivakaiinin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvua vaimentava paikallisten anesteettien kilpirauhassyöpä soluissa liittyy apoptoosin induktion.

(A) 8505C ja K1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla lidokaiini ja bupivakaiinin 24 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin, kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin DNA-sisällön eri vaiheissa solusyklin virtaussytometrialla. (B) kilpirauhassyöpä soluja käsiteltiin lidokaiinia ja bupivakaiini 48 tuntia, ja solut sen jälkeen värjättiin fluoreskeiini-konjugoidun anneksiini V: n ja PI: n ja analysoitiin virtaussytometrialla. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. *, P 0,05

verrattuna

ohjaus.

arviointi mitokondriohäiriöitä

pieneneminen mitokondrion kalvon potentiaali on yksi varhaisimmista tapahtumista apoptoosin. Mitokondrioiden kalvon eheys arvioitiin käyttämällä kationinen väriaine JC-1, joka on erittäin spesifinen koetin muutosten havaitsemiseksi mitokondrioiden ΔΨ

m. JC-1 muotojen punainen aggregaatit ehjä mitokondrioita, kun taas vihreä fluoresenssi johtuu muodostumista JC-1 monomeerit alhaisilla mitokondrion kalvon potentiaalia. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, lidokaiini ja bupivakaiini huomattavasti muodostumista JC-1 monomeerien 8505C ja K1-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Solujen prosenttiosuus, joilla on alhainen ΔΨ

m oli hieman pienempi kuin prosenttiosuus apoptoottisten solujen käsiteltiin paikallispuudutteet samoina pitoisuuksina.

(A) 8505C ja K1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla lidokaiinin ja bupivakaiini 16 tuntia. ΔΨ

m muutoksen seurattiin lastausta JC-1 ja analysoitiin virtaussytometrialla. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. *, P 0,05

verrattuna

ohjaus. (B) kilpirauhassyöpä soluja käsiteltiin lidokaiinia (6 mM) ja bupivakaiinin (2 mM) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Sytokromi c vapautumista mitokondrioita sytosoliin määritettiin Western blotting. Kalvoista poistettiin ja uudelleenseulottiin vastaista vasta-ainetta aktiinin samasta lastaus.

vieressä pyrittiin määrittämään, onko sytokromi c vapautettiin mitokondrioita sytosoliin. Kuten odotettua, korkeamman tason sytokromi c: mitattiin sytosoliin molemmissa solulinjoissa hoidon jälkeen lidokaiinia ja bupivakaiini (Fig. 3B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että hoito kilpirauhasen syövän solujen paikallispuudutteet johtaa aktivaatioon mitokondrion apoptoottisen reitin.

aktivointi kaspaasien paikallisten anesteettien

Release sytokromi c on osoitettu aktivoivan loppupään caspases joita lopulta tarvitaan apoptoosin. Siksi tutkittiin, kaspaasin aktivaatio oli mukana apoptoosin paikallisten anestesia. Hoidon lidokaiinia ja bupivakaiinin johti kaspaasi 3 ja kaspaasi 7, ja lohkaisu PARP 8505C ja K1-soluissa annoksesta riippuen (Fig. 4A). Lisäksi kaspaasi kolorimetristä substraattimäärityksen osoitti kaspaasi 3 vilkastuivat ajasta riippuva tavalla 8505C soluissa hoidon jälkeen lidokaiinia ja bupivakaiini (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että kaspaasi aktivaatio on tärkeä rooli kilpirauhassyöpä solun indusoiman apoptoosin puudutteita.

(A) 8505C ja K1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla lidokaiinin (L6, 6 mM, L12, 12 mM) ja bupivakaiinin (B2, 2 mM; B4, 4 mM) 16 tunnin ajan. Solut kerättiin ja näytteet valmistettiin ja Western blot -analyysi. C, ohjaus. PARP, poly (ADP-riboosi) polymeraasin. (B) kaspaasi 3 solulysaatteja 8505C soluja käsiteltiin lidokaiinia (12 mM) ja bupivakaiinin (4 mM) ja eri aikoina määritettiin käyttäen kolorimetristä proteaasimäärityksessä. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon.

proteiinit Bcl-2-perheen osallistua apoptoottisen prosessin toimimalla promoottorit (

esim

, Bax) tai estäjien (

esim

, Bcl-2). Aktivoi mitokondrioiden apoptoottisen reitin, aktivoituu Bax muodostaa oligomeerisen huokosten ja tuloksia läpäiseväksi mitokondriaalisen ulkokalvon. Huomasimme, että hoito lidokaiinia ja bupivakaiini johtaa vähenemiseen Bcl-2 tasossa samanaikaisen kasvun Bax tasojen (Fig. 4A). Näin ollen, paikallispuudutteet muuttaa proteiinin tasot keskeisten jäsenten Bcl-2-perheen tavalla, joka suosii kasvua suhteessa Bax /Bcl-2, joka voi edistää herkkyyttä kilpirauhasen syöpäsolujen apoptoosia.

analyysi geenin ilmentymisen allekirjoitusten vaikuttaa puudutteita

tunnistaa geenien ilmentymistä allekirjoitukset, jotka liittyvät biologisiin toimintoihin puudutteiden, mikrosirujen ja polku rikastaminen analyysi suoritettiin vertaamaan ilmaisun muotoja 8505C käsitellyissä soluissa lidokaiini ja bupivakaiini. Kymmenen reitit tunnistetaan polku rikastamiseen analyysi on lueteltu taulukoissa 1 ja 2. On huomattava, että näkyvin transkription muutos kilpirauhasen syöpäsoluja käsitelty puudutteiden on apoptoosin. Muita väyliä yhteisiä lidokaiini ja bupivakaiini hoito sisältää solun tukirangan remontin ja myelooisesta erilaistumista. Lisäksi käytimme

in silico

työkaluja Ingenuity tunnistaa polkuja kuulemma liittyy molekyylitason mekanismi syöpä. Integrointi microarray tiedot käsiteltyjen solujen lidokaiinia ja bupivakaiini, polku analyysi ehdotti, että ekstrasellulaarinen signaali-säännelty kinaasi (ERK) 1/2 ja p38 MAPK ovat merkittävästi ylös- tai alaspäin säädeltyjä hoitovasteen paikallisten anestesia (Fig. S2).

modulaatio mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi signalointi

microarray ja koulutusjakson rikastamiseen analyysi osoittaa, että MAPK reitit ovat luultavasti mukana mekanismien välittävä toiminta puudutteiden on kilpirauhassyöpä solut. Tämän tutkimiseksi mahdollista suhdetta, koko solun proteiinit uutettiin 8505C ja K1-soluissa käsiteltiin lidokaiinia (12 mM) ja bupivakaiinin (4 mM) ja eri aikaväleillä, ja lysaatit immunoblotattiin erityisiä vasta-aineita fosforyloidun ja yhteensä ERK1 /2, p38 ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK), vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 5, vähentynyt fosforylaatio ERK1 /2 havaittiin. Lidokaiini ja bupivakaiini huomattavasti fosforylaatioon p38 ja JNK. Lidokaiini ja bupivakaiini ollut merkittävää vaikutusta koko p38 ja JNK-proteiinin taso.

8505C (A) ja K1 (B) soluja käsiteltiin lidokaiinia (12 mM) ja bupivakaiinin (4 mM) eri aikoja ja toiminta ERK, p38, ja JNK tutkittiin Western blot -analyysillä käyttäen fosfo-spesifisiä vasta-aineita. Proteiinin kokonaismäärän tasoja ERK, p38 ja JNK mitattiin myös.

Effects eston mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien

Myöhemmin haluaisimme tietää, onko modulaatioina ERK1 /2, p38 MAPK, ja JNK signalointireitteihin osuus indusoiman apoptoosin puudutteita. Tätä varten tutkimme vaikutuksia erityisten estäjien kaspaasin aktivaatio ja PARP pilkkominen. PD98059 on estäjä MAPK /ERK-kinaasin (MEK), estäen siten fosforylaation ja MAPK. SB203580 on selektiivinen, reversiibeli, ja ATP-kilpaileva estäjä p38 MAPK, kun taas SP600125 on anthrapyrazolone JNK estäjä, joka kilpailee ATP estää fosforylaatiota c-jun. Kuten kuvioissa. 6A ja 6B, PD98059 ja SB203580, mutta ei SP600125, vähensi kaspaasi 3 ja pilkkominen PARP. Nämä tulokset vahvistettiin kaspaasi 3: n aktiivisuuden määritys (Fig. 6C). Yhteiskäsittely kanssa PD98059 tai SB203580 tukahdutetaan kaspaasi 3 toimintaa, kun taas SP600125 paradoksaalisesti kasvanut kaspaasi 3 aktiivisuus käsittelyn jälkeen paikallispuudutteiden. Nämä tiedot on yhtäpitävä tulosten kanssa reitin rikastus analyysi (Fig. S2), joka ERK1 /2: n ja p38 MAPK signalointireittejä ovat mukana indusoiman apoptoosin puudutteita.

8505C (A) ja K1 (B-solut) oli cotreated 30 uM PD98059 (PD), 30 uM SB203580 (SB), tai 30 uM SP600125 (SP) lisäksi 12 mM lidokaiini (L) tai 4 mM bupivakaiinin (B) 16 tuntia. Solut kerättiin ja näytteet valmistettiin ja Western blot -analyysi. C, ohjaus. C3, kaspaasi 3. PARP, poly (ADP-riboosi) polymeraasin. (C) aktiivisuus kaspaasi 3 solulysaatteja 8505C soluja käsiteltiin lidokaiinia (12 mM) ja bupivakaiinin (4 mM) kanssa tai ilman spesifisiä inhibiittoreita 24 h määritettiin käyttäen kolorimetristä proteaasimäärityksessä. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. *, P 0,01

verrattuna

ohjaus.

Keskustelu

Se on ollut yli vuosisadan koska ensimmäinen synteettinen puudutus otettiin käyttöön 1900-luvun alussa. Paikallispuudutteet sitoutuvat reversiibelisti spesifiseen reseptoriin sivuston sisällä natrium- kanavia ja estää ionin liikkuvuutta. Uskottiin, että vaikutukset ovat palautuvia elpymisen hermojen toimintaa ja ilman vaurioita hermosoluihin. Kuitenkin raportit pysyviä neurologisia vammoja ovat tuottaneet huolen neurotoksisuuden puudutteiden [18]. Kertyvät todisteet osoittavat, että paikalliset anesteetit voivat aiheuttaa nopeasti neuronaalisen kuoleman kautta liipaisu apoptoosin ja nekroosin [19], [20]. Lisäksi useat tutkimukset ovat puudutetoksisuuden muissa solutyypeissä [21] – [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensinnäkin osoittaneet suoraa vaikutusta lidokaiini ja bupivakaiinin estämällä solujen kasvua ja pesäkkeiden muodostumista kilpirauhasen syöpäsoluja.

mekanismit solujen toksisuusriskin puudutteiden ei ole täysin selvitetty. U937 histiosyyttistä lymfoomasoluilla, lidokaiinia indusoi apoptoosin pienempinä pitoisuuksina 12 mM ja aiheuttama nekroosi pitoisuus on yli 15 mm [24]. Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu muiden [19], [20], [25]. Tässä tutkimuksessa sekä apoptoosin ja nekroosin osallistua solukuoleman aiheuttama puudutteita. Kiehtovan, lievää antagonismi havaittiin yhdistelmällä lidokaiinia ja bupivakaiinin. Näyttää todennäköiseltä, että lidokaiinia ja bupivakaiinin indusoivat solukuoleman vastaava mekanismi. Kun solu ei pysty kuolla apoptoosin, se voi käydä läpi nekroottisen solukuolemaa. On hyvin tiedossa, että ATP-tasot ovat määräävä osoitus solukuoleman [26], [27]. Lidokaiini ja bupivakaiini osoitettiin vähentävän ATP-tasot ja elinkelpoisuus melanoomasolujen [28]. Moodin solukuoleman todennäköisesti riippuu altistuksen kestosta ja pitoisuuksien paikallispuudutteiden.

Mitokondrioiden energetics vaikuttavat puudutteita voi selittää lasku ATP-tasot. Paikallispuudutteet voi saavuttaa mitokondrioiden ja tämä vaikutus on hyvin riippuvainen lipidi-liukoisuudesta puudute [29]. Kliininen ja kokeellinen myopatia aiheuttama bupivakaiini on raportoitu johtuvan mitokondrioiden ja vähentää oksidatiivisen energia-aineenvaihdunnan [30], [31]. Erityisesti bupivakaiini tukahdutti soluhengitys estämällä komplekseja I ja III, mukana reaktiivisten happiradikaalien [32]. Irwin

et al.

Ovat osoittaneet, että bupivakaiinin myotoksisuuden tukeutunut aktiivinen oksidatiivisen metabolian vuoksi erittäin glykolyyttisissä extensor digitorum longus olivat resistenttejä bupivakaiini aiheuttamaa toksisuutta [30]. Kuitenkin kasvainsolut tuottavat etupäässä energiaa Glykolyysivaiheen (Warburg vaikutus) [33]. Meidän havainnot ovat yhtäpitäviä muutamia raportteja, joissa osoitetaan, että mitokondrioiden toimintahäiriöitä voitaisiin saada aikaan myös paikallisten anesteettien pahanlaatuisten syöpäsolujen [24], [25], [34].

Mitokondrioita keskeisiä apoptoosin modulaattoreina , nekroosi ja autophagy [27]. Luontainen (mitokondrion) reitin apoptoosin välittyy release pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit, kuten sytokromi c. Meidän kokeissa, paikallispuudutteet lisääntynyt pro-apoptoottisen Bax ilmaisun ja vaimentua Bcl-2: n ilmentymisen, mikä johtaa suurempaan suhde pro-apoptoottisen ja anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiineihin. Tämä lisääntynyt Bax /Bcl-2 suhde helpottaa vapautumista mitokondrion sytokromi c, joka sittemmin indusoi aktivointien kaspaasi Cascade jotka pilkkovat PARP inaktiivisiksi palasia. Kuitenkin, lidokaiini ja bupivakaiini edistää mitokondrioiden vahinkoa siinä määrin pienempi kuin indusoiman apoptoosin sama pitoisuudet puudute. Tämä viittaa siihen, että mitokondrioiden riippumaton prosessi voi myös olla merkitystä. Tätä hypoteesia tukee tulokset reitin rikastus analyysi (kuvio. S2), jossa transkription muutoksia kuoleman reseptorin reaktiotien komponentit olivat mukana.

Cellular mikrosiruja ovat tehokkaita kokeellisia välineitä tunnistamiseksi uusia lääkekohteita ja farmakogenomiikassa . Unami ja työtovereiden ensinnäkin todettu, että apoptoosiin liittyvien geenien transkriptionaalisesti säätelee bupivakaiinin mukaan mikrosiruanalyysi [34]. Äskettäin Lucchinetti

et al.

Osoitti, että useita transkription ohjelmat solujen erilaistumiseen liittyvien, kasvaimen kehittymisen, ja etäpesäkkeiden vaikutti negatiivisesti ropivakaiinin [35]. Kirjoittajat olettavat, että tämä merkitsee uusia sovitusmenetelmät varten leikkaussalin käytöstä puudutteiden syöpäpotilailla. Tuloksemme ovat yhdenmukaiset nämä tulokset ja osoittivat vahvan yhteyden paikallispuudutteet aiheuttama muutoksia geenien ilmentymisessä ja apoptoosin. Lisäksi olemme havainneet, että MAPK-reitin osallistuu molekyylimekanismeihin indusoiman apoptoosin puudutteita.

ensisijainen hermosolun kulttuureissa, bupivakaiinin ja ropivakaiinin todettiin aktivoida p38 MAPK ja JNK muttei ERK1 /2 [16] . Lisäksi farmakologinen esto näiden kinaasien vaimentaa neurotoksisuus

in vitro

. Kirjoittajat totesi, että aksonaalista rappeutumista aiheuttama lidokaiinin estetään p38 MAPK estäjä mutta ei kaspaasi esto [36]. Harato

et al.

Osoitti myös, että p38 MAPK-estäjää vaimennetaan kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja indusoimaa solukuolemaa bupivakaiini [37]. Toisessa tutkimuksessa, p38 MAPK-reitin on liitetty bupivakaiini indusoiman apoptoosin ihmisen neuroblastooma SH-SY5Y-soluja [17]. Sopusoinnussa havaintojen hermosolujen apoptoosin, huomasimme, että p38 MAPK aktivointi on keskeinen rooli paikallispuudutteet aiheuttaman apoptoosin kilpirauhasen syöpäsoluja. Negative sääntely leviämisen on erittäin konservoitunut ja tärkeä tehtävä p38a erilaisissa solutyypeissä [38]. Mielenkiintoista, upregulated p38a aktiivisuus on raportoitu papillaarinen ja follikulaarinen kilpirauhassyöpä [39]. Käsite tukee perusilmennystä fosfo-p38-proteiinien tässä tutkimuksessa (Fig. 5). Kaksoisrooli p38 MAPK kilpirauhassyöpä biologia on edelleen lähes hyödyntämättä alueella huolimatta Ras-Raf-ERK-reitin jotka on laajasti tutkittu kilpirauhassyöpä.

Tässä tutkimuksessa, ERK1 /2 aktiivisuus tukahdutettiin lidokaiini ja bupivakaiini. Joo

et al.

Osoittaneet, että lidokaiinia suppressoi merkitsevästi lisääntynyt ERK1 /2 vasteen rottamallissa neuropaattisen kivun [40]. Hiljattain litiumia osoitettu suojaavan bupivakaiini aiheuttaman neuronaalisen vamman peruuttaen tukahduttaminen ERK1 /2 signalointi [41]. On yhä enemmän näyttöä ylikuulumisen MAPK reittejä. Esimerkiksi p38 ja JNK-reitin aktivaatio apoptoosin voi säädellä negatiivisesti ERK-reitin [42]. On myös syytä huomata, että on olemassa paradoksaalinen väheneminen kaspaasin aktivaatio seuraavissa PD98059 hoitoa. Monet geneettiset muutokset ovat sekaantuneet kilpirauhassyöpä, ja poikkeavan aktivaation Ras-Raf-ERK-reitti on yleisin [43]. Estämällä MAPK-reitin pidätykset kilpirauhasen syöpäsoluja G1 vaiheessa [44]. Siksi uskottava selitys tuloksemme on, että ERK1 /2 esto lisääntynyt alttius kilpirauhassyövän solujen muiden mekanismien kasvunestoalueita kuten solusyklin pysähtymiseen ja kuolion, joihin ei liity kaspaasin aktivaatio.

Johtopäätökset

Yhteenvetona tutkimuksessamme avannut molekyylitason mekanismeja vastuussa sytotoksisuuden aiheuttama puudutteita kilpirauhassyövän hoitoon soluissa, esittelevät osallistuminen MPAK signalointipolkujen ja ehdottaa mahdollisia etuja käytön puudutteiden kliinisessä käytössä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen kilpirauhasen sinoomasolulinjoja 8505C ja K1 ostettiin Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Saksa) ja european Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Iso-Britannia), tässä järjestyksessä. 8505C soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 RPMI 1640-alustassa (Invitrogen /Gibco, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). K1-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (Gibco), sekoitettiin Hamin F12 (Gibco) ja MCDB 105 (Sigma, St. Louis, MO), väliaine 02:01:01 suhteissa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 2 mM L- glutamiini. Sekä 8505C ja K1 on todennettu olevan ainutlaatuinen kilpirauhassyöpä solulinjoissa [45]. Lidokaiini, bupivakaiini, prokaiini, PD98059, SB203580, ja SP600125 saatiin Sigma. Osmolaalisuus elatusaineet kokeissa analysoitiin jäätymispisteen alenemisen menetelmällä käyttäen Advanced 3320 Micro Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA).

solunelinkykyisyysmääritys ja lääkeyhdistelmä analyysi

Cell elinkelpoisuuden määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin kokeelle, kuten aikaisemmin on kuvattu [46]. Lyhyesti, 8505C ja K1-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille yksi päivä ennen lidokaiini ja bupivakaiinin (yksittäin tai yhdistelminä) lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Sillä tiatsolyyli blue tetratsolium (MTT) kolorimetristä määritystä, 100 ui MTT-reagenssia (5 mg /ml; Sigma) lisättiin soluviljelmään, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Formatsaanikiteet muunnettu tetratsoliumsuolojen jonka elävät solut liukoiseksi happamaksi isopropanolilla. Absorbanssi mitattiin Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) aallonpituudella 570 nm. Absorbanssi kontrollisoluja (inkuboitu ilman lääkkeitä) määriteltiin 100%.

Drug synergia määritettiin CI ja isobologrammin analysoi mukaan mediaani vaikutusta on kuvattu julkaisuissa Chou ja Talalay [47]. Pohjalta annos-vaste-käyrät MTT määrityksissä, CI-arvot laskettiin. Synergia, additiivisuus ja antagonismi on määritelty CI 1, CI = 1 ja CI 1, vastaavasti. Vuonna isobologram- kuvaaja, yhdistelmä datapisteiden, jotka kuuluvat, edellä, ja alapuolella vino viiva edustaa lisäainetta, antagonistisia, ja synergistinen vaikutus, vastaavasti.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

pesäkemuodostusta , 400 solua /kuoppa siirrostettiin kuuteen-kuoppaisille levyille, annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina lidokaiinin ja bupivakaiinin päivästä 2. Kun 8-15 päivää, pesäkkeet värjättiin 3% kristalliviolettia ja pesäkkeet sisältäviä 50 solut laskettiin.

Solusyklianalyysiä

vaikutus lidokaiini ja bupivakaiinin solun syklin analysoitiin PI värjäys ja virtaussytometria [48]. Hoidon jälkeen lidokaiinia ja bupivakaiini 6, 24, ja 48 h, kilpirauhasen syöpä solut kerättiin varovasti pesty, ja kiinnitettiin 70%: kylmään etanoliin 4 ° C: ssa yön yli. Kiinteät solut (1 x 10

6) inkuboitiin RNaasi A: lla 30 min ajan huoneenlämpötilassa, ja värjättiin PI liuosta käyttäen BD Cycletest Plus DNA reagenssipakkauksen (BD Biosciences, San Jose, CA) pimeässä. Tämän jälkeen solut analysoitiin FASCalibur virtaussytometrillä (BD Biosciences) on varustettu CellQuest Pro -ohjelmisto. Jakelu solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin solusyklin arvioitiin käyttäen ModFit LT-ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME). Koska arvioitu osuus apoptoottisten solujen prosenttiosuus hypodiploid solujen laskettiin DNA histogrammin.

analyysi apoptoosin

Cell apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti ( FITC) apoptoosin havaitseminen kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) mukaan valmistajan ohjeiden. Kilpirauhassyöpä-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet lidokaiini ja bupivakaiini on 24-72 tuntia. Sekä kelluva ja kiinnitetään solut otettiin talteen ja pestiin, jonka jälkeen inkuboitiin 5 ui anneksiini V-FITC: tä ja 5 ui PI 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Inkubaation jälkeen 400 ui: aan sitoutumispuskuria lisättiin, ja virtaussytometria-analyysi suoritettiin.

määritys mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m) B

Mitokondrioiden kalvojännite määritettiin virtaussytometria käyttäen ΔΨ

m riippuva fluoresoivaa väriainetta JC-1 (CS0390, Sigma). JC-1 on lipofiilinen, kationinen väriaine, joka että voi valikoivasti tehdä mitokondrioita, ja käy läpi palautuvan muutoksen fluoresenssiemissi- mukaan ΔΨ

m. Terveitä soluja, joilla on suuri ΔΨ

m muodostavat JC-1 aggregaatteja ja fluoresoivat punaista, kun taas apoptoottiset solut, joilla on alhainen ΔΨ

m sisältää monomeerisen JC-1 ja fluoresoivat vihreää. Hoidon jälkeen lidokaiinia ja bupivakaiini varten osoitetun ajan, kilpirauhasen syöpä solut kerättiin ja niitä inkuboitiin JC-1 20 min ajan 37 ° C: ssa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten näytteet kohteena virtaussytometrialla.

Western blot-analyysi

Yhteensä solun proteiinit uutettiin, määrällisesti ja sille suoritettiin geelielektroforeesi vakiomenetelmien mukaisesti kuten aiemmin on kuvattu [49].