Krooninen sairaus

tiivistelmä

On hyvin tunnettua, että keuhkokasvaimia indusoida imusuonten. Kuitenkin molekyylimekanismeja valvoa kasvaimen lymfangiogeneesiä keuhkosyövän ei ole täysin hahmoteltu. Tässä tutkimuksessa, tunnistamme paneeli ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat, jotka stimuloida imusuonten ja käyttää genominlaajuisten mRNA ilmaisun luonnehtia molekyylitason mekanismeja säätelevät kasvain imusuonten. Osoitamme, että Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, ja H2122 NSCLC solulinjoja muodostaa kasvaimia, jotka indusoivat imusuonten ottaa Calu-3, H1155, H1975 ja H2073 NSCLC solulinjoja muodostaa kasvaimia, jotka eivät indusoi imusuonten. Analysoimalla genominlaajuisten mRNA ekspressiotietojen, tunnistamme 17-geenin ilmentymisen allekirjoitus, joka erottaa imusuoniston ulkopuolisista imusuoniston NSCLC solulinjoissa. Tärkeää on, VEGF-C on ainoa imusuonten kasvutekijä tämä ilmaus allekirjoitus ja on noin 50-kertaa suurempi imusuoniston ryhmässä kuin ei-imusuoniston ryhmä. Osoitamme, että pakko ilmentymistä VEGF-C: H1975 solut indusoi lymfangiogeneesiä ja että knockdown VEGF-C: H1993 soluissa inhiboi imusuonten. Lisäksi osoitamme, että kolminkertainen angiokinase estäjä, nintedanib (pienimolekyylisiä, joka estää kaikki FGFR: ää, PDGFRs, ja VEGFRs), vaimentaa kasvaimen imusuonten sisään H1993 kasvaimia. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että VEGF-C on hallitseva kuljettaja kasvaimen lymfangiogeneesiä NSCLC ja paljastaa tietty hoito, jotka voivat estää kasvaimen lymfangiogeneesiä NSCLC potilailla.

Citation: Regan E, Sibley RC, Cenik BK, Silva, Girard L, Minna JD, et al. (2016) tunnistaminen Gene Expression Erot imusuoniston ja Non-imusuoniston ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 11 (3): e0150963. doi: 10,1371 /journal.pone.0150963

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 marraskuu 2015; Hyväksytty: 21 helmikuu 2016; Julkaistu: 07 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Regan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Microarray tuloksia että NSCLC solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa olivat aiemmin julkaistu ja arkistoitu Gene Expression Omnibus arkistoon (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; GEO hakunumero: GSE32036).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat käynnistyksen varoja Department of Surgery UT Southwestern Medical Center MTD ja urakehitystä palkinnon NCI SPORE P50CA70907 MTD. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman miehillä ja naisilla Yhdysvalloissa [1]. Keuhkosyöpäpotilaita tyypillisesti kuolevat vaikutuksesta etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin. Keuhkosyöpä solut näkyvät yleensä imusolmukkeisiin ennen kuin ne havaitaan kaukaisilla elimet. Tästä syystä imusolmukkeet arvellaan toimivan ”Kanariansaarten hiilikaivoksessa” ja arvioidaan, jotta voidaan määrittää, onko syöpäsolut ovat levinneet niiden ensisijainen sivustolla [2]. Läsnäolo syöpäsolut imusolmukkeissa liittyy huonoon ennusteeseen, ja se on yksi tärkeimmistä ennustavia potilaan lopputulokseen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja muut syövät [2, 3]. Tämä kliininen havainto polttoaineena intensiivistä tutkimustyötä tunnistamaan prosesseja, jotka hallitsevat lymphogenous syövän leviämisen ja vuonna 2001 todettiin, että imusuonten, joka on versomistilanteen uusien imusuonten välillä ennestään aluksiin, helpottaa etäpesäke imusolmukkeisiin [4- 6]. Tämä maamerkki havainto sytytetään suurta kiinnostusta rajattu molekyylitason mekanismit valvoa kasvaimen imusuonten.

Viimeisten 15 vuoden aikana huomattavaa edistystä on tapahtunut alalla kasvain imusuonten tutkimusta. Kasvutekijät, kuten Adrenomedulliini, angiopoietiini-1, angiopoietiini-2, HGF, Netrin-4, PDGF-BB, VEGF-A, VEGF-C, ja VEGF-D ovat kaikki esitetty edistävän kasvaimen imusuonten [4-12]. Tästä edistyksestä huolimatta tarkka mekanismit kasvain lymfangiogeneesiä jäädä puutteellisesti. Tämä johtuu osittain siitä, monet tutkimukset kasvainten lymfangiogeneesiä käyttää solulinjoja, jotka on geneettisesti muokattu yli-ilmentämään imusuonten kasvutekijä [4-12]. Vaikka arvioinnissa muuntogeenisten solulinjojen on antanut arvokasta tietoa roolista imusuonten palvella kasvaimia, niitä ei valaista täsmällisestä mekanismeja, joiden syöpäsolut indusoida imusuonten. Parempi ymmärrys molekyylitason mekanismeja ohjaamalla kasvain lymfangiogeneesiä tarvitaan, jotta voidaan kehittää hoitoja, jotka voivat estää levittämisen syövän ja parantaa kliininen tulos varhaisvaiheen potilaiden tauti. Siksi ryhdyimme tunnistamaan paneeli solulinjoja stimuloida imusuonten ja käyttää genominlaajuisten mRNA ekspressiotietojen tunnistamaan molekyylitason mekanismit kasvain lymfangiogeneesiä NSCLC.

Tulokset

tunnistetiedot imusuoniston ja ei-imusuoniston NSCLC solulinjoissa

tunnistaa NSCLC solulinjoja, jotka stimuloida imusuonten, me värjätään paneeli 13 NSCLC -tuumoriksenografti näytteitä aikaisemmista eläinkokeissa vasta-aineet Lyve-1 ja podoplanin (kuvio 1). Nämä ovat kaksi tavallista arvioidaan merkkiaineiden imusuonten endoteelisolujen. Vasta-aine sileän lihaksen aktiini (SMA) sisällytettiin podoplanin tahra auttaa erottamaan podoplanin-positiivisten imusuonten (podoplanin +; SMA-) peräisin podoplanin-positiivisten fibroblasteja (podoplanin +; SMA +). Laajuus lymfangiogeneesiä kvantifioitiin laskemalla kasvaimensisäisenä imusuonten per mikroskooppinen kenttä ja kasvaimet luokiteltiin imusuoniston ne sisälsivät yli 5 imusuonten per mikroskooppinen kenttä tai ei-imusuoniston jos ne puuttuivat kokonaan kasvaimensisäisenä imusuonten. Tämän analyysin pystyimme tunnistamaan paneelin imusuoniston (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, ja H2122) ja ei-imusuoniston NSCLC solulinjoja (Calu-3, H1155, H1975 ja H2073) (kuvio 1) .

(A) kuvat ovat keuhkojen ksenograftien värjättiin vasta-aine Lyve-1 (punainen) (B) edustavat kuvat keuhkojen ksenograftien värjättiin vasta-aineiden podoplanin (vihreä) ja sileän lihaksen aktiinin (SMA , punainen). (C) Kaavio kasvaimensisäisenä imusuonien tiheyttä podoplanin ja Lyve-1 positiivisia imusuonten NSCLC ksenograftien kasvanut hiirillä. Olemme luokiteltu Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 ja H2122 solut olevan imusuoniston ja Calu-3, H1155, H1975, ja H2073 olevan ei-imusuoniston. Kaavio osoittaa keskiarvo ± SEM.

VEGF-C säätelee lymfangiogeneesiä tekijänä NSCLC-solujen

Kun tunnistaminen imusuoniston ja ei-imusuoniston NSCLC solulinjoissa, ryhdyimme löytää eroja näiden kahden ryhmän . Huomasimme, että ei ollut selvää eroa kasvuvauhti imusuoniston ja ei-imusuoniston ihonalainen ksenografteja (kuvio 2). Huomasimme myös, että kyky solulinjan aiheuttaa imusuonten ei liittynyt sen alatyypin luokittelu (adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä tai suuri solu), syntypaikalla (Primaarikasvaimen vs. etäpesäke), tai mutaatio tila (taulukot 1 ja 2 ).

(A) Kaavio kasvun imusuoniston (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 ja H2122) kasvaimia. (B) Kaavio kasvu ei-imusuoniston (Calu-3, H1155, H1975 ja H2073) kasvaimia. Kaavio osoittaa keskiarvo ± SEM.

analysoidaan genominlaajuisten mRNA ekspressiotietojen geenien tunnistamiseen ilmennetty eri välillä imusuoniston (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, ja H2122 ) ja ei-imusuoniston (Calu-3, H1155, H1975 ja H2073-solut). Tämä analyysi tuotti 17-geenin ilmentymisen allekirjoitus, joka erottaa imusuoniston ulkopuolisten imusuoniston NSCLC-solut (kuvio 3). Verisuonten endoteelin kasvutekijä C (VEGF-C), ligandin reseptorin tyrosiini- kinaasien VEGFR2: n ja VEGFR3, oli ainoa geeni tämän allekirjoituksen raportoitu stimuloivan lymfangiogeneesiä ja oli noin 50-kertaa suurempi imusuoniston ryhmässä kuin ei-imusuoniston ryhmä . Olemme vahvisti, että VEGF-C ilmentyy korkeammalla tasolla imusuoniston soluja kuin ei-imusuoniston solujen kvantitatiivinen PCR (kuvio 3).

(A) Microarray tulokset osoittavat geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä imusuoniston (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 ja H2122) ja ei-imusuoniston (Calu-3, H1155, H1975 ja H2073-solut). (B) Kvantitatiivinen PCR tulokset osoittavat, että VEGF-C on ilmaistu korkeammalla tasolla imusuoniston kuin muilla imusuoniston NSCLC solulinjoissa. VEGF-C-arvot on normalisoitu taloudenhoito geeni GAPDH. Arvot NSCLC solulinjat normalisoidaan kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja (HBEC3KT).

Voit selvittää VEGF-C ilmentyminen oli riittävä indusoimaan imusuonten by NSCLC-solut, me geenitekniikalla H1975 soluja vakaasti ilmentämään joko punainen fluoresoiva proteiini (RFP, H1975-Ctrl) tai täyspitkää ihmisen VEGF-C (H1975-VEGFC). Käänteistranskriptiotuotteiden PCR-analyysi osoitti, että H1975-VEGFC solut ilmensivät korkeaa VEGF-C (kuvio 4). Lisäksi, kvantitatiivinen PCR-analyysi osoitti, että taso VEGF-C mRNA: n on noin 3-kertaa suurempi H1975-VEGFC soluja kuin H1993-soluja (tietoja ei esitetty). Olemme ruiskutetaan nämä solut kylkiin NOD /SCID-hiiriin, ja havaitsi, että H1975-VEGFC kasvaimet kasvoivat hieman nopeammin kuin H1975-Ctrl kasvaimia (kuvio 4). Tiheys kasvaimeen verisuonten ei ollut merkitsevää eroa H1975-VEGFC kasvaimet (16,18 ± 1,998, n = 7) ja H1975-Ctrl kasvaimet (13,75 ± 1,263, n = 7; kuvio 4). Kuitenkin, tiheys kasvaimeen imusuonten oli merkittävästi suurempi H1975-VEGFC kasvaimet (11,83 ± 3,125, n = 7) kuin H1975-Ctrl kasvaimet (0,4286 ± 0,4286 N = 7; kuvio 4). Nämä tiedot osoittavat, että pakko ekspressio VEGF-C on riittävä indusoimaan imusuonten jonka NSCLC solulinja.

(A) RT-PCR-tulokset osoittavat, että H1975-VEGFC soluja, mutta ei H1975-Ctrl-solut, ilmentävät VEGF -C. (B) Kasvaimen kasvukäyrät hiirille ihon alle joko H1975-Ctrl tai H1975-VEGFC soluissa. (C, D) edustaja kuvia H1975-Ctrl ja H1975-VEGFC tuumorisektioiden värjättiin anti-endomucin vasta-aine. (E) määrä verisuonten kohti mikroskooppinen kenttä on merkitsevää eroa H1975-Ctrl kasvaimet (13,75 ± 1,263, n = 7) ja H1975-VEGFC kasvaimet (16,18 ± 1,998, n = 7). (F, G) edustaja kuvia H1975-Ctrl ja H1975-VEGFC kasvaimen osat värjättiin anti-Lyve-1-vasta-aine. (H) on merkittävästi enemmän imusuonten kohti mikroskooppisen kentän H1975-VEGFC kasvaimet (11,83 ± 3,125, n = 7) kuin H1975-Ctrl kasvaimet (0,4286 ± 0,4286 N = 7). **

P

0.01.

Voit selvittää VEGF-C ilmentymistä tarvitaan NSCLC-solujen indusoimaan imusuonten, me geneettisesti H1993 solujen vakaasti ilmentämään joko vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP; H1993-Ctrl) tai shRNA vastaan VEGF-C (H1993-shVEGFC). Tehokas pudotus VEGF-C: H1993-shVEGFC solujen osoitettiin kvantitatiivisella PCR: llä (kuvio 5). Huomasimme, että ei ollut eroa kasvun välillä H1993-shVEGFC ja H1993-Ctrl kasvaimet (kuvio 5) ja että tiheys kasvaimensisäisenä verisuonten ollut merkitsevää eroa H1993-shVEGFC kasvaimet (10,42 ± 1,182, n = 7) ja H1993 -Ctrl kasvaimet (11,17 ± 0,7817, n = 6; kuvio 5). Kuitenkin, tiheys kasvaimeen imusuonten oli merkitsevästi pienempi H1993-shVEGFC kasvaimet (0,61 ± 0,400, n = 7) kuin H1993-Ctrl kasvaimet (27,61 ± 1,391, n = 6; kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat, että VEGF-C vaaditaan NSCLC-solujen indusoimaan kasvaimen imusuonten.

(A) qPCR tulokset osoittavat, että H1993-shVEGFC solut ilmentävät alhaisempia VEGF-C kuin H1993-Ctrl-soluja. (B) Kasvaimen kasvukäyrät hiirille ihon alle joko H1993-Ctrl tai H1993-shVEGFC soluissa. (C, D) edustaja kuvia H1993-Ctrl ja H1993-shVEGFC kasvaimen osat värjättiin anti-endomucin vasta-aine. (E) määrä verisuonten kohti mikroskooppinen kenttä on merkitsevää eroa H1993-Ctrl kasvaimet (11,17 ± 0,7817, n = 6) ja H1993-shVEGFC kasvaimet (10,42 ± 1,182, n = 7). (F, G) edustaja kuvia H1993-Ctrl ja H1993-shVEGFC kasvaimen osat värjättiin anti-Lyve-1-vasta-aine. (H): n tiheys kasvaimeen imusuonten on huomattavasti alhaisempi H1993-shVEGFC kasvaimet (0,61 ± 0,400, n = 7) kuin H1993-Ctrl kasvaimet (27,61 ± 1,391, n = 6). ****

P

0,0001.

Nintedanib estää kasvaimen lymfangiogeneesiä

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään, onko estämällä VEGF-C /VEGFR3 signalointi akselin kliinisesti merkityksellistä yhdiste voi tukahduttaa kasvaimen imusuonten. Nintedanib on pieni molekyyli, estäjä, joka estää kaikki FGFR: ää (IC

50 = 37-108 nM), PDGFRs (IC

50 = 59-65 nM), ja VEGFRs (IC

50 = 13-34 nM ) sitoutumalla ATP-sitoutumiskohdan kinaasidomeenissa reseptoreiden [13]. Nintedanib on aiemmin osoitettu estävän kasvaimen angiogeneesiä ja kasvua useissa hiiren malleissa [13, 14]. Lisäksi yhdistelmähoito on nintedanib dosetakseliannoksella on raportoitu pidentävän selviytymistä vaiheen III /IV ei aikaisemmin hoidettu platina-pohjainen terapia [15]. Sen määrittämiseksi, onko nintedanib voi estää kasvaimen imusuonten, analysoitiin kasvainten aikaisemmassa tutkimuksessa, jossa arvioitiin vaikutus nintedanib kasvuun H1993 kasvainten [14]. Olemme havainneet, että tiheys kasvaimeen imusuonten oli merkitsevästi pienempi nintedanib käsiteltiin H1993 kasvaimia (5,254 ± 2,745, n = 5), kuin ajoneuvon käsiteltiin H1993 kasvaimia (22,19 ± 2,536, n = 6; kuvio 6). Nämä tiedot osoittavat, että nintedanib on tehokas tuumorin imusuonten.

(A, B) edustavat kuvat Lyve-1-värjätyt leikkeet ja H1993 kasvainten ajoneuvon ja nintedanib käsitellyillä hiirillä. (C) tiheys imusuonten in H1993 ksenografteissa on huomattavasti alhaisempi nintedanib käsitellyissä hiirissä (5,254 ± 2,745, n = 5), kuin ajoneuvon käsitellyissä hiirissä (22,19 ± 2,536, n = 6). **

P

0.01.

VEGF-C kopioluvun vaihtelu vaikuttaa VEGF-C ilmaisu

Syöpäsolut usein tehdään genomista muutoksia, jotka johtavat vahvistumiseen ja poistamista geenejä. Nämä genomi-muutokset voivat vaikuttaa geenien ilmentymistä. Sen määrittämiseksi, oliko

VEGF-C

geeni monistetaan tai poistetaan keuhkojen syöpäsoluja, analysoimme SNP array tietoja saatavilla 59 keuhkosyövän solulinjat. Tämä osoitti, että

VEGF-C

geeni monistettiin 22% (13/59; välillä 3-5 kappaletta

VEGFC

), läsnä 2: sta 54% (32 /59) ja poistetaan 24% (14/59) ja keuhkosyövän solulinjoja, jotka analysoitiin (kuvio 7). Voit selvittää muutosten määrä kopioita

VEGF-C

geeni vaikutti ilmentymistä

VEGF-C

, arvioimme log muuttaneet mikrosirujen arvot

VEGF-C

tässä paneelissa 59 keuhkosyövän solulinjat. Tämä osoitti, että taso

VEGF-C

oli merkitsevästi pienempi soluissa, jotka oli deleetio (3,582 ± 0,3033) ja

VEGF-C

geenin verrattuna soluihin, jotka oli joko 2 kappaletta (7,029 ± 0,5023) tai vahvistusta (8,742 ± 0,6856) ja

VEGF-C

geeni (kuvio 7). Nämä tiedot osoittavat, että

VEGF-C

kopiomäärä vaihtelu voi vaikuttaa ilmentymistason

VEGF-C

.

(A) havainnollistava kuva

VEGFC

kopioluvun vaihtelu eri keuhkosyövän solulinjat. Riviä osoittavat tiedot yksittäisissä keuhkosyövän solulinjoja. Pylväät merkitä eri asentoihin pitkin

VEGFC

geeni. Amplified kannat ovat värillisiä punainen, diploidi kannat ovat värillisiä musta ja poistetut alueet ovat värillisiä vihreä tai valkoinen. (B) Kaavio log muuttaneet

VEGF-C

mRNA tasoilla microarray tietoja solulinjoilla, jotka ovat yli 2 kappaletta (vaihteluväli 3-5 kappaletta

VEGFC

), 2 kappaletta tai vähemmän kuin 2 kappaletta

VEGFC

geeni. Kaavio osoittaa keskiarvo ± SEM. ****

P

0,0001

Keskustelu

Tutkimus molekyyli- selityksin keuhkosyövän solulinjat on lisännyt ymmärrystä reittejä ajo kasvaimen kehittymisen ja johtanut tunnistamiseen uusien biomarkkereiden ja terapeuttisia kohteita keuhkosyöpä . Tässä tutkimuksessa käytämme paneeli molekyyli- selityksin NSCLC solulinjojen tutkimiseksi molekyylitason mekanismeja valvoa kasvain imusuonten. Osoitamme, että VEGF-C ilmaisu säätelee kasvaimen lymfangiogeneesiä mukaan NSCLC-solut ja että VEGF-C-indusoitu signalointi kanssa nintedandinb voi estää kasvaimen lymfangiogeneesiä mukaan NSCLC-solut.

VEGF-C on tullut keskeinen hahmo alalla imusuonten tutkimusta. VEGF-C: n on osoitettu olevan riittävä aiheuttamaan kasvaimen imusuonten mukaan melanooma [16, 17], rintasyöpä [4, 12, 18], fibrosarkooma [17], ja mahalaukun karsinooma soluihin [19]. Lisäksi VEGF-C: n on raportoitu tukahduttaa imusuonten eturauhasen [20, 21], haiman [22], rintojen [23-25], mahan [26], ja keuhkosyövän soluja [27]. VEGF-C-ilmentymisen on myös raportoitu korreloivan imusuonien tiheys monissa eri ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien NSCLC [28-31]. Osoitamme, että VEGF-C ilmaisu erottelee NSCLC solulinjoja, jotka stimuloida imusuonten välillä NSCLC solulinjoista, jotka eivät indusoi imusuonten. Lisäksi osoitamme yli-ilmentyminen ja knockdown kokeiluja, että VEGF-C säätelee kasvaimen lymfangiogeneesiä mukaan NSCLC soluja. Nämä havainnot osoittavat edelleen, että on tärkeää VEGF-C edistää kasvaimen lymfangiogeneesiä ja viittaavat siihen, että se on hallitseva kuljettaja kasvaimen imusuonten NSCLC.

Nintedanib on pieni molekyyli, tyrosiinikinaasi-inhibiittori, joka estää kaikki FGF, PGDF, ja VEGF-reseptoreihin. Nintedanib aiemmin osoitettu olevan syöpälääkkeen vaikutuksia useissa kokeellisissa NSCLC ja NSCLC potilaiden [14, 15]. Osoitamme, että nintedanib voi estää kasvaimen lymfangiogeneesiä hiirimallissa NSCLC. Vaikka me osoittavat, että nintedanib on anti-imusuoniston aktiivisuus, tämän yhdisteen on aiemmin raportoitu ei estä kasvaimen imusuonten on siirtogeenisen hiiren mallia haiman neuroendokriinikasvain (PNET), joka on geneettisesti muokattu yliekspressoimaan VEGF-C [32]. Puuttuminen anti-imusuoniston vaikutus nintedanib in

Rip1-Tag2; Rip1-VEGFC

siirtogeenisiä hiiriä voisi olla, koska laaja epäsäännöllisen imusuonten ehkä ollut läsnä haimassa ennen hoidon aloittamista. On raportoitu, että äskettäin muodostettu imusuonten voi säilyä pitkään peruuttamisen jälkeen VEGF-C tai edessä anti-imusuoniston hoito [33]. Siksi kaikki imusuonten että muodostunut

Rip1-Tag2; Rip1-VEGFC

siirtogeenisiä hiiriä ennen hoidon aloittamista saattaa olla vastustuskykyisiä anti-imusuoniston vaikutuksia nintedanib. Vaihtoehtoisesti erotus havaintomme ja niille Bill et al., (2015) voisi olla, koska tutkimme eri kasvaintyypeille tai koska käytimme käsittelemättömien solulinjaa ja ne käytetään geenimuunnossolulinjoissa mallin yli-ilmentämään VEGF-C.

molekyylitason mekanismeja ohjaamiseksi

VEGF-C

mRNA-tasot eivät ole hyvin ymmärretty. Osoitamme, että muutokset määrä kopioita

VEGF-C

geeni vaikuttaa ilmaus

VEGF-C

. Huomasimme, että keuhkosyövän solulinjat, jotka ovat menettäneet yhden kopioita

VEGF-C

geeni on taipumus ilmaista alhaista

VEGF-C

. Kuitenkin lisämekanismien todennäköisesti myös kontrolloivat VEGF-C NSCLC-solut. MAPK, mTOR, ja NF-kB signalointireitteihin on kaikki raportoitu ohjaamaan VEGF-C ilmentyminen syöpäsoluja [34-37]. Nämä reitit voivat myös olla mukana ohjaamalla ilmentymisen VEGF-C NSCLC-solut. Jatkotutkimuksissa meidän paneeli solulinjojen auttaa määrittämään mahdollista roolia näiden ja muiden reittien säätelyssä ilmentymisen VEGF-C NSCLC-solut.

Yhteenvetona Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että VEGF-C on kriittinen säätelijä kasvaimen lymfangiogeneesiä NSCLC ja osoittavat, että nintedanib estää kasvaimen imusuonten. Nämä havainnot valottavat molekyylitason mekanismeja ajo kasvain lymfangiogeneesiä ja saattavat vaikuttaa suunnitteluun tulevien kliinisten tutkimusten, joiden tarkoituksena on estää leviäminen alkuvaiheessa NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

eläinkokeet kuvattu tässä käsikirjoitus tehtiin mukaisesti eläimen protokollan (APN 2013-0121) hyväksymä Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC) UT Southwestern Medical Center. Kaikki hiiret tässä tutkimuksessa hankittiin kampuksella toimittaja. Hiiret pidettiin ilmanvaihto microisolater häkeissä patogeenivapaassa laitos ja syötettiin standardia säteilytetty ruokavaliota mielin määrin. Hiiret edellyttäen nestlets ja igloos kuin rikastukseeen. Hiiriä seurattiin merkkejä hätä kuten uneliaisuus ja muutokset turkin ulkonäkö. Jos hiiret näyttivät vakavasti sairas tai kuolemaisillaan, ne lopetettiin yliannoksella hiilidioksidi, jonka jälkeen niskanmurrolla. Ei hiiret tuli vakavasti sairas tai kuollut ennen kokeellisen päätepisteen. Menetelmä eutanasian kokeellisen päätepisteiden koostui inhalantiksi yliannostuksen hiilidioksidia tai isofluraania seuraa niskanmurrolla. Nämä menetelmät ovat yhdenmukaisia ​​suositusten American Veterinary Medical Association (AVMA) Suuntaviivat eutanasia.

Solulinjat

Ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja (HBEC3KT) ja suurin osa ihmisen NSCLC solu linjat tässä tutkimuksessa käytetyt (H1993, HCC461, HCC827, H2122, H1155, H1975, ja H2073) perustettiin laboratorioissa Dr. Adi Gazdar ja Dr. John Minna [38-40]. NSCLC solulinjat Calu-1 ja Calu-3 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). NSCLC solulinjoja viljeltiin DMEM + 10% FBS vakio-olosuhteissa (5% CO

2 37 ° C: ssa). HBEC3KT solulinja viljeltiin keratinosyyttien seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 5 ng /ml EGF: ää ja 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta vakio-olosuhteissa (5% CO

2 37 ° C: ssa). Kaikki NSCLC solulinjat olivat DNA-sormenjäljet ​​ja mykoplasma-testattu.

Kvantitatiivinen PCR ja RT-PCR

RNA eristettiin eri solulinjoissa RNeasy mini (Qiagen, luettelonro: 74104), ja cDNA luotiin kanssa iScript cDNA-synteesi (BioRad, cat no: 170-8890). Geenispesifiseen Taqman käytettiin analysoimaan tasot

VEGFC

(Applied Biosystems, Hs01099206_m1) ja

GAPDH

(Applied Biosystems, Hs02758991_g1) ja vertailevan

C

t-menetelmää käytetään laskettaessa suhteessa mRNA: n ekspression tasoa. Seuraavia alukkeita käytettiin RT-PCR-reaktioissa monistamiseksi

VEGF-C

(5’GTTCGTACATGGCCGTCTGT-3 ’ja 5′-GGACCAAACAAGGAGCTGGA-3’) ja

GAPDH

(5′ CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ’ja 5′-GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3’).

Generation stabiilien solulinjojen

yli-ilmentävät VEGF-C: n ei-imusuoniston NSCLC solulinja, me tartunnan H1975-soluja kaupallisesti saatavilla lentivirus- partikkeleita, jotka sisältävät plasmidilla, joka ilmentää täyspitkää ihmisen VEGF-C (Precision LentiORF VEGFC w /lopetuskodonin, Open Biosystems, cat no: OHS5899-202618255). Tuottaa säätökennoja, me tartunnan H1975 soluja lentiviraalinen hiukkasia, jotka ilmaisevat RFP (Precision LentiORF RFP Positive Control, Open Biosystems, kissa ei: OHS5833). Soluja kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi blastisidiinia (30 ug /ml) useita viikkoja valikoida stabiilisti transfektoitujen solujen.

vakaasti pudotus VEGF-C: imusuoniston NSCLC solulinja, me tartunnan H1993 soluja kaupallisesti saatavilla lentivirus hiukkasia, jotka ovat ilmaisseet shRNA suunnattu VEGF-C (TRCN0000425238; Sigma, luettelonro: SHCLNV-NM_005429). Tuottaa säätökennoja, me tartunnan H1993 soluja lentiviraalinen hiukkasia, jotka ilmentävät GFP (MISSION® TRC2 pLKO.5-puro-CMV-TurboGFP ™ Positive Control transduktiopartikkeleilla, Sigma, Cat nro: SHC203V). Soluja kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi puromysiiniä (1 ug /ml) useita viikkoja valikoida stabiilisti transfektoitujen solujen.

Eläinkokeet

NOD /SCID hiirille ihon alle 1 miljoona H1975- Ctrl, H1975-VEGFC, H1993-ctrl tai H1993-shVEGFC soluissa. Hiiret punnittiin ja tuumorit mitattiin kaksi kertaa viikossa. Kasvaintilavuudet lasketaan kaavalla

V = (a

2

XB) /2

, jossa

ja

b

edustavat pienten ja suurten kasvainten halkaisija, vastaavasti. Hiiret lopetettiin ennen niiden kasvaimet saavuttivat 1,500 mm

3 ja niiden kudokset kerättiin histologista analyysiä.

Vasta

Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin immunohistokemiallisella tai immunofluoresenssivärjäyksen kasvainten: vuohi anti-Lyve-1 (R GEO hakunumero: GSE32036).

Differentially ilmentyvien geenien kahteen eri luokkaan näytettä määritettiin laskemalla kertaluokkamuutos ja T-testi

P

arvot ja käyttää mielivaltaisia ​​cutoffs valinnassa (esim 4 kertainen muutos ja

P

0.05.

Kiitokset

Kiitämme Rolf Brekken sekä jäseninä JMST ja TIG hyödyllisiä keskusteluja ja kriittiseen lukemiseen käsikirjoituksen.